Artykuł metodologiczny

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

DOI:

10.3791/61014

⸱

21 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potężne narzędzia dostępne do edycji genomów drożdży sprawiły, że mikrob ten stał się cenną platformą dla inżynierii. Chociaż obecnie możliwe jest skonstruowanie bibliotek milionów genetycznie odrębnych szczepów, badania przesiewowe w kierunku pożądanego fenotypu pozostają poważną przeszkodą. W przypadku istniejących technik przesiewowych istnieje kompromis między wyjściem informacji a przepustowością, przy czym badania przesiewowe o wysokiej przepustowości są zwykle przeprowadzane na jednym produkcie będącym przedmiotem zainteresowania. W związku z tym przedstawiamy podejście mające na celu przyspieszenie badań przesiewowych szczepów poprzez dostosowanie sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki do izogenicznych kolonii pikoliterów genetycznie modyfikowanych szczepów drożdży. Aby sprostać wyjątkowym wyzwaniom związanym z sekwencjonowaniem RNA na komórkach drożdży, przed wykonaniem sekwencjonowania RNA hodujemy izogeniczne kolonie drożdży w hydrożelach i sferoplastach. Dane z sekwencjonowania RNA można wykorzystać do wywnioskowania fenotypów drożdży i uporządkowania szlaków inżynieryjnych. Skalowalność naszej metody rozwiązuje krytyczną przeszkodę w inżynierii mikrobiologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem inżynierii mikrobiologicznej jest modyfikowanie mikrobów w celu skłonienia ich do wytwarzania cennych związków1,2. S. cerevisiae jest podstawowym organizmem w inżynierii mikrobiologicznej ze względu na łatwość hodowli i szeroki zakres dostępnych narzędzi do inżynierii genomu3,4,5. Pozostaje jednak przeszkoda w przeprowadzaniu funkcjonalnych badań przesiewowych na zmodyfikowanych drożdżach: przepustowość badań przesiewowych pozostaje w tyle za inżynierią genomu o rzędy wielkości. Badania przesiewowe zazwyczaj polegają na izolowaniu szczepów w płytkach mikrodołkowych i fenotypowaniu ich poprzez pomiar produkcji określonego związku6,7. Przepustowość tego procesu jest ograniczona przez duże ilości odczynnika potrzebnego do oznaczania poszczególnych szczepów w reakcjach na stu mikrolitrach. Mikrofluidyka kropelkowa stanowi atrakcyjne rozwiązanie zwiększające przepustowość badań przesiewowych drożdży o rzędy wielkości poprzez zmniejszenie skali reakcji zwykle przeprowadzanych na płytkach studzienkowych8. Jednak, podobnie jak w przypadku ekranów z płytkami studziennymi, sita kropelkowe zazwyczaj wykrywają pojedyncze związki produktu, co dostarcza ograniczonych informacji na temat globalnej funkcji ścieżki inżynieryjnej9,10,11.

Sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) może umożliwić bardziej wszechstronną charakterystykę działania szlaku, umożliwiając jednoczesną ocenę poziomów ekspresji wszystkich istotnych genów12,13. Co więcej, metody kropelkowe pozwalają na profilowanie tysięcy komórek w jednym eksperymencie, zapewniając przepustowość niezbędną do przesiewania bibliotek zmodyfikowanych wariantów14,15. Jednak metody sekwencjonowania RNA są zoptymalizowane pod kątem komórek ssaków; Drożdże, dla porównania, mają mniej mRNA na komórkę i ścianę komórkową, która jest trudna do usunięcia16, co wyklucza ich sekwencjonowanie istniejącymi metodami. Gdyby udało się opracować metodę kropelkową o wysokiej przepustowości, która umożliwiłaby sekwencjonowanie RNA drożdży, zapewniłoby to skalowalną, opłacalną i bogatą w informacje platformę fenotypowania dla inżynierii drożdży.

Prezentujemy szczegółowy protokół naszej niedawno opracowanej metody sekwencjonowania komórek drożdży za pomocą wysokoprzepustowej mikrofluidyki kropelkowej17. Aby sprostać wyzwaniu, jakim jest ograniczone RNA, kapsułkujemy i hodujemy pojedyncze komórki drożdży w kulkach hydrożelowych pikolitrów. Hodowla duplikuje komórki, uzyskując setki kopii dzielących tę samą ścieżkę inżynieryjną; zmniejsza to zmienność spowodowaną ekspresją genów w pojedynczej komórce, jednocześnie znacznie zwiększając ilość RNA dostępnego do sekwencjonowania. Po amplifikacji opartej na hodowli poddajemy komórki sferoplastyzmowi, usuwając ścianę komórkową poprzez masowe trawienie enzymatyczne. Błony komórkowe pozostają nienaruszone, dzięki czemu każda kolonia izogeniczna i związane z nią mRNA pozostają zamknięte w swoich hydrożelowych kulkach. Dzięki temu możemy sparować poszczególne kolonie z odczynnikami wychwytującymi mRNA i buforem do lizy, a mRNA ma być wychwycone, zakodowane i zsekwencjonowane zgodnie z przepływem pracy Drop-Seq14. Nasza metoda pozwala na badanie przesiewowe tysięcy izogenicznych kolonii drożdży w całym transkryptomie w jednym eksperymencie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

  1. Główna produkcja SU-8
    1. Zaprojektuj maskę ujemną dla kanałów mikroprzepływowych dla urządzenia A i B (plik uzupełniający 1 i 2) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo i wydrukuj je na folii na płytce drukowanej o rozdzielczości co najmniej 10 μm.
    2. Umieść czystą wafel krzemowy o średnicy 75 mm na powlekarce wirowej i wlej około 1 ml SU-8 na jego środek. Włącz odkurzacz, aby przymocować wafel do uchwytu.
    3. W przypadku urządzenia A wiruj płaszcz SU-8 2150 z prędkością 500 obr./min przez 30 s, a następnie 30 s z prędkością 2,750 obr./min. W przypadku urządzenia B należy obrócić SU-8 2100 przy 500 obr./min przez 30 s, a następnie 30 s przy 2,500 obr./min. W ten sposób uzyskano warstwy SU-8 o grubości odpowiednio 200 μm i 120 μm.
    4. Wyjmij wafel z wirówki i umieść na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na 60 minut, aby upiec na miękko.
    5. Wyjmij wafel z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Umieść maskę na wierzchu płytki i naświetl pod kolimatorem 190 mW, 365 nm UV LED przez 2 minuty.
    6. Umieść wafel na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 5 minut do pieczenia po ekspozycji.
    7. Wyjmij wafel i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Umieścić wafel w kąpieli octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na 20 minut.
    8. Opłucz wafel za pomocą PGMEA, a następnie izopropanolu. Jeśli podczas tego procesu widoczne są jakiekolwiek nieprzezroczyste pozostałości, powtórz płukanie za pomocą PGMEA i izopropanolu. Wysuszyć wafel na powietrzu.
    9. Umieść wafel na płycie grzejnej w temperaturze 95 °C na 3 minuty.
    10. Wyjmij wafel i umieść go na szalce Petriego o średnicy 90 mm.
  2. Odlewanie polidimetylosiloksanu (PDMS) na masterze SU-8
    1. Wymieszaj ze sobą stosunek masowy bazy silikonowej do utwardzacza w stosunku masowym 10:1. Odgazować PDMS po wymieszaniu przez około 30 minut.
    2. Wlej odgazowany PDMS na wierzch mastera SU-8, aż na wierzchu płytki utworzy się warstwa o grubości co najmniej 5 mm.
    3. Odgazowuje PDMS na wierzchu płytki przez około 30 minut.
    4. Umieść wafel w piekarniku o temperaturze 65 °C na co najmniej 80 minut, aby utwardził PDMS.
    5. Wytnij utwardzoną płytę PDMS z wafla.
    6. Umieść płytę PDMS z elementami mikroprzepływowymi skierowanymi do góry i przebij otwory wlotowe i wylotowe dziurkaczem do biopsji 0,75 mm.
    7. Wyczyść szkiełko o wymiarach 50 mm x 75 mm izopropanolem i usuń cały kurz ze strony mikroprzepływowej płyty PDMS za pomocą taśmy.
    8. Oczyste szkiełko podstawowe i płytę PDMS z elementami mikroprzepływowymi należy wystawić na działanie plazmy o natężeniu do 100 Pa (1 mbarO2) przez 1 minutę.
    9. Umieść płytę PDMS z elementami skierowanymi w dół na szklanym szkiełku, aby umożliwić sklejenie. Umieść szkiełko w piekarniku o temperaturze 65 °C na co najmniej 30 minut, aby zakończyć klejenie.
    10. Traktuj wszystkie kanały mikroprzepływowe poprzez przepłukiwanie fluorowanym płynem do obróbki powierzchni. Piecz urządzenie w piekarniku o temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut, aby odparować płyn.

2. Kapsułkowanie drożdży w hydrożelach za pomocą urządzenia A

  1. Weź drożdże rosnące w kulturze zawiesinowej i policz na hemocytometr.
  2. Zawiesić komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stężenia około 750 k/ml. Gwarantuje to, że 30% hydrożeli będzie miało w sobie jedną komórkę drożdży. Tylko około połowa komórek drożdży wyrasta w kolonie, co prowadzi do ~15% hydrożeli zawierających kolonie drożdży.
  3. Zmieszać agarozę o bardzo niskiej temperaturze topnienia o stężeniu 2% w/v w PBS i podgrzewać w temperaturze 90 °C, aż się rozpuści. Trwa to ~10 min.
  4. Załadować mieszaninę agarozy do strzykawki z dołączonym filtrem 0,22 μm do pompy strzykawkowej znajdującej się przed ogrzewaczem pomieszczenia ustawionym na 80 °C.
  5. Załadować strzykawkę wypełnioną zawiesiną drożdży i strzykawkę zawierającą olej fluorowany z 2% w/v jonowym fluorosurfaktantem 18 do pomp strzykawkowych.
  6. Weź rozdzielacz kropli przepływu wykonany w sekcji 1 i podłącz rurkę ze strzykawek do urządzenia. Przenieś rurkę z wylotu do stożkowej rurki o pojemności 15 ml w pojemniku na lód w celu zbierania kropli.
  7. Wlać trzy roztwory do urządzenia o następujących natężeniach przepływu:
    1. Przelej zawiesinę drożdży z szybkością przepływu 3 ml/h.
    2. Mieszaninę agarozy należy przelać z szybkością przepływu 3 ml/h.
    3. Olej fluorowany należy przepuszczać z prędkością 15 ml/h.
  8. Zebrać około 1 ml emulsji. Odczekaj dodatkowe 5 minut, aby agaroza w pełni się zestaliła.

3. Żel do rozbijania i mycia dla kultury

  1. Do emulsji dodać równą objętość 20% perfluorooktanolu (PFO) w oleju fluorowanym. Odwróć stożkową rurkę kilka razy, aby umożliwić wymieszanie.
  2. Odwirowywać rozdrobnioną emulsję o masie 2 000 x g przez 2 minuty. Żele będą osadzać się nad fazami oleju i PFO.
  3. Usuń fazę olejową i dodaj 2 ml buforu TE-TW (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) w celu ponownego zawieszenia żeli. Przenieść zawiesinę do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
  4. Granuluj żele jak w kroku 3.2 i umyj jeszcze raz w TE-TW, w sumie dwa razy.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić żele w 2 ml pożywki. Przenieść do probówki hodowlanej o pojemności 5 ml.
  6. Inkubować w temperaturze 30 °C przez noc pod wstrząsem.
    UWAGA: Po całonocnej inkubacji hydrożele drożdżowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.

4. Liza kolonii drożdży

  1. Przenieść żele do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i granulki hydrożeli o pojemności 2 000 x g przez 2 minuty.
  2. Umyj hydrożele w PBS 2x.
  3. Umyć w 1x bufor sferoplastyczny 1x.
  4. Wykonaj 2–50-krotne rozcieńczenie enzymu sferoplastycznego w buforze sferoplastycznym i dodaj 1 ml do hydrożeli.
  5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Traktowane drożdże będą wyglądały na bardziej przezroczyste (Rysunek 3A).
  6. Pobrać dolne 0,8 ml zawiesiny hydrożelowej i przenieść do 1 ml strzykawki bez korka.
  7. Umieść strzykawkę w wydrukowanym w 3D uchwycie strzykawki (plik uzupełniający 3) i wiruj z prędkością 2,000 x g przez 2 minuty. Spowoduje to zamknięcie opakowania hydrożeli w głowicy strzykawki.

5. wychwyt mRNA z kolonii drożdży lizowanych za pomocą urządzenia B

  1. Weź 240 000 kulek Drop-Seq i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Granulki Drop-Seq wirując w dół z prędkością 1,000 x g przez 1 min.
  3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 2 ml 0,9x buforu do lizy drożdży z 500 mM chlorku sodu, aby uzyskać stężenie zawiesiny kulek 120 000 kulek/ml.
  4. Przenieść zawiesinę kulek do strzykawki o pojemności 3 ml z włożonym mieszadłem.
  5. Przygotować strzykawkę zawierającą kilka mililitrów środka powierzchniowo czynnego 2% w/v perfluoropolyeter-glikol polietylenowy (PFPE-PEG) w oleju fluorowanym.
  6. Opróżnić całą wodnistą główkę strzykawki zawierającą ciasno upakowane hydrożele i zakryć strzykawkę.
  7. Włóż hydrożel, zawiesinę kulkową i strzykawki olejowe do pomp strzykawkowych i podłącz za pomocą rurki do urządzenia do kapsułkowania wykonanego w rozdziale 1.
  8. Podłącz z rurki wylotowej do stożkowej rurki o pojemności 50 ml na lodzie.
  9. Wlać trzy roztwory do urządzenia o następujących natężeniach przepływu:
    1. Przepływ hydrożeli w tempie 0,4 ml/h.
    2. Przelej zawiesinę kulek z prędkością 0,4 ml/h.
    3. Przepływ oleju fluorowanego z prędkością 1,6 ml/h.
  10. Zebrać ~1 ml emulsji lub uruchomić urządzenie, aż nie będzie już więcej hydrożeli.

6. Generowanie cDNA, przygotowanie biblioteki sekwencjonowania i sekwencjonowanie

  1. Dodać 30 ml 6x buforu SSC i 1 ml PFO do zebranej emulsji, jak podano w protokole Drop-Seq14.
  2. Kontynuuj postępowanie zgodnie z protokołem Drop-Seq, aby wygenerować cDNA z mRNA wychwyconego na kulkach, przygotowanie biblioteki sekwencjonowania i analizę danych sekwencjonowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostosowaliśmy wcześniej opublikowany przepływ pracy Drop-Seq14 do sekwencjonowania kolonii izogenicznych (ICO-seq) do profilowania ekspresji genów w izogenicznych koloniach drożdży. Wyizolowaliśmy pojedyncze komórki drożdży i zamknęliśmy je w mikrożelach agarozowych (Rysunek 1A). Po całonocnej inkubacji mikrożeli, te zamknięte w kapsułkach komórki drożdży wyrosły w izogeniczne kolonie. Przed załadowaniem żeli do drugiego urządzenia mikroprzepływowego w celu wychwycenia mRNA, strawiliśmy ścianę komórkową drożdży, aby mRNA było bardziej dostępne (Rysunek 1B, po lewej). Szczelnie zapakowaliśmy te mikrożele i połączyliśmy kulki wychwytujące mRNA i bufor do lizy. Niektóre kropelki zawierały dokładnie jeden koralik w połączeniu z kolonią drożdży lizowanych. Wszystkie kulki w emulsji zostały zebrane, a cDNA zsyntetyzowane i zsekwencjonowane zgodnie z protokołem Drop-Seq.

Stworzyliśmy izogeniczne kolonie drożdży poprzez enkapsulację pojedynczych komórek drożdży w mikrożelach agarozowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego do koenkapsulacji z dołączonym rozdzielaczem ośmiu kropli (Rysunek 2A). Rozcieńczyliśmy wejściową zawiesinę drożdży do stężenia ~750 000/ml, tak aby ~30% mikrożeli zawierało dokładnie jeden drożdż. Przed włożeniem agarozy o bardzo niskiej temperaturze topnienia do urządzenia, rozpuściliśmy ją w podwyższonej temperaturze i utrzymaliśmy strzykawkę w tej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu. Na złączu generacji kroplowej (Rysunek 2B) komórki drożdży zostały początkowo zamknięte w kropelkach o wielkości 160 μm. Po złączu generacji kropli ośmiokrotny rozdzielacz podzielił te krople na osiem kropel o średnicy 80 μm (Rysunek 2C). Do stopionej agarozy przymocowano filtr strzykawkowy, aby zapobiec tworzeniu się zatorów w kanałach, które mogą mieć nawet 37 μm podczas rozdzielania kropli. Zebraliśmy emulsję na lodzie, który natychmiast rozpoczął proces żelowania agarozy. Obliczyliśmy, że polidyspersyjność typowej emulsji wynosi ~6% (rysunek uzupełniający 1), chociaż dopuszczalne są wartości polidyspersyjności do 10%. Gdy żele agarozowe stężały, rozbiliśmy emulsję i usunęliśmy fazę olejową. Żele przemyto w buforze wodnym przed zanurzeniem w pożywce wzrostowej. Nocna inkubacja mikrożeli spowodowała wzrost izogenicznych kolonii w niektórych mikrożelach (Rysunek 2D). Odsetek hydrożeli zawierających kolonie co najmniej 20 komórek zależał od warunków hodowli, w tym czasu inkubacji i składu pożywki. W naszej demonstracji z użyciem C. albicans ustaliliśmy, że około 15% hydrożeli zawierało kolonię po 20 godzinach hodowli zawiesinowej.

Drugie urządzenie do koenkapsulacji wyekstrahowało mRNA z izogenicznych kolonii (Rysunek 3A). Przed załadowaniem mikrożeli drożdżowych do urządzenia mikroprzepływowego umyliśmy je i zanurzyliśmy w roztworze w celu strawienia ścian komórkowych drożdży. Prawidłowe trawienie komórek drożdży zostało zweryfikowane za pomocą mikroskopii, przy czym drożdże traktowane produktem miały bardziej refleksyjną morfologię (Rysunek 3B). Ciasno zapakowaliśmy mikrożele do strzykawki i dostosowaliśmy wejściowe natężenie przepływu żelu tak, aby w każdej kropli znajdował się jeden żel. Strumień kulek wychwytujących mRNA w buforze do lizy zmieszany z ciasno upakowanym strumieniem żelu przed złączem tworzącym krople (Figura 3C). Zebraliśmy powstałą emulsję kropelek o wielkości 160 μm, a kolonie zaczęły lizować i uwalniać swoją zawartość komórkową. Załadowaliśmy kulki w ograniczonym rozcieńczeniu, aby zminimalizować liczbę kropli zawierających wiele kulek, ale ścisłe upakowanie żeli podczas tworzenia kropli spowodowało, że około 10% zebranych kropli zawierało jedną kulkę z lizowaną kolonią (Rysunek 3D).

Przeanalizowaliśmy ekspresję genów C. albicans, gatunku drożdży obecnego w ludzkim mikrobiomie jelitowym, korzystając z przepływu pracy ICO-seq. C. albicans jest znany ze swojej zdolności do przełączania się między dwoma różnymi stanami komórki, określanymi jako biały i nieprzezroczysty19. Używamy zmodyfikowanego szczepu C albicans, szczepu RZY122, który zastępuje jedną kopię genu WH11, aktywną tylko w białych krwinkach z YFP20. Uzyskaliśmy zestaw profili ekspresji genów za pomocą przepływu pracy i wykorzystaliśmy je do analizy kolonii wyrażających co najmniej 300 unikalnych genów. Jako zestaw danych referencyjnych wykorzystaliśmy dane dotyczące ekspresji C. Albicans uzyskane z wcześniej opublikowanego badania17 i odfiltrowaliśmy kolonie wyrażające mniej niż 600 unikalnych genów. Po przeprowadzeniu analizy składowej głównej (PC) i redukcji wymiarowości t-stochastic neighbor embedding (tSNE) dimensionality reduction21, znaleźliśmy ogólną zgodność między naszym przykładowym zestawem danych a odniesieniem (Rysunek 4A). Analiza komputerów PC wykazała, że YFP i WH11 znacząco przyczyniły się do powstania dwóch pierwszych komputerów. Co więcej, analiza tSNE ujawniła trzy klastry (Rysunek 4B). Podczas gdy klaster 2 składał się głównie z komórek z przykładowego zestawu danych, klastry 0 i 1 składały się z komórek z obu próbek. Nakładając wyrażenie WH11 na tSNE (Rysunek 4C, górny panel), ustaliliśmy, że klaster 1 prawdopodobnie zawierał białe kolonie. Stwierdziliśmy również, że ekspresja STF2 wzrosła w klastrze 1 (Rysunek 4C, dolny panel), zgodnie z wcześniej uzyskanymi danymi17. W klastrach 0 i 2 WH11 i STF2 były znacznie obniżone w porównaniu z klastrem 1 (Rysunek 4D). Geny biorące udział w fermentacji, takie jak ADH1, były regulowane w górę w klastrze 0, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami komórek nieprzezroczystych22. Odkryliśmy, że kolonie w klastrze 2 miały zmniejszone rybosomalne RNA w porównaniu z koloniami w klastrach 0 i 1. Chociaż próbki i referencyjne zestawy danych uzyskano przy użyciu tego samego zestawu komórek, wynik ten sugeruje, że nawet subtelne różnice w obsłudze eksperymentalnej mogą wpływać na ekspresję genów.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy ICO-seq. (A) Drożdże rosnące w kulturze zawiesinowej rozcieńczono w buforze i współkapsułkowano stopioną agarozą w urządzeniu do generowania kropel skupiającym przepływ, aby umożliwić ładowanie Poissona mikrożeli agarozowych pojedynczymi komórkami drożdży. Żele zastygły, gdy agaroza ostygła, zawiesina olej/woda została zerwana, a olej został usunięty, dając zawiesinę kulek żelu w wodzie. Po nocnej hodowli komórki drożdży wyrosły w izogeniczne kolonie w mikrożelach. (B) Kolonie poddano buforowi degradacji ściany komórkowej, po czym zostały one szczelnie upakowane i okapsułkowane kulkami wychwytującymi mRNA w drugim urządzeniu mikroprzepływowym. Dokładne upakowanie mikrożeli zapewniało, że każda kropla zawierała jeden żel, podczas gdy ładowanie kulek metodą Poissona zmniejszyło ryzyko wystąpienia wielu kulek w jednej kropli. Pobrane krople poddano analizie w celu syntezy cDNA i wygenerowania biblioteki sekwencjonowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wytwarzanie izogenicznych kolonii drożdży w mikrożelach agarozowych za pomocą urządzenia A. (A) Schemat urządzenia mikroprzepływowego, pokazujący lokalizacje trzech portów wejściowych i wyjściowych. Skrzyżowanie kropli jest podświetlone na czerwono. (B) Zbliżenie na złącze kroplowe podczas normalnej pracy urządzenia. (C) Mikrofotografia zebranych kropel, z zbliżeniem kropli zawierającej otoczoną komórkę (wstawkę). (D) Mikrofotografia izogenicznych kolonii drożdży w mikrożelach agarozowych po 24-godzinnej inkubacji, ze zbliżeniem na dwie kolonie (wstawka). Wszystkie paski skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Liza i wychwyt mRNA z kolonii izogenicznych za pomocą urządzenia B. (A) Schemat urządzenia mikroprzepływowego, pokazujący lokalizacje trzech portów wejściowych i wyjściowych. Skrzyżowanie kropli jest podświetlone na czerwono. (B) Mikrofotografia kolonii drożdży po trawieniu ściany komórkowej, z zbliżeniem jednej rodziny (wstawka). (C) Zbliżenie na złącze kroplowe podczas normalnej pracy urządzenia. (D) Mikrofotografia zebranych emulsji po sparowaniu mikrożelu i kulki, ze zbliżeniem pokazującym kroplę z kulką i lizowaną kolonią (wstawka). Wszystkie paski skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza odpowiedzi przełączania na biało-nieprzezroczystą postać u C. albicans. (A) wykres tSNE przykładowego zestawu danych w połączeniu z referencyjnym zestawem danych z Liu17. (B) Grupowanie transkryptomów ujawnia trzy klastry wizualizowane na wykresie tSNE. (C) Kluczowe geny zaangażowane w reakcję przełączania na kolor biały i nieprzezroczysty przyczyniły się do zmienności określonej za pomocą analizy głównych składowych. (D) Wykresy skrzypcowe znormalizowanych poziomów ekspresji YFP i WH11 za pomocą klastrów oznaczonych na wykresie tSNE. **oznacza p <<< 0,05, a * oznacza p << 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunki uzupełniające 1 i 2. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.

Pliki uzupełniające 1-3. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza metoda sekwencjonowania RNA kolonii drożdży izogenicznych (ICO-seq) adaptuje opublikowaną platformę sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, Drop-Seq, do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zmodyfikowanych szczepów drożdży. Komórki drożdży zawierają mniej niż 10% kopii mRNA typowej komórki ssaków i mają ścianę komórkową, która musi zostać zdegradowana przed wychwyceniem mRNA16. Te dwa czynniki wykluczają bezpośrednie zastosowanie drożdży do Drop-Seq lub innych platform scRNA-seq opartych na kropelkach. Aby rozwiązać te problemy, zamykamy pojedyncze komórki w hydrożelach i hodujemy je w kolonie, aby zapewnić wystarczającą ilość materiału wejściowego do sekwencjonowania RNA i trawimy ścianę komórkową drożdży, aby wytworzyć sferoplasty przed lizą i wychwytem mRNA. Zmiany te dodatkowo komplikują przepływ pracy ICO-seq w porównaniu z oryginalnym przepływem pracy Drop-Seq i są krytycznymi krokami, które użytkownicy muszą zapewnić, aby przebiegały sprawnie.

Prawidłowe działanie urządzenia A jest niezbędne do kapsułkowania pojedynczych komórek drożdży w hydrożelach agarozowych. Należy przestrzegać prawidłowego zliczania zawiesiny drożdży wejściowych, aby zminimalizować liczbę hydrożeli z więcej niż jedną komórką drożdży, przy jednoczesnym zapewnieniu, że wystarczająca ilość hydrożeli zawiera pojedynczą komórkę, aby zapewnić rozsądną wydajność wychwytywania komórek podczas wychwytywania mRNA. Podczas pracy urządzenia mikroprzepływowego mieszanina żelu agarozowego musi być dobrze rozpuszczona i przepuszczona przez filtr strzykawkowy, aby zminimalizować ryzyko zatkania urządzenia. Mieszanina żelu agarozowego jest lepka, a obszar, w którym pojedynczy kanał rozdziela się na osiem, jest szczególnie podatny na zatykanie. Centrując szybką kamerę w celu wizualizacji pracy urządzenia w tym obszarze urządzenia, użytkownicy mogą monitorować jednorodność kropel wychodzących z każdego z ośmiu kanałów i szybko reagować, jeśli jednorodność zmieni się z powodu zatkania w którymkolwiek z kanałów. Kontrola niewielkiej ilości pobranej emulsji pod mikroskopem stanowi drugorzędną metodę potwierdzania wysokiej jakości emulsji.

Po wzroście kolonii drożdży w hydrożelach konieczne jest podjęcie kilku środków ostrożności, aby zapewnić jakość ekstrakcji mRNA na poziomie pojedynczej kolonii. Ważne jest, aby zoptymalizować czas, w którym drożdże znajdują się w hodowli hydrożelowej, ponieważ jeśli drożdże pozostaną w kulturze zbyt długo, wiele z nich ucieknie z ograniczeń hydrożeli, co prowadzi do wyższego sygnału tła podczas sekwencjonowania RNA i niższej czułości podczas rozróżniania typów komórek. Prawidłowe wytwarzanie sferoplastów za pomocą zymoliazy zapewnia, że mRNA zostanie uwolnione po ekspozycji komórki na bufor do lizy. Oględziny kolonii drożdży po Zymoliazie powinny dać bardziej błyszczące komórki drożdży. Niewłaściwe trawienie ściany komórkowej doprowadzi do niższej wydajności wychwytywania RNA. Wreszcie, hydrożele powinny być szczelnie upakowane podczas wstrzykiwania do urządzenia B. Monitorowanie wejścia hydrożelu za pomocą szybkiej kamery pozwoli na zakończenie zbierania emulsji, gdy hydrożele nie są już ciasno upakowane po wprowadzeniu do urządzenia, w przeciwnym razie wpłynie to na wydajność wychwytywania.

Potencjalnym problemem związanym z naszą metodą jest to, że hodowla mikrożeli drożdży może znacząco zmienić ekspresję genów. Wcześniejsze prace badające ekspresję genów drożdży w mikrożelach i na agarze wykazały różnice w średniej ekspresji genów, ale ogólnie dodatnią korelację17, chociaż dalsze badania tego twierdzenia na różnych szczepach drożdży są rozsądne. Metoda ma również ograniczoną skuteczność wychwytywania komórek ze względu na stochastyczne ładowanie kulek wychwytu mRNA zgodnie ze statystykami Poissona14. Obecnie około 10% kropli zawiera kulkę i kolonię, a oczekuje się, że odsetek podwójnych enkapsulacji wyniesie poniżej 1%. Podwójna enkapsulacja prowadzi do elementów mylących podczas analizy danych sekwencyjnych RNA, a ich filtrowanie pozostaje wyzwaniem23; współczynnik wychwytywania wynoszący 25 % doprowadziłby do odpowiedniego wzrostu podwójnej enkapsulacji do 5 % (rysunek uzupełniający 2). Chociaż demonstrujemy ICO-seq za pomocą platformy Drop-Seq, istnieją inne platformy sekwencjonowania kropelkowego RNA, które wprowadzają kulki wychwytu mRNA deterministycznie, a nie statystycznie, takie jak dostępna na rynku platforma 10x Genomics Chromium15,24. Integracja tych platform z ICO-seq może zwiększyć wydajność przechwytywania ponad to, na co pozwalają statystyki Poissona. Wreszcie, podstawowym ograniczeniem sekwencjonowania kropelkowego RNA jest niezdolność do odzyskania interesujących komórek po sekwencjonowaniu. To ograniczenie należy wziąć pod uwagę przy rozważaniu typów bibliotek drożdży do analizy przy użyciu tej metody.

Wykazano heterogeniczność między komórkami na poziomie klonalnym dla drobnoustrojów, takich jak E. coli25 i S. Cerevisiae26 ujawnia nowe stany komórkowe, które w przeciwnym razie zamaskowałaby analiza na poziomie masowym. Masowe analizy sekwencyjne RNA przeprowadzone na C. albicans mają tendencję do patrzenia na zmiany transkryptomu w całej populacji lub białe i nieprzezroczyste komórki jako dwie oddzielne populacje27,28. Zastosowanie ICO-seq może doprowadzić do odkrycia dodatkowych podstanów i zapewnić ramy analityczne do odkrywania nowych stanów komórkowych w innych gatunkach drożdży. Jednak wzrost komórek w hydrożelach nie ogranicza się do drożdży: inne typy komórek, takie jak komórki ssaków, bakterii i innych grzybów, mogą być również hodowane w hydrożelach29,30. Sekwencjonowanie kolonii izogenicznych w porównaniu z pojedynczymi komórkami prowadzi do uśrednienia szumu biologicznego spowodowanego zmiennością między komórkami, poprawiając dyskryminację między typami komórek. Może to pomóc podczas analizy komórek, w których różnorodność genetyczna koncentruje się na określonych szlakach syntezy. Rozszerzone możliwości wprowadzania typów komórek do ICO-seq i jego potencjalna integracja z dostępnymi na rynku platformami sekwencyjnymi kropelkowego RNA-seq pozycjonuje ICO-seq jako obiecującą platformę do analizy heterogeniczności komórkowej na poziomie genetycznym.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 i grant R01HG008978, National Science Foundation Technology Center grant DBI-1548297 oraz UCSF Center for Cellular Construction. ARA i ZJG są badaczami Chan-Zuckerberg Biohub.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr strzykawkowy 0,22 umMilipore SigmaSLGP033RS
0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020Służy do produkcji buforu TE-TW
Dziurkacz do biopsji 0,75 mmWorld Precision Instruments504529
strzykawki 1 mlBD309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
1M Tris-HCI, pH 8,0Thermo-Fisher15568025Służy do produkcji igieł TE-TW
rozmiarze 27
3 mlBD309657
3 ", typ P, klasa dziewiczaWafers447
Drukowany w 3D uchwyt strzykawki wirówki(niestandardowy)(niestandardowy) Zobaczpliki uzupełniające do druku 3D plik
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigma-Aldricha9414
Aquapel (hydrofobowa obróbka szkła)Pittsburgh Glass Works47100
Koraliki Drop-SeqChemGenesMACOSKO-2011-10
Szklane szkiełka mikroskopowe (75 mm x 50 mm)Corning294775X50
Jonowy środek powierzchniowoczynny KrytoxInstrukcje syntezy w odnośniku 14. Może zastąpić surfaktantem PEG-PFPE.
IsopropanolSigma-Aldrich109827
NaClSigma-AldrichS9888
Novec 75003M98-0212-2928-5Powszechnie znany jako HFE 7500
PBSFisher ScientificBP243820
rurki polietylenowe PE-2Scientific CommoditiesB31695-PE/2
PEG-PFPE SurfaktantRan Biotechnologie008-FluoroSurfaktant
PGMEA deweloperSigma-Aldrich484431
PhotomasksCadArt Servcies(niestandardowe)Zobacz pliki uzupełniające dla projektów masek
Powlekarkawirowa Specjalistyczne systemy powłokoweG3P-8
Bufor SSCSigma-AldrichS6639
SU-8 2100MicroChem
SU-8 2150MicroChemY111077
zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184Krayden4019862
Tween-20Sigma-AldrichP1379Służy do produkcji buforu TE-TW
YR Bufor do wytrawianiaZymo ResearchR1001-1Bufor sferoblastyczny
YR Bufor do lizyZymo ResearchR1001-2
ZymolyaseZymo ResearchE1005Mieszanina enzymów sferoplastycznych
o Strzykawki BD 305109 Płytki silikonowe University Y111075

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., Del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  2. Curran, K. A., Alper, H. S. Expanding the chemical palate of cells by combining systems biology and metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (4), 289-297 (2012).
  3. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  4. Mager, W. H., Winderickx, J. Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Sciences. 26 (5), 265-273 (2005).
  5. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: Lessons from synthetic biology. Biotechnology Journal. 6 (3), 262-276 (2011).
  6. Vanella, R., et al. Yeast-based assays for screening 11β-HSD1 inhibitors. Microbial Cell Factories. 15 (1), (2016).
  7. Zhuang, X., Chappell, J. Building terpene production platforms in yeast. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1854-1864 (2015).
  8. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  9. Wang, G., et al. RNAi expression tuning, microfluidic screening, and genome recombineering for improved protein production in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9324-9332 (2019).
  10. Beneyton, T., et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microbial Cell Factories. 16 (1), 18(2017).
  11. Sjostrom, S. L., et al. High-throughput screening for industrial enzyme production hosts by droplet microfluidics. Lab on a Chip. 14 (4), 806-813 (2014).
  12. Nadal-Ribelles, M., et al. Sensitive high-throughput single-cell RNA-seq reveals within-clonal transcript correlations in yeast populations. Nature Microbiology. 4 (4), 683-692 (2019).
  13. Gasch, A. P., et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress. PLoS Biology. 15 (12), 2004050(2017).
  14. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  15. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  16. von der Haar, T. A quantitative estimation of the global translational activity in logarithmically growing yeast cells. BMC Systems Biology. 2, 87(2008).
  17. Liu, L., Dalal, C. K., Heineike, B. M., Abate, A. R. High throughput gene expression profiling of yeast colonies with microgel-culture Drop-seq. Lab on a Chip. 19 (10), 1838-1849 (2019).
  18. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  19. Berman, J., Sudbery, P. E. Candida albicans: A molecular revolution built on lessons from budding yeast. Nature Reviews Genetics. 3 (12), 918-930 (2002).
  20. Srikantha, T., Soll, D. R. A white-specific gene in the white-opaque switching system of Candida albicans. Gene. 131 (1), 53-60 (1993).
  21. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  22. Sun, Y., et al. Deletion of a yci1 domain protein of Candida albicans allows homothallic mating in MTL heterozygous cells. mBio. 7 (2), 00465-00516 (2016).
  23. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors. Cell Systems. 8 (4), 329-337 (2019).
  24. Baran-Gale, J., Chandra, T., Kirschner, K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Briefings in Functional Genomics. 17 (4), 233-239 (2018).
  25. Silander, O. K., et al. A Genome-Wide Analysis of Promoter-Mediated Phenotypic Noise in Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), 1002443(2012).
  26. Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  27. Tuch, B. B., et al. The Transcriptomes of Two Heritable Cell Types Illuminate the Circuit Governing Their Differentiation. PLoS Genetics. 6 (8), 1001070(2010).
  28. Romo, J. A., et al. Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation. mSphere. 4 (5), 00620(2019).
  29. Huang, H., et al. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture. Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).
  30. Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices. Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie RNA w kropelkachwysokoprzepustowy screeningenkapsulacja w hydro elusferoplastyka dro d owaurz dzenie mikroprzep ywoweprotok Drop seqsynteza cDNAanaliza g wnych sk adowychredukcja wymiarowo ci tSNE

Powiązane artykuły