Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Podsumowanie

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Streszczenie

Optogenetyczna modulacja obwodów neuronalnych u swobodnie poruszających się myszy wpływa na ostre i długotrwałe zachowanie. Metoda ta jest w stanie wykonywać manipulacje pojedynczymi neuronami i uwalnianiem nadajnika specyficznego dla regionu, aż do całych obwodów neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym i umożliwia bezpośredni pomiar wyników behawioralnych. Neurony wyrażają narzędzia optogenetyczne poprzez wstrzyknięcie wektorów wirusowych przenoszących wybrane DNA, takich jak rodopsyna kanałowa2 (ChR2). Światło jest doprowadzane do określonych obszarów mózgu za pomocą przewlekłych implantów optycznych, które kończą się bezpośrednio nad obszarem docelowym. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji i prawidłowej ekspresji narzędzi, myszy mogą być wielokrotnie wykorzystywane do testów behawioralnych z optogenetyczną stymulacją interesujących neuronów.

Modulacja optogenetyczna ma wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną, którą można osiągnąć z wysoką specyficznością komórkową, w porównaniu do powszechnie stosowanych metod, takich jak stymulacja chemiczna lub elektryczna. Światło nie uszkadza tkanki neuronalnej i dlatego może być wykorzystywane do długotrwałych eksperymentów, a także do wielu eksperymentów behawioralnych na jednej myszy. Możliwości narzędzi optogenetycznych są niemal nieograniczone i umożliwiają aktywację lub wyciszenie całych neuronów, a nawet manipulowanie określonym typem receptora za pomocą światła.

Wyniki takich eksperymentów behawioralnych ze zintegrowaną stymulacją optogenetyczną bezpośrednio wizualizują zmiany w zachowaniu spowodowane manipulacją. Zachowanie tego samego zwierzęcia bez stymulacji świetlnej jako punktu odniesienia jest dobrą kontrolą dla wywołanych zmian. Pozwala to na szczegółowy przegląd typów neuronów lub systemów neuroprzekaźników zaangażowanych w określone zachowania, takie jak lęk. Plastyczność sieci neuronalnych można również bardzo szczegółowo badać poprzez długotrwałą stymulację lub obserwacje behawioralne po stymulacji optycznej. Optogenetyka pomoże oświecić sygnalizację neuronalną w kilku rodzajach chorób neurologicznych.

Wprowadzenie

Modulacja obwodów neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym oraz ich skutki behawioralne są kluczowe dla zrozumienia funkcjonowania mózgu, szczególnie w kontekście chorób psychiatrycznych oraz zadań poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć. Dzięki optogenetyce możliwe jest modulowanie za pomocą światła pojedynczych komórek, populacji komórek, a nawet całych obwodów. Powszechnie stosowane narzędzia optogenetyczne, takie jak Channelrhodopsin2 (ChR2) lub Archaerhodopsin (Arch), pozwalają na aktywację lub wyciszenie neuronów, a także na zwiększenie lub zahamowanie uwalniania przekaźników w zakończeniach aksonów rzutujących do określonych obszarów mózgu^1,2,3,4. Należy jednak ostrożnie stosować Arch, ponieważ wykazano, że jego aktywacja w zakończeniach presynaptycznych zwiększa spontaniczne uwalnianie przekaźników⁵. Arch jest pompą protonową o charakterze prostującym zewnętrznie, która zmienia wartość pH wewnątrz komórki. To zasadowe środowisko indukuje napływ wapnia i nasila uwalnianie przekaźników⁵. W celu specyficznej modulacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych można tworzyć chimery receptorowe składające się z aktywowanego światłem narzędzia optogenetycznego, takiego jak rodopsyna lub opsyna czopkowa, w połączeniu z odpowiednim receptorem sprzężonym z białkiem G^6,7,8. Liczba i różnorodność dostępnych narzędzi optogenetycznych znacząco wzrosła w ciągu ostatniej dekady⁹.

Celem optogenetyki jest manipulowanie obwodami neuronalnymi podczas zachowania. Optogenetyka umożliwia na przykład pomiar gwałtownych zmian behawioralnych, takich jak zmiany w zachowaniach lękowych. Narzędzia optogenetyczne są dostarczane do docelowych obszarów mózgu za pomocą wektorów wirusowych. Dzięki zastosowaniu specjalnych promotorów i enhancerów lub systemu Cre-loxP można zapewnić specyficzność typu komórek w ekspresji narzędzi optogenetycznych (Rycina 1A). Istnieje kilka genetycznie zmodyfikowanych linii myszy wykazujących ekspresję enzymu Cre-Recombinase wyłącznie w określonych typach komórek. Na przykład myszy Nex-Cre wykazują ekspresję Cre-Recombinase w neuronach piramidowych kory i hipokampa pod kontrolą promotora Nex¹⁰. Enzym ten jest zdolny do inwersji sekwencji DNA flankowanych przez miejsca loxP¹¹. W konsekwencji sekwencja DNA podwójnie floxowanego narzędzia optogenetycznego, która jest odwrócona i flankowana przez miejsca loxP, może być transkrybowana wyłącznie przez neurony posiadające Cre-Recombinase, a nie przez inne typy neuronów^12,13. W przypadku myszy Nex-Cre narzędzie optogenetyczne będzie eksprymowane wyłącznie w neuronach piramidowych. Stymulacja światłem określonych obszarów mózgu jest następnie realizowana poprzez chroniczną implantację światłowodów bezpośrednio nad obszarem zainteresowania. Zwierzęta mogą być następnie podłączone do odpowiedniego źródła światła i swobodnie przejawiać zachowania w niemal wszystkich rodzajach testów behawioralnych.

Rysunek 1: Iniekcja i implantacja.A) System Cre-loxP dla ChR2-YFP. Podwójnie floksowane narzędzie optogenetyczne jest zapakowane w wirus adeno-zależny (AAV) w celu iniekcji do tkanki mózgowej. B) Widok strzałkowy iniekcji wirusa i implantacji optycznego interfejsu neuronalnego do/nad obszarem IL w mPFC. Iniekcja i implantacja zostały wykonane od góry. Przedstawiono wszystkie obszary zainteresowania: IL, BLA oraz DRN. C) Szczegółowy widok zaimplantowanego światłowodu, tulejki i źródła światła. D) Rozprzestrzenianie się stymulacji niebieskim i czerwonym światrem laserowym w tkance istoty szarej mózgu z włókna świetlnego 200 µm (Yizhar et al. 2011). Światło niebieskie rozprzestrzenia się maksymalnie na 0,5 mm w tkance, a światło czerwone na około 1 mm. Kodowanie kolorami: czerwony 50%, żółty 10%, zielony 5%, niebieski 1%, jeśli światło dociera do tego obszaru. E) Widok czołowy jednostronnej implantacji bezpośrednio nad lewym IL z użyciem światłowodu 200 µm. Obszar IL ma szerokość 0,25 mm w każdej półkuli i głębokość 0,2 mm. Niebieskie i czerwone obszary rozświetlenia wyznaczają granicę 5% rozprzestrzeniania się światła i zostały przeniesione z pracy Yizhar et al. w odpowiedniej skali. LoxP: locus of X-over P1; ChR2: kanałrodopsyna; YFP: żółte białko fluorescencyjne; dflox: podwójnie floksowane; IL: kora infralimbiczna; BLA: boczno-podstawowe jądro ciała migdałowatego; DRN: jądra szwu grzbietowego; PrL: obszar prelimbiczny. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Stosuje się podejścia optogenetyczne, ponieważ umożliwiają one zarówno wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną¹⁴, jak i modulację specyficzną dla danego typu komórek. Dodatkowo możliwe jest wielokrotne wykorzystanie wszczepionego urządzenia bez konieczności przeprowadzania dalszych zabiegów. Po zabiegu stereotaksyjnym, podczas którego wykonuje się wstrzyknięcie wirusa adeno-zależnego niosącego narzędzie optogenetyczne oraz implantację włókna optycznego, myszy mogą regenerować się przez dwa tygodnie. Wybrano czas rekonwalescencji wynoszący zaledwie 2 tygodnie, ponieważ jest to czas wystarczający na powrót do zdrowia po operacji oraz na ekspresję wirusa. Ponieważ po eksperymentach behawioralnych przeprowadza się immunohistochemię, należy dopilnować, aby myszy nie stały się zbyt stare w trakcie trwania badania; w przeciwnym razie jakość tkanki ulega pogorszeniu. Zwierzęta nie wykazują wyraźnych zaburzeń behawioralnych wynikających z implantacji i przejawiają typowe zachowania w klatce. Oczywiście implantacji towarzyszy znaczne uszkodzenie chirurgiczne, dlatego myszy są intensywnie monitorowane. Po operacji myszy muszą być przetrzymywane pojedynczo, ponieważ myszy w grupach mają tendencję do ranienia świeżych ran i implantów osobników współdzielących klatkę. Jednak warunki bytowe mają duży wpływ na poziom lęku u samców myszy, gdyż osobniki przetrzymywane pojedynczo wykazują niższy poziom lęku¹⁵ i ogólnie mniej objawów depresyjnych¹⁶.

Manipulacje chemiczne lub elektryczne obwodów mózgowych nie charakteryzują się tak wysoką specyficznością w odniesieniu do typów komórek jak optogenetyka oraz posiadają niższą rozdzielczość czasową i przestrzenną^14,17,18. W zależności od postawionego pytania badawczego, stymulacja elektryczna lub chemiczna może oferować różne zalety. W sytuacjach, gdy konieczna jest stymulacja również przechodzących zakończeń włókien w konkretnym obszarze, najlepszą metodą jest stymulacja elektryczna. Stymulacja chemiczna jest właściwym wyborem, gdy agonistami należy aktywować receptory specyficzne dla konkretnego przekaźnika w całym obszarze. Kolejną istotną zaletą optogenetyki w porównaniu ze stymulacją chemiczną lub elektryczną jest fakt, że neurony w warunkach endogennych nie są wrażliwe na światło, co pozwala uniknąć wystąpienia efektów ubocznych¹⁹. Rzeczywiście, wysoka intensywność światła może wywoływać efekty cieplne^8,20, jednak dzięki zastosowaniu odpowiednich grup kontrolnych, efekty behawioralne wynikające z manipulacji optogenetycznej mogą zostać wyeliminowane.

Badanie zachowania gryzoni, zwłaszcza w kontekście chorób psychiatrycznych, uległo znacznej poprawie dzięki zastosowaniu optogenetyki u zwierząt swobodnie poruszających się, ponieważ umożliwia ona bezpośrednią modulację pojedynczych receptorów, a także specyficznych populacji komórek²¹ i obwodów neuronalnych²². Możliwość pomiaru ostrych efektów takich modulacji, a także długofalowych skutków behawioralnych po określonym czasie²³ lub po chronicznej stymulacji²⁴, zapewnia dużą elastyczność projektowania eksperymentów i dostarcza bardzo szczegółowych informacji na temat obwodów mózgowych. Stymulacja światłem może być wykorzystana do modulacji neuronów zlokalizowanych w miejscu wstrzyknięcia narzędzia optogenetycznego. Gdy zarówno wstrzyknięcie, jak i implantacja dotyczą tego samego obszaru mózgu, możliwe jest celowanie w ciała komórek oraz aksony projekcyjne neuronów głównych i interneuronów w tym regionie^3,6,8. Jednak światłowód może zostać zaimplantowany również w obszarze innym niż ten, do którego wstrzyknięto preparat. W takim przypadku stymulacja światłem może modulować uwalnianie przekaźników w zakończeniach aksonów w obszarach projekcyjnych wstrzykniętego regionu^25,26,27.

W niniejszym badaniu optogenetyka jest wykorzystywana w połączeniu z eksperymentami do analizy zachowań związanych z lękiem. Choroby psychiatryczne związane z lękiem dotykają ponad jednej trzeciej populacji świata^28,29,30 i generują wysokie obciążenia ekonomiczne³¹. Osoby dotknięte tymi schorzeniami cierpią z powodu uczucia pobudzenia, napięcia i niepokoju, którym towarzyszą zachowania unikowe^32,33. Te przewlekle występujące negatywne emocje, koncentrujące się głównie na przyszłych zdarzeniach³⁴, w znacznym stopniu zakłócają codzienne życie pacjentów. Powszechne metody leczenia, takie jak benzodiazepiny czy selektywne inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI), okazują się skuteczne tylko u części pacjentów. Znaczna liczba osób w ogóle nie reaguje na leczenie³⁵, co wskazuje, że mechanizm leżący u podstaw takich chorób nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. Wiadomo, że przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) odgrywa ważną rolę w rozwoju i manifestacji lęku^{21,25,27,36,37,38}. W szczególności nadaktywność regionu kory infralimbicznej (IL) w mPFC może być elementem zaburzeń lękowych^39,40. Opisany tutaj przykładowy eksperyment może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób modulacje w regionie IL mPFC wpływają na zachowania lękowe. Ponadto może on potencjalnie wesprzeć opracowanie nowych strategii terapeutycznych w chorobach psychiatrycznych związanych z lękiem.

Do specyficznej ekspresji ChR2 w neuronach piramidowych w obrębie obszaru IL mPFC⁴¹ wykorzystuje się samce myszy Nex-Cre w wieku od 2 do 6 miesięcy. Myszy Nex-Cre mają tło genetyczne C57Bl/6 i wykazują specyficzną ekspresję enzymu rekombinazy Cre w neuronach piramidowych. Podczas zabiegu stereotaktycznego do obszaru IL wstrzykuje się podwójnie floksowany ChR2-DNA za pomocą wektorów wirusowych towarzyszących adenowirusom. Implant optyczny umieszcza się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania (Rysunek 1B), a następnie unieruchamia go za pomocą cementu stomatologicznego. Zwierzęta kontrolne otrzymują w tym samym obszarze wtrysk podwójnie floksowanego tdTomato-DNA w celu imitacji ekspresji specyficznej dla komórek.

Zwierzęta są utrzymywane w grupach do dnia operacji, a następnie w pojedynczych klatkach, aby uniknąć obrażeń spowodowanych przez inne myszy. Myszy są trzymane w szafach z indywidualnie wentylowanymi klatkami (IVC) w klatkach typu TypI-L przeznaczonych dla myszy trzymanych pojedynczo. Cykl światło-ciemność przebiega w rytmie 12:12 h, przy czym faza jasna rozpoczyna się o godzinie 10:00. Wszystkie eksperymenty behawioralne są przeprowadzane w fazie ciemnej, która odpowiada fazie aktywności gryzoni. Woda i standardowa karma w formie peletu są dostępne ad libitum. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji, co zapewnia wystarczającą ekspresję ChR2 w neuronach piramidalnych, myszy są wykorzystywane w eksperymentach behawioralnych.

Otwarte Pole (OF) to kwadratowy labirynt o wymiarach 50 cm x 50 cm z piaskowanymi ścianami o wysokości 40 cm. Podłoże jest podzielone na 16 kwadratów, z których 4 wewnętrzne stanowią centrum. Mierzone zachowania to: 1) czas spędzony w centrum, 2) liczba wejść do centrum oraz 3) całkowity dystans pokonany przez zwierzę. Podczas tego eksperymentu przeprowadzanych jest 4 prób o łącznym czasie 20 minut. W próbach 1 i 3 nie występuje stymulacja światłem, natomiast w próbach 2 i 4 wykonywana jest stymulacja o częstotliwości 20 Hz z impulsem świetlnym 5 ms i natężeniu światła 1 mW o długości fali 473 nm (Rycyna 2A). W późniejszych próbach uwzględniono habituację do obszaru testowego, a zastosowanie zwierząt kontrolnych po wstrzyknięciu pozorowanym (sham) wskazuje, w jaki sposób habituacja ta przejawia się w badaniu.

Labirynt Barnesa to eksperyment badający uczenie się i pamięć. Jest to okrągła platforma o średnicy 92 cm, w której obwodzie znajduje się 20 równomiernie rozmieszczonych otworów. 19 otworów jest zamkniętych, a pod jednym z nich znajduje się skrzynka ucieczkowa. Przez 4 kolejne dni myszy przechodzą 4 próby treningowe, aby nauczyć się lokalizacji skrzynki ucieczkowej. Piątego^th w tym dniu usuwa się skrzynkę ucieczkową i bada czas, jakiego myszy potrzebują na znalezienie właściwego otworu. Mierzone parametry behawioralne to: 1) czas do znalezienia skrzynki ucieczkowej/właściwego otworu, 2) liczba wejść do celu oraz liczba błędów oraz 3) dystans pokonany do momentu wejścia do skrzynki ucieczkowej. Stymulacja światłem w różnych grupach jest przeprowadzana albo podczas nabywania lub konsolidacji, które mają miejsce w dniach treningowych 1–4, albo podczas przypominania w dniu testowym, którym jest dzień 5 (Rycina 2D).

Rysunek 2: Eksperymenty behawioralne z protokołami optogenetycznymi. A) Schematyczny rysunek eksperymentu w otwartym polu z odpowiadającym mu protokołem stymulacji światłem. C) Schematyczny rysunek eksperymentu w labiryncie podniesionego krzyża z odpowiadającym mu protokołem stymulacji światłem. D) Schematyczny rysunek eksperymentu w labiryncie Barnesa z odpowiadającym mu protokołem stymulacji światłem. EPM: labirynt podniesionego krzyża; OF: otwarte pole; BM: test labiryntu Barnesa. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

W przypadku stymulacji optogenetycznej natężenie i częstotliwość światła muszą być dostosowane do narzędzia optogenetycznego oraz badanego typu neuronów. Należy stosować jak najniższe natężenie światła, aby uniknąć uszkodzenia tkanki, ponieważ liczne badania wykazały możliwość wystąpienia efektów cieplnych przy dużym natężeniu światła^8,20. Dla ChR2 powszechnie stosuje się stymulację o częstotliwości 20 Hz z impulsem świetlnym trwającym 5 ms². Ze względu na wysoką światłoczułość ChR2 wystarczające jest natężenie światła 1 mW. Protokół stymulacji świetlnej polega na naprzemiennym przeprowadzaniu prób z włączonym i wyłączonym światłem, aby bezpośrednio zmierzyć zmiany w zachowaniu. Zewnętrzne warunki w pomieszczeniu podczas eksperymentów behawioralnych powinny pozostać stabilne dla całej grupy zwierząt. Ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, są: hałas (należy pamiętać, że same urządzenia mogą generować dźwięki), zapach (układy behawioralne należy zawsze czyścić etanolem), natężenie światła oraz osoba przeprowadzająca badanie. Eksperymenty powinien zawsze przeprowadzać ta sama osoba. Ponadto pora dnia, w której odbywają się doświadczenia, powinna być taka sama dla wszystkich zwierząt w jednej grupie; preferowane jest kilka godzin po rozpoczęciu fazy ciemnej w pomieszczeniu dla zwierząt.

Celem niniejszego eksperymentu jest zwiększenie stosunku pobudzenia do hamowania (E/I) w obszarze IL poprzez silną aktywację pobudzających neuronów piramidowych. Wiadomo, że podwyższony stosunek E/I w tym szczególnym obszarze kory zwiększa poziom lęku u myszy^40,42,43,44.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalny ośrodek badań nad zwierzętami oraz „Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz” na Uniwersytecie w Bremie (#146)

1. Przygotowanie implantu optycznego⁹ (Rycina 1C)

1. Umieść ceramiczną tulejkę płaską stroną do góry w imadle warsztatowym.
2. Zdejmij izolację z włókna szklanego o średnicy 200 µm za pomocą ściągacza do światłowodów i odetnij kawałki o długości 2-3 cm przy użyciu ceramicznego nacinacza do włókien.
3. Wsuń kawałek włókna szklanego do ceramicznej tulejki tak, aby wystawał równomiernie z obu stron.
4. Nanieś kroplę superglue na płaską stronę ceramicznej tulejki za pomocą kaniuli wstrzykiwacza.
   UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
5. Wyjmij preimplant z imadła warsztatowego i od strony zaokrąglonej ceramicznej tulejki odetnij włókno szklane tak krótko, jak to możliwe, używając ceramicznego nacinacza do włókien.
6. Umieść preimplant w uchwycie do polerowania tulejek i poleruj stronę zaokrągloną na 4 różnych papierach ściernych, kreśląc ósemkę 20 razy na każdym papierze (ziarnistość 30 µm, 6 µm, 1 µm, a na koniec 0.02 µm).
7. Wyjmij preimplant z uchwytu do polerowania tulejek i odetnij włókno szklane po płaskiej stronie ceramicznej tulejki do długości wymaganej do implantacji. Pomiar długości rozpocznij za wystającym superglue.
   1. Aby uzyskać równą powierzchnię cięcia, nacinaj włókno szklane 2-3 razy, a następnie je przełam.
      UWAGA: Do obliczenia długości implantu należy użyć atlasu mózgu myszy autorstwa Paxinos i Franklin⁴⁵. Implant musi kończyć się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, a w obliczeniach długości należy uwzględnić grubość czaszki. Aby stymulować obszar IL, włókno szklane powinno mieć długość 1.8 mm (Rysunek 3).

Rycina 3: Atlas mózgu myszy (Paxinos i Franklin) z reprezentatywną długością implantu umożliwiającą dotarcie do obszaru IL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

8. Zdezynfekuj gotowy implant w etanolu przez 10 minut i pozostaw do wyschnięcia przed implantacją.

2. Iniekcja i implantacja

1. Przenieś pojedynczą mysz do sali operacyjnej i zważ ją. Podaj znieczulenie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) Ketaminy/Ksylazyny (Ketamina 0.12 mg/g, Ksylazyna 0.01 mg/g).
   1. Ustabilizuj mysz lewą ręką i odwróć ją na grzbiet, trzymając głowę nisko.
   2. Skieruj strzykawkę w lewy dolny kwadrant brzucha i wprowadź kaniulę do iniekcji 1 cm pod skórę.
   3. Wstrzyknij środek znieczulający powolnym i jednostajnym ruchem do jamy brzusznej.
   4. Umieść mysz z powrotem w klatce i poczekaj, aż osiągnie stan głębokiej narkozy.
      UWAGA: Głębokość znieczulenia można określić na podstawie braku mrugania oraz braku odruchów między palcami stóp.
2. Umieść mysz na płycie grzejnej i unieruchom głowę w uchwycie stereotaktycznym. Zafiksuj nos i zęby z przodu oraz uszy po obu stronach.
   UWAGA: Głowa musi być ustawiona prosto w osiach lewo-prawo oraz rostralno-kaudalnej, aby zapewnić prawidłowe współrzędne stereotaktyczne.
3. Podaj leki przeciwbólowe w postaci 2 mg/kg Karprofenu podskórnie w grzbiet myszy i nałóż nieprzezroczystą maść do oczu na oba oczy, aby chronić je przed wyschnięciem.
4. Zwilż sierść na skórze głowy mokrym ręcznikiem papierowym, a następnie usuń ją za pomocą nożyczek. Upewnij się, że wszystkie luźne włosy zostały usunięte za pomocą mokrego ręcznika papierowego. Aby zdezynfekować skórę głowy, użyj patyczka higienicznego, pobierz 0.5 mL nalewki zawierającej jod (Betaisodona 100 mg/mL jodyny povidonu i 11 mg/mL jodu) i pozostaw do wyschnięcia.
   UWAGA: Zamiast nożyczek do prawidłowego usunięcia sierści można użyć strzyżarki elektrycznej.
5. Unieś skórę głowy nad obszarem zainteresowania za pomocą pęsety i wykonaj nacięcie o długości 1 cm wzdłuż linii środkowej. Użyj dwóch pęset, aby odsunąć skórę i odsłonić czaszkę. Pamiętaj, aby usunąć również cienką warstwę skóry nad czaszką i pozostaw odsłoniętą czaszkę do wyschnięcia.
6. Zmatow czaszkę przed planowaną implantacją.
   1. Nałóż kroplę kwasu fosforowego (37%) o rozmiarach 2 mm x 2 mm z zestawu do adhezji (np. Optibond) na czaszkę, rozprowadź ją końcówką strzykawki i pozostaw na 15 s.
   2. Usuń cały kwas za pomocą patyczka higienicznego i dwukrotnie przemyj czaszkę 1 mL 0.9% NaCl.
   3. Osusz czaszkę patyczkiem higienicznym i sprężonym powietrzem.
      Uwaga: Kwas fosforowy jest niebezpieczny i musi zostać całkowicie usunięty, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
7. Oblicz współczynnik F (F-Factor) dla indywidualnych współrzędnych.
   1. Umieść kaniulę szklaną w uchwycie stereotaktycznym i zlokalizuj ją bezpośrednio nad bregma.
   2. Wyzeruj układ współrzędnych i przesuń kaniulę szklaną do lambda.
   3. Oblicz współczynnik F⁴⁶ za pomocą następującego wzoru:
      
   4. Pomnóż współczynnik F przez współrzędne z atlasu mózgu myszy, aby dostosować je do konkretnej myszy.
8. Wywierć otwór w czaszce do iniekcji.
   1. Używając skorygowanych współrzędnych, znajdź miejsce na czaszce bezpośrednio nad interesującą strukturą i zaznacz je końcówką kaniuli do iniekcji, wykonując zadrapanie na powierzchni kości.
   2. Użyj kaniuli do iniekcji, aby wywiercić otwór w czaszce w zaznaczonym miejscu, obracając kaniulę w punkcie. Jeśli z otworu wycieknie krew, przemyj go 1 mL 0.9% NaCl, a następnie osusz czaszkę.
9. Pobierz roztwór wirusa do kaniuli szklanej.
   1. Nałóż kroplę 100 µL 0.9% NaCl na czaszkę, a na wierzch kawałek parafilmu (1 cm x 1 cm) stroną sterylną do góry.
   2. Nałóż 1-2 µL roztworu wirusa na parafilm i opuść do niego końcówkę kaniuli szklanej.
   3. Podłącz kaniulę szklaną do strzykawki, zastosuj minimalne podciśnienie i poczekaj, aż roztwór wirusa zostanie zassany do kaniuli (w ciągu kilku sekund).
      UWAGA: Ważne jest, aby przerwać stosowanie podciśnienia, zanim do kaniuli dostanie się powietrze. W związku z tym zawsze pozostanie niewielka ilość roztworu wirusa.
10. Wstrzyknij roztwór wirusa do obszaru zainteresowania.
    1. Umieść wypełnioną wirusem kaniulę szklaną nad otworem trepanacyjnym.
    2. Powoli opuszczaj kaniulę do otworu i wyzeruj współrzędną z, gdy końcówka kaniuli znajdzie się na poziomie czaszki.
    3. Ostrożnie opuść kaniulę do najniższej pozycji w miejscu iniekcji.
    4. Ustaw ostrość binokularu na menisku roztworu wirusa wewnątrz kaniuli.
    5. Zastosuj niewielkie nadciśnienie za pomocą strzykawki, aż menisk nieznacznie opadnie.
    6. Pozostaw wirusa do rozprzestrzenienia się przez 2-3 min przed przesunięciem kaniuli szklanej w górę do kolejnej pozycji.
    7. Podawaj roztwór wirusa co 200-300 µm w całym obszarze zainteresowania.
    8. Bardzo powoli wyjmij kaniulę szklaną i wyrzuć ją po ostatniej iniekcji.
11. Przygotuj czaszkę do implantacji za pomocą zestawu do adhezji (np. Optibond^TMFL).
    1. Osusz czaszkę sprężonym powietrzem.
    2. Nałóż 5 µL primeru (np. Optibond, 1-30% (etanol, kwas krzemowy, glicerynofosforodimetakrylan, kwas 2-(2-(metakryloyloxy)etoksykarbonylo)benzoesowy, 2-hydroksyetylometakrylan)) za pomocą odpowiedniego aplikatora i pozostaw do wyschnięcia na 15 s.
    3. Nałóż 5 µL spoiwa (np. Optibond, 15-20% 2-hydroksyetylometakrylan + 1-2% heksafluorokrzemian sodu) tym samym aplikatorem i utwardź przez 20 s światłem UV (420-480 nm).
       UWAGA: Niezbędne jest, aby czaszka była sucha, a primer i spoiwo zostały nałożone bardzo cienką warstwą.
       Uwaga: Nie patrz bezpośrednio w światło UV, ponieważ może ono uszkodzić oczy.
12. Ustaw implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania.
    1. Ustabilizuj implant w odpowiednim uchwycie.
    2. Osusz czaszkę sprężonym powietrzem.
    3. Ustaw końcówkę włókna szklanego bezpośrednio nad otworem trepanacyjnym i ostrożnie ją opuść.
    4. Przestań opuszczać implant, gdy pozostała kropla superglue dotknie czaszki. Nie wywieraj nacisku na czaszkę!
       UWAGA: Jeśli iniekcja i implantacja są wykonywane w różnych obszarach (np. jądro szwu grzbietowego i hipokamp), wywierć wszystkie niezbędne otwory po zastosowaniu kwasu fosforowego, ale przed dwuskładnikową adhezją, a następnie postępuj zgodnie z wcześniej opisanymi instrukcjami (kroki 2.8-2.14).
13. Zafiksuj implant.
    1. Sprawdź, czy czaszka jest nadal całkowicie sucha.
    2. Nałóż płynny cement stomatologiczny (np. Gradia direct flo) wokół implantu i w obszarze go otaczającym, a następnie utwardź przez 20 s światłem UV (420-480 nm).
       UWAGA: Ilość cementu stomatologicznego zależy od wolnej powierzchni czaszki. Cała czaszka powinna być pokryta cementem stomatologicznym.
    3. Nałóż dwie kolejne warstwy cementu i całkowicie wypełnij wolny i osuszony obszar czaszki. Utwardzaj każdą warstwę światłem UV (420-480 nm).
14. Zakończ zabieg chirurgiczny.
    1. Nałóż 0.5 g maści jodowej (Betaisodona 100 mg/mL jodyny povidonu i 11 mg/mL jodu) na całą ranę.
    2. Wstrzyknij podskórnie w szyję 0.1 mL glukozy rozpuszczonej w 0.9% NaCl w celu przyspieszenia rekonwalescencji.
    3. Zwolnij mocowanie nosa i uszu, przenieś mysz do świeżej klatki i umieść ją pod lampą grzewczą, aby zapobiec utracie ciepła z organizmu.
    4. Gdy mysz się obudzi, przenieś ją z powrotem do pomieszczenia hodowlanego.
    5. Sprawdzaj stan zdrowia zwierzęcia co najmniej raz dziennie. Podejmij odpowiednie działania, jeśli myszy wykazują oznaki złego stanu zdrowia (np. zapewnij pooperacyjną analgezję Karprofenem do 3 dni, jeśli myszy wykazują jakiekolwiek oznaki bólu).
       UWAGA: Po dwóch tygodniach rekonwalescencji myszy mogą być wykorzystane w eksperymentach behawioralnych.

3. Konfiguracja nowego eksperymentu (Przykład stymulacji ChR2 i testu Open Field)

1. Pulser
   1. Zaprogramuj pulser (np. Prizmatix) do stymulacji światłem.
   2. Otwórz oprogramowanie i wybierz port USB COM, do którego podłączone jest źródło światła.
   3. Wybierz Select Operation Mode (3) | Execute pulse sequence after trigger HIGH, then stop when LOW, aby umożliwić zewnętrznemu oprogramowaniu sterowanie źródłem światła.
   4. Zaprogramuj protokół świetlny. Dla stymulacji 20 Hz z impulsem światła 5 ms: wybierz TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms oraz P2D = 0 ms.
   5. Naciśnij Start Sequence. Stan ten zostanie utrzymany do zakończenia eksperymentów.
      UWAGA: Oprogramowanie pulsera (Prizmatix Pulser) musi zostać uruchomione przed oprogramowaniem do śledzenia wideo; w przeciwnym razie oprogramowanie do śledzenia nie będzie w stanie rozpoznać urządzenia.
2. Oprogramowanie do śledzenia wideo (np. Ethovision XT)
   1. Utwórz nowy eksperyment z predefiniowanego szablonu.
      1. Otwórz oprogramowanie, przejdź do File, wybierz New from Template. Wybierz Apply a pre-defined template.
      2. Wybierz Live tracking i wskaż kamerę, klikając w Source, a następnie zatwierdź podłączoną kamerę Basler GenICam.
         UWAGA: Obraz na żywo z kamery zostanie teraz wyświetlony w oknie w prawym górnym rogu.
      3. Naciśnij Next i wybierz zwierzę, które ma być rejestrowane (Rodents, Mouse).
      4. Naciśnij Next i wybierz szablon areny Open Field, square. Wybierz szablon stref Center, Border, Corners i zatwierdź przyciskiem Next.
      5. Zatwierdź liczbę 1 subject do śledzenia przyciskiem Next.
      6. Wybierz Center-point, nose-point and tail-base i potwierdź przyciskiem Next, że kolor zwierzęcia w porównaniu z tłem jest ciemniejszy.
      7. Zatwierdź zalecaną częstotliwość próbkowania 12.5 przyciskiem Next i zakończ ten krok.
      8. Nadaj eksperymentowi odpowiednią nazwę i wybierz lokalizację zapisu.
   2. Zdefiniuj ustawienia eksperymentalne.
      1. Przejdź do Setup i Experimental Settings. Jako śledzone cechy (Tracked features) wybierz Center-point, nose-point and tail-base detection.
      2. Zaznacz Use of Trial Control Hardware i przejdź do Settings.
      3. Wybierz Noldus USB-IO box i zatwierdź przyciskiem Ok.
      4. Wybierz Custom Hardware jako typ urządzenia (Device Type) dla portu TTL, który został podłączony do pulsera, i zatwierdź przyciskiem Ok.
   3. Zdefiniuj ustawienia areny.
      1. Przejdź do Arena Settings i wybierz Arena Settings 1.
         UWAGA: Kamera automatycznie otworzy teraz obraz tła.
      2. Zatwierdź obraz przyciskiem Grab.
      3. Dostosuj predefiniowane strefy do rzeczywistej areny, zmieniając ich rozmiar. Użyj strzałki i dwóch symboli po jej prawej stronie. Jeśli niektóre strefy są niepotrzebne, usuń je.
      4. Naciśnij 1. Draw Scale to Calibrate i przeciągnij linię z jednego rogu labiryntu do drugiego. Wpisz rzeczywistą odległość w cm.
      5. Powtórz tę czynność dla drugiej osi.
   4. Sprawdź, czy stymulacja światłem działa.
      1. Przejdź do Arena - Hardware Mapping i wybierz Test na szarym pasku.
      2. Wybierz komendę Output 1 High i naciśnij Test.
         UWAGA: Z końca światłowodu powinno wydobywać się światło. Po wybraniu Output 1 Low i Test stymulacja powinna zostać zatrzymana.
   5. Zdefiniuj ustawienia kontroli prób dla 20 minut eksperymentu. Ustaw próby Off1, On1, Off2 i On2 tak, aby każda trwała 5 minut.
      1. Przejdź do Trial Control Setting i wybierz Track duration 30 minutes.
      2. Przygotuj główną regułę, dostosowując Condition: Time do 20 minut poprzez wybranie Settings i zmianę wartości 30 na 20 minut. Zatwierdź przyciskiem Ok.
         UWAGA: Warunek rozpoczęcia śledzenia (start track) powinien brzmieć when subject is in arena for 2 seconds. W ten sposób system automatycznie rozpocznie śledzenie, gdy mysz znajdzie się w arenie.
      3. Utwórz podregułę dla stymulacji światłem: przejdź do Structures, more i wybierz Sub-rule.
      4. Nadaj jej nazwę, np. light stimulation protocol.
      5. Umieść ją poniżej głównej reguły i rozsuń dwa pola, zaznaczając niebieski obszar kursorem myszy.
      6. Przejdź do Conditions, Time i nadaj jej nazwę, np. light on 1.
      7. Ustaw warunek spełnienia (Condition is met) na after 5 minutes. Zatwierdź przyciskiem Ok.
      8. Umieść pole bezpośrednio za polem Rule Begin podreguły, przeciągając je do czarnej linii.
      9. Przejdź do Action | Custom Hardware i nazwij je: light ON 1.
      10. Wybierz akcję do wykonania (Action to perform) jako Output 1 High i zatwierdź przyciskiem Ok.
      11. Umieść pole bezpośrednio za polem Condition.
          UWAGA: Teraz po 5 minutach eksperymentu powinna rozpocząć się stymulacja światłem.
      12. Powtórz kroki, aby zdefiniować warunek czasowy After 5 minutes oraz akcję Output 1 Low, aby zatrzymać stymulację światłem po kolejnych 5 minutach.
      13. Powtórz kroki ponownie, aby zaprogramować kolejną próbę wyłączenia i włączenia światła.
      14. Przejdź do Structures | Sub-rule reference i sprawdź, czy odniesienie należy do poprawnej podreguły.
      15. Wybierz Start conditions jako Without delay oraz Stop conditions jako Execute once per start condition. Zatwierdź przyciskiem Ok.
      16. Umieść pole odniesienia między polem akcji 1 a polem warunku 2 głównej reguły i narysuj linię od Action - start track do Reference.
          UWAGA: Teraz główna reguła bezpośrednio uruchamia podregułę po rozpoczęciu śledzenia.
   6. Zdefiniuj ustawienia detekcji, aby wskazać systemowi, co ma śledzić.
      1. Przejdź do Detection settings i wybierz Detection settings 1.
      2. Umieść mysz testową w arenie i wybierz Automated Setup.
      3. Wybierz Rodent jako typ zwierzęcia i użyj kursora myszy, aby narysować ramkę wokół myszy w arenie. Odpowiedz Yes na pytanie Results OK?.
   7. Zdefiniuj listę prób dla wszystkich zwierząt eksperymentalnych, które mają być śledzone.
      1. Przejdź do Trial List i zaplanuj wszystkie zwierzęta do rejestracji w dniu dzisiejszym: wybierz add trials i wskaż liczbę.
      2. Wybierz wszystkie wcześniej zdefiniowane warunki dla każdej myszy.
      3. Poprawnie nazwij Animal-ID oraz Treatment, aby ułatwić późniejszą analizę.
         UWAGA: Animal-ID jest nieistotny dla systemu i ważny jedynie dla eksperymentatora podczas późniejszej analizy danych. Grupowanie w Treatment i Control group jest istotne, aby system wiedział, jak grupować i porównywać wszystkie ścieżki w późniejszych etapach analizy.
   8. Przejdź do Acquisition i rozpocznij eksperyment.

4. Eksperyment w otwartym polu (lęk)

1. Przenieś mysz doświadczalną do pomieszczenia behawioralnego bezpośrednio przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiedni poziom lęku.
   UWAGA: Eksperymenty behawioralne należy przeprowadzać w fazie ciemnej, gdy myszy są aktywne, i zawsze w tym samym przedziale czasowym, aby zapewnić porównywalność wyników.
2. Połącz mysz z źródłem światła za pomocą tulei, delikatnie dociskając ją do kraty klatki.
3. Umieść mysz w klatce oczekującej ze świeżą ściółką na 10 min, aby mogła zaaklimatyzować się do kabla światłowodowego.
4. Rozpocznij akwizycję danych, naciskając przycisk Start w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT).
5. Przenieś mysz z klatki oczekującej w lewy górny róg otwartego pola. Usuń rękę w ciągu 2 sekund, aby uniknąć śledzenia ramienia zamiast myszy.
6. W czasie trwania eksperymentu pozostaw pole widzenia myszy i zachowaj spokój.
7. Po 20 minutach, po zakończeniu eksperymentu, usuń mysz z labiryntu, odłącz kabel światłowodowy i umieść zwierzę z powrotem w jego klatce domowej.
8. Zabierz mysz z powrotem do pomieszczenia hodowlanego.

5. Labirynt Barnesa (uczenie się)

1. Przenieś wszystkie myszy doświadczalne do pomieszczenia behawioralnego około 1 godziny przed eksperymentem.
2. Przygotuj labirynt Barnesa, zamykając wszystkie otwory poza jednym, pod którym znajduje się skrzynka ucieczkowa. Umieść tekturową ściankę na środku platformy, która będzie stanowić obszar startowy dla myszy.
3. Podłącz obie implanty u jednej myszy do źródła światła (tulejka na kablu światłowodowym).
4. Umieść mysz bezpośrednio na środku labiryntu Barnesa w obrębie tekturowej ścianki, która zapobiega bieganiu myszy przed rozpoczęciem eksperymentu.
5. Naciśnij Start w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT) i usuń tekturę.
   UWAGA: Oprogramowanie śledzi mysz aż do momentu dotarcia do właściwego otworu, jednak należy być przygotowanym do ręcznego zatrzymania próby na wypadek, gdyby oprogramowanie nie rozpoznało przejścia przez otwór.
6. Wyjmij mysz z labiryntu i odłącz kabel światłowodowy.
   UWAGA: Jeśli jest to dzień treningowy z kilkoma próbami na mysz, pozostaw mysz w poczekalni obok pomieszczenia behawioralnego do rozpoczęcia kolejnej sesji treningowej. Jeśli był to dzień testowy z tylko jedną próbą testową na mysz, przenieś mysz z powrotem do pomieszczenia hodowlanego.

6. Analiza danych (Przykład danych z testu otwartego pola z 4 rozróżnialnymi próbami)

1. Oprogramowanie do wideotrackingu (np. Ethovision XT)
   1. Zdefiniowanie grup eksperymentalnych i prób w profilu danych.
      1. Przejdź do sekcji Data Profiles (Profile danych) po lewej stronie i wybierz Treated vs. Control (Grupa traktowana vs. kontrolna).
      2. Przejdź do sekcji Nesting (Gniazdowanie) w nowym oknie pośrodku po lewej stronie i wybierz Trial control state (Stan kontrolny próby).
      3. Wybierz interwał stanu od elementu Action: start Track (Akcja: start trackingu) do elementu Action: light goes ON 1 (Akcja: światło włącza się 1).
      4. Umieść pole Nesting pomiędzy polem filtra Treatment (Traktowanie) a odpowiednim polem wyników.
         UWAGA: Zdefiniowany w ten sposób interwał to Off1, który opisuje pierwsze 2,5 minuty eksperymentu, podczas których nie występuje stymulacja światłem.
      5. Powtórz kroki dla interwałów On1 (od elementu Action: light goes on 1 do elementu Action: light goes out 1), Off2 (od elementu Action: light goes out 1 do elementu light goes on 2) oraz On2 (od elementu Action: light goes on 2 do elementu Action: stop track).
      6. Powtórz definiowanie 4 interwałów dla grupy filtra kontrolnego.
         UWAGA: Każde pole nesting wymaga własnego pola wyników o nazwach Off1, On1, Off2, On2. W ten sposób zarówno grupa traktowana, jak i kontrolna są podzielone na 4 różne próby stymulacji światłem, które są analizowane oddzielnie.
   2. Zdefiniowanie parametrów do analizy w profilu analizy.
      1. Przejdź do sekcji Analysis Profiles (Profile analizy) po lewej stronie i wybierz In zones (W strefach).
      2. Wybierz zmienną zależną In Zone (W strefie) i zaznacz Center (Centrum) jako strefę.
      3. Kliknij dwukrotnie w In center (W centrum), wybierz dowolny z zaznaczonych punktów i zaznacz tylko in center.
      4. Przed zamknięciem okna przejdź do Trial Statistics (Statystyki próby) i wybierz Frequency (Częstotliwość), Cumulative duration (Czas trwania skumulowany) oraz Latency to first (Latencja do pierwszego wejścia).
      5. Dodaj zmienną zależną Distance moved (Przebyta odległość).
         UWAGA: W sekcji Group Statistics (Statystyki grupowe) wybierz, czy jako błąd użyć błędu standardowego, czy odchylenia standardowego. Dzięki temu profilowi dostępne są dane dotyczące Time spent in the center (Czas spędzony w centrum), Center entries (Liczba wejść do centrum) oraz Total distance moved (Całkowita przebyta odległość).
   3. Ekstrakcja danych
      1. Przejdź do sekcji Results (Wyniki) i wybierz Statistics and Charts (Statystyki i wykresy).
      2. Naciśnij Calculate (Oblicz), aby wyświetlić przeanalizowane dane.
         UWAGA: Statystyki próby dostarczają informacji o każdej pojedynczej myszy, a statystyki grupowe analizują średnią i błąd dla obu grup, z podziałem na 4 próby wraz z odpowiadającym im wykresem słupkowym.
      3. Naciśnij Export data (Eksportuj dane), wybierz statystyki próby oraz lokalizację zapisu.
         UWAGA: Eksportowane dane są zapisywane jako plik Excel z indywidualnymi wartościami dla każdej myszy. W tym pliku Excel identyfikator Animal-ID pomaga w rozpoznaniu myszy.
      4. Przejdź do Heatmap Visualization (Wizualizacja map ciepła) i naciśnij Plot Heatmaps (Wykreśl mapy ciepła).
      5. Wybierz Trials (Próby) po prawej stronie, aby zobaczyć indywidualne mapy ciepła dla każdej myszy i próby.
      6. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i wyeksportuj mapy ciepła jako obrazy.
2. Wykresy
   1. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego na komputerze i oblicz średnie oraz błędy standardowe (SEM) dla wszystkich 4 prób w każdym mierzonym warunku i grupie.
   2. Wygeneruj wykresy w programie statystycznym (np. Sigma Plot).
      1. Skopiuj średnie i SEM w odpowiedniej kolejności z pliku arkusza do programu Sigma Plot. Wiersze muszą zawierać dane dla Off1, On1 itd., a kolumny powinny mieć nagłówki: trial (próba), mean (średnia) i SEM.
      2. Zaznacz wszystkie trzy kolumny i przejdź do Create Graph (Utwórz wykres).
      3. Wybierz pole Bar (Słupkowy) i wybierz niezgrupowane słupki z błędem (górny rząd, trzecie pole).
      4. Zatwierdź przyciskiem Finish (Zakończ), aby otworzyć nową stronę wykresu.
      5. Oznacz cały wykres, następnie przejdź do sekcji Home (Start), wybierz pole Graph (Wykres) po lewej stronie i naciśnij Export (Eksportuj). Wybierz folder docelowy i wybierz format MetaFile (*.wmf).
         UWAGA: Format .wmf może być później obrabiany w oprogramowaniu graficznym, takim jak CorelDraw.
   3. Oblicz statystyki dla uzyskanych danych.
      1. Skopiuj surowe dane z arkusza (Off1, On1 itd.) do pojedynczych kolumn w programie Sigma Plot.
      2. Zaznacz kolumny do porównania, przejdź do sekcji Analysis (Analiza), wybierz t-test i naciśnij Run (Uruchom).
      3. Zatwierdź format danych Raw (Surowe) przyciskiem Next (Dalej) i uruchom test przyciskiem Finish (Zakończ).

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest pomiar zmian w zachowaniu myszy modyfikowanych genetycznie podczas eksperymentu optogenetycznego. Manipulacja optogenetyczna jest przeprowadzana poprzez wstrzyknięcie wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom. Stymulacja światłem u swobodnie poruszających się myszy jest możliwa dzięki implantacji światłowodu bezpośrednio nad obszarem zainteresowania.

Na Rysunku 4 przedstawiono wyniki eksperymentu optogenetycznego. Silna aktywacja pobudzających neuronów piramidowych w obszarze IL za pomocą ChR2 zwiększyła zachowania związane z lękiem w teście Open Field. ChR2 wstrzyknięto do obszaru IL w obrębie mPFC u myszy Nex-Cre w celu ekspresji w neuronach piramidowych (Rysunek 4A). Podczas dwóch testów lękowych: Open Field (Rysunek 4B,C) oraz testu Novelty-Suppressed Feeding (Rysunek 4F,G), ChR2 jest stymulowany niebieskim światłem, co aktywuje neurony piramidowe. W ramach kontroli inna grupa myszy otrzymała wstrzyknięcie fluoroforu tdTomato zamiast ChR2 (Rysunek 4D,G). W takim eksperymencie lęk definiuje się jako unikanie jaśniejszego obszaru centralnego. Myszy wykazują wrodzoną tendencję do unikania otwartych przestrzeni ze względu na lęk przed drapieżnikami.

W eksperymencie w otwartym polu (Open Field), przedstawionym na Rysunku 4B, myszy przeszły 4 próby po 5 minut każda. W próbach 1 i 3 nie stosowano stymulacji światłem (Off1,2), natomiast w próbach 2 i 4 przeprowadzono stymulację niebieskim światłem o częstotliwości 20 Hz (impuls świetlny 5 ms) i natężeniu 1 mW (On1,2). Mapy ciepła pokazują, że w grupie eksperymentalnej czas przebywania w centrum różnił się pomiędzy próbami Off a On. Podczas stymulacji światłem myszy preferencyjnie pozostawały w strefie brzeżnej. Zwierzęta kontrolne również preferowały obrzeża, ale nie zmieniały swojego zachowania pod wpływem stymulacji światłem. Na Rysunku 4C przedstawiono główne pomiary behawioralne podczas eksperymentu w otwartym polu dla grupy eksperymentalnej. Jeśli dane przeszły test Shapiro-Wilka na normalność rozkładu, analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą niezależnego dwustronnego testu t. W przypadku braku normalności rozkładu zastosowano test sum rang Manna-Whitneya jako nieparametryczną alternatywę. W tego typu eksperymentach wybrano porównanie wewnątrzgrupową, aby zbadać, czy stymulacja światłem może bezpośrednio zmienić zachowania lękowe w czasie, niezależnie od wyjściowego poziomu lęku zwierząt w grupie eksperymentalnej i kontrolnej. Czas przebywania w centrum uległ znacznącemu skróceniu podczas obu prób stymulacji światłem, co wskazuje na zwiększony poziom lęku. Całkowity dystans nie uległ zmianie, co pokazuje, że zachowanie lokomotoryczne nie zostało zaburzone. Liczba wejść do centrum wzrosła, choć nie w sposób istotny. Na Rysunku 4D przedstawiono dane grupy kontrolnej. Zwierzęta kontrolne nie wykazały żadnych zmian behawioralnych pomiędzy próbami Off a On w żadnym z analizowanych parametrów, co dowodzi, że stymulacja światłem ani implantacja nie wywołały zaobserwowanych efektów. Podsumowując, test ten wykazuje zwiększony lęk podczas stymulacji światłem neuronów piramidalnych IL za pomocą ChR2.

Na Rysunku 5 przedstawiono dane z nieudanego eksperymentu optogenetycznego z wykorzystaniem krzyżowego labiryntu wzniesionego (Elevated-Plus Maze). Podczas eksperymentu w labiryncie, zaprezentowanego na Rysunku 5A, myszy przeszły 6 prób po 3 minuty każda. W próbach 1, 3 i 5 nie stosowano stymulacji światłem (Off1, Off2, Off3), a w próbach 2, 4 i 6 przeprowadzono stymulację światłem niebieskim o częstotliwości 20 Hz (impuls świetlny 5 ms) i intensywności 1 mW (On1, On2, On3). W tych przykładowych wynikach długość protokołu optogenetycznego oraz sama konstrukcja labiryntu nie były odpowiednie dla zastosowanej linii myszy transgenicznych. Na Rysunku 5B widać, że kilka myszy ześlizgnęło się z labiryntu tylnymi łapami lub nawet z niego spadło. W takich przypadkach myszy otrzymywały drugą szansę na wykonanie próby w EPM dzień później. Jeśli spadły ponownie, były wykluczane z analizy. W sytuacjach, gdy myszy ześlizgiwały się kilkakrotnie, ale zdołały pozostać w labiryncie, dane analizowano w zwykły sposób. Niemniej jednak dane te muszą być interpretowane bardzo ostrożnie, a zwierzęta kontrolne nabierają większego znaczenia. Myszy Nex-Cre miały trudności motoryczne z utrzymaniem się na wąskich otwartych ramionach. Aby tego uniknąć, pomocne byłyby niskie ścianki o wysokości 1 cm, zapewniające pewniejszy chwyt tylnych łap na ramionach labiryntu. Zarówno mapy ciepła, jak i wykresy pokazują, że myszy doświadczalne oraz kontrolne zaczęły unikać otwartych ramion od próby 2 (On1) (Rysunek 5C-E). Czas spędzony na otwartych ramionach uległ znacznemu skróceniu w obu grupach, podobnie jak liczba wejść na otwarte ramiona. Analiza wyłącznie grupy doświadczalnej dostarczyła danych sugerujących silny efekt anksjogenny stymulacji światłem, ponieważ czas przebywania na otwartym ramieniu oraz liczba wejść na nie uległy znacznemu zmniejszeniu podczas próby On1. Jednakże po porównaniu tych danych z grupą kontrolną, która wykazała takie samo zachowanie, staje się jasne, że zaobserwowane zachowanie nie jest wywoływane przez stymulację optogenetyczną, lecz przez ogólne unikanie otwartych ramion wynikające z habituacji do labiryntu. Dane te podkreślają znaczenie odpowiedniej grupy kontrolnej w celu odróżnienia efektów behawioralnych wywołanych stymulacją optogenetyczną od możliwej adaptacji behawioralnej. Ponadto dane te rzucają światło na wagę właściwego dostosowania układu eksperymentalnego do konkretnej linii myszy i pytania badawczego.

Aby zweryfikować i wzmocnić zgromadzone dane behawioralne, po ostatnim eksperymencie pobiera się mózgi myszy w celu sprawdzenia poprawności iniekcji oraz implantacji (Rycina 6). Mózgi utrwala się w 4% paraformaldehydzie, a następnie usuwa z czaszki. Mózgi odwadnia się w 30% sacharozie przez 1-2 dni, po czym wykonuje się kriosekcje. Koronalne skrawki mózgu o grubości 40 µm są płukane i montowane na szkiełkach przedmiotowych superfrost przy użyciu medium montującego zawierającego DAPI, który barwi jądra komórkowe. Umożliwia to identyfikację obszarów docelowych w skrawkach koronalnych. Fluorescencja znacznika YFP lub samego tdTomato wskazuje miejsce iniekcji wirusa. Na Rycini 6B przedstawiono przykładowe miejsca iniekcji ChR2-YFP po lewej stronie (żółty) oraz tdTomato po prawej stronie (czerwony). Za pomocą szablonu opracowanego na podstawie atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin⁴⁵ można zidentyfikować obszar IL. Na obu szkiełkach narzędzie optogenetyczne wykazuje ekspresję w obszarze IL, ale również w sąsiadujących obszarach mózgu. W celu prawidłowej interpretacji analizuje się rozchodzenie się niebieskiego światła w tkance mózgowej⁸ (Rycina 1D,E). Można zauważyć, że niebieskie światło dociera do obszaru DP poniżej IL z natężeniem wynoszącym mniej niż 5% początkowej wartości 1 mW na końcówce światłowodu (linia niebieska na Rycini 1D)⁸. Dodatkowo, ze względu na rozproszenie wsteczne, niewielka ilość światła może przedostać się w górę do obszaru PrL⁴⁷. W związku z tym można stwierdzić, że obszar IL jest oświetlony najsilniej, jednak obszary sąsiadujące, takie jak DP i PrL, mogą być również lekko stymulowane. Zatem stymulacja specyficzna dla komórek IL nie jest gwarantowana i należy przeprowadzić analizę immunohistochemiczną sąsiednich obszarów, aby sprawdzić, czy aktywność komórek PrL i DP jest modulowana za pomocą światła. Na Rycini 6C pokazano kolejną ważną kontrolę: specyficzność linii myszy Nex-Cre. Dzięki barwieniu przeciwciałami przeciwko dwóm typom komórek w obszarze IL – neuronom głównym glutaminergicznym oraz interneuronom GABAergicznym – można zauważyć, że ekspresja ChR2-YFP występuje tylko w neuronach glutaminergicznych, a nie w GABAergicznych.

Podsumowując, nasze eksperymenty wykazują, że dzięki manipulacjom optogenetycznym podczas testów behawioralnych można zaobserwować zmiany w zachowaniach związanych z lękiem. Zastosowanie więcej niż jednego testu dla tego samego zachowania pozwala na wyciągnięcie wiarygodnych wniosków. Dodatkowo analiza immunohistochemiczna potwierdza uzyskane dane. Nasze eksperymenty sugerują, że specyficzna aktywacja neuronów piramidowych w korze podlimbicznej zwiększyła zachowania związane z lękiem w niektórych testach.

Rycina 4: Optogenetyczna aktywacja neuronów piramidalnych IL zwiększa zachowania lękowe. Stymulacja światłem podczas eksperymentów: 473 nm, 1 mW, stymulacja 20 Hz. A) Schemat miejsca iniekcji i implantacji ChR2-YFP lub tdTomato do IL. Podczas eksperymentu neurony piramidalne w obszarze IL mPFC są aktywowane przez ChR2. Przekroje mózgu w płaszczyźnie strzałkowej dostosowane do atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin, płaszczyzna strzałkowa: lateral 0,6. B) Labirynt Open Field z protokołem stymulacji światłem (20 min z 4x5 min naprzemiennych prób Off i On; po lewej) oraz mapy ciepła przykładowych myszy z iniekcją ChR2 (EXP) i tdTomato (CT) we wszystkich 4 próbach eksperymentu (po prawej). Zwierzęta EXP spędzają mniej czasu w centrum OF podczas stymulacji niebieskim światłem laserowym. W przypadku zwierząt CT czas spędzony w centrum nie różni się między próbami z wyłączonym (Off) i włączonym (On) światłem. C) Dane grupowe dla zwierząt EXP w OF, n=11. Myszy spędzają istotnie mniej czasu w centrum OF podczas stymulacji niebieskim światłem (Off1 39,49±6,9 s, On1 19,87±4,47 s, Off2 28,13±8,55 s, On2 23,42±9,32 s, Off1:On1, t-test, p = 0,033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Pokonany dystans nie uległ zmianie (Off1 2703,09±292,65 cm, On1 3113,4±491,15 cm, Off2 3331,86 ±482,62 cm, On2 3082,17±658,61 cm). Liczba wejść do centrum zmniejsza się z czasem, ale nie wykazuje istotnych różnic (Off 1 22,36±3,78, On1 18,45±3,95, Off2 17,36±1,99, On2 13,27±2,64). D) Dane grupowe dla zwierząt CT w OF, n=15. Czas spędzony przez myszy w centrum OF, pokonany dystans oraz liczba wejść do centrum nie zmieniają się między próbami z włączonym (On) i wyłączonym (Off) światłem (Czas w centrum Off1 16,73±2,65 s, On1 16,02±1,89 s, Off2 12,02±1,76 s, On2 13,04±2,58 s; Dystans Off1 3399,69±296,77 cm, On1 3210,6±446,9 cm, Off2 3030,28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; liczba wejść do centrum Off1 14,2±1,98, On1 13,6±2,02, Off2 10,8±1,88, On2 11,67±2,5). Myszy CT wykazują istotnie wyższy bazowy poziom lęku (Off1 EXP:CT, MWRS, p=0,005, **). Wartości przedstawiono jako średnia±S.E.M. * oznacza istotne różnice (p≤0,05), ** oznacza istotne różnice (p≤0,01). t-test zawsze dwustronny, MWRS: test suma rang Manna-Whitneya; IL: kora infralimbiczna; BLA: jądro boczno-podstawne ciała migdałowatego; DRN: jądra szwu grzbietowego; OF: Open Field; CT: zwierzęta kontrolne; EXP: zwierzęta eksperymentalne; L: światło. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ oraz Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Eksperyment EPM nie wykazał efektów behawioralnych u myszy Nex-Cre. Stymulacja światłem podczas eksperymentów: 473 nm, 1 mW, stymulacja 20 Hz. A) Labirynt z krzyżującymi się ramionami (Elevated-Plus Maze) z protokołem stymulacji światłem (18 min, 6x3 min, naprzemienne próby Off i On). B) Dane grupowe uwzględniają myszy, które „ześlizgnęły się” z labiryntu, całkowite n=23. Myszy Nex-Cre miały tendencję do ześlizgiwania się tylnymi łapami z otwartego ramienia, niezależnie od grupy eksperymentalnej (lewo). W późniejszych analizach uwzględniono tylko myszy, które pozostały w labiryncie przez wszystkie 6 prób. Ześlizgnięcia w pierwszej fazie Off1 są przyczyną późniejszego unikania otwartych ramion (Off1 EXP 1,63±0,6, CT 2,2±0,79, Off2+3 EXP 0,125±0,125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0,625±0,26, CT 0,1±0,1). Wykres kołowy (prawo) pokazuje, że 42,42% myszy spadło z labiryntu w ciągu 18 min. Tylko 57,57% ukończyło eksperyment. C) Mapy ciepła dla przykładowych myszy EXP i CT we wszystkich 6 próbach eksperymentu. Obie grupy wykazują skrócenie czasu przebywania w otwartych ramionach po próbie Off1. D) Dane grupowe dla zwierząt EXP w EPM, n=12. Czas spędzony w otwartych ramionach uległ znacznemu skróceniu podczas dwóch pierwszych prób, a następnie malał stale (Off1 73,91±12,22 s, On1 36,15±14,65 s, Off2 15,61±6,23 s, On2 19,49±7,51 s, Off3 9,36±4,44 s, On3 7,96±3,47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Dystans pokonany nie uległ zmianie (Off1 679,96±71,63 cm, On1 712,24±112,82 cm, Off2 717,49±97,39 cm, On2 782,51±81,11 cm, Off3 722,11±68,60 cm, On3 663,90±106,57 cm). Liczba wejść do otwartych ramion zmniejsza się znacząco od Off1 do On1, a następnie pozostaje stała (Off1 8,08±1,08, On1 3,33±0,76, Off2 2,16±0,69, On2 2,91±1,09, Off3 1,73±0,75, On3 1,73±0,66. Off1:On1, t-test, p=0,002, **). Czas spędzony w centrum EPM maleje w kolejnych próbach, ale nie wykazuje istotnych różnic między próbami Off a On (Off1 41,71±5,34 s, On1 31,2±4,59 s, Off2 19,8±3,44 s, On2 24,49±3,38 s, Off3 20,37±4,77 s, On3 18,85±4,07 s). E) Dane grupowe dla zwierząt CT w EPM, n=11. Dane CT wykazują te same istotne spadki co dane EXP, co wskazuje, że eksperyment nie przebiegł prawidłowo (Czas w otwartych ramionach Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18,01±11,61 s, On2 16,41±9,61 s, Off3 11,36±4,01 s, On3 5,43±2,07 s. Off1:On1, MWRS, p=0,009, **; Dystans Off1 705,11±88,36 cm, On1 789,45±77,53 cm, Off2 724,74±80,49 cm, On2 676,57±111,99 cm, Off3 716,99±132,47 cm, On3 663,03±132,46 cm; Wejścia do otwartych ramion Off1 7,09±1, On1 3,72±1,17, Off2 1,45±0,47, On2 1,36±0,58, Off3 0,91±0,43, Off3 1,64±0,59. Off1:On1, MWRS, p=0,01, *; Czas spędzony w centrum Off1 35,89 s, On1 29,25±3,96 s, Off2 22,17±3,58 s, On2 15,9±2,57 s, Off3 13,86±4,2 s, On3 16,89±5,75 s). Wartości przedstawiono jako średnia ± S.E.M. * oznacza istotne różnice (p≤0,05), ** oznacza istotne różnice (p≤0,01). T-test jest zawsze dwustronny, MWRS: test sum rang Mann-Whitneya; EPM: labirynt z krzyżującymi się ramionami; CT: zwierzęta kontrolne; EXP: zwierzęta eksperymentalne; OA: otwarte ramiona. Rysunek zmodyfikowano na podstawie Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ oraz Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Strona iniekcji ChR2 i tdTomato w obszarze IL oraz swoistość Nex-Cre. A) Schematyczny rysunek miejsca implantacji na koronarnych przekrojach mózgu przy AP + 1.66 mm, mL 0.3 mm, DV -1.8 mm, z jednostronną iniekcją i implantacją (adaptacja z atlasu mózgu myszy, Paxinos i Franklin, Bregma +1.54 mm). B) Przykładowe miejsca iniekcji ChR2-YFP (lewo, żółty) i tdTomato (prawo, czerwony) nałożone na jądra komórkowe barwione DAPI (niebieski) u myszy Nex-Cre. Pasek skali 1 mm. Wstawki przedstawiają duże powiększenie obszaru IL. Pasek skali 150 µm. Białe ramki wskazują położenie wstawek. C) Górny rząd: obrazy konfokalne lewego obszaru IL myszy Nex-Cre barwionej CamKII jako markerem neuronów glutaminergicznych (niebieski) oraz ChR2-YFP (żółty) lub Gad67 jako markerem neuronów GABAergicznych (zielony). Dolny rząd: kolokalizacja ChR2-YFP (żółty) z CamKII (lewo, niebieski), ale nie z Gad67 (prawo, zielony), co wykazuje swoistość myszy Nex-Cre względem neuronów glutaminergicznych. Pasek skali 50 µm. PrL: kora prelimbiczna; IL: kora infralimbiczna; DP: grzbietowa kora peduńczykowa. Rycina została zmodyfikowana na podstawie Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ oraz Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wykorzystanie światła do manipulowania sygnalizacją neuronalną jest metodą z wyboru już od prawie dekady. Od 2005 roku liczba opublikowanych artykułów na temat rozwoju nowych narzędzi optogenetycznych 4,6,8,14,49,50,51 oraz badań, w których takie narzędzia są wykorzystywane do badania obwodów mózgowych 21,23,40,43,52 , znacznie zwiększony. Z jednej strony, przy ogromnej różnorodności wstrzykiwanych narzędzi optogenetycznych, wariantów implantacji, transgenicznych linii myszy i eksperymentów behawioralnych, możliwości eksperymentów są wielorakie i nieograniczone. Z drugiej strony, możliwość popełnienia błędów w doborze warunków eksperymentalnych jest bardzo duża, a eksperymenty są na tyle specyficzne, że często trudno jest je porównać z innymi badaniami.

Kroki krytyczne
Jednym z ważnych krytycznych kroków tego protokołu jest właściwe planowanie. Wybór narzędzia optogenetycznego powinien być zgodny z pytaniem naukowym. Czy konieczne jest tylko manipulowanie ogólną aktywnością neuronu lub synapsy? W takim razie dobrym wyborem są komercyjnie dostarczane narzędzia, takie jak ChR2^21,25,27 i Arch³⁷. Ale poza tym, jeśli ma się manipulować jednym specjalnym układem neuroprzekaźników lub nawet pojedynczym receptorem, indywidualna chimera receptora jest często lepszym wyborem ^3,6. Kilka chimer receptorowych z GPCR, tzw. Opto-XR, oraz wytyczne do ich wytwarzania są już dostępne ^4,50. Oprócz wyboru narzędzi optogenetycznych, kluczowe znaczenie ma również linia myszy w połączeniu z eksperymentem behawioralnym. Różne szczepy tła, takie jak na przykład C57Bl/6 i BALB/cByJ, wykazują różne fenotypy behawioralne pod pewnymi względami^53,54. Myszy C57Bl / 6 mają niski wyjściowy lęk i mogą być używane do manipulacji przeciwlękowej, podczas gdy BALB / cByJ wykazują wyższy poziom lęku i dlatego są bardziej wrażliwe na leki przeciwlękowe. Dodatkowo, transgeniczne warianty tych szczepów tła mogą również różnić się fenotypem⁴⁸. Dzięki odpowiedniej kombinacji specyficznych promotorów w połączeniu z narzędziem optogenetycznym i transgeniczną linią myszy, prawie każda pożądana populacja komórek może być ukierunkowana.

Kluczowym krokiem podczas operacji jest celowanie we właściwe miejsce. Za pomocą atlasu mózgu myszy można ustalić właściwe współrzędne osi przednio-tylnej i przyśrodkowej-bocznej oraz głębokość struktury⁴⁵. W rzeczywistości każda czaszka ma nieco inną formę i wielkość. Dlatego współczynnik F⁴⁶ do regulacji współrzędnych stereotaktycznych jest bardzo ważny, podobnie jak prawidłowe mocowanie nosa i ucha podczas operacji stereotaktycznej. Jeśli głowa myszy jest przechylona, kaniula iniekcyjna nie będzie celować w żądany obszar zainteresowania.

Dodatkowo krytyczna jest również średnica kaniuli iniekcyjnej. Jeśli jest zbyt mały, żaden wirus nie może zostać uwolniony do tkanki, jeśli jest zbyt szeroki, kaniula wycieknie roztwór wirusa w drodze do obszaru zainteresowania. Jeśli wszczepiony światłowód kończy się bezpośrednio nad regionem docelowym, ekspresja wirusa w obszarach kory mózgowej powyżej nie ma znaczenia. Ale jeśli implant zostanie umieszczony nad innymi obszarami w celu stymulacji zakończeń aksonów, aksony górnych regionów kory również zostaną aktywowane przez światło i sfałszują uzyskane dane. Na przykład: Region IL i region przedlimbiczny (PrL) rzutują na ciało migdałowate^{podstawy 55,56}, ale mają zupełnie inne funkcje i role w modulacji lęku^26,57. Jeśli implant zostanie umieszczony powyżej ciała migdałowatego w celu aktywacji zakończeń aksonów z obszaru IL, a podczas iniekcji roztwór wirusa został również umieszczony w PrL z powodu niewłaściwej kaniuli iniekcyjnej, ryzyko aktywacji również końcówek aksonów z PrL jest bardzo wysokie.

Podczas przygotowania czaszki do zamocowania implantu, rzadkie użycie podkładu i spoiwa ma kluczowe znaczenie dla niezawodnego i trwałego mocowania. Jeśli 2-składnikowy system adhezyjny nie zostanie nałożony cienko, cement dentystyczny może oderwać się od czaszki po kilku dniach lub tygodniach. Ponadto czaszka musi być całkowicie wysuszona przed zamocowaniem implantu, ponieważ w przeciwnym razie cement nie przylgnie prawidłowo do czaszki.

Krytyczne kroki istnieją również w behawioralnej części tego protokołu. Po pierwsze, bardzo ważna jest budowa labiryntu. W każdym układzie behawioralnym istnieje kilka wariantów w literaturze dotyczącej wielkości i formy, a także samej procedury 58,59,60. Ważne jest, aby wybrać wariant, który sprawi, że dane będą porównywalne i powtarzalne. Należy również wziąć pod uwagę specjalne wymagania dotyczące używanych linii myszy^43,48. W danych reprezentatywnych dla EPM można zauważyć, że kilka myszy Nex-Cre wypadło z labiryntu lub kilkakrotnie się ześlizgnęło (ryc. 2b). Dla tych myszy lepszą alternatywą byłby labirynt z małym murkiem wokół otwartych ramion.

Po drugie, bardzo ważne jest, aby wszystkie warunki zewnętrzne w pomieszczeniu były stałe⁶¹, w przeciwnym razie różne grupy myszy nie byłyby w ogóle porównywalne. W związku z tym bardzo ważne jest, aby wybrać czas eksperymentu jako taki, w którym zestaw eksperymentalny jest wolny, a eksperymentator jest zawsze obecny. Ponadto należy wziąć pod uwagę zdarzenia w budynku, takie jak prace budowlane, testowanie jakichkolwiek systemów (alarm przeciwpożarowy) lub dzień sprzątania obiektu myszy, aby uniknąć ingerencji w uzyskane dane.

Wreszcie, warunki obsługi i przetrzymywania mają kluczowe znaczenie dla eksperymentów behawioralnych. Podczas implantacji myszy muszą być trzymane w jednym pomieszczeniu ze względu na ryzyko obrażeń spowodowanych przez inne myszy. Aby zapewnić dobrą porównywalność między grupami i niski poziom błędu w jednej grupie, każda mysz musi mieć ten sam rozmiar klatki i wzbogacenie. W przypadku eksperymentów związanych z lękiem, pojedyncze trzymanie ma pewne zalety, ponieważ samce myszy trzymane w jednym pomieszczeniu wykazują niższy wyjściowy poziom lęku, mniejszą zmienność poziomu lęku i mniej objawów depresyjnych^15,16. Samce myszy trzymane w grupie mogą znacznie różnić się poziomem lęku ze względu na hierarchię wśród myszy. Oprócz pomieszczenia inwentarskiego ważne jest również stałe i równe obchodzenie się ze wszystkimi myszami i grupami. Chwytanie myszy w celu połączenia światłowodu na implancie jest bardzo stresujące. Dlatego ta procedura musi być taka sama dla każdej myszy, co oznacza tę samą technikę i tego samego eksperymentatora. Co więcej, czas przyzwyczajenia w klatce oczekiwania, który ma na celu uspokojenie myszy po stresującej procedurze łączenia, musi również mieć takie same warunki pod względem czasu trwania, śmieci i pozycji w labiryncie. Obsługa w obiekcie myszy ma również kluczowe znaczenie dla późniejszej wydajności behawioralnej. Zwierzęta doświadczalne i kontrolne nie powinny być czyszczone w różne dni lub przez różne osoby, ponieważ jest to również stresujące dla myszy. Ponadto dzień sprzątania nie powinien być dniem eksperymentalnym, aby uniknąć różnic w zachowaniu.

Rozwiązywanie problemów
Istnieje kilka problemów, które mogą wystąpić podczas protokołu. Na przykład wiercenie w całości w czaszce podczas operacji stereotaktycznej może uszkodzić naczynia krwionośne. Zwykle występuje silne krwawienie, zwłaszcza powyżej bregmy i lambdy. Jeśli tak się stanie, nie próbuj zatamować krwawienia patyczkami kosmetycznymi, ponieważ mają one tendencję do jeszcze większego krwawienia z naczynia ze względu na ich chłonność, zamiast tego należy bezpośrednio spłukać NaCl.

Może się również zdarzyć, że wstrzyknięcie ciśnieniowe roztworu wirusa nie działa. W takim przypadku może się zdarzyć, że parafilm, strup z otworu zadziorowego lub tkanki mózgowej, zatyka końcówkę kaniuli. W takim przypadku należy powoli wyjąć kaniulę z mózgu bez zmiany osi x lub y i za pomocą pęsety usunąć 1-2 mm przedniej części końcówki kaniuli. Przed ponownym opuszczeniem kaniuli przetestuj funkcjonalność, wywierając niewielki nacisk, aby sprawdzić, czy wirus wydostaje się z końcówki kaniuli. Aby uniknąć zaparć, należy opuścić kaniulę ze stałą prędkością i nie przerywać ruchu, dopóki nie zostanie osiągnięta najgłębsza głębokość strony iniekcyjnej. Jeśli usunięta zostanie zbyt duża część końcówki kaniuli, a średnica będzie zbyt duża, kaniula uszkodzi tkankę, a ryzyko nałożenia wirusa na raz wzrośnie. Dlatego upewnij się, że tylko zatkana część końcówki została ostrożnie usunięta.

Podczas eksperymentu behawioralnego konfiguracja eksperymentu w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT) może powodować problemy. Jeśli na przykład strumień świetlny nie działa prawidłowo, może to wynikać z kilku powodów. Pulser musi zostać otwarty, zaprogramowany i uruchomiony przed otwarciem Ethovision XT. Sprzęt musi być poprawnie wybrany w "Konfiguracji eksperymentalnej" (krok 3.2.2.4). W przypadku wybrania niewłaściwego IO-Boxa lub czegokolwiek innego niż "Costume Hardware", urządzenie Pulser nie może być kontrolowane przez Ethovision. Jeśli test strumienia świetlnego zakończy się pomyślnie, ale zaprogramowany protokół świetlny w "Próbnych ustawieniach sterowania" nie działa podczas akwizycji, może to oznaczać, że podreguła lub odniesienie do podreguły są nieprawidłowo zlokalizowane lub warunki i działania są niejasne. Na przykład: czy odwołanie należy do właściwej reguły podrzędnej? Czy odniesienie jest poprawnie zaprogramowane (np. jak często wykonywana jest reguła podrzędna)?

Dodatkowo może się zdarzyć, że podczas "ustawień detekcji" zwierzę jest odpowiednio śledzone, ale podczas pozyskiwania pojawiają się próbki, w których nie znaleziono obiektu. W takim przypadku sprawdź, czy oświetlenie w pomieszczeniu eksperymentalnym zostało zmienione lub czy coś spowodowało niepożądane cienie w labiryncie. Całe dno labiryntu musi mieć ten sam kolor, ponieważ ustawienie będzie działać tylko dla jednej określonej kombinacji. Jeśli z jakichś powodów nie można uniknąć różnych kolorów lub cieni na dole, zdefiniuj ustawienie wykrywania w najciemniejszej części labiryntu.

Aby zmienić jakiekolwiek ustawienia po nabyciu pierwszych zwierząt, nie należy stosować tych zmian w już używanych ustawieniach. Zduplikuj je, aby je dostosować. Oznacza to również, że już zarejestrowane badanie nie jest już ważne do analizy danych. W takim przypadku nagraj wszystkie zwierzęta dla tej grupy eksperymentalnej z oryginalnymi ustawieniami, a następnie utwórz nowy eksperyment, w którym nagrane filmy są analizowane zamiast śledzenia na żywo. W tym eksperymencie "z wideo" do analizy można wykorzystać kilka ustawień bez utraty porównywalności między zwierzętami, a nawet danych.

Ograniczenia i przyszłe zastosowania
Ta metoda manipulowania zachowaniem za pomocą optogenetyki u swobodnie poruszających się zwierząt również zawiera ograniczenia. Podczas zabiegu odległość dwóch implantów jest ograniczona. W przypadku podwójnej implantacji odległość między dwoma implantami musi być co najmniej równa szerokości aparatu, aby utrzymać implant. Aparat musi opuścić drugi implant do otworu w zadziorach, podczas gdy pierwsze implanty są już zamocowane. Rozwiązaniem tego problemu może być implantacja pod kątem, w której końcówki włókna szklanego mogą być bardzo blisko, podczas gdy ceramiczne ferule nad czaszką mają większą odległość 23,55,56,57,62,63. Wadą implantacji pod kątem jest rozchodzenie się światła. Gdy końcówka włókna jest nachylona, a nie od prostej góry, stymulowany obszar jest inny. W przypadku dwóch obszarów docelowych znajdujących się w bliskiej odległości należy wziąć pod uwagę zmienione położenie stymulacji świetlnej.

Podczas eksperymentu behawioralnego konstrukcja labiryntu może kolidować z kablem optycznym podłączonym do zwierzęcia. Niektóre testy behawioralne, takie jak jasno-ciemne pudełko, zawierają obszar wewnętrzny^64,65, a inne labirynty zawierają przedziały, do których mysz musi wejść. Takich eksperymentów nie można przeprowadzić przy użyciu tej konfiguracji. Alternatywnie system bezprzewodowy może być opcją 22,26,66. Na szczęście niektóre labirynty, takie jak labirynt Barnesa, można urządzić w taki sposób, że myszy są w stanie wejść do odpowiednich przegródek⁶⁷.

Oprócz tych z zamkniętymi strefami, zbyt szerokie labirynty również mogą sprawiać problemy. Im większa powierzchnia labiryntu, tym dłuższy musi być kabel, aby zwierzę mogło przejść do każdej pozycji w labiryncie. Należy uważać, aby zwierzę nie było w stanie nadepnąć na kabel lub złapać go i ugryźć. Rozwiązaniem tego problemu może być konstrukcja zwijająca redundantny kabel. Wadą jest to, że przeciąganie w celu rozwinięcia kabla jest trudne dla myszy. To rozwiązanie lepiej pasowałoby do szczurów. Inną możliwą opcją może być wykonanie stymulacji świetlnej z wyprzedzeniem, a nie w trakcie eksperymentu, oczywiście jest to wykonalne tylko wtedy, gdy wystąpi długotrwały efekt spowodowany stymulacją światłem²³.

Porównanie z istniejącymi/alternatywnymi metodami
Alternatywnymi metodami byłaby chemiczna lub elektryczna stymulacja podczas zachowania ^8,18. Chemiczni agoniści lub antagoniści są w stanie aktywować lub wyciszać neurony za pośrednictwem określonych receptorów, a także mogą manipulować pojedynczymi systemami neuroprzekaźników^38,68. Z jednej strony, swoistość receptorowa jest dość wysoka dla substancji chemicznych, ponieważ specyficzny agonista lub antagonista aktywuje tylko niektóre receptory³⁹. Z drugiej strony, swoistość dla podtypów receptorów z tej samej grupy neuroprzekaźników jest często niewystarczająca. Większość substancji chemicznych wiąże się z co najmniej dwoma podtypami o różnym prawdopodobieństwie⁶⁹. Ponadto substancje chemiczne nie mogą rozróżniać typów komórek neuronalnych, o ile mają te same typy receptorów. Poza tym rozdzielczość czasowa i przestrzenna jest słaba w przypadku manipulacji chemicznych w porównaniu z optogenetyką. Agoniści lub antagoniści są często podawani doustnie³⁵ lub w postaci zastrzyków ogólnoustrojowych ^57,70. Jeśli wlew chemiczny jest wykonywany bezpośrednio w tkance mózgowej, efekty pojawiają się szybciej niż w przypadku aplikacji doustnych, ale nadal w wolniejszym czasie niż w przypadku stymulacji światłem. Ponieważ podawane substancje chemiczne dyfundują w mózgu i nie są specyficzne dla typów neuronów lub regionów mózgu, manipulacja określonymi obwodami mózgu nie jest możliwa.

Stymulacja elektryczna ma wyższą rozdzielczość czasową niż stymulacja chemiczna ^9,14. Rozprzestrzenianie się w tkance neuronalnej jest mniejsze niż w przypadku stymulacji chemicznej, a rozdzielczość przestrzenna jest lepsza niż w przypadku stymulacji chemicznej. Jednak stymulacja elektryczna nie ma możliwości specyficznego zajęcia się różnymi typami komórek neuronalnych lub typami receptorów, ponieważ każdy neuron znajdujący się w pobliżu elektrody będzie reagował na stymulację elektryczną.

Alternatywnymi metodami zachowania u swobodnie poruszających się myszy są na przykład zapisy elektrofizjologiczne w wycinkach mózgu, gdzie pojedyncze neurony lub aksony mogą być modulowane za pomocą optogenetyki, a wywołane efekty można mierzyć za pomocą elektrod rejestrujących ^6,71. Eksperymenty in vitro dają możliwość zbadania molekularnych i komórkowych podstaw stymulacji optogenetycznej, ale mają ograniczenie polegające na tym, że brakuje wewnętrznej łączności i danych wejściowych z innych regionów mózgu. Inną opcją jest zastosowanie optogenetyki w połączeniu z obrazowaniem wielofotonowym ^1,72. W tym przypadku myszy mają nieruchomą głowę i mogą być znieczulone lub obudzić się, aby rozwiązać proste zadania.

Aby przeprowadzić udany eksperyment optogenetyczny, obecnie dostępna jest szeroka gama narzędzi i aplikacji. Dobór narzędzi optogenetycznych i konfiguracji behawioralnej ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Jeśli zostanie wybrana odpowiednia kombinacja narzędzi i eksperymentów, optogenetyka pozwala na bezprecedensowe, dogłębne badanie obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Pomoże to zrozumieć i opracować nowe strategie terapeutyczne w chorobach psychicznych i poznawczych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glukoza	AlleMan Pharma		Injection s.c. dla szybkiego powrotu do zdrowia
Labirynty behawioralne Kostium	wykonany		Zmierz niepokój
Bepanthen	Bayer		Maść okulistyczna
Betaisodona	Monodipharma		Sterylant zawierający jod
Lornetka Betaisodona	Monodipharma		Maść jodowa
	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160	Chirurgia
Okucia ceramiczne	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Rysownik z włókna ceramicznego	Thorlabs	CSW12.5	Cięcie włókna szklanego
Wirus rodopsyny kanałowej2-YFP	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogenetyczne narzędzie
Sprężone powietrze	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Suszenie czaszki
Układ współrzędnych	Stoelting		Współrzędne stereotaktyczne do operacji
Correl Draw			Graficzna wersja oprogramowania 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Produkcja wycinków mózgu do barwienia
Ethovision XT 14	Noldus		Oprogramowanie do śledzenia behawioralnego
Oprogramowanie statystyczne	Exel
Okucie Polerowanie krążka	Thorlabs	D50-F	Implanty polerskie okrągłe boki
Patchcord światłowodowy podwójny	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Rdzeń tulejki 1,25 mm	, które są połączone z dwoma implantami implantacji obustronnej
Patchcord światłowodowy pojedynczy	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Rdzeń tulejki 1,25 mm	, który jest połączony z implantem za pomocą tulei
Narzędzie do ściągania izolacji z włókien	Thorlabs	T06S13	Usuwanie izolacji z włókna szklanego do implantu
Bibuła filtracyjna	VWR European	516-0300	Pocięte na kawałki do testu karmienia z tłumieniem nowości
Granulki spożywcze	Mü hle Dźwignie	Hö veler Nagerfutter	Żywienie dla myszy
Pipety szklane	Aparat Harvard	GC150-10	Pipety iniekcyjne
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Płynny cement dentystyczny
Lampa grzewcza	efbe-Schott/Phillips	R95E	Zapobiegaj wychłodzeniu myszy po operacji
Płyta grzewcza	Stoelting		Zintegrowany ze współrzędnymi System
Wtrysk kaniula	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	Wszystkie iniekcje i do wiercenia otworu w czaszce
Miot		T 1350	Uziemienie dla Nowości Stłumiony Test żywieniowy
Klatki dla myszy	Zoonlab	405 cm^2	Pojedyncza obudowa do eksperymentów
Optibond FL	Kerr	26684E	Przygotowanie czaszki do implantacji
Włókno szklane	Thorlabs	FT200EMT	Światłowód do implantu
Optogenetics-LED.STSI	Prizmatix		Optogenetyczny zestaw narzędzi do stymulacji światłem podczas eksperymentów behawioralnych
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfuzja myszy w celu usunięcia mózgu
Arkusz polerski 0,02 i mikro; m grit	Thorlabs	LFCF	Implanty polerskie po stronie okrągłej
Arkusz polerski 1 i mikro; m grit	Thorlabs	LF1D	Implanty polerskie po okrągłej stronie
Arkusz polerski 30 i mikro; m grit	Thorlabs	LF30D	Implanty polerskie okrągłe boki
Arkusz polerski 6 i mikro; m grit	Thorlabs	LF6D	Implanty polerskie okrągłe boki
Oprogramowanie Pulser	Prizmatix		Oprogramowanie do sterowania urządzeniami świetlnymi
Rimadyl-Carprofen	Zoetis		Analgesia
Sigma Plot Oprogramowanie			do statystyk
Rękaw	Thorlabs	FT200EMT	Połączenie implantu i świetlnego
SodiumCloride ( NaCl)	Braun	3570410	Płukanie czaszki
Superglue	Pattex Henkel		Aby naprawić włókno szklane w okuciu wirusa
td-Tomato	Penn Vector Core	Addgene 51503	Narzędzie optogenetyczne
Światło UV	KoQGHJ	bezprzewodowe, 1200 mW/cm^2	Lampa polimeryzacyjna do cementu dentystycznego
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Znieczulenie