Ten artykuł przedstawia skuteczną metodę przeprowadzenia niedokrwienia mięśnia sercowego i następującej po nim przewlekłej reperfuzji u szczurów przy użyciu minimalnie inwazyjnego podejścia. Ponadto funkcję hemodynamiczną lewej komory szczurów ocenia się za pomocą echokardiografii i izolowanych metod pracy serca.
Artykuł metodologiczny
Półminimalnie inwazyjna metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u szczurów i ocena czynności serca przez izolowany działający układ serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zawał mięśnia sercowego (MI) pozostaje głównym czynnikiem przyczyniającym się do zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Dlatego badania na ten temat są obowiązkowe. Łatwa i wysoce powtarzalna procedura indukcji zawału mięśnia sercowego jest niezbędna do uzyskania dalszych informacji i lepszego zrozumienia leżących u podstaw zmian patologicznych. Procedura ta może być również stosowana do oceny efektów lub siły działania nowych i obiecujących metod leczenia (jako leków lub interwencji) w ostrym zawale serca, późniejszej przebudowie i niewydolności serca (HF). Po intubacji i przygotowaniu przedoperacyjnym zwierzęcia wykonano protokół znieczulenia izofluranem, a zabieg chirurgiczny przeprowadzono szybko. Stosując podejście małoinwazyjne, lewa tętnica zstępująca przednia (LAD) została zlokalizowana i zamknięta przez ligaturę. Okluzja może być wykonana ostro w celu późniejszej reperfuzji (niedokrwienie/uraz reperfuzyjny). Alternatywnie, naczynie może być podwiązane na stałe w celu zbadania rozwoju przewlekłego zawału mięśnia sercowego, przebudowy lub HF. Pomimo typowych pułapek, wskaźniki rezygnacji są minimalne. Różne metody leczenia, takie jak zdalne kondycjonowanie niedokrwienne, mogą być badane pod kątem ich potencjału kardioprotekcyjnego przed, około- i pooperacyjnie. Rekonwalescencja pooperacyjna była szybka, ponieważ znieczulenie było precyzyjnie kontrolowane, a czas trwania operacji był krótki. Analgezję pooperacyjną podawano przez trzy dni. Małoinwazyjny zabieg zmniejsza ryzyko infekcji i stanów zapalnych. Ponadto ułatwia szybki powrót do zdrowia. Pomiary "serca roboczego" zostały wykonane ex vivo i umożliwiły precyzyjną kontrolę napięcia wstępnego, obciążenia następczego i przepływu. Ta procedura wymaga specjalnego sprzętu i szkolenia w celu uzyskania odpowiedniej wydajności. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowe wprowadzenie krok po kroku do przeprowadzania tych pomiarów.
Wprowadzenie
Chociaż częstość występowania stale maleje, ostry zawał mięśnia sercowego (MI) jest nadal głównym czynnikiem przyczyniającym się do zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Istnieją ograniczenia w ocenie skuteczności potencjalnych metod leczenia, takich jak leki lub zabiegi chirurgiczne, które zapobiegają i leczą ostre zawałie mięśnia sercowego. Zanim będzie można zbadać ich działanie u ludzi, zabiegi te muszą zostać wcześniej przetestowane pod kątem ryzyka, w tym badania in vivo na zwierzętach. Nie ma lepszej okazji do zbadania patologii niż w warunkach in vivo. Dlatego indukcja MI u szczurów lub myszy, a nawet dużych modeli zwierzęcych (świń lub owiec) pozwala na badanie krótko- (ostrych) i długoterminowych (przewlekłych) zmian spowodowanych niedokrwieniem tętnic wieńcowych i otaczającego mięśnia sercowego, a także zmian ogólnoustrojowych spowodowanych upośledzeniem funkcji serca. Wielkość zawału była wcześniej głównym celem, ale ostatnio duże zainteresowanie wzbudziły późniejsze procesy przebudowy serca w ostrym zawale serca lub urazie niedokrwiennym/reperfuzyjnym, a także w następującej po sobie niewydolności serca (HF). W związku z tym do osiągnięcia spójnych wyników potrzebna jest porównywalna i łatwa do odtworzenia metoda.
Chociaż zgłoszono użycie krioablacji w celu uzyskania MI2, nasza metoda opiera się na innych badaniach, w których badacze blokują lewą przednią tętnicę zstępującą (LAD) za pomocą podwiązania jednym szwem. W porównaniu z zabiegami (hemi-)sternotomii, podejście małoinwazyjne, które zostanie przedstawione w tym artykule, pozwala na szybszą rekonwalescencję pooperacyjną i znacznie skraca czas operacji. Częstym etapem innych zabiegów chirurgicznych jest wyjęcie serca z klatki piersiowej w celu wykonania ściegu serca3. Podejście tej metody sprawia, że ten krok nie jest potrzebny. W zależności od protokołu można wykonać dwie różne procedury: tymczasową okluzję za pomocą opaski uciskowej w celu wywołania niedokrwienia/reperfuzji w określonym czasie; lub trwałe zamknięcie tętnicy poprzez utrwalenie ligatury. Powodzenie okluzji można ocenić za pomocą elektrokardiogramu (EKG) oraz zmian makroskopowych w lewej komorze (LV) i jej bladości.
Kolejnym ważnym krokiem przed operacją jest intubacja. Podczas gdy w większości przypadków intubacja jest wykonywana za pomocą tracheotomii lub poprzez doustne wprowadzenie rurki pod kątem wzroku przez nacięcie skóry w gardle, protokół ten opisuje intubację dotchawiczą znieczulonego zwierzęcia, która zmniejsza trudności w oddychaniu lub infekcje po operacji4,5. Aby uniknąć powikłań pooperacyjnych, powietrze jest usuwane z klatki piersiowej za pomocą strzykawki przed zamknięciem klatki piersiowej.
Drugim zadaniem tego artykułu jest ocena funkcji hemodynamicznej za pomocą izolowanego eksperymentalnego modelu pracy serca, jak jest ona wykorzystywana w innych projektach w naszym instytucie6,7. Chociaż echokardiografia, rezonans magnetyczny serca (MRI) i inwazyjne oznaczanie ilościowe pętli ciśnienie-objętość są dobrze znanymi i szeroko stosowanymi metodami oceny czynności serca in vivo, wiadomo, że mają pewne ograniczenia. Podejścia inwazyjne, takie jak stosowanie cewników do badania ogólnej funkcji lub określonych parametrów serca, są powszechnie stosowane i stanowią złoty standard pomiarów serca. W przeciwieństwie do tego, aparat pracujący ex vivo serca jest rzadko używany ze względu na jego złożoność i koszt. Istnieje wiele ważnych aspektów, od mieszaniny perfuzatu po odpowiednią kaniulację serca, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnej oceny. Izolowany działający aparat serca został po raz pierwszy opisany przez Oskara Langendorffa w 1897 roku8 i był modyfikowany przez ostatnie dziesięciolecia9. Obecnie stosowane są dwa modele: tryb Langendorff (LD) i tryb pracy serca (WH). W naszym badaniu tryb LD służy do aklimatyzacji serca do nowego środowiska (około 15 minut). W tym trybie serce jest kaniulowane przez aortę, a tętnice wieńcowe są perfundowane przednioczo, odpowiednio zaopatrując mięsień sercowy. W trybie LD serce nie wykonuje żadnej pracy ciśnieniowo-objętościowej. Natomiast w trybie WH lewy przedsionek jest kaniulowany przez żyłę płucną, przez którą perfuzat dostaje się do lewego przedsionka. Serce następnie pompuje ten perfuzat fizjologicznie przeciwko wcześniej zdefiniowanemu obciążeniu następczemu. Zwiększając obciążenie następcze w czasie, czynność serca może być mierzona w sposób ciągły. Można mierzyć takie parametry, jak przepływ wieńcowy, pojemność minutowa serca (CO), objętość wyrzutowa (SV) i praca, przepływ przedsionkowy oraz ciśnienie skurczowe i rozkurczowe lewej komory. Można zbadać wpływ różnych metod leczenia bezpośrednio i wyłącznie na serce6,10. Przegląd przeprowadzony przez Liao i Podesser9 przedstawił szerokie zastosowanie tej metody w ocenie wpływu farmakologicznego na czynność serca i metabolizm, a także w badaniu różnych chorób, takich jak zawał mięśnia serca, niewydolność serca, otyłość i cukrzyca.
Podsumowując, ten protokół przedstawia powtarzalną metodę wykonywania MI lub uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji mięśnia sercowego (MIR) in vivo. Ponadto pozwala na scharakteryzowanie funkcji LV (dys-) na izolowanym sercu szczura po zawale mięśnia sercowego. Protokół ten stanowi unikalne połączenie leczenia i analizy.
Protokół
Protokół eksperymentalny, który dostarczył wyników opisanych w tym artykule, został zatwierdzony przez regionalną Komisję Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Laboratoryjnych na Uniwersytecie Medycznym w Wiedniu oraz Austriackie Federalne Ministerstwo Edukacji, Nauki i Badań (BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016). Wszystkie eksperymenty są zgodne z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, opublikowanym przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 r.).
UWAGA: Używane są 10−12-tygodniowe samce szczurów Sprague Dawley o masie ciała 250−300 g (BW). Ponieważ poniższe procedury i zabiegi są wykonywane w sterylnym środowisku sali operacyjnej (OR), podczas pracy ze zwierzętami należy nosić fartuchy, rękawiczki, maski na twarz i kaptury. Przed wejściem na salę operacyjną należy upewnić się, że ręce są umyte i zdezynfekowane. Jeśli zamiarem jest operowanie kilku zwierząt podczas sesji chirurgicznej, należy umyć i zdezynfekować lub autoklawować narzędzia między operacjami. Te wytyczne higieniczne obowiązują dla wszystkich procedur przedstawionych w sekcji dotyczącej protokołu.
1. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie
- Znieczulenie przedoperacyjne należy rozpocząć od wstrzyknięcia dootrzewnowej mieszaniny ksylazyny (4 mg/kg masy ciała) i ketaminy (100 mg/kg masy ciała).
- Zaintubuj szczury za pomocą rurki 14 G i wentylacji o kontrolowanej objętości mieszaninąO2, powietrza i izofluranu (1−2,5%) przy 75−85 uderzeniach/min, 100 ml/udar/bw (Rycina 1A). Jeśli to konieczne, dla lepszej widoczności podczas intubacji: nałóż Xylocain za pomocą końcówki z waty na dolne gardło, aby uzyskać miejscowe rozluźnienie.
- Umieść szczury na podgrzewanym stole operacyjnym w pozycji leżącej na plecach i przymocuj przednie kończyny taśmą (Rysunek 1B).
- Zmierz temperaturę w odbycie za pomocą sondy.
UWAGA: Powinien być utrzymywany w zakresie 37,5−38,5 °C. - Ogolić klatkę piersiową i oczyścić obszar operacyjny antyseptycznym roztworem jodu powidonu. Nałóż maść na oko szczura, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
- Analgezję śródoperacyjną należy podawać przez wstrzyknięcie pirytramidu (0,1 ml/kg masy ciała) dootrzewnowo.
- Umieść sondy EKG podskórnie w kończynach zwierzęcia.
- Sprawdź odruchy ogonowe i palce u nóg przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
2. Zabieg chirurgiczny―indukcja niedokrwienia mięśnia sercowego
- Wykonaj nacięcie skóry za pomocą skalpela. Upewnij się, że zaczynasz 2 mm przymostkowy na lewej klatce piersiowej na poziomie 3. przestrzeni międzyżebrowej i kontynuuj do przedniej linii pachowej na poziomie 5. przestrzeni międzyżebrowej (Rysunek 1C).
- Delikatnie wymień mięśnie powierzchowne, aby żebra były widoczne (Rysunek 1D).
- W przypadku niewielkiego krwawienia należy użyć kautera, aby zatrzeć lub odłączyć otaczającą tkankę.
- Wykonaj torakotomię na poziomie 4. przestrzeni międzyżebrowej i włóż retraktor, aby uzyskać widoczność serca i płuc (Rysunek 1E). Ostrożnie otwórz opłucną, aby uniknąć krwawienia.
- Tymczasowo zamknij LAD za pomocą opaski uciskowej w celu wywołania niedokrwienia/reperfuzji (MIR) w określonym czasie; lub trwale (MI) zamknij go, wykonując 6−7 węzłów za pomocą szwu 6-0, aby zamknąć podwiązanie (Rysunek 1F,G).
UWAGA: Prawe miejsce do okluzji LAD znajduje się około 2−3 mm poniżej lewej małżowiny usznej na brzusznym/lewym bocznym brzegu serca. Udana okluzja wiąże się ze zmianami w EKG (uniesienie odcinka ST) i makroskopowymi zmianami w lewej części LV w postaci bladości. - W przypadku modelu niedokrwiennego/reperfuzyjnego należy ponownie otworzyć LAD poprzez zdjęcie opaski uciskowej po 30 minutach okluzji.
- Zamknij klatkę piersiową trzema szwami jednoguzikowymi za pomocą pojedynczego szwu monofilamentowego 4-0 (Rysunek 1H). Przed zaciśnięciem ostatniego szwu usuń resztki powietrza z klatki piersiowej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aby zapobiec powstaniu odmy opłucnowej (Rysunek 1I).
- Zmień położenie mięśni i wyłącz lotne znieczulenie.
- Zszyj skórę szwem ciągłym za pomocą szwu 4-0 (Rysunek 1J).
- Podaj spray antyseptyczny w celu ochrony przed infekcjami i gryzieniem szwu przez szczury.
3. Leczenie pooperacyjne i kryteria wykluczenia
- Trzymaj szczury na stole grzewczym, aż się obudzą. Ekstubować szczury, gdy tylko zaczną spontanicznie oddychać.
- Umieść ekstubowane szczury w klatce pod lampą grzewczą, aby zapobiec ich wychłodzeniu.
- Szczury powinny wrócić do pomieszczeń dla zwierząt w znormalizowanych warunkach, gdy zaczną znowu zachowywać się normalnie.
- Dodaj 2 ampułki pirytramidu i 30 ml 5% glukozy do 250 ml wody w celu znieczulenia pooperacyjnego przez trzy dni.
- Sprawdź kondycję i zachowanie szczurów za pomocą listy kontrolnej i kryteriów wykluczenia (Tabela 1). Obserwuj zwierzęta dwa razy dziennie przez następny tydzień, a następnie dwa razy w tygodniu.
UWAGA: Zgodnie z międzynarodowymi standardami, wszelkie cierpiące zwierzęta lub zwierzęta, które uzyskają do 6 punktów w ocenie z listą kontrolną, należy przedstawić lekarzom weterynarii w celu podjęcia decyzji związanych z terapią. Każde zwierzę, które zdobędzie 7 lub więcej punktów, musi zostać natychmiast uśmiercone z powodu przedawkowania ketaminy i ksylazyny.
| egzamin | obserwacja | wynik |
| Masa ciała | stajnia | 0 |
| 10% straty | 4 | |
| 15% straty przez 48 h | 7 | |
| 18% straty | 7 | |
| normalny (sierść płaska i błyszcząca) | 0 | |
| Wygląd zewnętrzny | piloerekcja | 1 |
| krwiak | cyfra arabska | |
| Rany skóry/skaleczenia/ślady ugryzień | cyfra arabska | |
| znacznie zmniejszona pielęgnacja | 4 | |
| (otwory nieczyste/zakrzepłe lub wilgotne) | 7 | |
| silne podrażnienia skóry lub rany | 7 | |
| zgarbiona postawa >2 h | 7 | |
| znaczne wzdęcia brzucha (wodobrzusze) | 7 | |
| Zachowanie | normalny (sen, ciekawość, kontakty społeczne, reakcja na dotyk) | 0 |
| nietypowe zachowanie, np. upośledzona aktywność | cyfra arabska | |
| samoizolacja, wyraźna nadpobudliwość lub stereotypia | 4 | |
| letarg trwający <6 h | 4 | |
| letarg trwający od 6 h do 8 h | 7 | |
| apatia >8 h | 7 | |
| stereotypia trwa nieprzerwanie przez >10 minut i utrzymuje się nadal po 2 godzinach | 7 | |
| Oznaki bólu po dotknięciu | 7 | |
| Automatyczne okaleczenie | 7 | |
| Trawienie | normalny | 0 |
| biegunka (miękki kał) | 3 | |
| biegunka trwająca 72 godziny lub wodnista | 7 | |
| krwawy stolec | 7 |
Tabela 1: Lista kontrolna i kryteria wykluczenia. Poniższa tabela zawiera egzaminy, których należy przestrzegać, oraz odpowiadający im wynik. W związku z tym należy dostosować leczenie pooperacyjne zwierzęcia lub skonsultować się z weterynarzem.
4. Pomiary echokardiograficzne
UWAGA: Echokardiografia jest zwykle wykonywana dwukrotnie, przed indukcją zawału mięśnia sercowego i przed pobraniem narządów.
- Szczurom należy wstrzykiwać mieszaninę ksylazyny (4 mg/kg m.c.) i ketaminy (100 mg/kg m.c.) dootrzewnowo.
- Umieść szczury w pozycji leżącej na tacy grzewczej. Nałóż żel echo na klatkę piersiową, który pomaga falom ultradźwiękowym lepiej się rozchodzić i zmniejsza zakłócenia sygnału.
- Uzyskaj przymostkowe widoki krótkiej osi jamy lewej komory na poziomie mięśnia brodawkowatego.
- Wykonaj echokardiografię w trybie M w celu zmierzenia frakcji wyrzutowej lewej komory i morfologii.
5. Grabież organów (bez pracującego serca)
- Ksylazynę (4 mg/kg m.c.) i ketaminę (100 mg/kg m.c.) podawać dootrzewnowo przed pobraniem narządów. Upewnij się, że odruchy są negatywne.
UWAGA: Nie jest wymagana intubacja, ponieważ zabieg nie trwa dłużej niż 1 minutę. - Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry pod mieczykiem mieczykowatym i rozciągnij go równolegle do żeber po obu stronach za pomocą nożyczek.
- Przetnij żebra w przedniej linii pachowej i chwyć mieczykowaty, aby podnieść klatkę piersiową do góry (Rysunek 2A).
- Usuń zrosty tkankowe anatomiczne lub zwłóknieniowe, ostrożnie rozrywając tkankę dwiema parami kleszczy.
- Pobrać próbki krwi (do gazometrii lub analizy molekularnej) z żyły głównej dolnej za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml.
- Wykonaj wycięcie całego serca na poziomie wlotu i wylotu (Rysunek 2B). W razie potrzeby należy przeprowadzić ocenę pracy serca zgodnie z opisem w punkcie 6.
- Organy należy zebrać, zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych analiz molekularnych lub w formaldehydzie do celów histologicznych.
6. Pomiary hemodynamiczne ex vivo za pomocą działającego układu serca
UWAGA: Ogólna konfiguracja i komponenty aparatu zostały już wcześniej opisane11. Poniższy protokół opisuje postępowanie z sercem zwierzęcia i kroki niezbędne do oceny funkcji lewej komory.
- Znieczulić szczury zgodnie z opisem w kroku 5.1 i wstrzyknąć dożylnie 200 j.m. heparyny (żyła udowa).
- Otwórz klatkę piersiową przez nacięcie pod łukiem żebrowym za pomocą skalpela i przedłuż ją nożyczkami do obu przednich linii pachowych i podnieś mostek.
- Przetnij wielkie naczynia w pobliżu ich wylotu lub wlotu do serca, aby je wyciąć (Rysunek 2B).
- Zanurz serce w lodowatym buforze Krebsa-Henseleita i zamontuj go na izolowanym układzie serca z perfuzją erytrocytów poprzez kaniulację aorty (Ryc. 3A).
- Zacznij od trybu LD ze stałym obciążeniem następczym 60 mmHg (okres stabilizacji).
- Po 15 minutach trybu LD przełącz się w tryb WH. W związku z tym należy kancelować lewy przedsionek przez żyłę płucną (Ryc. 3B). Następnie zmień kierunek przepływu w systemie, otwierając zacisk zamykający kaniulę przedsionkową. Powoduje to perfuzję lewego przedsionka i fizjologiczny przepływ krwi w lewym sercu11.
- Nagrywaj pomiary hemodynamiczne przez 20 minut w trybie WH.
- Zbieraj krople krwi z naczyń wieńcowych za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml, aby mierzyć przepływ wieńcowy (CF, ml/min) co 5 minut.
UWAGA: CF mierzy się jako różnicę między przepływem z lewej strony przedsionka (LAF) a przepływem z aorty (AF). - Wykonuj ciągłe pomiary LAF (odpowiednik rzutu serca) i AF za pomocą sondy przepływu.
UWAGA: Sonda jest wkładana przez aparat WH do LV. Wszystkie dane są rejestrowane w sposób ciągły. - Jeśli wymaga tego trwający protokół, wprowadź cewnik o wysokiej wierności wstecz przez zastawkę aortalną do lewej komory i zmierz ciśnienie skurczowe lewej komory (LVSP).
- Aby ocenić pracę ciśnienie-objętość wykonywaną w ciągu minuty, oblicz objętość wyrzutową jako pojemność minutową serca podzieloną przez częstość akcji serca.
- Obliczyć zewnętrzną pracę serca (EHW) według następującego wzoru: CO x LVSP (g x m/min) znormalizowane do masy serca.
Wyniki
Poniższe wyniki zostały opublikowane przez Pilz i wsp.6. Dzięki tej precyzyjnej procedurze chirurgicznej można badać efekt kardioprotekcyjny zdalnego uprzedniego warunkowania niedokrwiennego (RIPerc). Jest to potencjalna nowa metoda leczenia pacjentów cierpiących na ostry MI lub MIR oraz następujące po nich przebudowy komór, która w wielu przypadkach prowadzi do wtórnej HF. Naśladowanie zmian patofizjologicznych MI/MIR jest obligatoryjnym krokiem w ocenie metod leczenia, ponieważ badania in vitro lub ex vivo nie zapewniają środowiska fizjologicznego. W niniejszym protokole zwierzęta poddano 30 min okluzji LAD, po której nastąpiła reperfuzja (t.j. MIR).
Aby udowodnić powtarzalność procedury, wykonano skrawki histologiczne i barwienia (Rycyna 4A). Wyraźnie widoczno było, że blizna włóknista u zwierząt leczonych za pomocą MIR+RIPerc była porównywalna z formowaniem się blizny u zwierząt z grupy Sham, podczas gdy porównanie włóknienia pomiędzy grupami Sham i MIR było istotne (Rycyna 4B). Dodatkowo u zwierząt leczonych za pomocą MIR+RIPerc stwierdzono istotne zmniejszenie włóknienia w porównaniu do zwierząt leczonych MIR. Jednak reprezentatywne obrazy histologiczne wyjaśniają skuteczność tej procedury chirurgicznej, ponieważ w grupie MIR wyraźnie utrzymuje się obszar zawału (Rycyna 4A). Przy użyciu echografii in vivo zmierzono frakcję wyrzutową oraz końcowoprzestrzenne średnice rozkurczowe i skurczowe lewej komory (LVEDD i LVESD), co wykazało istotne zmniejszenie funkcji serca w wyniku leczenia MIR, podczas gdy parametry hemodynamiczne zostały zachowane dzięki RIPerc (Rycyna 4C−F). Dane hemodynamiczne ex vivo wykazały skuteczność procedury, ponieważ w grupie MIR odnotowano istotne spadki LVSP, rzutu serca (CO), objętości wyrzutowej (SV) oraz zewnętrznej pracy serca (EHW) (Rycyna 5A−G).
Przegląd literatury dotyczący tej procedury chirurgicznej nie wykazał negatywnych ani niezadowalających uwag i wyników w przypadkach, gdy została ona przeprowadzona prawidłowo. Niemniej jednak należy zapobiegać błędom wspomnianym we wprowadzeniu i dyskusji, a szkolenie jest niezbędne do osiągnięcia stabilnego poziomu sprawności i uzyskania porównywalnych wyników.
Rycina 1: Przygotowanie przedoperacyjne i procedura chirurgiczna. (A) Intubacja zwierzęcia przy użyciu rurki 14 G. (B) Pozycja wyprostna na plecach i dezynfekcja pola operacyjnego. (C) Nacięcie skóry (2 mm przyśrodkowo od mostka na klatce piersiowej po lewej stronie na poziomie 3. przestrzeni międzyżebrowej). Nacięcie musi sięgać przedniej linii pachowej na poziomie 5. przestrzeni międzyżebrowej. (DOdsuń mięśnie, aby odsłonić żebra.E) Otwarcie klatki piersiowej. (F) Trwała okluzja LAD przy użyciu 6–7 węzłów. (G) Przejściowe zamknięcie LAD za pomocą stazy. (H) Zamknięcie klatki piersiowej po niedokrwieniu i reperfuzji mięśnia sercowego poprzez wykonanie trzech pojedynczych szwów z jednym węzłem wokół żeber. (I) Prawidłowe zamknięcie klatki piersiowej. Przed ciasnym zawiązaniem ostatniego węzła należy użyć strzykawki o pojemności 10 ml, aby usunąć z klatki piersiowej resztki powietrza. Jest to niezbędne w celu zapobieżenia odmie opłucnowej. (J) Szew skóry. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Pobieranie narządów. (A) Otwórz klatkę piersiową, wykonując nacięcia podmieczowate i przedłużając je do obu linii średnio-pachowych. Następnie wykonaj nacięcia międzyżebrowe, aby ułatwić uniesienie mostka. (B) Wycięcie serca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Aparatura do izolowanego serca. (A) tryb Langendorffa. Serce zostaje zamocowane do aparatu WH poprzez kaniulację aorty. (B) Tryb pracującego serca. System można przełączyć w tryb WH w celu oceny funkcji serca poprzez kanulację lewego przedsionka. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 4: Wpływ zdalnego warunkowania niedokrwiennego na formowanie się blizny, funkcję i przebudowę lewej komory. (A) Przekroje histologiczne lewej komory serca pobrane w 14. dniu po reperfuzji mięśnia sercowego. (B) Ilościowe wyniki włóknienia przedstawione na wykresach słupkowych. (C) Reprezentatywne echokardiogramy w trybie M. (D) Frakcja wyrzutowa (EF) przedstawiona na wykresach słupkowych. (E) końcowy wymiar rozkurczowy lewej komory (LVESD) przedstawiony na wykresach słupkowych. (F) średnica lewej komory w końcu rozkurczu (LVEDD) przedstawiona na wykresach słupkowych. MIR – niedokrwienie-reperfuzja mięśnia sercowego; RIPerc – zdalne przeciwwarunkowanie niedokrwienne. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0.01. Przedrukowano z opracowania Pilz i wsp.6 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Wpływ RIPerc na funkcję hemodynamiczną LV. (A) ciśnienie skurczowe lewej komory (LVSP), (B) rzut serca (CO), i (C) wyniki objętości wyrzutowej (SV) uzyskano z izolowanego pracującego serca w 14. dobie po reperfuzji mięśnia sercowego. (D) CO przedstawiono jako funkcję obciążenia następczego; (F) zewnętrzna praca serca w funkcji obciążenia następczego, wyniki ilościowe przedstawione na wykresie słupkowym (E i G). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, n = 4–7 w grupie. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0.01. MIR, niedokrwienie/reperfusja mięśnia sercowego; RIPerc, zdalna prekondycja niedokrwienna; EHW, zewnętrzna praca serca; SV, objętość wyrzutowa; AUC, pole pod krzywą. Przedrukowano z Pilz et al.6 za zgodą wydawnictwa Elsevier. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Niekorzystna przebudowa po zawale mięśnia sercowego jest uważana za kluczowy mechanizm w rozwoju niewydolności serca. W związku z tym, aby zapewnić ciągłość badań nad układem sercowo-naczyniowym, procedury i techniki eksperymentalne powinny być powtarzalne. Zrozumiały i jasno zdefiniowany protokół eksperymentalny jest podstawowym elementem odtwarzalności. Odtwarzalność odnosi się do wyników, które mogą być powtarzane przez wielu naukowców i są walidowane w różnych laboratoriach. Badanie to miało na celu przedstawienie półminimalnie inwazyjnej metody indukcji przewlekłego lub reperfuzji MI oraz ocena funkcji hemodynamicznej serca u szczurów.
Wyniki te i dalsze opublikowane dane wskazują na wysoką siłę działania tej metody chirurgicznej i jej znaczenie w badaniach nad zawałem serca, przebudową i niewydolnością serca. Podczas gdy uszkodzenie niedokrwienne/reperfuzyjne może być wykorzystane do zrozumienia zmian w MI z późniejszą reperfuzją, stała okluzja pozwala na dalsze zrozumienie krótko- i długoterminowych procesów przebudowy mięśnia sercowego. Inne metody chirurgiczne powodują więcej uszkodzeń tkanek, a zwierzęta wykazują większe ryzyko rozwoju infekcji i odmy opłucnowej, co skutkuje wyższym odsetkiem rezygnacji. Natomiast procedura ta ma na celu zmniejszenie śmiertelności poprzez określone ulepszenia w konfiguracji i obsłudze. Dodatkowo wykazują różnice w rozszerzaniu się blizn zwłóknieniowych z powodu niestabilnej okluzji LAD.
Nasz protokół zapewnia łatwą metodę intubacji, która jest jednym z najbardziej krytycznych etapów całej procedury. W przeciwieństwie do kilku innych publikacji12, tracheotomia nie jest wykonywana w naszym zabiegu. Wspomaga to przebudzenie i rehabilitację zwierząt po operacji, prowadząc do rozwoju zmian patofizjologicznych, które są zamierzone przez tę procedurę chirurgiczną przed poddaniem zwierząt pomiarom pooperacyjnym. Oczywiście, jeśli jest to protokół bez przeżycia, tracheotomia jest wykonywana pod wzrokiem i dlatego jest łatwiejsza do wykonania. Dodatkowo, zamknięcie tracheotomii w protokole przeżycia nie ma zastosowania. Jeśli klatka piersiowa jest otwarta, konieczne jest przewietrzenie płuc, aby zapobiec zapadnięciu się. Dlatego szczury są intubowane przed zabiegiem chirurgicznym. Minimalnie inwazyjne podejście nie przecina żeber ani mostka, zachowując w ten sposób zwartość i stabilność klatki piersiowej. W związku z tym poprawia się rekonwalescencja zwierząt, a ryzyko wystąpienia samoistnej odmy opłucnowej lub krwawienia jest stosunkowo niskie.
Jak wspomniano powyżej, chociaż intubacja jest wyraźną zaletą, jest trudna do wykonania i może spowodować wyższy odsetek rezygnacji na początku eksperymentów. Ten problem można złagodzić dzięki szkoleniu i pewnej wiedzy anatomicznej. Ważne jest, aby włożyć rurkę pod odpowiednim kątem i rozciągnąć ciało zwierzęcia, aż światło zacznie świecić przez usta głosowe, po czym rurkę można delikatnie popchnąć do przodu. Uważaj, aby nie uszkodzić warg głosowych, ponieważ może to spowodować obrzęk, późniejszą niedrożność głośni i uduszenie.
Ważne jest również, aby LAD był prawidłowo podwiązany. Małe okienko chirurgiczne, szybko bijące serce i wentylowane płuco (unikaj dotykania go tak często, jak to możliwe, ponieważ każdy kontakt może spowodować krwawienie w płucu) sprawiają, że naczynie nie jest wyraźnie widoczne. Dlatego wiedza anatomiczna jest niezbędna. Lewa małżowina uszna jest niezbędna, aby pomóc w standaryzacji zarówno obszaru zagrożonego, jak i w umiejscowieniu podwiązania wokół LAD. Ścieg musi być wykonywany śródściennie, a nie przezściennie w lewej komorze, ponieważ może to spowodować zmniejszenie średnicy i objętości komory lewej komory, co nie jest spowodowane procesami patologicznymi. Udana okluzja wiąże się z sinicą zagrożonego obszaru mięśnia sercowego i podwyższeniem odcinka ST w EKG. Głównym ograniczeniem tej procedury jest prawidłowe ułożenie szwu. Aby osiągnąć porównywalne wyniki, szwy muszą znajdować się na tym samym poziomie i muszą być użyte podobne ilości tkanki. Wymaga to wysokiego poziomu wyszkolenia i należy wziąć pod uwagę różną wagę zwierząt. Kolejną kwestią do rozważenia jest odpowiednie usunięcie odmy opłucnowej przed zamknięciem przestrzeni międzyżebrowej. Jeśli nie zostanie to dokładnie wykonane, zwierzęta będą wykazywać trudności w oddychaniu, ponieważ napompowanie lewego płuca będzie utrudnione przez odmę opłucnową. Jak wspomniano powyżej, można to złagodzić, używając strzykawki do usunięcia resztek powietrza z klatki piersiowej.
Obecnie ta procedura zawału mięśnia sercowego jest powszechnie stosowaną metodą, która gwarantuje porównywalne wyniki i wysoki wskaźnik przeżycia, jeśli krytyczne etapy są wykonywane z dużą precyzją. Przyszłe projekty dotyczące różnych metod leczenia, urządzeń lub leków w zawale mięśnia sercowego, niewydolności serca lub przebudowie serca mogą być oceniane poprzez wykonanie tej minimalnie inwazyjnej techniki.
Pomiary WH nie są, jak wspomniano powyżej, powszechnie stosowane, ponieważ ich konserwacja i obsługa wymagają specjalnego sprzętu i wiedzy. Aby uzyskać reprezentatywne i porównywalne dane, należy unikać pułapek. Najbardziej krytycznymi krokami są montaż serca i przełączenie z modelu D na tryb WH. Jeśli serce nie zostanie odpowiednio wycięte, montaż może być trudny, ponieważ wymagana jest wystarczająca długość tkanki aortalnej, aby przymocować serce do aparatu. Wkrótce po podłączeniu do trybu LD częstotliwość pracy serca może się zmniejszyć z powodu płukania w zimnym buforze, odłączenia jego bodźców fizjologicznych w organizmie lub reperfuzji krwi innego gatunku przez aparat. W takich przypadkach należy zastosować rozrusznik serca, aby zarówno przywrócić, jak i zachować częstotliwość fizjologiczną. Zapewnia to porównywalne wyniki u wszystkich zwierząt. Ponieważ objętość krwi w aparacie jest wielokrotnością objętości fizjologicznej u szczurów, stosuje się bydlęce krwinki czerwone w zawiesinie opartej na buforze Krebsa-Henseleita.
Przełączenie z trybu LD na tryb WH jest równoznaczne z przejściem z biernej na czynną pracę serca. Tryb LD służy do przyzwyczajenia serca do nowego środowiska. W trybie WH serce musi spełniać swoje fizjologiczne funkcje wyrzutowe. W związku z tym przed oceną wymagana jest krótka faza adaptacji do nowych warunków poprzez zwiększenie obciążenia następczego.
Kolejnym krytycznym krokiem, o którym często się zapomina, jest odpowiednie przygotowanie i konserwacja aparatu i perfuzatu. Dokładna objętość każdego związku musi być wymieszana, a temperatura w systemie musi być kontrolowana i regulowana. Niemniej jednak WH jest elegancką metodą jednoczesnej oceny rzutu serca, objętości wyrzutowej, ciśnienia skurczowego lewej komory i przepływu wieńcowego.
Ta wysoce powtarzalna procedura indukcji MI i reprezentujące ją dane uzyskane przez aparat WH same w sobie udowadniają swoją zdolność. Podejście półminimalnie inwazyjne, poziom okluzji LAD i metoda intubacji ułatwiają szybki powrót do zdrowia i niską zmienność wielkości zawału. Dodatkowo analiza funkcji serca w izolowanych pracujących sercach dostarcza cennych wyników hemodynamicznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują zespołowi operacyjnej i technikom Centrum Badań Biomedycznych za ich wkład, pomoc techniczną, cenny wkład i porady. Projekty są finansowane przez Instytut Ludwiga Boltzmanna, Klaster Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (projekt REM).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| < MOCNE> ZNIECZULENIE & ANALGEZJA | |||
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 / 8-00487 | |
| Ketamina | Dr. E. Grä ub AG | 100 mg/kg masy ciała | |
| Pirytramid | Hameln-Pharma Plus GmbH | 2 ampułkle z 30 ml glukozy 5% w 250 ml wody | |
| Ksylazyna | Bayer | 4 mg/kg masy ciała | |
| INTUBACJA | |||
| Powietrze | |||
| Tlen (czysty) | |||
| Maszyna wentylacyjna | Hugo Sachs Electronics | UGO Basile S.R.L. | Respirator |
| Rurka o rozmiarze 14 | Dickinson and Company | BD Venflon | |
| PREPARAT | |||
| Antyseptyczny roztwór jodu powidyny | Mundipharma | Betaisodona roztwór | |
| Maść do oczu | Fresenius Kabi Austria | Oleovital z witaminą A + dekspantenolem | |
| Golarka | |||
| NARZĘDZIA CHIRURGICZNE | |||
| Kleszcze anatomiczne | Martin | 12-272-15 | |
| Kleszcze anatomiczne małe | Martin | 24-386-16 | |
| Kleszcze anatomiczne cienkie | Odelga | RU4042-15 | |
| Kubek kauteryzacyjny z cienką końcówką | wysokotemperaturową | bvi-Accu-Temp | |
| (mały, do płynów) | Martin | 56-231/11 | |
| Mensur | MTI | 29-260/25 | |
| Zaciski na komary | MTI | 05-055/12 | |
| Uchwyt na igły krótki | Martin | 20-658-14 | |
| Uchwyt na igły cienki | Martin | ||
| Haczyk | BT-190 | ||
| Skalpel rozmiar 3 | Swann Morton | No.10, 0301 | |
| Nożyczki do preparacji tkanek | Aesculap | BC259R | |
| Ostre nożyczki | MTI | 01-010/10 | |
| Mały zwijacz | Alm | AM.416.10 | |
| Kleszczyki do surcygalów | Martin | 12-321-13 | |
| Nożyczki | |||
| SZWY | |||
| PermaHand Silk 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | K891H | |
| Vicryl 4-0 | Johnson & Johnson Medical Products GmbH | JV2024 | pojedynczy szew monofilowy |
| Vicryl - Johnson 6:0 | Szew polietylenowy Johnson Medical Products GmbH | V301G | |
| PROGRAMY KOMPUTEROWE & APARATURA | |||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments | v7.3.2 | Oprogramowanie Labchart |
| System PowerLab | ADInstruments | Powerlab 8/30 | |
| EX VIVO HEMODYNAMICS | |||
| Flowmeter Narcomatic RT-500 | Narco Bio-Systems | sonda przepływowa | |
| Izolowany aparat kardiologiczny | Hugo Sachs Electronics | ||
| Labchart 7 Pro | ADInstruments GmbH | v7.3.2 | Oprogramowanie Labchart |
| Millar SPR-407 | Millar Instruments Inc. | 840-4079 | Cewnik MicroTip o wysokiej wierności |
| Elektrody igłowe za pośrednictwem Animal bio Amp | ADInstruments GmbH | MLA1203 | |
| Przetwornik ciśnienia fizjologicznego (MLT844) z przypinanymi kopułkami BP | ADInstruments GmbH | MLT844 | |
| System PowerLab | ADInstruments GmbH | Powerlab 8/30 |
Bibliografia
- WHO. Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015. World Health Organization. , (2016).
- Jaquet, K., et al. Reduction of myocardial scar size after implantation of mesenchymal stem cells in rats: what is the mechanism. Stem Cells and Development. 14 (3), 299-309 (2005).
- Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion. Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).
- Kolk, M. V. V., et al. LAD-Ligation: A Murine Model of Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438(2009).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591(2019).
- Pilz, P. M., et al. Remote ischemic perconditioning attenuates adverse cardiac remodeling and preserves left ventricular function in a rat model of reperfused myocardial infarction. International Journal of Cardiology. 285, 72-79 (2019).
- Santer, D., et al. In vivo and ex vivo functional characterization of left ventricular remodelling after myocardial infarction in mice. ESC Heart Failure. 2 (3), 171-177 (2015).
- Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugetierherzen II. Über den Einfluss von Wärme und Kälte auf das Herz der warmblütigen Tiere. Pflügers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 66 (67-68), 355-400 (1897).
- Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
- Podesser, B. K., et al. The erythrocyte-perfused "working heart" model: hemodynamic and metabolic performance in comparison to crystalloid perfused hearts. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 9-15 (1999).
- Kiss, A., et al. Argon preconditioning enhances postischaemic cardiac functional recovery following cardioplegic arrest and global cold ischaemia. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 54 (3), 539-546 (2018).
- Kiss, A., et al. Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase. Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).
Przedruki i uprawnienia
