Artykuł metodologiczny

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

DOI:

10.3791/61024

⸱

30 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans jest powszechnie używany do modelowania chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem spowodowanych powtarzającymi się mutacjami ekspansji, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroba Huntingtona. Niedawno wykazano, że RNA zawierające wielokrotną ekspansję jest substratem dla nowego rodzaju translacji białek zwanej translacją niezależną od AUG (RAN) związaną z powtórzeniami. W przeciwieństwie do translacji kanonicznej, translacja RAN nie wymaga kodonu start i występuje tylko wtedy, gdy powtórzenia przekraczają długość progową. Ponieważ nie ma kodonu startowego do określenia ramki odczytu, translacja RAN zachodzi we wszystkich ramkach odczytu zarówno z matryc RNA sensownych, jak i antysensownych, które zawierają powtarzającą się sekwencję ekspansji. W związku z tym translacja RAN zwiększa liczbę możliwych toksycznych peptydów związanych z chorobą z jednego do sześciu. Do tej pory translacja RAN została udokumentowana w ośmiu różnych chorobach neurodegeneracyjnych i nerwowo-mięśniowych opartych na powtarzającej się ekspansji. W każdym przypadku rozszyfrowanie, które produkty RAN są toksyczne, a także ich mechanizmy toksyczności, jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia, w jaki sposób peptydy te przyczyniają się do patofizjologii choroby. W artykule przedstawiono strategie pomiaru toksyczności peptydów RAN w układzie modelowym C. elegans. Po pierwsze, opisujemy procedury pomiaru toksyczności peptydu RAN na wzrost i ruchliwość rozwijającego się C. elegans. Po drugie, szczegółowo opisujemy test do pomiaru porozwojowego, zależnego od wieku wpływu peptydów RAN na ruchliwość. Na koniec opisujemy test neurotoksyczności do oceny wpływu peptydów RAN na morfologię neuronów. Testy te zapewniają szeroką ocenę toksyczności peptydów RAN i mogą być przydatne do wykonywania badań genetycznych na dużą skalę lub badań przesiewowych małych cząsteczek w celu identyfikacji mechanizmów chorobowych lub terapii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewłaściwe rozszerzanie sekwencji powtórzeń DNA jest podstawą genetyczną wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), otępienie czołowo-skroniowe (FTD) i choroba Huntingtona (HD)1. Chociaż istnieją ustalone modele komórkowe i zwierzęce tych chorób, mechanizmy leżące u podstaw tych stanów nie są dobrze zdefiniowane. Na przykład, choroba Huntingtona jest spowodowana ekspansją sekwencji powtórzeń CAG w sekwencji kodującej białko huntingtyny Htt2. Ponieważ CAG koduje aminokwas glutaminę, ekspansja powtórzeń CAG powoduje insercję sekwencji poliglutaminy lub polyQ w Htt. Ekspandowane białka polyQ tworzą zależne od długości i wieku agregaty białkowe, które są związane z toksycznością3,4. Co zaskakujące, dwa ostatnie badania sugerują, że długość sekwencji polyQ nie jest głównym czynnikiem powodującym wystąpienie choroby Huntingtona, co sugeruje, że czynniki niezależne od polyQ mogą również przyczyniać się do choroby5,6.

Jednym z możliwych mechanizmów niezależnych od polyQ jest nowo odkryty typ translacji białek, określany jako Repeat Askojarzony Nzależny od AUG (RAN) translacja7. Jak sama nazwa wskazuje, translacja RAN występuje tylko wtedy, gdy obecna jest rozszerzona sekwencja powtórzeń i nie wymaga kanonicznego kodonu startowego. W związku z tym translacja RAN zachodzi we wszystkich trzech ramkach odczytu powtórzenia, tworząc trzy odrębne polipeptydy. Ponadto, ponieważ wiele genów wytwarza również transkrypt antysensowny, który zawiera odwrotne uzupełnienie rozszerzonej sekwencji powtórzeń, translacja RAN zachodzi również we wszystkich trzech ramkach odczytu transkryptu antysensownego. Łącznie, translacja RAN zwiększa liczbę białek wytwarzanych z rozszerzonej sekwencji DNA zawierającej powtórzenia z jednego peptydu do sześciu peptydów. Do tej pory translację RAN zaobserwowano w co najmniej ośmiu różnych zaburzeniach powtarzania ekspansji8. Peptydy RAN obserwuje się w próbkach pobranych pośmiertnie od pacjentów i tylko w przypadkach, gdy pacjent jest nosicielem rozszerzonego repeat9,10. Chociaż peptydy te są wyraźnie obecne w komórkach pacjentów, ich wkład w patofizjologię choroby jest niejasny.

Aby lepiej zdefiniować potencjalną toksyczność związaną z peptydami RAN, kilka grup wyraziło każdy peptyd w różnych systemach modelowych, takich jak drożdże, muchy, myszy i komórki hodowli tkankowej11,12,13,14,15,16. Zamiast wykorzystywać sekwencję powtórzeń do ekspresji, modele te wykorzystują podejście wariacji kodonów, w którym sekwencja powtórzeń jest eliminowana, ale sekwencja aminokwasów jest zachowywana. Inicjacja translacji następuje poprzez kanoniczny ATG, a peptyd jest zwykle łączony z białkiem fluorescencyjnym na końcu N lub C, z których żadne nie wydaje się zakłócać toksyczności peptydu RAN. W związku z tym każdy konstrukt wykazuje nadekspresję pojedynczego peptydu RAN. Modelowanie różnych produktów RAN w organizmie wielokomórkowym za pomocą prostych testów do pomiaru toksyczności peptydów RAN jest niezwykle ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób różne produkty RAN z każdej powodującej chorobę powtórnej ekspansji przyczyniają się do dysfunkcji komórkowej i neurodegeneracji.

Podobnie jak inne systemy modelowe, C. elegans dostarcza elastyczną i efektywną platformę eksperymentalną, która umożliwia badania nowych mechanizmów chorobowych, takich jak toksyczność peptydów RAN. Robaki oferują kilka unikalnych cech eksperymentalnych, które nie są obecnie dostępne w innych modelach toksyczności peptydów RAN. Po pierwsze, C. elegans są optycznie przezroczyste od urodzenia aż do śmierci. Pozwala to na prostą wizualizację ekspresji i lokalizacji peptydu RAN, a także analizę in vivo neurodegeneracji u żywych zwierząt. Po drugie, transgeniczne metody generowania modeli ekspresji peptydów RAN są niedrogie i szybkie. Biorąc pod uwagę krótki, trzydniowy cykl życiowy C. elegans, stabilne linie transgeniczne wyrażające dowolny peptyd RAN w sposób specyficzny dla typu komórki mogą zostać wytworzone w czasie krótszym niż tydzień. Po trzecie, proste wyniki fenotypowe można połączyć z genetycznymi metodami przesiewowymi, takimi jak mutageneza chemiczna lub badania przesiewowe RNAi, w celu szybkiej identyfikacji genów niezbędnych do toksyczności peptydów RAN. Wreszcie, krótka żywotność C. elegans (~ 20 dni) pozwala badaczom określić, w jaki sposób starzenie się, które jest największym czynnikiem ryzyka większości powtarzających się chorób ekspansji, wpływa na toksyczność peptydu RAN. Razem, ta kombinacja cech eksperymentalnych nie ma sobie równych w żadnym innym systemie modelowym i stanowi potężną platformę do badania toksyczności peptydów RAN.

Tutaj opisujemy kilka testów, które wykorzystują eksperymentalne zalety C. elegans do pomiaru toksyczności peptydów RAN i identyfikacji genetycznych modyfikatorów tej toksyczności. Zróżnicowane kodonem peptydy RAN inicjowane przez ATG są znakowane GFP i wyrażane indywidualnie w komórkach mięśniowych pod promotorem myo-3 lub w neuronach ruchowych GABA-ergiczny pod promotorem unc-47. Dla ekspresji w komórkach mięśniowych ważne jest, aby toksyczne peptydy RAN były oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub innym znacznikiem białka fluorescencyjnego (FP), które może być celem wektora żywieniowego RNAi. Dzieje się tak, ponieważ toksyczna ekspresja peptydu RAN zwykle blokuje wzrost, czyniąc takie szczepy nieżywotnymi. Zastosowanie gfp(RNAi) warunkowo dezaktywuje ekspresję peptydu RAN i umożliwia utrzymanie szczepu, krzyżowanie genetyczne itp. Do testów zwierzęta te są usuwane z gfp (RNAi), co umożliwia ekspresję peptydu RAN i powstałych fenotypów. Oprócz strategii molekularnej do projektowania zróżnicowanych kodonami konstruktów ekspresji peptydu RAN, opisujemy testy do pomiaru toksyczności rozwojowej (test ruchliwości larw i wzrostu), porozwojowej toksyczności związanej z wiekiem (test paraliżu) i defektów morfologicznych neuronów (test spoidła).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie zróżnicowanych kodonów konstrukcji ekspresji peptydów RAN

  1. Zaprojektuj indywidualną sekwencję kodującą peptyd RAN, wykorzystując synonimiczne kodony, aby wyeliminować podstawową powtarzalną strukturę DNA/RNA, ale zachować leżącą nad nią sekwencję aminokwasów.
  2. Zamów niestandardowe sekwencje kodonów komercyjnie o długości powtórzeń potrzebnej do badań (zwykle 5–100 powtórzeń). Uwzględnij miejsce restrykcyjne HindIII na końcu 5' i miejsce restrykcyjne BamHI na końcu 3', aby ułatwić klonowanie do wektorów ekspresji C. elegans, takich jak pPD95.79.
    UWAGA: Jeśli synteza większych konstruktów okaże się trudna, można zsyntetyzować mniejsze sekwencje bloków budulcowych, a następnie wbudować je w większe powtórzenia przy użyciu strategii ligacji kierunkowej17.
  3. Subklonować sekwencję peptydową do wektora ekspresji C. elegans przy użyciu standardowych metod ligacji T4.
  4. Subklonuj specyficzną dla typu komórki sekwencję promotora wygenerowaną przez PCR przed sekwencją peptydową RAN w celu sterowania specyficzną tkankowo ekspresją peptydu RAN-GFP.
  5. Mikrowstrzyknąć konstrukt peptydu RAN do gonady dzikiego typu C. elegans w celu wygenerowania transgenicznych szczepów zawierających macierze pozachromosomalne przy użyciu standardowych metod18. W przypadku markera do jednoczesnego wstrzyknięcia wykorzystano specyficzny dla mięśni reporter RFP (myo-3p::RFP (pCFJ104)), chociaż można również wykorzystać inne markery.
  6. Zintegruj stabilny transgen z genomem przy użyciu standardowych metod przesiewowych integracji C. elegans19.
  7. Jeśli peptyd RAN jest toksyczny, a zwierzęta transgeniczne nie przeżywają, karmić zwierzęta gfp(RNAi) wykazującymi ekspresję bakterii przed i po wstrzyknięciu, aby wyciszyć ekspresję toksycznego białka.
    UWAGA: Usunięcie zwierząt z gfp(RNAi) umożliwia ekspresję peptydu RAN do analiz fenotypowych przy użyciu testów opisanych poniżej.

2. Pomiar toksyczności rozwojowej peptydów RAN po knockdownie genu opartego na RNAi: Protokół analizy prędkości wideo

  1. Standardowe pożywki do wzrostu nicieni (NGM) RNAi 24-dołkowe płytki zalać 1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 25 μg/ml karbenicyliny.
  2. Umieść klony żywiące się RNAi w bakteriach HT115 do przetestowania na płytkach agarowych Luria bulion (LB) + karbenicylina (25 μg/ml) i hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Uwzględnij pusty wektor (RNAi) jako pozytywną kontrolę toksyczności i gfp(RNAi) jako kontrolę negatywną.
  3. Dla każdego klonu wybierz pojedynczą kolonię na 1 ml płynnej pożywki LB + karbenicyliny i hoduj bakterie przez noc przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obrotów na minutę (RPM).
  4. Umieść cztery pojedyncze studzienki w dołkach NGM RNAI 24 z 20 μl następujących nocnych kultur bakteryjnych: kolumna 1 dołki = gfp(RNAi); kolumna 2 dołki = (EV)RNAi; kolumny 3–6 dołków = RNAi przeciwko genom, które mają być testowane. Pozwól bakteriom RNAi indukować produkcję dsRNA przez noc w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Wyizoluj jaja od pierwszego dnia dorosłego C. elegans wykazującego ekspresję zintegrowanego transgenu peptydu RAN przy użyciu standardowej metody podchlorynu i wysiewaj jaja ~ 30 C. elegans do każdej studzienki płytki NGM RNAi 24 dołki.
  6. Inkubować 24 studzienki w temperaturze 20 °C przez 7 dni.
    UWAGA: Ten czas inkubacji dotyczy szczepów eksprymujących toksyczne dipeptydy RAN C9orf72, takie jak PR50 lub GR50. Inne szczepy mogą wymagać krótszego czasu inkubacji, aby zapobiec wyczerpaniu źródła pokarmu bakteryjnego i późniejszemu głodowi.
  7. Rejestruj filmy w świetle przechodzącym za pomocą stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego Leica MZ16FA wyposażonego w DFC345FX monochromatyczną kamerę podłączoną do komputera kompatybilnego z systemem Windows z oprogramowaniem do akwizycji wideo Leica AF (wersja 2.6.0.7266).
    1. Uzyskaj dwa filmy z dwóch oddzielnych dołków dla każdego warunku RNAi, korzystając ze spójnych ustawień akwizycji wideo między dołkami. Dla każdego filmu utrwal 10 sekund w rozdzielczości 800 x 600 pikseli i 13,16 klatkach na sekundę (wymiar woksela = 0,076 sekundy) przy użyciu powiększenia 18,6x (ustawienie zoomu 1,49 w oprogramowaniu AF). Ustaw czas naświetlania obrazu na 4 milisekundy. Natychmiast oznacz każdy film szczepem, stanem RNAi i numerem studzienki.
  8. Nie zwracaj uwagi na genotyp związany z każdym plikiem wideo, losowo dobierając kolejność filmów i zmieniając nazwy filmów na liczby. Zapisz tę grupę filmów jako nowy plik. Odślep eksperymentatora po zakończeniu analizy.
  9. Zmierz "przebytą odległość" i długość każdego zwierzęcia dla 20 różnych zwierząt z każdego filmu, badając w sumie ~40 robaków dla każdego stanu RNAi.
    1. W oprogramowaniu wybierz przycisk narzędzi adnotacji, a następnie narzędzie do rysowania tekstu. Kliknij punkt w środku mierzonego robaka w pierwszej klatce filmu i oznacz go jako liczbę. Przewiń film do końca, wizualnie śledząc ścieżkę ruchu robaka. W ostatniej klatce kliknij punkt w środku mierzonego robaka i zaznacz następną odpowiednią liczbę. Następnie, za pomocą narzędzia rysowania podziałki liniowej, narysuj linię od pierwszej liczby do drugiej liczby, aby zapisać "przebytą odległość".
    2. "Przebyta odległość" oznacza odległość między dwoma punktami środka ciężkości. Odległość ta jest pokazana obok linii pomiarowej. Zapisz ten pomiar w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz ten pomiar dla 19 innych robaków na filmie, zachowując każdy pojedynczy pomiar w oknie analizy.
  10. Wykonuj pomiary na zwierzętach wykazujących najbardziej dynamiczny ruch, aby uniknąć selekcji zwierząt nie wykazujących ruchu i stronniczości danych w kierunku paraliżu. Po zakończeniu pomiarów zrób migawkę ostatniej klatki wideo ilustrującej wszystkie linie pomiarowe, tak aby dane można było prześledzić wstecz do zwierzęcia, od którego pochodzą.
  11. Analizuj dane za pomocą czterokolumnowego arkusza kalkulacyjnego. Kolumna pierwsza to "identyfikator" robaka, kolumna druga to przebyta odległość / czas (prędkość).
    1. Czas każdego filmu można znaleźć, klikając prawym przyciskiem myszy film w eksperymencie i przechodząc do właściwości filmu.
  12. Znormalizuj pomiar prędkości, znajdując długość każdego zwierzęcia, wybierając opcję Quantify, a następnie Statistics w oprogramowaniu. Kliknięcie na ikonę narzędzia adnotacji na ekranie wideo powinno pozwolić na użycie narzędzia "Narysuj polilinię". To narzędzie może być następnie używane do swobodnego śledzenia C. elegans od filmu od czubka głowy do czubka ogona. Długość linii będzie rejestrowana w statystykach.
    1. Zrób migawkę ostatniej klatki wideo ilustrującej wszystkie polilinie użyte do wymiarowania C. elegans, tak aby dane można było prześledzić wstecz do zwierzęcia, od którego pochodzą.
  13. Przeanalizuj dane, dodając dwie dodatkowe kolumny do arkusza kalkulacyjnego. Kolumna trzecia to "Długość zwierzęcia", a kolumna czwarta to "Prędkość znormalizowana" (prędkość/długość zwierzęcia). Analizuj znormalizowane dane dotyczące prędkości przy użyciu jednokierunkowej ANOVA z testami post-hoc w porównaniu z pustym wektorem (RNAi).

3. Pomiar toksyczności rozwojowej peptydu RAN: Test wzrostu

  1. Wybierz ~ 30 ciężarnych zwierząt do 50 μl plamki roztworu podchlorynu (10 ml wybielacza, 2,5 ml 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) na gfp (RNAi), (EV) RNAi lub (specyficznej dla genu) 6 cm płytce RNAi.
  2. Po 24 godzinach przenieść sześć transgenicznych potomków, które wypełzły z miejsca roztworu podchlorynu, na nową 6 cm płytkę RNAi, identyczną z warunkami RNAi na płytce, na której zostały poddane działaniu roztworu podchlorynu. Umieścić to potomstwo (F1) w temperaturze 20 °C, aby rosło i rozmnażało się.
  3. Po 24–48 godzinach wybierz 10 transgenicznych zwierząt L4 na 6 cm RNAi pasujące do warunków RNAi, na których zwierzęta rosły. Pozwolić zwierzętom na pulsacyjne składanie jaj przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 20 °C.
  4. Po 24 godzinach należy usunąć dorosłe zwierzęta i wyrzucić je. Policz liczbę jaj i larw L1 złożonych w ciągu 24 godzin za pomocą mechanicznego licznika ręcznego. Jest to całkowita wielkość czerwiu.
  5. W ciągu następnych 72 godzin policz liczbę zwierząt, które osiągną poziom L4 lub starszy. Podczas liczenia każdego zwierzęcia wyjmij je z talerza.
  6. Określ ilościowo "procentowy wzrost" jako procent zwierząt, które osiągają stadium L4 lub starsze w stosunku do całkowitej wielkości lęgu.
  7. Wykonaj dokładny test Fishera 2 x 2 w porównaniu z pustym wektorem (RNAi), aby określić, czy procentowy wzrost jest statystycznie istotny. Kategorie do porównania to "Wzrost" (# zwierząt, które osiągnęły stadium L4 lub starsze w ciągu 72 godzin) i "Brak wzrostu" (całkowita wielkość lęgu minus liczba zwierząt osiągających stadium L4 lub starsze w ciągu 72 godzin).

4. Test porażenia peptydowego RAN

  1. Utrzymuj zintegrowane transgeniczne szczepy C. elegans eksprymujące peptyd RAN-GFP w mięśniach na gfp (RNAi), umieszczając 4-6 transgenicznych L4 na 6 cm płytce gfp (RNAi) i hoduj robaki w temperaturze 20 °C.
  2. Jeśli eksperyment wykorzystuje RNAi do testowania wpływu genetycznego na toksyczność peptydu RAN, przenieś 10 transgenicznych dorosłych gravidów z niegłodzonej płytki na każdy z dwóch 6 cm pustego wektora (RNAi) (pozytywna kontrola paraliżu, negatywna kontrola skutków genetycznych), gfp(RNAi) (negatywna kontrola paraliżu, pozytywna kontrola skutków genetycznych), specyficzny dla genu (RNAi) (tj. 10 ciężarnych dorosłych na 6 cm talerzu).
  3. Jeśli mutanty są używane do analizy wpływu genetycznego na toksyczność peptydu RAN, umieść 10 ciężarnych WT lub zmutowanych zwierząt wykazujących ekspresję tego samego transgenu RAN na każdej z dwóch 6 cm pustych płytek wektorowych (RNAi) lub gfp (RNAi). Hoduj robaki w temperaturze 20 °C przez 48 godzin.
  4. Wybierz 10 zestawów po 10 transgenicznych L4 z 6 cm płytek RNAi i umieść każdy zestaw na 3 cm płytce RNAi (tj. n = 100 zwierząt dla każdego genotypu). Upewnij się, że wszystkie L4 wybrane do testu mają powierzchownie normalną ruchliwość. Umieść talerze w torbie do przechowywania na zamek błyskawiczny, aby zatrzymać wilgoć.
  5. Umieścić zapakowane w worki płytki z L4 w inkubatorze o temperaturze 25 °C.
  6. 24 godziny później należy wyjmować zwierzęta z inkubatora w temperaturze 25 °C, po jednym naturze na raz, aby zminimalizować czas przebywania w temperaturze pokojowej.
  7. Postukaj w płytki mikroskopu preparacyjnego, aby sprawdzić ruch. Jeśli zwierzę porusza się na więcej niż długość ciała, policz zwierzę jako ruchome i przenieś je na nową 3-centymetrową płytkę RNAi. Użyj platynowego kilofa, aby postukać w pozostałe robaki na głowie lub ogonie. Jeśli zwierzę porusza się na więcej niż długość ciała, policz je jako ruchome i przenieś je na nową 3 cm płytkę RNAi.
    UWAGA: Nie przekraczaj 10 robaków na płytkę podczas przenoszenia. Należy uważać, aby nie przenosić potomstwa na nową płytkę RNAi, ponieważ test zależy tylko od obserwacji starszych zwierząt.
  8. Zgrupuj wszystkie nieruchome robaki razem, aby można było łatwo wykryć ruch większy niż długość ciała. Daj zwierzęciu co najmniej minutę na przemieszczenie się o więcej niż jedną długość ciała. Jeśli nadal się nie porusza, jest sparaliżowany, zapakowany w worki (tj. larwy wykluwają się wewnątrz matki) lub martwy.
  9. Cenzuruj zwierzęta, które wykazują worki, wysuszają się po bokach płytki, wykazują wyciśnięte jelita, zakopują się, gubią się lub umierają od testu w momencie wykrycia. Sparaliżowane robaki są liczone, pozostawiane na starej płytce RNAi i odrzucane.
  10. Oceniaj zwierzęta pod kątem paraliżu codziennie przez 5–7 dni, zgodnie z opisem w krokach 4.6–4.9.
  11. Analizuj dane dotyczące paraliżu za pomocą testu logarytmicznego identycznego z tym, który jest używany do analizy długości życia. W tej analizie statystycznej poruszające się robaki są oceniane jako "żywe", sparaliżowane robaki są oceniane jako "martwe", a martwe, workowane, wytłaczane jelita, wysuszone, zagrzebane lub w inny sposób zagubione robaki są oceniane jako "ocenzurowane".
    UWAGA: W tej analizie liczba "Procent życia" wskazuje "Procent poruszających się" zwierząt. Odwrotność reprezentuje "procent sparaliżowanych". Użyj narzędzia do analizy online OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/), aby przeprowadzić analizy statystyczne logarytmiczne.

5. Pomiar patologii neuronów: Test spoidła

  1. Generuj transgeniczne C. elegans eksprymujące peptyd RAN będący przedmiotem zainteresowania w neuronach GABA-ergicznych za pomocą promotora unc-47. Wyraź również unc-47p::GFP lub unc-47p::RFP, aby ujawnić morfologię komórkową neuronów GABA.
  2. Wybierz 50 transgenicznych zwierząt L4 i umieść je na 6 cm talerzu OP50 w temperaturze 25 °C na 24 godziny.
  3. Przenieść 50 transgenicznych zwierząt na nową 6 cm płytkę OP50 w temperaturze 25 °C na 24 godziny.
  4. Wykonaj podkładki agarozowe do obrazowania zwierząt pod mikroskopem szerokokątnym.
    1. Umieść dwa kawałki taśmy na dwóch szkiełkach mikroskopowych. Umieść oczyszczony slajd bez taśmy na środku dwóch zaklejonych taśmą slajdów.
    2. Dozować ~100 μL (1 kropla z jednorazowej plastikowej pipety Pasteura) 3% stopionej agarozy na środkowe szkiełko za pomocą jednorazowej sterylnej pipety transferowej.
    3. Natychmiast umieść drugie czyste szkiełko w poprzek kropli stopionej agarozy, tak aby spoczywało na zaklejonych szkiełkach i tworzyło cienką i równą warstwę agarozy między szkiełkami.
    4. Po ostygnięciu i zestaleniu się agarozy ostrożnie usuń dwa szkiełka z warstwą agarozy między nimi, nie rozdzielając ich, i umieść je w plastikowej torbie z wilgotnym kawałkiem papieru pod nimi. Zrób jedno szkiełko na 10 robaków do zbadania wraz z trzema dodatkowymi szkiełkami.
  5. Usunąć transgeniczne C. elegans z inkubatora w temperaturze 25 °C i pobrać 10 transgenicznych C. elegans do 100 μl kropli 10 mM lewamizolu w szklanym szkiełku wgłębieniowym. Inkubować przez 10 minut lub do momentu, gdy zwierzęta zostaną sparaliżowane.
  6. Wyjmij parę szkiełek z plastikowej torby i ostrożnie je oddziel. Oznacz szkiełko agarozą genotypem i dodaj 2 μl 10 mM lewamizolu do środka agarozy. Przenieś 10 zwierząt do lewamizolu na podkładce agarozowej. Przykryj zwierzęta szkiełkiem nakrywkowym o grubości #1.
  7. Wyobraź sobie zwierzęta, u których srom jest zorientowany w taki sposób, że znajduje się po prawej stronie zwierzęcia. Jeśli srom znajduje się po lewej stronie głowy, spoidła neuronów ruchowych będą znajdować się pod zwierzętami i nie będą tak wyraźnie widoczne, co utrudni dokładną kwantyfikację. Pomiń oznaczanie ilościowe w odniesieniu do tych zwierząt. W tej orientacji spoidła neuronów ruchowych znajdują się najbliżej szkiełka nakrywkowego i są wyraźnie widoczne w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym o szerokim polu. Wizualizacja spoidła neuronów wyrażających GFP za pomocą odwróconego szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMI4000B z soczewką zanurzeniową olejową 63X 1,4X NA i zestawem filtrów Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Jeśli spoidła neuronów wyrażają RFP zamiast GFP, użyj zestawu filtrów RFP Leica TX2 (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Wizualizacja spoidła neuronów wyrażających GFP za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego szerokokątnego z soczewką immersyjną olejową 63x 1,4x i zestawem filtrów GFP (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Jeśli spoidła neuronów wyrażają RFP zamiast GFP, użyj zestawu filtrów z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Wyobraź sobie robaki w ciągu 45 minut od umieszczenia szkiełka nakrywkowego na robakach, aby zminimalizować toksyczność wynikającą z unieruchomienia.
  9. Dla każdego robaka policz liczbę widocznych spoideł. U zwierząt w typie dzikim widocznych jest 16 spoidł. Policz również liczbę spoidła, które mają duże kulki (tj. pęcherzyki) w spoidłach, a także liczbę spoidła, które są zepsute. Aby potwierdzić, że spoidło jest przerwane, postępuj zgodnie z spoidłem od rdzenia grzbietowego do sznura brzusznego, regulując płaszczyznę ogniskowej.
    UWAGA: Spoidła, w których fluorescencja unc-47p::GFP wykazuje przerwę, są uważane za uszkodzone. Zepsute spoidło zazwyczaj ma pęcherzyk po obu stronach przerwy, co pomaga pokazać, że spoidło jest zepsute. Policz ilość blebbingu i przerw na 20 robaków.
  10. Obliczyć ułamek spoidła z pęcherzykami lub przerwami w stosunku do całkowitej liczby zaobserwowanych spoideł dla każdego zwierzęcia. Można również zmierzyć bezwzględną liczbę spoidła zliczonych na zwierzę (w tym zdarzenia typu dzikiego, wyblakłego i uszkodzonego).
  11. Dla każdej kategorii oblicz średnią ± SD i przeanalizuj statystycznie za pomocą testu t Studenta do porównania dwóch populacji lub jednoczynnikowej ANOVA do porównań między 3 lub więcej populacjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy opisanych tutaj testów, aby ocenić wpływ różnych hamowań genów na toksyczność dipeptydów RAN, które występują u pacjentów z ALS z ekspansją powtórzeńG4C2. Używając testu wzrostu do pomiaru toksyczności rozwojowej, przeanalizowaliśmy wpływ kilku mutantów nokautujących genetycznych zidentyfikowanych w supresorach przesiewowych RNAi całego genomu o toksyczności PR50-GFP wyrażanej przez mięśnie. Podczas gdy sama ekspresja PR50-GFP spowodowała całkowicie penetrujące zatrzymanie wzrostu, mutacje ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy metody, które można wykorzystać do oznaczania toksyczności peptydu RAN modelowanego w mięśniach lub neuronach C. elegans. Podczas gdy białka neurodegeneracyjne mają fenotyp początkowy u ludzi z wiekiem, mogą również wykazywać toksyczność rozwojową, gdy są nadmiernie eksprymowane w systemach modelowych. Nadekspresja ma znaczące ograniczenia interpretacyjne, ale stanowi również potężny punkt wyjścia dla genetycznych lub farmakologicznych badań przesiewowych mających na celu identyfikacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35mm x 10mm szalka Petriego, sterylnaCELLTREAT Scientific Products50-202-036Płytki wzrostu nicieni i RNAi
AGAR GRANULOWANE 2KILOGRAMOWESYSTEMY DIAGNOSTYCZNE BDPłytki wzrostu nicieni i RNAi
AGAROZA ULTRAPURELIFE TECHNOLOGIESMikroiniekcja do generowania peptydu RAN szczepy transgeniczne
KARBENICYLINA 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485Płytki wzrostu nicieni i RNAi
OKULARY NAKRYWKOWE NR 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BObrazowanie do testu spoidła
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSMikroiniekcja do generowania peptydów RAN szczepy transgeniczne
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CMikroiniekcja do generowania transgenicznych szczepów peptydu RAN
Fisherbrand  Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusTHERMO SCI ERIE12-550-15Obrazowanie do testu spoidła
Gibco  Bacto Pepton Gibco DF0118-17-0Płytki wzrostu nicieni i RNAi
OLEJ HALOCARBON 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLMikroiniekcja do generowania szczepów transgenicznych peptydu RAN
IPTG BIOTECH 10GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSPłytki wzrostu nicieni i RNAi
Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego LeicaMicrosystemsLAS-AFOprogramowanie do akwizycji obrazu do analizy prędkości wideo i testu spoidła
Leica Immersion type N (Oil)W NUHSBAUM INCObrazowanie do testu spoidła
CHLOROWODOREK LEWAIZOLU 10GRTHERMO SCI ACROS ORGANICSObrazowanie do testu spoidła
KOŃCÓWKI MIKROŁADOWARKI 2 X 96 SZTEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSE5242956003Mikroiniekcja do generowania transgenicznych szczepów peptydu RAN

SZALKA PETRI, 60X15MM, 500/CS		CORNING LIFE SCIENCES PLASTICPłytki wzrostu nicieni i PŁYTKA KULTU TKANKOWEGO RNAi
24WEL 50/CSCORNING LIFE SCIENCES DL87721Płytki wzrostu nicieni i RNAi
DF0145070 16500500 E5242952008 BP162010 NC9547002 AC187870100 FB0875713A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877(2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87(2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494(2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C elegans ModelRepeat Expansion DisordersVideo Speed AnalysisAge Dependent Paralysis AssayNeuron Morphology AssayRNAi ScreeningProteasome Subunit RPN7Insulin IGF Receptor DAF 2Commissure Assay

Powiązane artykuły