Artykuł metodologiczny

Model in vitro ludzkich blizn przerostowych skóry z wykorzystaniem stłoczenia makromolekularnego

DOI:

10.3791/61037

⸱

1 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie makromolekularnego stłoczenia do stworzenia in vitro modelu ludzkiej przerostowej tkanki bliznowatej, która przypomina warunki in vivo. Uprawiane w zatłoczonym środowisku makromolekularnym fibroblasty ludzkiej skóry wykazują fenotypy, biochemię, fizjologię i cechy funkcjonalne przypominające tkankę bliznowatą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że in vivo tkanki są bardzo zatłoczone przez białka, kwasy nukleinowe, rybonukleoproteiny, polisacharydy, itp. Poniższy protokół stosuje technikę stłoczenia makromolekularnego (MMC) w celu naśladowania tego fizjologicznego stłoczenia poprzez dodanie neutralnych polimerów (tłumów) do kultur komórkowych in vitro. Wcześniejsze badania z użyciem Ficollu lub dekstranu jako tłumów pokazują, że ekspresja kolagenu I i fibronektyny w liniach komórkowych WI38 i WS-1 jest znacznie zwiększona przy użyciu techniki MMC. Jednak technika ta nie została zwalidowana w pierwotnych fibroblastach ludzkiej skóry pochodzących z blizn przerostowych (hHSF). Ponieważ blizny przerostowe powstają w wyniku nadmiernego odkładania się kolagenu, protokół ten ma na celu skonstruowanie bogatego w kolagen modelu blizny przerostowej in vitro poprzez zastosowanie techniki MMC z hHSF. Wykazano, że ten zoptymalizowany model MMC ma więcej podobieństw z tkanką bliznowatą in vivo w porównaniu z tradycyjnymi dwuwymiarowymi (2D) systemami hodowli komórek. Ponadto jest opłacalny, efektywny czasowo i etycznie pożądany w porównaniu z modelami zwierzęcymi. W związku z tym opisany tutaj zoptymalizowany model oferuje zaawansowany model "podobny do in vivo" do badań związanych z bliznami przerostowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka bliznowata reprezentuje punkt końcowy naprawy tkanki. Jednak u wielu osób, zwłaszcza tych cierpiących z powodu oparzeń lub urazów1, blizny mogą być nadmierne i wywierać niepożądany wpływ na morfologię i funkcjonowanie zagojonej skóry. Chociaż dokładne mechanizmy powstawania blizn patologicznych (blizny przerostowe i bliznowce) nie są w pełni poznane, wykazano, że nadmierne odkładanie się kolagenu podczas gojenia się ran jest istotnym wkładem2.

Jest powszechnie wiadomo, że transformujący czynnik wzrostu beta 1 (TGF-β1) i alfa aktyna mięśni gładkich (αSMA) odgrywają kluczową rolę w tworzeniu blizn przerostowych. Dowody sugerują, że podwyższony TGF-β1 bezpośrednio stymuluje nadmierne odkładanie kolagenu poprzez regulację szlaku sygnałowego SMAD3. Ponadto stwierdzono, że αSMA przyczynia się do powstawania blizn przerostowych poprzez regulację skurczu komórek i reepitelializacji w procesie gojenia się ran4. Brak odpowiednich modeli in vitro i in vivo jest główną przeszkodą w opracowywaniu i ocenie interwencji i terapii w celu remediacji blizn. Celem tego badania jest wykorzystanie istniejącej techniki MMC do skonstruowania "in vivo" modelu blizny przerostowej, który jest odpowiedni do oceny nowych i pojawiających się interwencji związanych z bliznami.

Rozmnażanie żywej tkanki poza ciałem było celem od lat w społeczności naukowej. Rozwój technik in vitro na początku XX wieku częściowo osiągnął ten cel. Obecne techniki in vitro nieznacznie ewoluowały od pierwotnej demonstracji Roux, że komórki embrionalne mogą przetrwać ex vivo przez kilka dni w ciepłym roztworze soli fizjologicznej5. Jednak metodologie in vitro są w większości ograniczone do pojedynczych typów komórek hodowanych w 2D i nie odzwierciedlają dokładnie tkanek in vivo. Chociaż jest to przydatne do badania biochemii komórek, fizjologii i genetyki, tkanki natywne są trójwymiarowe i zawierają wiele typów komórek. Proste systemy 2D in vitro poddają komórki ssaków wysoce sztucznemu środowisku, w którym zatracana jest natywna architektura specyficzna dla tkanki6. To z kolei wpływa na zdarzenia wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe, powodując nieprawidłową morfologię, fizjologię i zachowanie komórek7.

Zainteresowanie tym protokołem polega na rozwoju i klinicznym leczeniu blizn przerostowych i bliznowców. Chociaż powszechnie wiadomo, że fibroblasty skóry są w dużej mierze odpowiedzialne za obfitą produkcję kolagenu obecnego w tkance bliznowatej, hodowla fibroblastów skóry przy użyciu systemów 2D in vitro nie jest w stanie odtworzyć obrotu kolagenu obserwowanego in vivo8. Współczesne metody in vitro nadal zasadniczo wykorzystują "ciepłą sól fizjologiczną", środowisko zupełnie inne niż w żywych tkankach. Tkanki in vivo są niezwykle zatłoczone, a białka, kwasy nukleinowe, rybonukleoproteiny i polisacharydy zajmują od 5% do 40% całkowitej objętości. Ponieważ żadne dwie cząsteczki nie mogą zajmować tej samej przestrzeni w tym samym czasie, dostępna jest niewielka ilość wolnej przestrzeni i prawie całkowity brak wolnej wody9.

Technika MMC nakłada ograniczenia wpływające na właściwości termodynamiczne cytozolu i płynów śródmiąższowych. Interakcje molekularne, kompleksy sygnalizacyjne receptor-ligand, enzymy i organelle są ograniczone i nie mogą ze sobą swobodnie oddziaływać9. Interakcje w środowisku okołokomórkowym (tj. śródmiąższu) są również ograniczone. Najnowsze dowody potwierdzają, że wysokie stężenia obojętnych makrocząsteczek w zatłoczonych roztworach zaburzają dyfuzję, asocjację fizyczną, lepkość i właściwości hydrodynamiczne10.

Ciekawe, kilka popularnych czynników tłumiących (np. Ficoll, dextran, poliwinylopirolidon [PVP] i 4-styrenosulfonian sodu [PSS]) nie są równoważne, gdy są stosowane do różnych typów komórek i w różnych ustawieniach. W jednym z poprzednich badań stwierdzono, że Ficoll jest mniej cytotoksyczny dla mezenchymalnych komórek macierzystych w porównaniu z PVP. Wyniki te zostały zinterpretowane jako konsekwencja jego neutralnego ładunku i stosunkowo małego promienia hydrodynamicznego11. Natomiast drugie badanie wykazało, że dekstran jest bardziej skuteczny w stymulowaniu odkładania kolagenu I przez ludzkie fibroblasty płuc w porównaniu z Ficoll12. Dane z naszego własnego badania sugerują, że Ficoll zwiększa odkładanie kolagenu przez fibroblasty pochodzące z blizn przerostowych, podczas gdy PVP jest toksyczny dla tych komórek13.

Wykazano, że konwersja prokolagenu do kolagenu jest szybsza w bardzo zatłoczonym środowisku in vivo14, podczas gdy tempo reakcji biologicznych jest opóźnione w rozcieńczonym systemie hodowli 2-D15. Zoptymalizowaliśmy tutaj protokół in vitro, włączając MMC, aby pokazać hodowlę fibroblastów skóry służącej jako bardziej "in vivo" model zwłóknienia skóry i tworzenia blizn. W przeciwieństwie do powszechnego systemu hodowli 2D, hodowla hHSF z MMC znacznie stymuluje biosyntezę i odkładanie kolagenu13. Warto zauważyć, że inne cechy zwłóknienia (tj. zwiększona ekspresja metaloproteinaz macierzy [MMP] i cytokin prozapalnych) są również widoczne w tym zoptymalizowanym protokole MMC13. Podczas hodowli tą metodą wykazano, że komórki skóry właściwej podsumowują parametry fizjologiczne, biochemiczne i funkcjonalne mierzone in vivo.

Zoptymalizowany protokół MMC in vitro został wykorzystany do oceny ekspresji kolagenu i innych białek ECM przez fibroblasty skóry wyizolowane z przerostowej blizny skóry właściwej i niezaangażowanej sąsiedniej skóry właściwej. Podczas hodowli w środowiskach MMC in vitro zaobserwowano, że hHSF wyrażają pewne cechy (tj. mRNA, biochemię, fizjologię i fenotyp) podobne do przerostowej tkanki bliznowatej skóry in vivo. Dowody wskazują, że właściwości fizyczne i chemiczne są ważnymi czynnikami przy wyborze tłumników i optymalizacji warunków MMC do uprawy in vitro.

Dla dowodu zasady, protokół MMC jest tutaj stosowany do jakościowej i ilościowej oceny zdolności Shikoninu i jego analogów do wywoływania apoptozy. Pozwala to na ocenę potencjalnych zastosowań tych naturalnie pochodzących związków Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM) do radzenia sobie z bliznami skórnymi13. Niezależnie od tego, prostota, opłacalność i terminowość tego protokołu MMC in vitro spełnia również najnowsze przepisy mające na celu wyeliminowanie eksperymentów na ssakach, wynikające z dyrektywy UE 2010/63/UE i amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Utrzymuj hHSF i prawidłowe fibroblasty skóry pochodzące z tkanki niepatologicznej (hNSF) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% v/v roztworu penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2/95% powietrzem.
  2. Kup Ficoll 70, Ficoll 400 i kwas askorbinowy od odpowiednich firm.

2. Budowa modelu blizny przerostowej MMC

  1. Zasiaj hHSF lub hNSF (50 000 / dołek) na 24-dołkowej płytce zawierającej 1 ml pożywki w każdym dołku.
  2. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37°C przy 5% CO2 i pozostawić na noc.
  3. Przygotuj nośnik programu MMC. W oparciu o całkowitą objętość wymaganą do eksperymentu, wyprodukuj 10% pożywki FCS/DMEM, mieszając Ficoll 70 (18,75 mg / ml), Ficoll 400 (12,5 mg / ml) i kwas askorbinowy (100 μM).
  4. Umieść mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 1 godzinę, aby rozproszyć tłumy w roztworze, a następnie wysterylizuj media MMC za pomocą filtra 0,2 μm.
  5. Odessaj zużyty nośnik i zastąp go świeżo wyprodukowanym nośnikiem MMC.
  6. Inkubować komórki przez 6 dni w temperaturze 37°C i 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 3 dni.

3. Wyrażenie całkowitej ilości kolagenu

  1. Przygotować czerwony roztwór Syriusza (0,1% w/v). Rozpuścić 0,2 g proszku Direct Red 80 w 200 ml destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O) w 1 ml kwasu octowego.
  2. Odessać pożywkę MMC i dodać 300 μl roztworu Sirius Red do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min.
  3. Delikatnie spłucz roztwór Sirius Red wodą z kranu i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez noc.
  4. Ekstrahuj czerwoną plamę Syriusza, dodając 200 μl wodorotlenku sodu (0,1 M) do każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5–10 minut, aby całkowicie usunąć czerwoną plamę Syriusza.
  5. Przenieść 100 μl wyekstrahowanego barwnika Sirius Red na przezroczystą płytkę 96-dołkową i zmierzyć absorbancję przy 620 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

4. Ekspresja kolagenu I (barwienie immunologiczne)

  1. Umyć studzienki za pomocą 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH = 7,35).
  2. Utrwalić komórki za pomocą metanolu (500 μl/basenik) w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  3. Blokuj niespecyficzne interakcje z 3% albuminą surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Odessać roztwór blokujący i inkubować z 200 μl przeciwciała antykolagenowego I (10 μg/ml) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć 3x PBS przez 5 minut każdy.
  6. Inkubować z 200 μl koziego przeciwciała drugorzędowego anty-królika-FITC (rozcieńczenie 1:400) i 4',6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI; rozcieńczenie 1:2000) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przykryć płytkę folią aluminiową.
  7. Odrzuć zarówno przeciwciało drugorzędowe, jak i DAPI i przemyj 3x PBS przez 5 minut.
  8. Wizualizacja barwienia fluorescencyjnego bezpośrednio pod mikroskopem.

5. Western blotting

  1. Umyj komórki 2x PBS.
  2. Dodać 40 μl buforu do lizy do każdej studzienki i zeskrobać warstwę komórek końcówką pipety. Bufor do lizy zawiera bufor RIPA, koktajl inhibitorów proteazy (), 2 mM wanadan sodu i 10 mM fluorek sodu.
  3. Przenieś lizat białkowy do probówek mikrowirówkowych i zmierz stężenie białka za pomocą testu białka zgodnie z instrukcjami producenta16.
  4. Załaduj 10 μg białka z każdej grupy do studzienek z 4%-12% żelami białkowymi Bis-Tris. Wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) przy 200 V przez 30 minut.
  5. Przenieść białko do membrany nitrocelulozowej, uruchamiając western blot przy napięciu 90 V przez 90 minut. Unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza między żelem a membraną nitrocelulozową.
  6. Zablokuj membranę 10 ml buforu blokującego.
  7. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 4°C przez noc. Podstawowymi przeciwciałami są: anty-kolagen I, anty-kolagen III, anty-kolagen IV, anty-αSMA, anty-MMP-1, anty-MMP-2, anty-MMP-9, anty-MMP-13 i dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego (GAPDH).
  8. Umyj membranę 0,1% TBS-Tween 20 (5x po 5 min). TBS/Tween 20 (1 L) zawiera: 50 ml 1 M Tris (pH = 7,4), 30 ml 5 M chlorku sodu, 1 ml Tween 20 i 920 ml ddH2O.
  9. Inkubować z odpowiednim dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. Powtórz krok 5.8 i zwizualizuj fluorescencję za pomocą systemu obrazowania.

6. RT-PCR

  1. Zebrać całkowite RNA za pomocą buforu do lizy zmieszanego z 2-merkaptoetanolem zawartym w zestawie do oznaczania ekstrakcji RNA.
  2. Oczyść RNA zgodnie z instrukcjami producenta17.
  3. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  4. Wykonaj pierwszą syntezę nici cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Startery oligonukleotydowe RT-PCR są dostarczane (wstępnie powlekane) w niestandardowych płytkach 96-dołkowych. Wymieszaj 100 ng próbek cDNA z 10 μl zielonego supermiksu SYBR na niestandardową płytkę.
  6. Zwiększyć całkowitą objętość do 20 μl/studzienkę za pomocą ddH2O.
  7. Uruchom RT-PCR za pomocą termocyklera zgodnie z instrukcjami producenta: 40 cykli denaturacji w temperaturze 98°C przez 15 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60°C przez 60 s. Geny badane w RT-PCR to: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 i VEGF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W każdym eksperymencie przeprowadzono potrójne próbki, a każdy eksperyment powtórzono 3 razy przy użyciu komórek od trzech indywidualnych pacjentów. Dane są wyrażone w procentach grupy kontrolnej. Do analizy różnic statystycznych zastosowano jednoczynnikową ANOVA i test post-hoc Tukeya (*p ˂ 0,05).

MMC przy użyciu Ficoll przy 9% FVO (fractional volume cupancyy) zwiększa całkowitą ilość kolagenu i kolagenu I deposition w hHSF13. Jak pokazano w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu optymalizację i uwierzytelnienie ulepszonego modelu in vitro "blizna w słoiku" dla ludzkiej tkanki bliznowatej skóry. Wcześniejsze badania donosiły o zastosowaniu techniki MMC do ludzkich fibroblastów płuc12, mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiego szpiku kostnego23 i ludzkich fibroblastów skóry23 przy użyciu dekstranu12, Ficollu12 i PVP23 jako cro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez fundusze z Singapurskiej Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań "SPF 2013/004: Biologia skóry Podstawowe badania" oraz "Innowacje w leczeniu ran w tropikach" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Autorzy dziękują za rady i pomoc dr Pauli Benny i dr Michaela Raghunatha.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ Filtr mSartorius16534
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
pierwszorzędowe przeciwciało alfa aktyny mięśni gładkich (&alfa;SMA)Abcamab5694
Applied Biosystems 7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym (termocykler)Thermo Fisher Scientific4351106
Kwas askorbinowyWako#013-12061
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich#A2153
Test białka BradfordBio-Rad500-0006
Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu I (do barwienia immunologicznego)Abcam6308
Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu I (dla Western blot)Abcamab21286
Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu IIIAbcamab7778
Przeciwciało pierwszorzędowe kolagenu IVAbcamab6586
Czerwień bezpośrednia 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies11996-065
Surowica cielęca płodu (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
Przeciwciało pierwotne GAPDHSigma-AldrichG8795
Wtórne przeciwciało przeciw królikowi KozieAbcamab97050
Ludzka blizna przerostowa/normalne fibroblasty (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad#1708890
Przeciwciało pierwszorzędowe MMP-1Abcamab38929
MMP-13 przeciwciało pierwszorzędoweAbcamab39012
Przeciwciało pierwszorzędowe MMP-2Abcamab37150
MMP-9 przeciwciało pierwszorzędoweAbcamab38898
Spektrofotometry mikroobjętościowe NanoDropThermo Fisher ScientificN/A
Membrana nitrocelulozowaBio-Rad10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkoweThermo Fisher ScientificNP0321BOX
Bufor blokujący OdysseyLI-COR Biosciences927– System obrazowania 40000
Odyssey FCLI-COR BiosciencesN/A
Mikroskop Olympus IX-81 HCS (do barwienia immunologicznego)OlympusN/A
Roztwór penicyliny/streptomycyny (P/S)Life Technologies15140-122
Testy PrimePCRBio-RadIndywidualne startery wstępnie powlekane w 96-dołkowe płytki w zależności od wymagań
Koktajl inhibitorów proteazy ()Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40
bufor RIPAMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN#74134
Wanadan soduSigma-Aldrich450022
Sód wanadanSigma-Aldrich450243
Wielotrybowy czytnik mikropłytek SpectraMax M5Molecular DevicesN/A
SsoAdvanced uniwersalny SYBR zielony supermixBio-Rad#172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904(2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165(2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746(2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70(2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

odk adanie kolagenuFicoll 70Ficoll 400barwienie Sirius RedWestern blotanaliza RT PCRludzkie fibroblasty sk rymacierz zewn trzkom rkowa

Powiązane artykuły