Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Summary

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Abstract

Optogenetyczna modulacja obwodów neuronalnych u swobodnie poruszających się myszy wpływa na ostre i długotrwałe zachowanie. Metoda ta jest w stanie wykonywać manipulacje pojedynczymi neuronami i uwalnianiem nadajnika specyficznego dla regionu, aż do całych obwodów neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym i umożliwia bezpośredni pomiar wyników behawioralnych. Neurony wyrażają narzędzia optogenetyczne poprzez wstrzyknięcie wektorów wirusowych przenoszących wybrane DNA, takich jak rodopsyna kanałowa2 (ChR2). Światło jest doprowadzane do określonych obszarów mózgu za pomocą przewlekłych implantów optycznych, które kończą się bezpośrednio nad obszarem docelowym. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji i prawidłowej ekspresji narzędzi, myszy mogą być wielokrotnie wykorzystywane do testów behawioralnych z optogenetyczną stymulacją interesujących neuronów.

Modulacja optogenetyczna ma wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną, którą można osiągnąć z wysoką specyficznością komórkową, w porównaniu do powszechnie stosowanych metod, takich jak stymulacja chemiczna lub elektryczna. Światło nie uszkadza tkanki neuronalnej i dlatego może być wykorzystywane do długotrwałych eksperymentów, a także do wielu eksperymentów behawioralnych na jednej myszy. Możliwości narzędzi optogenetycznych są niemal nieograniczone i umożliwiają aktywację lub wyciszenie całych neuronów, a nawet manipulowanie określonym typem receptora za pomocą światła.

Wyniki takich eksperymentów behawioralnych ze zintegrowaną stymulacją optogenetyczną bezpośrednio wizualizują zmiany w zachowaniu spowodowane manipulacją. Zachowanie tego samego zwierzęcia bez stymulacji świetlnej jako punktu odniesienia jest dobrą kontrolą dla wywołanych zmian. Pozwala to na szczegółowy przegląd typów neuronów lub systemów neuroprzekaźników zaangażowanych w określone zachowania, takie jak lęk. Plastyczność sieci neuronalnych można również bardzo szczegółowo badać poprzez długotrwałą stymulację lub obserwacje behawioralne po stymulacji optycznej. Optogenetyka pomoże oświecić sygnalizację neuronalną w kilku rodzajach chorób neurologicznych.

Introduction

Modulacja obwodów neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym i ich wyniki behawioralne są ważne dla zrozumienia, jak działa mózg, szczególnie w chorobach psychicznych i zadaniach poznawczych, takich jak nauka i pamięć. Dzięki optogenetyce pojedyncze komórki lub populacje komórek, a nawet całe obwody mogą być modulowane przez światło. Popularne narzędzia optogenetyczne, takie jak rodopsyna kanałowa2 (ChR2) lub archaerodopsyna (Arch), są w stanie aktywować lub wyciszać neurony, a także zwiększać lub hamować uwalnianie przekaźnika na końcach aksonów rzutujących do różnych regionów mózgu^1,2,3,4. Jednak Arch musi być używany ostrożnie, ponieważ wykazano, że jego aktywacja na końcach presynaptycznych zwiększa spontaniczne uwalnianie nadajnika⁵. Łuk to prostytująca na zewnątrz pompa protonowa, która zmienia wartość pH wewnątrz komórki. To alkaliczne środowisko indukuje napływ wapnia i zwiększa uwalnianie nadajnika⁵. Aby specyficznie modulować wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, można utworzyć chimery receptorowe złożone z aktywowanego światłem narzędzia optogenetycznego, takiego jak rodopsyna lub opsyna stożkowa, w połączeniu z odpowiednim receptorem sprzężonym z białkiem G^6,7,8. Ilość i różnorodność dostępnych narzędzi optogenetycznych znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady⁹.

Celem optogenetyki jest manipulowanie obwodami neuronalnymi podczas zachowania. Optogenetyka umożliwia na przykład pomiar ostrych zmian behawioralnych, takich jak zmiany w zachowaniu lękowym. Narzędzia optogenetyczne są dostarczane do docelowych obszarów mózgu za pośrednictwem wektorów wirusowych. Za pomocą specjalnych promotorów i wzmacniaczy, czyli systemu Cre-loxP, można zapewnić specyficzność typu komórki dla ekspresji narzędzi optogenetycznych (Figura 1A). Istnieje kilka genetycznie zmodyfikowanych linii myszy wykazujących ekspresję enzymu Cre-rekombinazy tylko w określonych typach komórek. Na przykład myszy Nex-Cre wyrażają rekombinazę Cre w neuronach piramidowych w korze i hipokampie pod kontrolą promotora Nex¹⁰. Enzym ten jest w stanie odwrócić sekwencje DNA, które są otoczone przez boki loxP¹¹. W związku z tym sekwencja DNA podwójnie floksowanego narzędzia optogenetycznego, które jest odwrócone i otoczone bokami loxP, może być transkrybowana tylko przez neurony, które posiadają Cre-Rekombinazę, ale nie przez inne typy neuronów^12,13. W przypadku myszy Nex-Cre narzędzie optogenetyczne będzie ulegać ekspresji wyłącznie w neuronach piramidowych. Stymulacja światłem niektórych obszarów mózgu jest następnie osiągana poprzez przewlekłą implantację światłowodów bezpośrednio nad obszarem zainteresowania. Zwierzęta mogą być następnie sprzężone z odpowiednim źródłem światła i swobodnie zachowywać się w prawie wszystkich rodzajach testów behawioralnych.

Rycina 1: Wstrzyknięcie i implantacja. A) System Cre-loxP dla ChR2-YFP. Podwójnie floksowane narzędzie optogenetyczne jest wypełnione wirusem związanym z adeno (AAV) do wstrzyknięcia do tkanki mózgowej. B) Strzałkowy widok wstrzyknięcia wirusa i implantacji optycznego interfejsu neuronalnego do/powyżej regionu IL mPFC. Iniekcja i implantacja zostały wykonane z góry. Wyświetlane są wszystkie interesujące regiony, IL, BLA i DRN. C) Szczegółowy widok wszczepionego światłowodu, tulei i źródła światła. D) Rozprzestrzenianie się stymulacji niebieskim i czerwonym światłem laserowym w tkance mózgowej istoty szarej z włókna świetlnego o średnicy 200 μm (Yizhar i wsp. 2011). Światło niebieskie rozchodzi się maksymalnie 0,5 mm w głąb tkanki, światło czerwone około 1 mm. Kodowanie kolorami: czerwony 50%, żółty 10%, zielony 5%, niebieski 1%, jeśli światło dociera do tego obszaru. E) Widok koronalny jednostronnej implantacji bezpośrednio nad lewym IL ze światłowodem 200 μm. Obszar IL ma szerokość 0,25 mm w każdej półkuli i głębokość 0,2 mm. Niebieskie i czerwone żarówki są granicą 5% rozpraszania światła i są przenoszone z Yizhar i innych do odpowiedniego rozmiaru. LoxP: locus of X-over P1; ChR2: rodopsyna kanałowa; YFP: żółte białko fluorescencyjne; dflox: podwójnie floksowany; IL: kora podlimbiczna; BLA: ciało migdałowate podstawno-boczne; DRN: jądra szwu grzbietowego; PrL: obszar przedlimbiczny. Ten rysunek został zmodyfikowany z Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stosowane są podejścia optogenetyczne, ponieważ umożliwiają one zarówno wysoką rozdzielczość czasową, jak i przestrzenną¹⁴ oraz modulację specyficzną dla typu komórki. Dodatkowo możliwe jest wielokrotne korzystanie z wszczepionego urządzenia bez dalszego leczenia. Po operacji stereotaktycznej, w której wykonuje się wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem przenoszącym narzędzie optogenetyczne i wszczepienie światłowodu, myszy mogą wracać do zdrowia przez dwa tygodnie. Wybraliśmy czas rekonwalescencji wynoszący tylko 2 tygodnie, ponieważ jest to wystarczający czas na powrót do zdrowia po operacji i na ekspresję wirusa. Ponieważ po eksperymentach behawioralnych następuje immunohistochemia, musimy upewnić się, że myszy nie staną się zbyt stare podczas eksperymentu; w przeciwnym razie jakość tkanki ulega pogorszeniu. Nie wykazują żadnych oczywistych zaburzeń behawioralnych spowodowanych implantem i zachowują się typowo jak w klatce. Oczywiście implantacji towarzyszy znaczna zmiana chirurgiczna; Dlatego myszy są intensywnie monitorowane. Po operacji myszy muszą być trzymane pojedynczo, ponieważ myszy trzymane w grupach mają tendencję do wzajemnego ranienia świeżych ran i implantów. Jednak warunki mieszkaniowe mają duży wpływ na poziom lęku samców myszy, ponieważ myszy trzymane samotnie wykazują niższy poziom lęku¹⁵ i ogólnie mniej depresyjne objawy¹⁶.

Chemiczna lub elektryczna manipulacja obwodami mózgu nie ma wysokiej specyficzności typu komórki optogenetyki i ma niższą rozdzielczość czasową i przestrzenną^14,17,18. W zależności od pytania eksperymentalnego, stymulacja elektryczna lub chemiczna może mieć różne zalety. Gdy należy również stymulować przepuszczanie końcówek światłowodowych w określonym regionie, najlepszą metodą jest stymulacja elektryczna. Stymulacja chemiczna jest dobrym wyborem, gdy receptory specyficzne dla przekaźnika w całym regionie powinny być aktywowane przez agonistów. Kolejną wielką zaletą optogenetyki w porównaniu ze stymulacją chemiczną lub elektryczną jest to, że endogennie neurony nie są wrażliwe na światło, co pozwala uniknąć wystąpienia skutków ubocznych¹⁹. Rzeczywiście, wysokie natężenie światła może wywoływać efekty grzewcze^8,20, ale dzięki odpowiednim grupom kontrolnym, efekty behawioralne wynikające z manipulacji optogenetycznej mogą zostać wyeliminowane.

Badanie zachowań gryzoni, zwłaszcza w odniesieniu do chorób psychicznych, znacznie się poprawiło dzięki optogenetyce u swobodnie poruszających się zwierząt, ponieważ umożliwia bezpośrednią modulację pojedynczych receptorów aż do określonych populacji komórek²¹ i obwody²². Możliwość zmierzenia ostrych skutków takich modulacji, jak również długoterminowych skutków behawioralnych po określonym czasie²³ lub po przewlekłej stymulacji²⁴, umożliwia szeroką elastyczność projektów eksperymentalnych i zapewnia bardzo szczegółowy wgląd w obwody mózgowe. Stymulacja światłem może być wykorzystana do modulacji neuronów znajdujących się w miejscu wstrzyknięcia narzędzia optogenetycznego. Gdy zarówno wstrzyknięcie, jak i implantacja dotyczą tego samego obszaru mózgu, można celować w ciała komórkowe i aksony wystające z tyłu głównych neuronów i interneuronów w tym regionie^3,6,8. Jednak światłowód może być również wszczepiony w obszar inny niż wstrzyknięty. W tym przypadku stymulacja światłem może modulować uwalnianie nadajnika na zaciskach aksonów w obszarach projekcji wstrzykiwanego obszaru^25,26,27.

W tym badaniu, optogenetyka jest używana w połączeniu z eksperymentami do analizy zachowań związanych z lękiem. Choroby psychiczne związane z lękiem dotykają ponad jedną trzecią światowej populacji^28,29,30 i powodują duże obciążenie ekonomiczne³¹. Osoby dotknięte chorobą cierpią z powodu uczucia pobudzenia, napięcia i zmartwienia, po którym następuje zachowanie unikające^32,33. Te przewlekle występujące negatywne emocje, które skupiają się głównie na przyszłych wydarzeniach³⁴, silnie ingerują w codzienne życie pacjentów. Powszechne metody leczenia, takie jak benzodiazepiny lub selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI), są skuteczne tylko u niektórych pacjentów. Duża liczba osób w ogóle nie reaguje na leczenie³⁵, co pokazuje, że mechanizm leżący u podstaw takich chorób nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. Wiadomo, że przyśrodkowa kora przedczołowa (mPFC) odgrywa ważną rolę w rozwoju i manifestacji lęku^{21,25,27,36,37,38}. W szczególności nadmierna aktywacja regionu kory podlimbicznej (IL) w mPFC może być częścią zaburzeń związanych z lękiem^39,40. Opisany tutaj przykładowy eksperyment może pomóc zrozumieć, w jaki sposób modulacje w regionie IL mPFC wpływają na zachowanie lękowe. Ponadto potencjalnie można również wspierać opracowywanie nowych strategii terapeutycznych w chorobach psychicznych związanych z lękiem.

2-6 miesięczny samce myszy Nex-Cre są używane do ekspresji ChR2 specyficznie w neuronach piramidowych w regionie IL klasy mPFC⁴¹. Myszy Nex-Cre mają tło C57Bl / 6 i wyrażają enzym rekombinazę Cre specyficznie w neuronach piramidowych. Podczas operacji stereotaktycznej podwójnie floksowane ChR2-DNA jest wstrzykiwane do regionu IL za pośrednictwem wektorów wirusowych związanych z adeno. Implant optyczny umieszcza się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania (Rysunek 1B), a implant mocuje się za pomocą cementu dentystycznego. Zwierzęta kontrolne otrzymują zastrzyk z podwójnie floksowanym tdTomato-DNA w tym samym regionie, aby naśladować ekspresję specyficzną dla komórki.

Zwierzęta są trzymane w grupach do dnia operacji, a następnie są trzymane pojedynczo, aby uniknąć obrażeń od innych myszy. Myszy są trzymane w indywidualnych wentylowanych klatkach (IVC) w klatkach TypI-L dla myszy trzymanych pojedynczo. Cykl światło-ciemność przebiega w rytmie godziny 12:12, a faza światła rozpoczyna się o godzinie 10 rano. Wszystkie eksperymenty behawioralne wykonywane są w fazie ciemnej, która przypomina fazę aktywną gryzoni. Woda i standardowe granulki spożywcze są dostępne ad libitum. Po dwóch tygodniach rekonwalescencji, która zapewnia wystarczającą ekspresję ChR2 w neuronach piramidowych, myszy są wykorzystywane do eksperymentów behawioralnych.

Otwarte Pole (OF) to kwadratowy labirynt o wymiarach 50 cm x 50 cm z piaskowanymi ścianami o wysokości 40 cm. Ziemia jest podzielona na 16 kwadratów, z których wewnętrzne 4 reprezentują środek. Mierzone zachowanie to: 1) czas spędzony w centrum, 2) liczba wejść do centrum i 3) całkowity przebyty dystans. Podczas tego eksperymentu odbywają się 4 próby trwające łącznie 20 minut. W próbach 1 i 3 nie występuje stymulacja światłem, a w próbach 2 i 4 przeprowadza się stymulację 20 Hz impulsem świetlnym 5 ms i natężeniem światła 1 mW 473 nm (Rysunek 2A). W późniejszych badaniach wzięto pod uwagę przyzwyczajenie do obszaru testowego, ale użycie zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto pozorowane, wskazuje, w jaki sposób wyraża się przyzwyczajenie.

Labirynt Barnesa to eksperyment na rzecz uczenia się i zapamiętywania. Jest to okrągła platforma o średnicy 92 cm i zawiera 20 równoodległych otworów na obwodzie. 19 otworów jest zamkniętych, a pod jednym otworem znajduje się skrzynka ewakuacyjna. Przez 4 kolejne dni myszy przechodzą 4 próby treningowe, aby nauczyć się lokalizacji skrzynki ucieczkowej. W 5^dniu skrzynka ewakuacyjna jest usuwana, a myszy są testowane, ile czasu potrzebują na znalezienie właściwej. Mierzone zachowanie to: 1) czas do znalezienia skrzynki ewakuacyjnej/właściwego otworu, 2) liczba wizyt celu i błędów oraz 3) odległość przebyta do momentu znalezienia się w skrzynce ewakuacyjnej. Stymulacja światłem w różnych grupach odbywa się albo podczas akwizycji lub konsolidacji, które mają miejsce w dniach treningowych 1-4, albo podczas pobierania w dniu testowym, czyli w dniu 5 (Rysunek 2D).

Rysunek 2: Eksperymenty behawioralne z protokołami optogenetycznymi. A) Schematyczny rysunek eksperymentu Open Field z odpowiednim protokołem stymulacji światłem. C) Schematyczny rysunek eksperymentu Elevated-Plus Maze z odpowiednim protokołem stymulacji światłem. D) Schematyczny rysunek eksperymentu w labiryncie Barnesa z odpowiednim protokołem stymulacji światłem. EPM: Labirynt Elevated-Plus; OF: Otwarte pole; BM: Test labiryntu Barnesa. Ten rysunek został zmodyfikowany z Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dla stymulacji optogenetycznej, intensywność i częstotliwość światła muszą być dostosowane do narzędzia optogenetycznego i typu neuronu, który jest badany. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, należy użyć najniższego możliwego natężenia światła, ponieważ kilka badań wykazało, że silne natężenie światła może powodować efekty grzewcze^8,20. W przypadku ChR2 powszechnie stosuje się stymulację 20 Hz impulsem świetlnym 5 ms². Ponieważ ChR2 jest dość wrażliwy na światło, natężenie światła 1 mW jest wystarczające. Protokół stymulacji światłem odbywa się naprzemiennie między próbami wyłączania i włączania światła, aby bezpośrednio mierzyć zmiany w zachowaniu. Warunki zewnętrzne w pomieszczeniu do eksperymentów behawioralnych powinny pozostać stabilne dla całej grupy zwierząt. Ważnymi warunkami, które należy wziąć pod uwagę, są hałas (należy pamiętać, że urządzenia same w sobie mogą hałasować), zapach (zawsze czyść konfiguracje behawioralne etanolem), natężenie światła i eksperymentator. Eksperymentatorem powinna być zawsze ta sama osoba. Dodatkowo pora dnia eksperymentów powinna być taka sama dla wszystkich zwierząt w jednej grupie, preferowane jest kilka godzin po rozpoczęciu fazy ciemnej w obiekcie.

Celem tego eksperymentu jest zwiększenie stosunku pobudzenia/hamowania (E/I) w obszarze IL poprzez silną aktywację pobudzających neuronów piramidowych. Wiadomo, że zwiększony stosunek E / I w tym specjalnym regionie kory zwiększa poziom lęku u myszy^40,42,43,44.

Protocol

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalny ośrodek badań na zwierzętach oraz "Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz" na Uniwersytecie w Bremie (#146)

1. Przygotowanie implantu optycznego⁹ (Rysunek 1C)

1. Umieść ceramiczną skuwkę płaską stroną do góry w imadle stołowym.
2. Usuń powłokę z włókna szklanego o średnicy 200 μm za pomocą narzędzia do usuwania włókien i wytnij kawałki o długości 2-3 cm za pomocą rysika z włókna ceramicznego.
3. Umieść kawałek włókna szklanego w ceramicznej skuwce z równym zwisem po obu stronach.
4. Umieść kroplę kleju superglue na płaskiej stronie ceramicznej skuwki za pomocą kaniuli iniekcyjnej.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
5. Wyjmij preimplant z imadła stołowego i po okrągłej stronie ceramicznej skuwki przytnij włókno szklane tak krótko, jak to możliwe, za pomocą rysika z włókna ceramicznego.
6. Umieść preimplant na krążku polerskim z tulejką i wypoleruj okrągłą stronę na 4 różnych papierach polerskich, rysując osiem razy na papier (ziarnistość 30 μm, ziarnistość 6 μm, ziarnistość 1 μm i wreszcie ziarnistość 0,02 μm).
7. Wyjmij preimplant z krążka polerskiego skuwki i przytnij włókno szklane po płaskiej stronie ceramicznej skuwki na długość potrzebną do implantacji. Rozpocznij mierzenie długości za wystającym klejem superglue.
   1. Aby uzyskać równą powierzchnię cięcia, wystarczy zarysować włókno szklane 2-3 razy, a następnie je złamać.
      UWAGA: Użyj atlasu mózgu myszy z Paxinos i Franklin⁴⁵, aby obliczyć długość implantu. Implant musi kończyć się bezpośrednio nad obszarem zainteresowania, a grubość czaszki powinna być uwzględniona w obliczeniach długości. Aby stymulować obszar IL, włókno szklane ma długość 1,8 mm (Rysunek 3).

Rycina 3: Atlas mózgu myszy (Paxinos i Franklin) z reprezentatywną długością implantu docierającego do obszaru IL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Zdezynfekuj gotowy implant przez 10 minut w etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przed implantacją.

2. Iniekcja i implantacja

1. Przetransportuj pojedynczą mysz na salę operacyjną i zważ ją. Zastosuj znieczulenie z dootrzewnowym (i.p.) wstrzyknięciem ketaminy/ksylazyny (ketamina 0,12 mg/g, ksylazyna 0,01 mg/g).
   1. Zamocuj mysz lewą ręką i obróć ją na plecy z nisko trzymaną głową.
   2. Strzykawką należy skierować się w lewy dolny kwadrant brzucha i wprowadzić do kaniuli iniekcyjnej 1 cm pod skórą.
   3. Wstrzyknąć znieczulenie powolnym i stałym ruchem do jamy brzusznej.
   4. Umieść mysz z powrotem w klatce i poczekaj, aż osiągnie głęboki stan znieczulenia.
      UWAGA: Głębokość znieczulenia można określić na podstawie braku mrugania i odruchów między palcami.
2. Umieść mysz na płycie grzewczej i zamocuj głowicę w ramie stereotaktycznej. Zamocuj nos i zęby z przodu, a uszy po obu stronach.
   UWAGA: Głowa musi być wyprostowana na osi lewo-prawo i rostralno-ogonowa, aby zapewnić prawidłowe współrzędne stereotaktyczne.
3. Zastosować środek przeciwbólowy z karprofenem w dawce 2 mg/kg podskórnie na grzbiet myszy i nałożyć nieprzezroczystą maść na oba oczy, aby chronić je przed wysuszeniem.
4. Zwilż włosy na skórze głowy mokrym ręcznikiem papierowym, a następnie odetnij je nożyczkami. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie luźne włosy mokrym ręcznikiem papierowym. Do dezynfekcji skóry głowy użyj bawełnianego patyczka i weź 0,5 ml nalewki zawierającej jod (Betaisodona 100 mg/ml jodu powidonu i 11 mg/ml jodu) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
   UWAGA: Zamiast nożyczek do prawidłowego usuwania włosów można również użyć elektrycznej maszynki do strzyżenia.
5. Podnieś skórę głowy powyżej obszaru zainteresowania za pomocą pęsety i przytnij 1 cm wzdłuż linii środkowej. Użyj dwóch pęset, aby odsunąć skórę na bok, aby odsłonić czaszkę. Pamiętaj również, aby usunąć cienką skórę nad czaszką i pozostawić odsłoniętą czaszkę do wyschnięcia.
6. Szorstkość czaszki do późniejszej implantacji.
   1. Nałóż kroplę kwasu fosforowego (37%) o wymiarach 2 mm x 2 mm z zestawu kleju (np. Optibond) na czaszkę, rozprowadź ją końcówką strzykawki i pozwól jej działać przez 15 sekund.
   2. Usuń cały kwas wacikiem i dwukrotnie przepłucz czaszkę 1 ml 0,9% NaCl.
   3. Osusz czaszkę wacikowym patyczkiem i sprężonym powietrzem.
      Uwaga: Kwas fosforowy jest niebezpieczny i musi zostać całkowicie usunięty, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
7. Oblicz współczynnik F dla poszczególnych współrzędnych.
   1. Umieść szklaną kaniulę w ramce stereotaktycznej i umieść ją bezpośrednio nad bregmą.
   2. Wyzeruj układ współrzędnych i przesuń szklaną kaniulę do lambda.
   3. Oblicz współczynnik F⁴⁶ według następującego wzoru:
      
   4. Pomnóż współczynnik F przez współrzędne z atlasu mózgu myszy, aby dostosować je do pojedynczej myszy.
8. Wywierć otwór w czaszce do wstrzyknięcia.
   1. Użyj dostosowanych współrzędnych, aby znaleźć miejsce na czaszce bezpośrednio nad interesującą nas strukturą i oznacz ją za pomocą końcówki kaniuli do wstrzykiwań, drapiąc ją nad powierzchnią kości.
   2. Za pomocą kaniuli iniekcyjnej wywiercić otwór w czaszce w zaznaczonym miejscu, obracając kaniulę w miejscu. Jeśli krew wycieknie z otworu na żarna, spłucz 1 ml 0,9% NaCl, a następnie osusz czaszkę.
9. Pobrać roztwór wirusa do szklanej kaniuli.
   1. Umieść kroplę 100 μl 0,9% NaCl na czaszce i kawałek parafilmu (1 cm x 1 cm) na wierzchu, sterylną stroną do góry.
   2. Umieść 1-2 μl roztworu wirusa na parafilmie i opuść do niego końcówkę szklanej kaniuli.
   3. Podłącz szklaną kaniulę do strzykawki, zastosuj minimalne podciśnienie i poczekaj, aż roztwór wirusa zostanie wchłonięty przez kaniulę (w ciągu kilku sekund).
      UWAGA: Ważne jest, aby zaprzestać stosowania podciśnienia, zanim powietrze zostanie pobrane do kaniuli. Dlatego zawsze będzie istniała niewielka pozostałość po rozwiązaniu wirusowym.
10. Wstrzyknij roztwór wirusa do obszaru zainteresowania.
    1. Umieść szklaną kaniulę wypełnioną wirusem nad otworem na żarna.
    2. Powoli opuść kaniulę do otworu zadziorów i wyzeruj współrzędną z, gdy końcówka kaniuli znajdzie się na poziomie czaszki.
    3. Ostrożnie opuścić kaniulę do najniższego położenia w miejscu wstrzyknięcia.
    4. Ustaw lornetkę na menisku roztworu wirusa w kaniuli.
    5. Zastosować niewielką ilość nadciśnienia za pomocą strzykawki, aż łąkotka zostanie nieznacznie obniżona.
    6. Pozwól wirusowi rozprzestrzeniać się przez 2-3 minuty przed przesunięciem szklanej kaniuli w górę do następnej pozycji.
    7. Roztwór wirusa należy stosować co 200-300 μm w całym obszarze zainteresowania.
    8. Szklaną kaniulę należy wyjmować bardzo powoli i wyrzucić po ostatnim wstrzyknięciu.
11. Przygotuj czaszkę do implantacji za pomocą zestawu adhezyjnego (np. Optibond^TMFL).
    1. Osuszyć czaszkę sprężonym powietrzem.
    2. Nałożyć 5 μl podkładu (np. Optibond, 1-30% (etanol, kwas krzemowy, glicerynofosfatdimetakrylan, 2-(2-(metakryloyloksy)etoksykarbonylo)benzoesäure, 2-hydroksyetylometakrylan)) za pomocą odpowiedniego patyczka i pozostawić do wyschnięcia na 15 sekund.
    3. Nałożyć 5 μl spoiwa (np. Optibond, 15-20% 2-hydroksyetylometakrylanu + 1-2% alkaliheksafluorokrzemikat(Na)) tym samym patyczkiem i utwardzać przez 20 s światłem UV (420-480 nm).
       UWAGA: Istotne jest, aby czaszka była sucha, a podkład i spoiwo były nakładane bardzo cienką warstwą.
       Ostrzeżenie: Nie patrz bezpośrednio w światło UV, ponieważ światło UV może uszkodzić oczy.
12. Umieść implant bezpośrednio nad obszarem zainteresowania.
    1. Zamocuj implant w odpowiednim uchwycie.
    2. Osuszyć czaszkę sprężonym powietrzem.
    3. Umieść końcówkę włókna szklanego bezpośrednio nad otworem zadziorów i ostrożnie ją opuść.
    4. Przestań opuszczać implant, gdy pozostała bańka superglue dotknie czaszki. Nie wywieraj nacisku na czaszkę!
       UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie i implantacja są wykonywane w różnych obszarach (np. Szwu grzbietowym i hipokampie), wywierć wszystkie niezbędne otwory po zastosowaniu kwasu fosforowego, ale przed adhezją 2-składnikową, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami, jak opisano wcześniej (krok 2.8-2.14).
13. Zamocuj implant.
    1. Sprawdź, czy czaszka jest nadal całkowicie sucha.
    2. Nałożyć płynny cement dentystyczny (np. Gradia direct flo) wokół implantu i w jego okolicy i utwardzać przez 20 s światłem UV (420-480 nm).
       UWAGA: Ilość cementu dentystycznego zależy od wolnego obszaru czaszki. Cała czaszka powinna być pokryta cementem dentystycznym.
    3. Nałóż dwie kolejne warstwy cementu i całkowicie wypełnij wolny i wysuszony obszar czaszki. Utwardź każdą warstwę światłem UV (420-480 nm).
14. Zakończ operację.
    1. Nałożyć 0,5 g maści jodowej (Betaisodona 100 mg/ml jodu powidonu i 11 mg/ml jodu) na całą ranę.
    2. Wstrzyknij podskórnie w szyję 0,1 ml glukozy rozpuszczonej w 0,9% NaCl w celu szybkiego powrotu do zdrowia.
    3. Zwolnij mocowanie nosa i ucha, umieść mysz w nowej klatce i umieść ją pod lampą grzewczą, aby uniknąć utraty ciepła ciała.
    4. Gdy mysz się obudzi, przynieś ją z powrotem do obiektu.
    5. Sprawdzaj jego stan zdrowia co najmniej raz dziennie. Podejmij odpowiednie działania, jeśli myszy wykazują jakąkolwiek złą konstytucję (np. zapewnij pooperacyjną analgezję karprofenem do 3 dni, jeśli myszy wykazują jakiekolwiek oznaki bólu).
       UWAGA: Po dwóch tygodniach rekonwalescencji myszy można wykorzystać do eksperymentów behawioralnych.

3. Przygotowanie nowego eksperymentu (Przykładowa stymulacja ChR2 i Open Field)

1. Nadajnik impulsowy
   1. Zaprogramuj pulser (np. Prizmatix) do stymulacji światłem.
   2. Otwórz oprogramowanie i wybierz port COM USB, do którego podłączone jest źródło światła.
   3. Wybierz Wybierz tryb pracy (3) | Wykonaj sekwencję impulsów po wyzwoleniu HIGH, a następnie zatrzymaj się, gdy LOW, aby umożliwić zewnętrznemu oprogramowaniu sterowanie źródłem światła.
   4. Zaprogramuj protokół świetlny. Dla stymulacji 20 Hz impulsem świetlnym 5 ms: wybierz TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms i P2D = 0 ms.
   5. Naciśnij przycisk Start Sequence (Rozpocznij sekwencję). Ten stan pozostanie do momentu zakończenia eksperymentów.
      UWAGA: Oprogramowanie pulsatora (Prizmatix Pulser) musi zostać uruchomione przed oprogramowaniem do śledzenia wideo; W przeciwnym razie oprogramowanie do śledzenia wideo nie będzie w stanie rozpoznać urządzenia.
2. Oprogramowanie do śledzenia wideo (np. Ethovision XT)
   1. Utwórz nowy eksperyment na podstawie wstępnie zdefiniowanego szablonu.
      1. Otwórz oprogramowanie, przejdź do Plik, wybierz Nowy z szablonu. Wybierz opcję Zastosuj wstępnie zdefiniowany szablon.
      2. Wybierz Śledzenie na żywo i wybierz kamerę, naciskając Źródło i potwierdź podłączony Basler GenICam.
         UWAGA: Obraz na żywo z kamery będzie teraz wyświetlany w oknie w prawym górnym rogu.
      3. Naciśnij Dalej i wybierz zwierzę, które ma być nagrywane (Gryzonie, Mysz).
      4. Naciśnij Dalej i wybierz szablon areny Otwórz pole, kwadrat. Wybierz szablon strefy Środek, Obramowanie, Narożniki i potwierdź przyciskiem Dalej.
      5. Potwierdź 1 temat, który ma być śledzony, za pomocą przycisku Dalej.
      6. Wybierz Punkt centralny, punkt nosa i podstawę ogona i potwierdź, że kolor zwierzęcia w porównaniu z tłem jest ciemniejszy za pomocą przycisku Next.
      7. Potwierdź zalecaną częstotliwość próbkowania 12,5 za pomocą przycisku Next i zakończ krok.
      8. Nazwij eksperyment odpowiednim i wybierz lokalizację, którą chcesz zapisać.
   2. Zdefiniuj ustawienia eksperymentalne.
      1. Przejdź do ustawień i ustawień eksperymentalnych. Wybierz opcję Wykrywanie punktu środkowego, punktu nosa i podstawy ogona jako Śledzone obiekty.
      2. Wybierz opcję Korzystanie ze sprzętu do kontroli próbnej i przejdź do Ustawień.
      3. Wybierz skrzynkę Noldus USB-IO i potwierdź przyciskiem Ok.
      4. Wybierz Niestandardowy sprzęt jako Typ urządzenia na porcie TTL, który został podłączony do urządzenia impulsowego, i potwierdź przyciskiem Ok.
   3. Zdefiniuj ustawienia areny.
      1. Przejdź do Ustawień Areny i wybierz Ustawienia Areny 1.
         UWAGA: Aparat automatycznie otworzy teraz obraz tła.
      2. Potwierdź obraz za pomocą Grab.
      3. Dostosuj predefiniowane strefy do rzeczywistej areny, zmieniając ich rozmiar. Użyj strzałki i dwóch symboli po jej prawej stronie. Jeśli niektóre strefy są niepotrzebne, usuń je.
      4. Naciśnij 1. Narysuj skalę, aby skalibrować i przeciągnij linię z jednego rogu labiryntu do drugiego. Wprowadź długość rzeczywistej odległości w cm.
      5. Powtórz to dla drugiej osi.
   4. Sprawdź, czy stymulacja światłem działa.
      1. Przejdź do Arena - Mapowanie sprzętu i wybierz Test na szarym pasku.
      2. Wybierz pozycję Command Output 1 High (Wyjście polecenia 1 wysokie) i naciśnij przycisk Test.
         UWAGA: Z końca światłowodu powinno wydobywać się światło. Po wybraniu opcji Output 1 Low (Wyjście 1) i Test (Test) stymulacja powinna się zatrzymać.
   5. Zdefiniuj ustawienia kontroli próbnej dla 20 minut eksperymentu. Ustaw próby Off1, On1, Off2 i On2 tak, aby każda z nich trwała 5 minut.
      1. Przejdź do ustawień kontroli próbnej i wybierz Czas trwania ścieżki 30 minut.
      2. Przygotuj główną regułę, dostosowując Warunek: Czas na 20 minut, wybierając Ustawienia i zmień 30 na 20 minut. Potwierdź za pomocą Ok.
         UWAGA: Warunkiem rozpoczęcia ścieżki powinno być przebywanie obiektu na arenie przez 2 sekundy. W ten sposób system automatycznie rozpocznie śledzenie, gdy mysz znajdzie się na arenie.
      3. Utwórz regułę podrzędną dla stymulacji światłem: Przejdź do pozycji Struktury, więcej i wybierz opcję Reguła podrzędna.
      4. Nadaj mu nazwę, taką jak protokół stymulacji światłem.
      5. Umieść go poniżej głównej reguły i rozłóż dwa pola, zaznaczając niebieski obszar za pomocą kursora myszy.
      6. Przejdź do Warunki, Czas i nadaj mu nazwę, np. Światło włączone 1.
      7. Dostosuj warunek jest spełniony po 5 minutach. Potwierdź przyciskiem Ok.
      8. Umieść pole bezpośrednio za polem Początek reguły podrzędnej, pociągając je do czarnej linii.
      9. Przejdź do punktu Akcja | Niestandardowy sprzęt i nazwij go: światło włączone 1.
      10. Wybierz Akcja do wykonania jako Wyjście 1 Wysokie i potwierdź przyciskiem OK.
      11. Umieść pudełko bezpośrednio za polem Warunek.
          UWAGA: Teraz po 5 minutach eksperymentu powinna rozpocząć się stymulacja światłem.
      12. Powtórz kroki, aby zdefiniować warunek czasowy Po 5 minutach i akcję Wyjście 1 Niskie, aby zatrzymać stymulację świetlną po kolejnych 5 minutach.
      13. Powtórz kroki ponownie, aby zaprogramować kolejną próbę wyłączania i włączania światła.
      14. Przejdź do punktu menu Struktury | Odwołanie do reguły podrzędnej i sprawdź, czy odwołanie należy do właściwej reguły podrzędnej.
      15. Wybierz warunki początkowe jako Bez opóźnienia i warunki zatrzymania jako Wykonaj raz na warunek początkowy. Potwierdź przyciskiem Ok.
      16. Umieść pole odniesienia między polem akcji 1 a polem warunku 2 reguły głównej i narysuj linię od pola Akcja - ścieżka początkowa do pola Odniesienie.
          UWAGA: Teraz reguła główna bezpośrednio uruchamia regułę podrzędną po uruchomieniu ścieżki.
   6. Zdefiniuj ustawienia wykrywania, aby pokazać systemowi, co powinien śledzić.
      1. Przejdź do pozycji Ustawienia wykrywania i wybierz pozycję Ustawienia wykrywania 1.
      2. Umieść mysz testową na arenie i wybierz opcję Automatyczna konfiguracja.
      3. Wybierz gryzonia jako typ zwierzęcia i użyj przekleństwa myszy, aby narysować ramkę wokół myszy na arenie. Potwierdź wyniki OK? pytanie za pomocą Tak.
   7. Zdefiniuj listę badań dla wszystkich zwierząt doświadczalnych, które powinny być śledzone.
      1. Przejdź do Listy prób i zaplanuj wszystkie zwierzęta do zarejestrowania dzisiaj: Wybierz dodaj próby i wybierz liczbę.
      2. Zaznacz wszystkie warunki zdefiniowane wcześniej dla każdej myszy.
      3. Nazwij poprawnie identyfikator zwierzęcia i leczenie, aby później uprościć analizę.
         UWAGA: Animal-ID jest nieistotny dla systemu i ważny tylko dla późniejszej analizy danych przez eksperymentatora. Grupowanie w grupie leczenia i kontroli jest ważne, aby system wiedział, jak grupować i jak porównywać wszystkie ścieżki w późniejszych krokach analizy.
   8. Przejdź do sekcji Pozyskiwanie i rozpocznij eksperyment.

4. Eksperyment Open Field (lęk)

1. Przyprowadź eksperymentalną mysz do pokoju behawioralnego tuż przed eksperymentem, aby zapewnić odpowiedni poziom lęku.
   UWAGA: Eksperymenty behawioralne powinny być przeprowadzane w ciemnej fazie, kiedy myszy nie śpią i zawsze w tym samym przedziale czasowym, aby zapewnić porównywalność.
2. Połącz mysz za pomocą tulei ze źródłem światła, delikatnie dociskając ją do siatki klatki.
3. Umieść go w klatce ze świeżą ściółką na 10 minut, aby zaaklimatyzował się do świetlnego.
4. Rozpocznij akwizycję, naciskając przycisk Start w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT).
5. Przenieś mysz z czekającej klatki do lewego górnego rogu otwartego pola. Zdejmij ramię w ciągu 2 sekund, aby uniknąć śledzenia ramienia zamiast myszy.
6. Opuść pole widzenia myszy podczas eksperymentu i zachowaj spokój.
7. Po 20 minutach, gdy eksperyment zostanie zakończony, wyjmij mysz z labiryntu, odłącz świetlny i włóż go z powrotem do klatki domowej.
8. Przynieś mysz z powrotem do placówki.

5. Labirynt Barnesa (nauka)

1. Przynieś wszystkie myszy eksperymentalne do pokoju behawioralnego na około 1 godzinę przed eksperymentem.
2. Przygotuj labirynt Barnesa, zamykając wszystkie otwory z wyjątkiem jednego, pod którym znajduje się skrzynka ewakuacyjna. Umieść ścianę z kartonu na środku platformy, która jest obszarem początkowym dla myszy.
3. Podłącz jedną mysz do źródła światła (tuleja na świetlnym) przy obu implantach.
4. Umieść mysz bezpośrednio w środku labiryntu Barnesa w ścianie kartonu, co uniemożliwi mysz bieganie przed rozpoczęciem eksperymentu.
5. Naciśnij Start w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT) i wyjmij karton.
   UWAGA: Oprogramowanie śledzi mysz do momentu osiągnięcia właściwego otworu, ale należy być przygotowanym na ręczne zatrzymanie próby na wypadek, gdyby oprogramowanie nie rozpoznało przejścia otworu.
6. Wyjmij mysz z labiryntu i usuń połączenie z świetlnym.
   UWAGA: Jeśli jest to dzień treningowy z kilkoma próbami na mysz, pozostaw mysz w poczekalni obok pokoju behawioralnego do czasu rozpoczęcia następnej sesji treningowej. Jeśli był to dzień testowy, w którym na mysz przypadała tylko jedna próba testowa, przynieś mysz z powrotem do placówki.

6. Analiza danych (Przykładowe dane Open Field z 4 wyróżniającymi się próbami)

1. Oprogramowanie do śledzenia wideo (np. Ethovision XT)
   1. Zdefiniuj grupy eksperymentalne i próby w profilu danych.
      1. Przejdź do pozycji Profile danych po lewej stronie i wybierz opcję Leczone a kontrolne.
      2. Przejdź do pozycji Zagnieżdżanie w nowym oknie w lewym środkowym rogu i wybierz pozycję Stan kontroli próbnej.
      3. Wybierz przedział stanu z Akcja elementu: rozpocznij ścieżkę do akcji elementu: światło zapala się WŁĄCZONE 1.
      4. Umieść pole zagnieżdżania między polem Leczenie pola filtru a odpowiednim polem wyników.
         UWAGA: Ten zdefiniowany interwał to Off1, który opisuje pierwsze 2.5 minuty eksperymentu, w których nie występuje stymulacja światłem.
      5. Powtórz kroki dla interwałów On1 (od elementu Akcja: światło zapala się 1 do elementu Akcja: światło gaśnie 1), Off2 (od elementu Akcja: światło gaśnie 1 do elementu światło zapala się 2) i On2 (od elementu Akcja: światło zapala się 2 do elementu Akcja: stop track).
      6. Powtórz 4 interwały dla grupy filtrów kontrolnych.
         UWAGA: Każda skrzynka lęgowa musi mieć własną skrzynkę wyników o nazwach Off1, On1, Off2, On2. Teraz zarówno grupa leczona, jak i kontrolna są podzielone na 4 różne próby stymulacji światłem, które są analizowane oddzielnie.
   2. Zdefiniuj parametry do analizy w profilu analizy.
      1. Przejdź do sekcji Profile analizy po lewej stronie i wybierz opcję W strefach.
      2. Wybierz opcję Zmienna zależna w strefie i wybierz opcję Wyśrodkuj jako strefę.
      3. Kliknij dwukrotnie na środku i wybierz dowolny z wybranych punktów i wybierz tylko na środku.
      4. Przed wyjściem z okna przejdź do Statystyki próbne i wybierz Częstotliwość, Skumulowany czas trwania i Opóźnienie na początku.
      5. Dodaj zmienną zależną Odległość przeniesiona.
         UWAGA: W obszarze Statystyka grupy wybierz, czy jako błąd ma być używany błąd standardowy, czy odchylenie standardowe. Dzięki temu profilowi dostępne są dane dotyczące czasu spędzonego w centrum, wpisów w centrum i całkowitego przebytego dystansu.
   3. Wyodrębnianie danych
      1. Przejdź do sekcji Wyniki i wybierz pozycję Statystyki i wykresy.
      2. Naciśnij przycisk Oblicz, aby wyświetlić analizowane dane.
         UWAGA: Statystyka próby zawiera informacje o każdej pojedynczej statystyce myszy, a statystyki grupowe analizują średnią i błąd dla obu grup, podzielonych na 4 próby z odpowiadającym im wykresem słupkowym.
      3. Naciśnij Eksportuj dane i wybierz statystyki próby oraz lokalizację do zapisania.
         UWAGA: Wyeksportowane dane są zapisywane jako plik Excel i z indywidualnymi wartościami dla każdej myszy. W tym pliku Excel identyfikator zwierzęcia pomaga zidentyfikować myszy.
      4. Przejdź do Wizualizacji mapy cieplnej i naciśnij Kreśl mapy cieplne.
      5. Wybierz Wersje próbne po prawej stronie, aby zobaczyć indywidualne mapy popularności dla każdej myszy i wersji próbnej.
      6. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wyeksportuj mapy ciepła jako obrazy.
2. Drukowania
   1. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego na komputerze i oblicz średnie i błędy standardowe (SEM) dla wszystkich 4 prób w każdym mierzonym warunku i grupie.
   2. Generuj wykresy w programie statystycznym (np. Sigma Plot).
      1. Skopiuj średnie i SEM w odpowiedniej kolejności z pliku arkusza kalkulacyjnego do wykresu Sigma. Wiersze muszą zawierać dane dla Off1, On1 itd., a kolumny zawierają próbę, średnią i SEM jako nagłówki.
      2. Zaznacz wszystkie trzy kolumny i przejdź do pozycji Utwórz wykres.
      3. Zaznacz pole Pasek i wybierz niezgrupowane paski z błędem (górny wiersz, trzecie pole).
      4. Potwierdź przyciskiem Zakończ, aby otworzyć nową stronę wykresu.
      5. Oznacz cały wykres, a następnie przejdź do strony głównej, zaznacz pole Wykres po lewej stronie i naciśnij Eksportuj. Wybierz folder docelowy i wybierz MetaFile (*.wmf) jako format.
         UWAGA: Format .wmf można później przetworzyć w programie graficznym, takim jak CorelDraw.
   3. Obliczanie statystyk dla uzyskanych danych.
      1. Skopiuj surowe dane z arkusza kalkulacyjnego (Off1, On1 itd.) do pojedynczych kolumn Sigma Plot.
      2. Zaznacz kolumny do porównania i przejdź do Analizy, wybierz t-test i naciśnij Uruchom.
      3. Potwierdź format danych Raw za pomocą przycisku Next i uruchom test za pomocą przycisku Zakończ.

Results

Celem tego protokołu jest zmierzenie zmian w zachowaniu genetycznie zmodyfikowanych myszy podczas eksperymentu optogenetycznego. Manipulacja optogenetyczna odbywa się poprzez wstrzyknięcie wektora wirusowego związanego z adeno. Stymulacja światłem u swobodnie poruszających się myszy jest możliwa poprzez wszczepienie włókna świetlnego bezpośrednio nad obszarem zainteresowania.

W Rysunek 4 przedstawia wyniki eksperymentu optogenetycznego. Silna aktywacja pobudzających neuronów piramidowych w regionie IL poprzez ChR2 zwiększyła zachowania związane z lękiem na otwartym polu. ChR2 wstrzyknięto w region IL mPFC u myszy Nex-Cre w celu ekspresji w neuronach piramidowych (Figura 4A). Podczas dwóch testów lękowych, Open Field (Rysunek 4B,C) i test karmienia z tłumieniem nowości (Figura 4F,G), ChR2 jest stymulowany niebieskim światłem i aktywuje neurony piramidowe. Jako kontrolę, inna grupa myszy otrzymała zastrzyk fluoroforu tdTomato zamiast ChR2 (Rysunek 4D, G). W takim eksperymencie lęk definiuje się jako unikanie jaśniejszego obszaru centralnego. Myszy wykazują wrodzone unikanie otwartych przestrzeni, ponieważ obawiają się drapieżników.

W eksperymencie Open Field, pokazanym w Rysunek 4B, myszy przeprowadziły 4 próby po 5 minut każda. W próbach 1 i 3 nie stwierdzono stymulacji światłem (Off1,2), a w próbach 2 i 4 przeprowadzono stymulację światłem niebieskim o częstotliwości 20 Hz (impuls świetlny 5 ms) i natężeniu 1 mW (On1,2). Mapy cieplne pokazują, że w grupie eksperymentalnej czas trwania centrum różnił się między próbami Off i On. Podczas stymulacji światłem myszy preferencyjnie pozostają w strefie granicznej. Zwierzęta kontrolne również preferują granicę, ale nie zmieniają swojego zachowania pod wpływem stymulacji światłem. W Rysunek 4C, główne pomiary behawioralne podczas eksperymentu Open Field są pokazane dla grupy eksperymentalnej. Jeśli dane przeszły test Shapiro-Wilka dla normalności, statystyki zostały wykonane za pomocą niezależnego dwustronnego testu t. Jeśli test normalności nie powiódł się, jako alternatywę nieparametryczną stosowano test sumy rang Manna-Whitneya. Do tego rodzaju eksperymentów wybrano porównanie w grupie, aby zbadać, czy stymulacja światłem może bezpośrednio zmieniać zachowanie lękowe w czasie, niezależnie od wyjściowego lęku zwierząt doświadczalnych i kontrolnych. Czas trwania ośrodka znacznie się skrócił podczas obu prób stymulacji światłem, co wskazuje na zwiększony poziom lęku. Całkowita przebyta odległość nie uległa zmianie, co pokazuje, że zachowanie lokomotoryczne nie uległo zmianie. Zwiększono liczbę wejść do ośrodka, choć nie znacząco. W Rysunek 4D pokazane są dane grupy kontrolnej. Zwierzęta kontrolne nie wykazywały żadnych zmian behawioralnych między próbami Off i On w żadnym z analizowanych parametrów, co pokazuje, że stymulacja światłem lub implantacja nie spowodowały obserwowanych efektów. Podsumowując, test ten wykazuje zwiększony niepokój podczas stymulacji światłem neuronów piramidowych IL za pośrednictwem ChR2.

W Rysunek 5, dane nieudanego eksperymentu optogenetycznego są pokazane dla labiryntu Elevated-Plus. Podczas eksperymentu Elevated-Plus Maze, który jest przedstawiony w Rysunek 5A, myszy wykonały 6 prób po 3 minuty każda. W próbach 1, 3 i 5 nie wykonywano stymulacji światłem (Off1, Off2, Off3), a w próbach 2, 4 i 6 wykonywano stymulację światłem niebieskim o częstotliwości 20 Hz (impuls świetlny 5 ms) i intensywności 1 mW (On1, On2, On3). W tych przykładowych wynikach długość protokołu optogenetycznego i budowa samego labiryntu nie były odpowiednie dla transgenicznej linii myszy. W Rysunek 5B, można zobaczyć, że kilka myszy ześlizgnęło się z labiryntu tylnymi łapami lub nawet upadło. Kiedy tak się stało, myszy dostały drugą szansę na wykonanie EPM dzień później. Jeśli ponownie upadły, były wyłączone z analizy. Kiedy myszy ześlizgnęły się kilka razy, ale udało im się pozostać w labiryncie, dane były analizowane normalnie. Niemniej jednak dane muszą być interpretowane bardzo ostrożnie, a zwierzęta kontrolne mają większe znaczenie. Myszy Nex-Cre miały trudności motoryczne, aby utrzymać się na wąskich, otwartych ramionach. Aby tego uniknąć, małe ścianki o wysokości 1 cm pomogłyby w bezpiecznym trzymaniu tylnych łap na ramionach labiryntu. Zarówno mapy cieplne, jak i wykresy pokazują, że myszy eksperymentalne, jak również kontrolne, zaczęły unikać otwartych ramion od próby 2 (On1) na (Rysunek 5C-E). Czas na otwartych ramionach jest znacznie skrócony dla obu grup, podobnie jak wejścia z otwartymi ramionami. Analizując grupę eksperymentalną, uzyskano jedynie dane sugerujące duży efekt przeciwlękowy stymulacji świetlnej, ponieważ czas na otwartym ramieniu i wejściu z otwartym ramieniem jest znacznie skrócony podczas próby On1. Jednak porównując te dane z grupą kontrolną, która wykazuje to samo zachowanie, staje się jasne, że obserwowane zachowanie nie jest zapośredniczone przez stymulację optogenetyczną, ale przez unikanie otwartych ramion w ogóle z powodu przyzwyczajenia do labiryntu. Dane te podkreślają znaczenie odpowiedniej grupy kontrolnej w celu rozróżnienia między efektami behawioralnymi, w których pośredniczy stymulacja optogenetyczna, a możliwą adaptacją behawioralną. Ponadto dane te rzucają światło na znaczenie prawidłowego dostosowania konfiguracji eksperymentalnej do konkretnej linii musu i pytania eksperymentalnego.

Aby zweryfikować i wzmocnić zebrane dane behawioralne, mózgi myszy są usuwane po ostatnim eksperymencie, aby kontrolować poprawność wstrzyknięcia i implantacji (Rysunek 6). Mózgi są utrwalane w 4% paraformaldehydzie i usuwane z czaszki. Mózgi są odwadniane w 30% sacharozie przez 1-2 dni, a następnie krioplastowane. Wycinki koronalnego mózgu o grubości 40 μm są myte i montowane na szkiełkach obiektywowych superfrost za pomocą podłoża montażowego zawierającego DAPI, które barwi jądra komórkowe. Umożliwia to identyfikację obszarów docelowych w warstwach koronalnych. Fluorescencja znacznika YFP lub tdTomato sama w sobie wskazuje na miejsce wstrzyknięcia wirusa. W Rysunek 6B przedstawiono przykładowe miejsca wstrzyknięć ChR2-YFP po lewej (żółty) i tdTomato po prawej (czerwony). Za pomocą szablonu, zaadaptowanego z atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin⁴⁵, można zidentyfikować region IL. Na obu slajdach narzędzie optogenetyczne ulega ekspresji w regionie IL, ale także w sąsiednich obszarach mózgu. Dla poprawnej interpretacji należy zapoznać się z rozprzestrzenianiem się niebieskiego światła w tkance mózgowej⁸ (Rysunek 1D,E). Można zauważyć, że niebieskie światło dotrze do obszaru DP poniżej IL przy zaledwie mniej niż 5% początkowego natężenia światła 1 mW na końcówce światłowodu (niebieska linia w Rysunek 1D)8. Dodatkowo, niewielka ilość światła może iść w górę do obszaru PrL z powodu rozpraszania wstecznego⁴⁷. W związku z tym można powiedzieć, że obszar IL jest oświetlony najmocniej, jednak sąsiednie obszary, takie jak obszar DP i PrL, mogą być również lekko stymulowane. W związku z tym stymulacja specyficzna dla komórek IL nie jest gwarantowana i należy przeprowadzić analizę immunohistochemiczną sąsiednich regionów, aby sprawdzić, czy aktywność komórek PrL i DP jest modulowana przez światło. W Rysunek 6C, pokazana jest kolejna ważna kontrolka: specyfika linii myszy Nex-Cre. Poprzez barwienie przeciwciałami przeciwko dwóm typom komórek w regionie IL, neuronom o zasadzie glutaminergicznej i interneuronom GABA-ergicznym, można zauważyć, że ekspresja ChR2-YFP występuje tylko w neuronach glutaminergicznym, a nie w neuronach GABA-ergicznych.

Podsumowując, nasze eksperymenty pokazują, że dzięki manipulacji optogenetycznej podczas testów behawioralnych, można zaobserwować zmiany w zachowaniu związanym z lękiem. Używając więcej niż jednego testu dla tego samego zachowania, można wyciągnąć wiarygodne wnioski. Ponadto analiza immunohistochemiczna potwierdza uzyskane dane. Nasze eksperymenty sugerują, że specyficzna aktywacja neuronów piramidowych w korze podlimbicznej zwiększa zachowania związane z lękiem w niektórych testach.

Ryc. 4: Optogenetyczna aktywacja neuronów piramidowych IL zwiększa zachowanie lękowe. Stymulacja światłem podczas eksperymentów: stymulacja 473 nm, 1 mW, 20 Hz. A) Schematyczny rysunek miejsca wstrzyknięcia i implantacji ChR2-YFP lub tdTomato do IL. Podczas eksperymentu neurony piramidowe w regionie IL mPFC są aktywowane przez ChR2. Saggital wycinki mózgu zaadaptowane z atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklina, saggital: boczny o,6. B) Labirynt Open Field z protokołem stymulacji światłem (20 min z 4x5 min naprzemiennymi próbami Off i On; po lewej) oraz mapy cieplne przykładowych myszy z wstrzyknięciem ChR2 (EXP) i tdTomato-iniekcją (CT) we wszystkich 4 próbach eksperymentu (po prawej). Zwierzęta EXP spędzają mniej czasu w centrum OF, gdy są stymulowane niebieskim światłem laserowym. W przypadku zwierząt z tomografią komputerową czas spędzony w ośrodku nie różni się między próbami światła wyłączonego i włączonego. C) Dane grupowe dla zwierząt EXP w OF, n=11. Myszy spędzają znacznie mniej czasu w centrum OF, gdy są stymulowane niebieskim światłem (Off1 39,49±6,9 s, On1 19,87±4,47 s, Off2 28,13±8,55 s, On2 23,42±9,32 s, Off1:On1, t-test, p = 0,033, *; Off1:On2, MWRS, p=0,049, *). Nie ma to wpływu na przebytą odległość (Wył.1 2703.09±292.65 cm, Wł.1 3113.4±491.15 cm, Wył.2 3331.86 ±482.62 cm, Wł.2 3082.17±658,61 cm). # środkowych wpisów zmniejsza się z czasem, ale nie wykazują znaczących różnic (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Dane grupowe dla zwierząt poddanych TK w OF, n=15. Czas, jaki myszy spędzają w środku OF, przebyta odległość, # środkowych wejść nie zmienia się między próbami włączania i wyłączania światła (czas w centrum Off 116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Odległość Wył.1 3399.69±296.77 cm, Wł.1 3210.6±446.9 cm, Wył.2 3030.28±513.83 cm, Wł.2 2955±617.7 cm; # środkowych wpisów Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). Myszy CT wykazują znacznie wyższy wyjściowy lęk (Off1 EXP:CT, MWRS, p = 0,005, **). Wartości są średnie±S.E.M. * wskazują istotne różnice (p≤0,05), ** wskazują istotne różnice (p≤0,01). test t zawsze dwustronny, MWRS: test sumy rang Manna-Whitneya; IL: kora podlimbiczna; BLA: ciało migdałowate podstawno-boczne; DRN: jądra szwu grzbietowego; OF: Otwarte pole; CT: zwierzęta kontrolne; EXP: zwierzę doświadczalne; L: światło. Ten rysunek został zmodyfikowany z Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ i z Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Eksperyment EPM nie wykazał efektów behawioralnych u myszy Nex-Cre. Stymulacja światłem podczas eksperymentów: stymulacja 473 nm, 1 mW, 20 Hz. A) Labirynt Elevated-Plus z protokołem stymulacji światłem (18 min, 6x3 min, naprzemienne próby Off i On). B) Dane grupowe dla myszy, które "ześlizgnęły się", są zawarte w danych, łącznie n = 23. Myszy Nex-Cre miały tendencję do ześlizgiwania się z otwartego ramienia tylnymi łapami, niezależnie od grupy eksperymentalnej (po lewej). Tylko myszy, które pozostały w labiryncie we wszystkich 6 próbach, były brane pod uwagę w późniejszych analizach. Slip offy w pierwszej fazie Off1 są powodem do późniejszego unikania otwartych ramion (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Wykres kołowy (po prawej) pokazuje myszy spadające z labiryntu w ciągu 18 minut z 42,42%. Tylko 57,57% ukończyło eksperyment. C) Mapy cieplne przykładowych myszy EXP i CT we wszystkich 6 próbach eksperymentu. Obie grupy wykazują skrócenie czasu trwania otwartego ramienia po badaniu Off1. D) Dane grupowe dla zwierząt EXP w EPM, n=12. Czas spędzony w otwartych ramionach uległ znacznemu skróceniu podczas pierwszych dwóch prób i stale po ich zakończeniu (Off1 73,91±12,22 s, On1 36,15±14,65 s, Off2 15,61±6,23 s, On2 19,49±7,51 s, Off3 9,36±4,44 s, On3 7,96±3,47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). Nie ma to wpływu na przebytą odległość (Wył.1 679.96±71.63 cm, Wł.1 712.24±112.82 cm, Wył.2 717.49±97.39 cm, Wł.2 782.51±81.11 cm, Wył.3 722.11±68.60 cm, Wł.3 663.90±106.57 cm). Liczba wejść z otwartym ramieniem znacznie spada z Off1 do On1, a następnie pozostaje stała (Off1 8.08±1.08, On1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, test t, p=0,002, **). Czas spędzony w środku EPM zmniejsza się wraz z próbami, ale nie wykazuje znaczącej różnicy między próbą Off a On (Off1 41,71±5,34 s, On1 31,2±4,59 s, Off2 19,8±3,44 s, On2 24,49±3,38 s, Off3 20,37±4,77 s, On3 18,85±4,07 s). E) Dane grupowe dla zwierząt poddanych badaniu TK w EPM, n=11. Dane CT pokazują te same znaczące spadki, co dane EXP, co wskazuje, że eksperyment nie zadziałał prawidłowo (Czas w otwartych ramionach Off1 86,92±12,74 s, On1 33,78±14,38 s, Off2 18,01±11,61 s, On2 16,41±9,61 s, Off3 11,36±4,01 s, On3 5,43±2,07 s. Off1:On1, MWRS, p=0,009, **; Odległość Wył.1 705.11±88.36 cm, Wł.1 789.45±77.53 cm, Wł.2 724.74±80.49 cm, Wł.2 676.57±111.99 cm, Wył.3 716.99±132.47 cm, Wł.3 663.03±132.46 cm; Wejścia z otwartym ramieniem Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p=0.01, *; Czas spędzony w centrum Wył.1 35,89 s, Wł.1 29,25±3,96 s, Wył.2 22,17±3,58 s, Wł. 2 15,9±2,57 s, Wył.3 13,86±4,2 s, Wł. 3 16,89±5,75 s). Wartości są średnie, ± S.E.M. * wskazują istotne różnice (p≤0,05), ** wskazują istotne różnice (p≤0,01). test t jest zawsze dwustronny, MWRS: test sumy rang Manna-Whitneya; EPM: Labirynt Elevated-Plus; CT: zwierzęta kontrolne; EXP: zwierzę doświadczalne; OA: otwarte ramiona. Ten rysunek został zmodyfikowany z Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ i z Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Strona iniekcyjna ChR2 i tdTomato w swoistości IL i Nex-Cre. A) Schematyczny rysunek miejsca implantacji na koronalnych wycinkach mózgu przy AP + 1,66 mm, ml 0,3 mm, DV -1,8 mm, z jednostronnym wstrzyknięciem i implantacją (zaadaptowany z atlasu mózgu myszy, Paxinos i Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Przykładowe miejsca wstrzyknięcia ChR2-YFP (po lewej, żółty) i tdTomato (po prawej, czerwony) połączone z jądrami komórkowymi barwionymi DAPI (niebieskie) u myszy Nex-Cre. Podziałka liniowa 1 mm. Wstawki wykazują duże powiększenie obszaru IL. Podziałka 150 μm. Białe pola wskazują położenie wstawek. C) Górny rząd: konfokalne obrazy lewego obszaru IL myszy Nex-Cre wybarwione CamKII jako markerem neuronów glutaminergicznym (niebieski) i ChR2-YFP (żółty) lub Gad67 jako markerem neuronów GABA-ergicznych (zielony), myszy Nex-Cre. Dolny rząd: kolokalizacja ChR2-YFP (żółty) z CamKII (po lewej, niebieski), ale nie z Gad67 (po prawej, zielony), pokazująca specyficzność myszy Nex-Cre dla neuronów glutaminergicznych. Podziałka 50 μm. PrL: kora przedlimbiczna; IL: kora podlimbiczna; DP: grzbietowa kora szypułkowa. Ten rysunek został zmodyfikowany z Berg et al. 2019, PLoS One⁴³ i z Berg 2019⁴⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wykorzystanie światła do manipulowania sygnalizacją neuronalną jest metodą z wyboru już od prawie dekady. Od 2005 roku liczba opublikowanych artykułów na temat rozwoju nowych narzędzi optogenetycznych 4,6,8,14,49,50,51 oraz badań, w których takie narzędzia są wykorzystywane do badania obwodów mózgowych 21,23,40,43,52 , znacznie zwiększony. Z jednej strony, przy ogromnej różnorodności wstrzykiwanych narzędzi optogenetycznych, wariantów implantacji, transgenicznych linii myszy i eksperymentów behawioralnych, możliwości eksperymentów są wielorakie i nieograniczone. Z drugiej strony, możliwość popełnienia błędów w doborze warunków eksperymentalnych jest bardzo duża, a eksperymenty są na tyle specyficzne, że często trudno jest je porównać z innymi badaniami.

Kroki krytyczne
Jednym z ważnych krytycznych kroków tego protokołu jest właściwe planowanie. Wybór narzędzia optogenetycznego powinien być zgodny z pytaniem naukowym. Czy konieczne jest tylko manipulowanie ogólną aktywnością neuronu lub synapsy? W takim razie dobrym wyborem są komercyjnie dostarczane narzędzia, takie jak ChR2^21,25,27 i Arch³⁷. Ale poza tym, jeśli ma się manipulować jednym specjalnym układem neuroprzekaźników lub nawet pojedynczym receptorem, indywidualna chimera receptora jest często lepszym wyborem ^3,6. Kilka chimer receptorowych z GPCR, tzw. Opto-XR, oraz wytyczne do ich wytwarzania są już dostępne ^4,50. Oprócz wyboru narzędzi optogenetycznych, kluczowe znaczenie ma również linia myszy w połączeniu z eksperymentem behawioralnym. Różne szczepy tła, takie jak na przykład C57Bl/6 i BALB/cByJ, wykazują różne fenotypy behawioralne pod pewnymi względami^53,54. Myszy C57Bl / 6 mają niski wyjściowy lęk i mogą być używane do manipulacji przeciwlękowej, podczas gdy BALB / cByJ wykazują wyższy poziom lęku i dlatego są bardziej wrażliwe na leki przeciwlękowe. Dodatkowo, transgeniczne warianty tych szczepów tła mogą również różnić się fenotypem⁴⁸. Dzięki odpowiedniej kombinacji specyficznych promotorów w połączeniu z narzędziem optogenetycznym i transgeniczną linią myszy, prawie każda pożądana populacja komórek może być ukierunkowana.

Kluczowym krokiem podczas operacji jest celowanie we właściwe miejsce. Za pomocą atlasu mózgu myszy można ustalić właściwe współrzędne osi przednio-tylnej i przyśrodkowej-bocznej oraz głębokość struktury⁴⁵. W rzeczywistości każda czaszka ma nieco inną formę i wielkość. Dlatego współczynnik F⁴⁶ do regulacji współrzędnych stereotaktycznych jest bardzo ważny, podobnie jak prawidłowe mocowanie nosa i ucha podczas operacji stereotaktycznej. Jeśli głowa myszy jest przechylona, kaniula iniekcyjna nie będzie celować w żądany obszar zainteresowania.

Dodatkowo krytyczna jest również średnica kaniuli iniekcyjnej. Jeśli jest zbyt mały, żaden wirus nie może zostać uwolniony do tkanki, jeśli jest zbyt szeroki, kaniula wycieknie roztwór wirusa w drodze do obszaru zainteresowania. Jeśli wszczepiony światłowód kończy się bezpośrednio nad regionem docelowym, ekspresja wirusa w obszarach kory mózgowej powyżej nie ma znaczenia. Ale jeśli implant zostanie umieszczony nad innymi obszarami w celu stymulacji zakończeń aksonów, aksony górnych regionów kory również zostaną aktywowane przez światło i sfałszują uzyskane dane. Na przykład: Region IL i region przedlimbiczny (PrL) rzutują na ciało migdałowate^{podstawy 55,56}, ale mają zupełnie inne funkcje i role w modulacji lęku^26,57. Jeśli implant zostanie umieszczony powyżej ciała migdałowatego w celu aktywacji zakończeń aksonów z obszaru IL, a podczas iniekcji roztwór wirusa został również umieszczony w PrL z powodu niewłaściwej kaniuli iniekcyjnej, ryzyko aktywacji również końcówek aksonów z PrL jest bardzo wysokie.

Podczas przygotowania czaszki do zamocowania implantu, rzadkie użycie podkładu i spoiwa ma kluczowe znaczenie dla niezawodnego i trwałego mocowania. Jeśli 2-składnikowy system adhezyjny nie zostanie nałożony cienko, cement dentystyczny może oderwać się od czaszki po kilku dniach lub tygodniach. Ponadto czaszka musi być całkowicie wysuszona przed zamocowaniem implantu, ponieważ w przeciwnym razie cement nie przylgnie prawidłowo do czaszki.

Krytyczne kroki istnieją również w behawioralnej części tego protokołu. Po pierwsze, bardzo ważna jest budowa labiryntu. W każdym układzie behawioralnym istnieje kilka wariantów w literaturze dotyczącej wielkości i formy, a także samej procedury 58,59,60. Ważne jest, aby wybrać wariant, który sprawi, że dane będą porównywalne i powtarzalne. Należy również wziąć pod uwagę specjalne wymagania dotyczące używanych linii myszy^43,48. W danych reprezentatywnych dla EPM można zauważyć, że kilka myszy Nex-Cre wypadło z labiryntu lub kilkakrotnie się ześlizgnęło (ryc. 2b). Dla tych myszy lepszą alternatywą byłby labirynt z małym murkiem wokół otwartych ramion.

Po drugie, bardzo ważne jest, aby wszystkie warunki zewnętrzne w pomieszczeniu były stałe⁶¹, w przeciwnym razie różne grupy myszy nie byłyby w ogóle porównywalne. W związku z tym bardzo ważne jest, aby wybrać czas eksperymentu jako taki, w którym zestaw eksperymentalny jest wolny, a eksperymentator jest zawsze obecny. Ponadto należy wziąć pod uwagę zdarzenia w budynku, takie jak prace budowlane, testowanie jakichkolwiek systemów (alarm przeciwpożarowy) lub dzień sprzątania obiektu myszy, aby uniknąć ingerencji w uzyskane dane.

Wreszcie, warunki obsługi i przetrzymywania mają kluczowe znaczenie dla eksperymentów behawioralnych. Podczas implantacji myszy muszą być trzymane w jednym pomieszczeniu ze względu na ryzyko obrażeń spowodowanych przez inne myszy. Aby zapewnić dobrą porównywalność między grupami i niski poziom błędu w jednej grupie, każda mysz musi mieć ten sam rozmiar klatki i wzbogacenie. W przypadku eksperymentów związanych z lękiem, pojedyncze trzymanie ma pewne zalety, ponieważ samce myszy trzymane w jednym pomieszczeniu wykazują niższy wyjściowy poziom lęku, mniejszą zmienność poziomu lęku i mniej objawów depresyjnych^15,16. Samce myszy trzymane w grupie mogą znacznie różnić się poziomem lęku ze względu na hierarchię wśród myszy. Oprócz pomieszczenia inwentarskiego ważne jest również stałe i równe obchodzenie się ze wszystkimi myszami i grupami. Chwytanie myszy w celu połączenia światłowodu na implancie jest bardzo stresujące. Dlatego ta procedura musi być taka sama dla każdej myszy, co oznacza tę samą technikę i tego samego eksperymentatora. Co więcej, czas przyzwyczajenia w klatce oczekiwania, który ma na celu uspokojenie myszy po stresującej procedurze łączenia, musi również mieć takie same warunki pod względem czasu trwania, śmieci i pozycji w labiryncie. Obsługa w obiekcie myszy ma również kluczowe znaczenie dla późniejszej wydajności behawioralnej. Zwierzęta doświadczalne i kontrolne nie powinny być czyszczone w różne dni lub przez różne osoby, ponieważ jest to również stresujące dla myszy. Ponadto dzień sprzątania nie powinien być dniem eksperymentalnym, aby uniknąć różnic w zachowaniu.

Rozwiązywanie problemów
Istnieje kilka problemów, które mogą wystąpić podczas protokołu. Na przykład wiercenie w całości w czaszce podczas operacji stereotaktycznej może uszkodzić naczynia krwionośne. Zwykle występuje silne krwawienie, zwłaszcza powyżej bregmy i lambdy. Jeśli tak się stanie, nie próbuj zatamować krwawienia patyczkami kosmetycznymi, ponieważ mają one tendencję do jeszcze większego krwawienia z naczynia ze względu na ich chłonność, zamiast tego należy bezpośrednio spłukać NaCl.

Może się również zdarzyć, że wstrzyknięcie ciśnieniowe roztworu wirusa nie działa. W takim przypadku może się zdarzyć, że parafilm, strup z otworu zadziorowego lub tkanki mózgowej, zatyka końcówkę kaniuli. W takim przypadku należy powoli wyjąć kaniulę z mózgu bez zmiany osi x lub y i za pomocą pęsety usunąć 1-2 mm przedniej części końcówki kaniuli. Przed ponownym opuszczeniem kaniuli przetestuj funkcjonalność, wywierając niewielki nacisk, aby sprawdzić, czy wirus wydostaje się z końcówki kaniuli. Aby uniknąć zaparć, należy opuścić kaniulę ze stałą prędkością i nie przerywać ruchu, dopóki nie zostanie osiągnięta najgłębsza głębokość strony iniekcyjnej. Jeśli usunięta zostanie zbyt duża część końcówki kaniuli, a średnica będzie zbyt duża, kaniula uszkodzi tkankę, a ryzyko nałożenia wirusa na raz wzrośnie. Dlatego upewnij się, że tylko zatkana część końcówki została ostrożnie usunięta.

Podczas eksperymentu behawioralnego konfiguracja eksperymentu w oprogramowaniu do śledzenia wideo (np. Ethovision XT) może powodować problemy. Jeśli na przykład strumień świetlny nie działa prawidłowo, może to wynikać z kilku powodów. Pulser musi zostać otwarty, zaprogramowany i uruchomiony przed otwarciem Ethovision XT. Sprzęt musi być poprawnie wybrany w "Konfiguracji eksperymentalnej" (krok 3.2.2.4). W przypadku wybrania niewłaściwego IO-Boxa lub czegokolwiek innego niż "Costume Hardware", urządzenie Pulser nie może być kontrolowane przez Ethovision. Jeśli test strumienia świetlnego zakończy się pomyślnie, ale zaprogramowany protokół świetlny w "Próbnych ustawieniach sterowania" nie działa podczas akwizycji, może to oznaczać, że podreguła lub odniesienie do podreguły są nieprawidłowo zlokalizowane lub warunki i działania są niejasne. Na przykład: czy odwołanie należy do właściwej reguły podrzędnej? Czy odniesienie jest poprawnie zaprogramowane (np. jak często wykonywana jest reguła podrzędna)?

Dodatkowo może się zdarzyć, że podczas "ustawień detekcji" zwierzę jest odpowiednio śledzone, ale podczas pozyskiwania pojawiają się próbki, w których nie znaleziono obiektu. W takim przypadku sprawdź, czy oświetlenie w pomieszczeniu eksperymentalnym zostało zmienione lub czy coś spowodowało niepożądane cienie w labiryncie. Całe dno labiryntu musi mieć ten sam kolor, ponieważ ustawienie będzie działać tylko dla jednej określonej kombinacji. Jeśli z jakichś powodów nie można uniknąć różnych kolorów lub cieni na dole, zdefiniuj ustawienie wykrywania w najciemniejszej części labiryntu.

Aby zmienić jakiekolwiek ustawienia po nabyciu pierwszych zwierząt, nie należy stosować tych zmian w już używanych ustawieniach. Zduplikuj je, aby je dostosować. Oznacza to również, że już zarejestrowane badanie nie jest już ważne do analizy danych. W takim przypadku nagraj wszystkie zwierzęta dla tej grupy eksperymentalnej z oryginalnymi ustawieniami, a następnie utwórz nowy eksperyment, w którym nagrane filmy są analizowane zamiast śledzenia na żywo. W tym eksperymencie "z wideo" do analizy można wykorzystać kilka ustawień bez utraty porównywalności między zwierzętami, a nawet danych.

Ograniczenia i przyszłe zastosowania
Ta metoda manipulowania zachowaniem za pomocą optogenetyki u swobodnie poruszających się zwierząt również zawiera ograniczenia. Podczas zabiegu odległość dwóch implantów jest ograniczona. W przypadku podwójnej implantacji odległość między dwoma implantami musi być co najmniej równa szerokości aparatu, aby utrzymać implant. Aparat musi opuścić drugi implant do otworu w zadziorach, podczas gdy pierwsze implanty są już zamocowane. Rozwiązaniem tego problemu może być implantacja pod kątem, w której końcówki włókna szklanego mogą być bardzo blisko, podczas gdy ceramiczne ferule nad czaszką mają większą odległość 23,55,56,57,62,63. Wadą implantacji pod kątem jest rozchodzenie się światła. Gdy końcówka włókna jest nachylona, a nie od prostej góry, stymulowany obszar jest inny. W przypadku dwóch obszarów docelowych znajdujących się w bliskiej odległości należy wziąć pod uwagę zmienione położenie stymulacji świetlnej.

Podczas eksperymentu behawioralnego konstrukcja labiryntu może kolidować z kablem optycznym podłączonym do zwierzęcia. Niektóre testy behawioralne, takie jak jasno-ciemne pudełko, zawierają obszar wewnętrzny^64,65, a inne labirynty zawierają przedziały, do których mysz musi wejść. Takich eksperymentów nie można przeprowadzić przy użyciu tej konfiguracji. Alternatywnie system bezprzewodowy może być opcją 22,26,66. Na szczęście niektóre labirynty, takie jak labirynt Barnesa, można urządzić w taki sposób, że myszy są w stanie wejść do odpowiednich przegródek⁶⁷.

Oprócz tych z zamkniętymi strefami, zbyt szerokie labirynty również mogą sprawiać problemy. Im większa powierzchnia labiryntu, tym dłuższy musi być kabel, aby zwierzę mogło przejść do każdej pozycji w labiryncie. Należy uważać, aby zwierzę nie było w stanie nadepnąć na kabel lub złapać go i ugryźć. Rozwiązaniem tego problemu może być konstrukcja zwijająca redundantny kabel. Wadą jest to, że przeciąganie w celu rozwinięcia kabla jest trudne dla myszy. To rozwiązanie lepiej pasowałoby do szczurów. Inną możliwą opcją może być wykonanie stymulacji świetlnej z wyprzedzeniem, a nie w trakcie eksperymentu, oczywiście jest to wykonalne tylko wtedy, gdy wystąpi długotrwały efekt spowodowany stymulacją światłem²³.

Porównanie z istniejącymi/alternatywnymi metodami
Alternatywnymi metodami byłaby chemiczna lub elektryczna stymulacja podczas zachowania ^8,18. Chemiczni agoniści lub antagoniści są w stanie aktywować lub wyciszać neurony za pośrednictwem określonych receptorów, a także mogą manipulować pojedynczymi systemami neuroprzekaźników^38,68. Z jednej strony, swoistość receptorowa jest dość wysoka dla substancji chemicznych, ponieważ specyficzny agonista lub antagonista aktywuje tylko niektóre receptory³⁹. Z drugiej strony, swoistość dla podtypów receptorów z tej samej grupy neuroprzekaźników jest często niewystarczająca. Większość substancji chemicznych wiąże się z co najmniej dwoma podtypami o różnym prawdopodobieństwie⁶⁹. Ponadto substancje chemiczne nie mogą rozróżniać typów komórek neuronalnych, o ile mają te same typy receptorów. Poza tym rozdzielczość czasowa i przestrzenna jest słaba w przypadku manipulacji chemicznych w porównaniu z optogenetyką. Agoniści lub antagoniści są często podawani doustnie³⁵ lub w postaci zastrzyków ogólnoustrojowych ^57,70. Jeśli wlew chemiczny jest wykonywany bezpośrednio w tkance mózgowej, efekty pojawiają się szybciej niż w przypadku aplikacji doustnych, ale nadal w wolniejszym czasie niż w przypadku stymulacji światłem. Ponieważ podawane substancje chemiczne dyfundują w mózgu i nie są specyficzne dla typów neuronów lub regionów mózgu, manipulacja określonymi obwodami mózgu nie jest możliwa.

Stymulacja elektryczna ma wyższą rozdzielczość czasową niż stymulacja chemiczna ^9,14. Rozprzestrzenianie się w tkance neuronalnej jest mniejsze niż w przypadku stymulacji chemicznej, a rozdzielczość przestrzenna jest lepsza niż w przypadku stymulacji chemicznej. Jednak stymulacja elektryczna nie ma możliwości specyficznego zajęcia się różnymi typami komórek neuronalnych lub typami receptorów, ponieważ każdy neuron znajdujący się w pobliżu elektrody będzie reagował na stymulację elektryczną.

Alternatywnymi metodami zachowania u swobodnie poruszających się myszy są na przykład zapisy elektrofizjologiczne w wycinkach mózgu, gdzie pojedyncze neurony lub aksony mogą być modulowane za pomocą optogenetyki, a wywołane efekty można mierzyć za pomocą elektrod rejestrujących ^6,71. Eksperymenty in vitro dają możliwość zbadania molekularnych i komórkowych podstaw stymulacji optogenetycznej, ale mają ograniczenie polegające na tym, że brakuje wewnętrznej łączności i danych wejściowych z innych regionów mózgu. Inną opcją jest zastosowanie optogenetyki w połączeniu z obrazowaniem wielofotonowym ^1,72. W tym przypadku myszy mają nieruchomą głowę i mogą być znieczulone lub obudzić się, aby rozwiązać proste zadania.

Aby przeprowadzić udany eksperyment optogenetyczny, obecnie dostępna jest szeroka gama narzędzi i aplikacji. Dobór narzędzi optogenetycznych i konfiguracji behawioralnej ma kluczowe znaczenie dla odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Jeśli zostanie wybrana odpowiednia kombinacja narzędzi i eksperymentów, optogenetyka pozwala na bezprecedensowe, dogłębne badanie obwodów neuronalnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Pomoże to zrozumieć i opracować nowe strategie terapeutyczne w chorobach psychicznych i poznawczych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glukoza	AlleMan Pharma		Injection s.c. dla szybkiego powrotu do zdrowia
Labirynty behawioralne Kostium	wykonany		Zmierz niepokój
Bepanthen	Bayer		Maść okulistyczna
Betaisodona	Monodipharma		Sterylant zawierający jod
Lornetka Betaisodona	Monodipharma		Maść jodowa
	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160	Chirurgia
Okucia ceramiczne	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Rysownik z włókna ceramicznego	Thorlabs	CSW12.5	Cięcie włókna szklanego
Wirus rodopsyny kanałowej2-YFP	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogenetyczne narzędzie
Sprężone powietrze	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Suszenie czaszki
Układ współrzędnych	Stoelting		Współrzędne stereotaktyczne do operacji
Correl Draw			Graficzna wersja oprogramowania 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Produkcja wycinków mózgu do barwienia
Ethovision XT 14	Noldus		Oprogramowanie do śledzenia behawioralnego
Oprogramowanie statystyczne	Exel
Okucie Polerowanie krążka	Thorlabs	D50-F	Implanty polerskie okrągłe boki
Patchcord światłowodowy podwójny	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Rdzeń tulejki 1,25 mm	, które są połączone z dwoma implantami implantacji obustronnej
Patchcord światłowodowy pojedynczy	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Rdzeń tulejki 1,25 mm	, który jest połączony z implantem za pomocą tulei
Narzędzie do ściągania izolacji z włókien	Thorlabs	T06S13	Usuwanie izolacji z włókna szklanego do implantu
Bibuła filtracyjna	VWR European	516-0300	Pocięte na kawałki do testu karmienia z tłumieniem nowości
Granulki spożywcze	Mü hle Dźwignie	Hö veler Nagerfutter	Żywienie dla myszy
Pipety szklane	Aparat Harvard	GC150-10	Pipety iniekcyjne
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Płynny cement dentystyczny
Lampa grzewcza	efbe-Schott/Phillips	R95E	Zapobiegaj wychłodzeniu myszy po operacji
Płyta grzewcza	Stoelting		Zintegrowany ze współrzędnymi System
Wtrysk kaniula	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	Wszystkie iniekcje i do wiercenia otworu w czaszce
Miot		T 1350	Uziemienie dla Nowości Stłumiony Test żywieniowy
Klatki dla myszy	Zoonlab	405 cm^2	Pojedyncza obudowa do eksperymentów
Optibond FL	Kerr	26684E	Przygotowanie czaszki do implantacji
Włókno szklane	Thorlabs	FT200EMT	Światłowód do implantu
Optogenetics-LED.STSI	Prizmatix		Optogenetyczny zestaw narzędzi do stymulacji światłem podczas eksperymentów behawioralnych
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfuzja myszy w celu usunięcia mózgu
Arkusz polerski 0,02 i mikro; m grit	Thorlabs	LFCF	Implanty polerskie po stronie okrągłej
Arkusz polerski 1 i mikro; m grit	Thorlabs	LF1D	Implanty polerskie po okrągłej stronie
Arkusz polerski 30 i mikro; m grit	Thorlabs	LF30D	Implanty polerskie okrągłe boki
Arkusz polerski 6 i mikro; m grit	Thorlabs	LF6D	Implanty polerskie okrągłe boki
Oprogramowanie Pulser	Prizmatix		Oprogramowanie do sterowania urządzeniami świetlnymi
Rimadyl-Carprofen	Zoetis		Analgesia
Sigma Plot Oprogramowanie			do statystyk
Rękaw	Thorlabs	FT200EMT	Połączenie implantu i świetlnego
SodiumCloride ( NaCl)	Braun	3570410	Płukanie czaszki
Superglue	Pattex Henkel		Aby naprawić włókno szklane w okuciu wirusa
td-Tomato	Penn Vector Core	Addgene 51503	Narzędzie optogenetyczne
Światło UV	KoQGHJ	bezprzewodowe, 1200 mW/cm^2	Lampa polimeryzacyjna do cementu dentystycznego
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Znieczulenie