Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61018

⸱

29 marca 2020

 , 
1Department of Pharmacology, UC Davis School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Palmitoylacja polega na włączeniu 16-węglowego ugrupowania palmitynianowego do reszt cysteinowych docelowych białek w odwracalny sposób. W tym miejscu opisujemy podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS), w celu zbadania stanu palmitoilacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w lizatach mózgu myszy.

Streszczenie

Uważa się, że zależne od aktywności zmiany poziomów synaptycznych receptorów AMPA (AMPAR) w gęstości postsynaptycznej (PSD) reprezentują komórkowy mechanizm uczenia się i pamięci. Palmitoylacja reguluje lokalizację i funkcję wielu białek synaptycznych, w tym AMPA-R, czynników pomocniczych i rusztowań synaptycznych w sposób zależny od aktywności. Zidentyfikowaliśmy rodzinę czterech genów (SynDIG1-4) genów indukowanych różnicowaniem synaps (SynDIG) kodujących specyficzne dla mózgu białka transbłonowe, które łączą się z AMPAR i regulują siłę synaps. SynDIG1 jest palmitoilowany na dwóch resztach cysteiny znajdujących się w pozycjach 191 i 192 w regionie transbłonowym juxta, ważnym dla rozwoju synaps pobudzających zależnych od aktywności. W tym miejscu opisujemy innowacyjne podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS), w celu zbadania stanu palmitoilacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania i wykazania jego użyteczności z rodziną białek SynDIG w lizatach mózgu myszy.

Wprowadzenie

S-palmitoilacja to odwracalna potranslacyjna modyfikacja docelowych białek, która reguluje stabilną asocjację błony, transport białek i interakcje białko-białko1. Polega na dodaniu ugrupowania palmitynianu 16-węgla do reszt cysteiny poprzez wiązanie tioestrowe katalizowane przez enzymy acylotransferazy palmitoilowej (PAT). Wiele białek synaptycznych w mózgu jest palmitoilowanych, w tym AMPA-Rs i PSD-95, w sposób zależny od aktywności, aby regulować stabilność, lokalizację i funkcję2,3,4. Zmiany w poziomach synaptycznych AMPAR w PSD poprzez interakcję czynników pomocniczych z rusztowaniami synaptycznymi, takimi jak PSD-95, leżą u podstaw plastyczności synaptycznej; W związku z tym metody określania stanu palmitoilacji białek synaptycznych dostarczają ważnych informacji na temat mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Poprzednio zidentyfikowaliśmy rodzinę czterech genów SynDIG (SynDIG1-4) kodujących specyficzne dla mózgu białka transbłonowe, które kojarzą się z AMPARs5. Nadekspresja lub knockdown SynDIG1 w zdysocjowanych neuronach hipokampa szczura zwiększa lub zmniejsza odpowiednio rozmiar i liczbę synaps AMPA-R o ~50%, jak wykryto za pomocą immunocytochemii i elektrofizjologii5. Wykorzystaliśmy test wymiany acyl-biotyny (ABE), aby wykazać, że SynDIG1 jest palmitoilowany na dwóch konserwatywnych transbłonowych resztach Cys (znajdujących się we wszystkich białkach SynDIG) w sposób zależny od aktywności, aby regulować stabilność, lokalizację i funkcję6. Test ABE opiera się na wymianie biotyny na cysteiny chronione przez modyfikację i późniejsze oczyszczanie powinowactwa7. W tym miejscu opisujemy innowacyjne podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-PEGylowego (APEGS)8,9,10,11,12, który nie wymaga oczyszczania powinowactwa, a zamiast tego wykorzystuje zmiany w ruchliwości żelu do określenia liczby modyfikacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół jest opisany w celu zbadania endogennych białek błonowych z mózgu myszy, dla których dostępne są odpowiednie przeciwciała.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt były zgodne z wytycznymi określonymi przez National Institutes of Health (NIH) i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.

1. Przygotowanie błon mózgowych myszy

  1. Odciąć głowę myszy za pomocą aparatu gilotynowego i szybko wyciąć mózg (w <1 min, jeśli to możliwe, aby zminimalizować zmiany w palmitoilacji, które mogą wystąpić podczas procedury sekcji). Natychmiast homogenizować w 10 ml buforu homogenizacyjnego (Tabela 1) w szklanym homogenizatorze (~12 cykli) na lodzie.
  2. Odwirowywać lizaty przez 15 minut w temperaturze 1 400 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Zawiesić osad (~6 uderzeń) w równej objętości buforu homogenizacyjnego i odwirować przy 710 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Połączyć supernatanty z kroku 1.2 i odwirować przy 40 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant (frakcję cytozolową) i ponownie zawiesić granulowaną frakcję membranową (P2) w buforze homogenizacyjnym.
    UWAGA: Próbki można błyskawicznie zamrażać i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  5. Wykonaj test kwasu bicinchoninowego (BCA), aby określić ilościowo poziom białka. W przypadku testu APEGS należy rozpocząć od ~100-200 mg białka (maksymalnie 250 mg) w objętości 470 μl buforu A (Tabela 1) w probówce o pojemności 1,5 ml. Sonikować i odwirowywać w temperaturze 13 000 x g > przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego białka. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

2. Test przesunięcia żelu z wymiennikiem acylo-pegylowym (APEGS)

  1. Rozbijaj wiązania dwusiarczkowe i blokuj wolne cysteiny.
    1. Rozbijać wiązania dwusiarczkowe przez inkubację w 25 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP; 25 μl, dodanej z roztworu podstawowego; Tabela 1) przez 60 min w temperaturze 55 °C.
    2. Blokować cysteiny wolne od 50 mM N-etylomaleimidem (NEM; 12,5 μl, dodanym z roztworu podstawowego; Tabela 1) w temperaturze pokojowej przez 3 h.
      UWAGA: Reakcja może zostać przedłużona z dnia na dzień.
  2. Przeprowadzić wytrącanie chloroformu metanolu (CM).
    1. Przenieś roztwór białkowy z probówki o pojemności 1,5 ml do probówki z polipropylenu lub szkła, którą można odwirować w wahadłowym wirniku kubełkowym z niewielką prędkością. Idealna jest tubka o pojemności 5 ml. Dodać cztery objętości (2 ml) metanolu (MeOH) i krótko odmieszać.
    2. Dodać dwie objętości (1 ml) chloroformu i krótko przemieszać.
    3. Dodać trzy objętości (1,5 ml) dH2O i krótko odwirować.
    4. Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.
    5. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć górną fazę.
    6. Dodaj 3 objętości (1,5 ml) MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, uważając, aby nie rozdrobnić nieprzezroczystego naleśnika białkowego.
    7. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.
    8. Za pomocą szklanej pipety serologicznej usuń jak najwięcej górnej fazy, nie naruszając naleśnika białkowego.
    9. Ostrożnie spłucz osad 1 ml MeOH.
    10. Suszyć pelety na powietrzu przez co najmniej 10 minut.
      UWAGA: Wysuszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Wykonać rozszczepienie wiązań palmitoilowo-tioestrowych za pomocą hydroksyloaminy (NH2OH, HAM).
    1. Zawiesić osad białkowy w 125 μl buforu A i krótko wykonać sonikę. Wirować przy >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Przenieś rozpuszczone białko do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 375 μl buforu H (HAM+; Tabela 1) lub bufor T (HAM-; Tabela 1) i inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 25 °C.
  4. Powtórzyć opady CM opisane w kroku 2.2.
    UWAGA: Wysuszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Dodaj mPEG do niezabezpieczonych cystein.
    1. Zawiesić osad w 100 μl buforu A zawierającego 10 mM TCEP. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: To normalne, że znaczna utrata białka nastąpiła podczas etapów wytrącania CM. Wszystkie kolejne kroki będą wykonywane w probówce o pojemności 1,5 ml, ograniczając objętość białka do maksymalnie ~120−130 μL. Zmniejszy to utratę białka podczas końcowego wytrącania CM.
    2. Dodać 20 mM mPEG-5k (25 μl, dodać z roztworu podstawowego; Tabela 1) do próbki białka i wymieszać przez pipetowanie. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 25 °C z obrotem od końca do końca.
    3. Aby usunąć nieinkorporowany mPEG-5k, należy przeprowadzić wytrącanie CM zgodnie z opisem w kroku 2.2, używając następujących dostosowanych objętości: 4 objętości MeOH (500 μL), 2 objętości chloroformu (250 μL) i 3 objętości dH2O (375 μL). Wirować przy >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
    4. Ostrożnie usuń górną fazę jak poprzednio, unikając grubego, kłaczkowatego naleśnika. Dodaj 1 ml MeOH i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj. Wirować przy >13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
    5. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml MeOH. Wirować w temperaturze 13 000 x g > przez 10 minut w temperaturze 25 °C. Suche na powietrzu granulki.
      UWAGA: Wysuszony pellet można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Zawiesić wysuszony osad w 50 μl buforu A (bez TCEP lub jakiegokolwiek środka redukującego). Zarezerwuj 5 μl na ilościowe oznaczanie białka BCA. Po oznaczeniu ilościowym dodać odpowiednią ilość 4x buforu próbki Laemmli i, w zależności od interesującego białka, potencjalnie podgrzać próbkę do temperatury 70-100 °C przez 10 min.
      UWAGA: Gotowanie może spowodować agregację niektórych białek błonowych.

3. Analiza Western blot białek pegylowanych

  1. Załaduj próbkę do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) gel13.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano 10% poliakrylamidu.
  2. Używaj standardowych protokołów separacji, transferu i wykrywania dla Western blotting14.
  3. Użyj densytometry14, aby określić względne ilości białek pegylowanych i niepegylowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Immunoblotting z użyciem przeciwciał przeciwko białku zainteresowania ujawnia stan palmitoilacji (brak, jednokrotna, dwukrotna itp.) w lizatach mózgu myszy, określony na podstawie przesunięcia mobilności w porównaniu z próbkami, do których nie dodano HAM. Wcześniej wykazaliśmy, że SynDIG1 jest palmitoilowany w dwóch miejscach przy użyciu analizy ABE6; jednak nie byliśmy w stanie określić, czy oba te miejsca są modyfikowane w tkance mózgowej. Tutaj pokazujemy, że Sy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W naszej poprzedniej pracy wykorzystaliśmy test ABE, aby wykazać, że SynDIG1 jest palmitoilowany w dwóch konserwatywnych transbłonowych resztach Cys (znajdujących się we wszystkich białkach SynDIG) w sposób zależny od aktywności w celu regulacji stabilności, lokalizacji i funkcji6. Ograniczeniem jest to, że test ABE wymaga oczyszczenia z powinowactwa żywicami agarozowymi sprzężonymi z ugrupowaniami awidyny jako ostatniego etapu procedury, co powoduje znaczną utratę sygnału, co komplikuje analizę i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują K. Woolfreyowi za rady i wkład w test APEGS. Badania te zostały sfinansowane z grantów badawczych dla E.D. z Whitehall Foundation i NIH-NIMH (1R01MH119347).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydroksyloamina (SZYNKA)ThermoFisher26103
Metoksy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)NOFME-050MAMW ~5000 kDa
MicrofugeEppendorf5415Rlub równoważny sprzęt
N-etylomalemid (NEM)Calbiochem34115Silnie toksyczny.
Obrazownik optyczny do densytometriiAzure BiosystemsSapphire Biomolecular Imagerlub równoważny sprzęt
Probówki polipropylenowe z nasadkąFisher Scientific14-956-1D
Pipety serologiczne (szkło)Fisher Scientific13-678-27D
Wirówka stołowaBeckmanAllegra X-15Rlub równoważne wyposażenie
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)EMD Milipor580560

Bibliografia

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  14. Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza palmitoilacjibia ka SynDIGwytr canie w chloroformie i metanoluanaliza Western blotprzesuni cie bia ka w eluizolacja frakcji b onowejredukcja TCEPblokowanie NEM
Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.