Artykuł metodologiczny

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/61038

⸱

16 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi są obecne w większości tkanek kręgowców i składają się z szeroko rozproszonych i niejednorodnych populacji komórek o różnych funkcjach. Są kluczowymi graczami w zdrowiu i chorobie, działając jako fagocyty podczas obrony immunologicznej i pośrednicząc w funkcjach troficznych, konserwacyjnych i naprawczych. Chociaż udało się zbadać niektóre procesy molekularne związane z funkcjonowaniem ludzkich makrofagów, zastosowanie technik inżynierii genetycznej do pierwotnych ludzkich makrofagów okazało się trudne. To znacznie ograniczyło naszą zdolność do badania złożonych szlaków genetycznych zaangażowanych w biologię makrofagów i generowania modeli dla określonych stanów chorobowych. Gotowe źródło ludzkich makrofagów, które jest podatne na ogromny arsenał technik manipulacji genetycznej, stanowiłoby zatem cenne narzędzie w tej dziedzinie. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który pozwala na generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) in vitro. Te makrofagi pochodzące z iPSC (iPSC-DM) wyrażają markery powierzchniowe ludzkich komórek makrofagów, w tym CD45, 25F9, CD163 i CD169, a nasz funkcjonalny test obrazowania żywych komórek wykazuje, że wykazują one silną aktywność fagocytarną. Hodowane iPSC-DM mogą być aktywowane do różnych stanów makrofagów, które wykazują zmienioną ekspresję genów i aktywność fagocytarną przez dodanie LPS i IFNg, IL4 lub IL10. W ten sposób system ten zapewnia platformę do generowania ludzkich makrofagów przenoszących zmiany genetyczne, które modelują określoną chorobę ludzką oraz źródło komórek do badań przesiewowych leków lub terapii komórkowej w leczeniu tych chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) reprezentują samoodnawiające się źródło komórek, które mogą być różnicowane w celu wytworzenia komórek wszystkich trzech linii listków rozrodczych. Technologie pozwalające na manipulację genetyczną ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (PSC), takie jak Zinc Finger Nuclease, TALENS i CRISPR-Cas9, zrewolucjonizowały badania medyczne1,2,3,4. Manipulacja genetyczna ludzkimi PSC jest szczególnie atrakcyjną strategią, gdy pierwotna komórka będąca przedmiotem zainteresowania jest trudna do namnażania i/lub utrzymania in vitro lub jest trudna do genetycznej manipulacji, jak ma to miejsce w przypadku makrofagów5,6,7,8,9. Ponieważ ludzkie komórki iPS mogą pochodzić z dowolnej komórki somatycznej, omijają one ograniczenia etyczne związane z ESC i zapewniają strategię dostarczania medycyny spersonalizowanej. Obejmuje to modelowanie chorób specyficznych dla pacjenta, testy leków i autologiczną terapię komórkową ze zmniejszonym ryzykiem odrzucenia układu immunologicznego i infekcji6,8,10,11.

Protokoły opisujące wytwarzanie makrofagów z iPSC składają się z trzyetapowego procesu, który obejmuje: 1) Generowanie ciał embrionalnych; 2) Pojawienie się komórek krwiotwórczych w zawiesinie; 3) Końcowe dojrzewanie makrofagów.

Tworzenie trójwymiarowych agregatów, znanych jako ciała embrionoidalne (EBs), inicjuje różnicowanie iPSC. Białko morfogenetyczne kości (BMP4), czynnik komórek macierzystych (SCF) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) są dodawane w celu stymulowania specyfikacji mezodermy i wspierania powstających komórek krwiotwórczych7,8,9,11,12. Różnicujące się komórki w EB inicjują również aktywację endogennych szlaków sygnałowych, takich jak Wnt i aktywina. Niektóre protokoły różnicowania nie przechodzą przez etap tworzenia EB. W takich przypadkach regulatory sygnalizacji Wnt i Activin, takie jak rekombinowana ludzka Activin A i/lub Chiron, są dodawane do różnicujących iPSC w formacie jednowarstwowym13,14,15. Tutaj skupiamy się na protokole, który wykorzystuje tworzenie EB. W drugim etapie różnicowania EB są powlekane na przylegającej powierzchni. Te przyłączone komórki są następnie wystawiane na działanie cytokin, które sprzyjają powstawaniu komórek zawiesinowych, które obejmują hematopoetyczne i mieloidalne komórki progenitorowe. W tych warunkach hodowli in vitro interleukina-3 (IL3) prawdopodobnie wspomaga tworzenie i proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych16,17, a także proliferację i różnicowanie prekursorów szpiku18. Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (CSF1) wspomaga produkcję komórek szpikowych i ich różnicowanie do makrofagów19,20. Podczas trzeciego etapu różnicowania te komórki zawiesinowe są hodowane w obecności CSF1 w celu wsparcia końcowego dojrzewania makrofagów.

Różnicowanie ludzkich iPSC na makrofagi in vitro naśladuje wczesną falę produkcji makrofagów podczas rozwoju. Makrofagi rezydujące w tkankach powstają podczas embriogenezy i mają odrębną linię rozwojową od dorosłych monocytów. Kilka badań wykazało, że iPSC-DM mają sygnaturę genową, która jest bardziej porównywalna z makrofagami pochodzącymi z wątroby płodu niż monocytami pochodzącymi z krwi, co sugeruje, że iPSC-DM są bardziej zbliżone do makrofagów rezydujących w tkankach. iPSC-DM wyrażają wyższe poziomy genów, które kodują wydzielanie białek zaangażowanych w przebudowę tkanek i angiogenezę oraz wyrażają niższe poziomy genów kodujących prozapalne wydzielanie cytokin i działania związane z prezentacją antygenu21,22. Ponadto iPSC-DM mają analogiczne wymagania dotyczące czynnika transkrypcyjnego do makrofagów rezydujących w tkankach23,24. Korzystając z linii komórkowych iPSC z nokautem, które mają niedobór czynników transkrypcyjnych RUNX1, SPI1 (PU.1) i MYB, Buchrieser i in. wykazali, że wytwarzanie iPSC-DM jest zależne od SPI1 i RUNX1, ale niezależne od MYB. Oznacza to, że są one transkrypcyjnie podobne do makrofagów pochodzących z woreczka żółtkowego, które są generowane podczas pierwszej fali hematopoezy podczas rozwoju23. Dlatego powszechnie przyjmuje się, że iPSC-DM stanowią bardziej odpowiedni model komórkowy do badania makrofagów rezydujących w tkankach, takich jak microglia14,25 i Kupffer cells11, oraz bardziej pożądane źródło komórek, które potencjalnie mogą być wykorzystane w terapiach do naprawy tkanek. Na przykład wykazano, że makrofagi wytwarzane in vitro z mysich ESC były skuteczne w łagodzeniu zwłóknienia w modelu uszkodzenia wątroby wywołanego CCl4 in vivo11. Co więcej, te makrofagi pochodzące z ESC były bardziej wydajne niż makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego w ponownym zasiedlaniu przedziałów komórek Kupffera pozbawionych makrofagów przy użyciu liposomalnego klodronianu11 u myszy.

Tutaj opisujemy protokoły bez surowicy i karmy do konserwacji, zamrażania i rozmrażania ludzkich iPSC, a także do różnicowania tych iPSC na funkcjonalne makrofagi. Protokół ten jest bardzo podobny do opisanego przez Van Wilgenburga i wsp.12, z niewielkimi zmianami, w tym: 1) nośnikiem podtrzymującym iPSC; 2) Inhibitor ROCK nie jest stosowany na etapie tworzenia EB; 3) Do generowania jednorodnych EB z kolonii iPSC stosuje się podejście mechaniczne, a nie enzymatyczne; 4) Metoda zbioru i powlekania EB jest inna; 5) Komórki zawiesinowe są zbierane 2 razy w tygodniu, a nie co tydzień; oraz 6) Zebrane komórki zawiesiny są hodowane w CSF1 w celu dojrzewania makrofagów przez 9 dni, a nie 7 dni. Opisujemy również protokoły stosowane do charakteryzowania fenotypu i funkcji makrofagów pochodzących z iPSC, w tym analizy ekspresji genów (qRT-PCR), ekspresji markerów powierzchniowych komórek (cytometria przepływowa) oraz testy funkcjonalne do oceny fagocytozy i polaryzacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie odczynniki i sprzęt używany w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Pożywka powinna mieć temperaturę 37 °C dla hodowli komórkowych. Pożywki i odczynniki stosowane w protokole różnicowania muszą być sterylne.

1. Ludzkie rozmrażanie i konserwacja linii iPSC

  1. Przygotuj pożywkę do konserwacji komórek, czynniki wzrostu i inne odczynniki.
    1. Przygotować pożywkę wolną od surowicy hESC (hESC-SFM; patrz Tabela materiałów) poprzez uzupełnienie zmodyfikowanego podłoża Eagle F12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) suplementem hESC, 1,8% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1 mM 2-merkaptoetanolu.
    2. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) (10 μg/ml), rozpuszczając bFGF w sterylnym 0,1% roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosikonami fosikonów ludzkiej surowicy (HSA) i albuminy surowicy (HSA). Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 200 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 roku. Po rozmrożeniu bulion bFGF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
    3. Przygotować roztwór podstawowy inhibitora kinazy Rho (ROCK Inhibitor)-Y27632 (1 mg/ml), rozpuszczając go w sterylnej wodzie. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 50 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 roku. Po rozmrożeniu podstawowy inhibitor ROCK można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
  2. Rozcieńczyć substrat komórek macierzystych (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:50 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco z wapniem i magnezem.
  3. Umieścić rozcieńczony roztwór substratu komórek macierzystych na płytkach hodowlanych tak, aby końcowa objętość na powierzchnię wynosiła 78 μl/cm2. Aby pokryć zagłębienie płytki 6-dołkowej, dodaj 750 μl roztworu.
  4. Inkubować powlekaną płytkę przez 1 godzinę w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Odessać powłokę substratu komórek macierzystych i dodać 1 ml hESC uzupełnionego 20 ng/ml bFGF i 10 μM inhibitorem ROCK.
  6. Aby rozmrozić fiolkę z zamrożonymi ludzkimi komórkami iPSC, należy inkubować fiolkę w temperaturze 37 °C do momentu rozmrożenia i przenieść komórki do pożywki o pojemności 5 ml hESC-SFM.
  7. Odwirować komórki przy 100 x g przez 3 min.
  8. Zawiesić w 0,5 ml hESC-SFM uzupełnionym 20 ng/ml bFGF i 10 μM inhibitorem ROCK. Przenieś komórki do dobrze pokrytego.
  9. Hodowla komórek przez 24 godziny.
  10. Zmień pożywkę na hESC-SFM uzupełnioną 20 ng/ml bFGF, ale bez inhibitora ROCK.
  11. Aby utrzymać komórki, zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 80% zbieżności. Niezróżnicowane iPSC zwykle potrzebują 3–4 dni, aby osiągnąć 80% konfluencji.
  12. Gdy komórki osiągną 80% zbiegu, komórki pasażowe.
    1. Zastąp zużytą pożywkę hodowlaną 1,5 ml świeżego hESC-SFM uzupełnionego 20 ng/ml bFGF (bez inhibitora ROCK).
    2. Trzymaj naczynie hodowlane w jednej ręce i przetocz jednorazowe narzędzie do pasowania komórek (patrz Tabela materiałów) po płytce w jednym kierunku (tj. od lewej do prawej). Wszystkie ostrza w rolce muszą stykać się z płytą. Utrzymuj równomierny nacisk podczas toczenia.
    3. Powtarzaj zwijanie w tym samym kierunku, aż cała studzienka zostanie pokryta.
    4. Obrócić naczynie hodowlane o 90° i powtórzyć zwijanie zgodnie z opisem w krokach 1.12.2 i 1.12.3.
    5. Po użyciu wyrzuć narzędzie do pasażowania.
    6. Za pomocą sterylnej pipety użyj pożywki w studzince, aby usunąć wycięte kolonie.
    7. Przenieś komórki w stosunku 1:4 do wstępnie pokrytych dołków substratu komórek macierzystych (etapy 1,2-1,5) do końcowej objętości pożywki (hESC -SFM uzupełnionej 20 ng / ml bFGF) wynoszącej 1,5 ml na studzienkę.

2. Zamrażanie linii iPSC u człowieka

  1. Aby zamrozić komórki iPSC, zastąp pożywkę z 70%-80% zlewającej się studzienki 6-dołkowej płytki hESC-SFM uzupełnioną 20 ng / ml bFGF i 10 μM inhibitorem ROCK.
  2. Dobrze inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
  3. Wytnij kolonie za pomocą narzędzia do pasażowania komórek i umieść usunięte kolonie w probówce wirówkowej.
  4. Odwirować komórki przy 100 x g przez 3 min.
  5. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do kriokonserwacji komórek (patrz tabela materiałów).
  6. Podzielić komórki równo na dwa kriowiale i umieścić je we wstępnie schłodzonym pojemniku do kriokonserwacji komórek w temperaturze 4 °C.
  7. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C przez 24–48 godzin.
  8. Przenieść fiolki do zamrażarki o temperaturze -135 °C lub do zbiornika z ciekłym azotem.

3. Różnicowanie ludzkiego iPSC do makrofagów

UWAGA: Schematyczne podsumowanie protokołu różnicowania makrofagów jest przedstawione w Rysunek 1.

  1. Przygotowanie czynników wzrostu różnicowania komórek i innych odczynników
    1. Przygotować pożywkę hESC-SFM (patrz poprzednia sekcja).
    2. Przygotować 0,1% m/v roztwór żelatyny wieprzowej, rozpuszczając żelatynę w sterylnej wodzie. Roztwór żelatyny można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 lat.
    3. Przygotować ludzki roztwór podstawowy BMP4 (25 μg/ml), rozpuszczając BMP4 w 4 mM roztworze chlorowodoru (HCl)-0,2% BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 50 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 roku. Po rozmrożeniu BMP4 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 5 dni.
    4. Przygotować ludzki roztwór podstawowy VEGF (100 μg/ml), rozpuszczając VEGF w 0,2% roztworze BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 10 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 roku. Po rozmrożeniu wywar VEGF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
    5. Przygotować ludzki roztwór podstawowy SCF (100 μg/ml), rozpuszczając SCF w 0,2% roztworze BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 5 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 roku. Po rozmrożeniu wywar SCF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 10 dni.
    6. Przygotować ludzki roztwór podstawowy IL3 (10 μg/ml), rozpuszczając IL3 w 0,2% roztworze BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 500 μl podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 lat. Po rozmrożeniu wywar SCF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 15 dni.
    7. Przygotować ludzki roztwór podstawowy CSF1 (10 μg/ml), rozpuszczając CSF1 w 0,2% roztworze BSA PBS. Rozprowadzić roztwór podstawowy w postaci 1 ml podwielokrotności w krioprobówkach. Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 lat. Po rozmrożeniu wywar SCF można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 15 dni.
    8. Przygotować oddzielne roztwory podstawowe interferonu gamma (IFNg), interleukiny 4 (IL4) i interleukiny 10 (IL10) o stężeniu 10 μg/ml, rozpuszczając się w 0,2% roztworach PBS BSA. Przygotować lipopolisacharyd (LPS) do roztworu podstawowego (100 U/ml), rozpuszczając się w 0,2% roztworze BSA PBS. Rozprowadzić każdy roztwór podstawowy jako 35 μl podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze -80 °C do 2 lat. Po rozmrożeniu wywar można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 7 dni.
  2. Etap 1: Wytwarzanie ciał zarodkowych (dzień 0–dzień 3)
    1. W dniu 0 dodaj 2,25 ml pożywki etapu 1 (hESC-SFM uzupełnione 50 ng / ml BMP4, 50 ng / ml VEGF i 20 ng / ml SCF) do dwóch dołków z 6-dołkową płytką o ultraniskim przyłączeniu.
    2. Zastąp pożywkę konserwacyjną jednej 80% zlewającej się studzienki iPSC w 6-dołkowej płytce z 1,5 ml pożywki etapu 1.
    3. Wytnij kolonie za pomocą narzędzia do pasażowania komórek i przenieś wycięte kolonie za pomocą pipety do dwóch dołków 6-dołkowej płytki o ultraniskim nasadce (patrz Tabela materiałów).
    4. W 2. dniu doprowadź cytokiny do końcowego stężenia 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF i 20 ng/ml SCF za pomocą 0,5 ml pożywki hESC-SFM.
      nuta: Kolonie IPSC staną się EB (Rysunek 2A).
  3. Etap 2: Pojawienie się komórek krwiotwórczych w zawiesinie
    1. W dniu 4 pokryj 4 dołki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 0,1% w/v żelatyny i inkubuj przez co najmniej 10 minut.
    2. Usuń żelatynę i dodaj 2,5 ml pożywki etapu 2 (X-VIVO15 uzupełniony 100 ng/ml CSF1, 25 ng/ml IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,055 mM 2-merkaptoetanolu).
    3. Zebrać uformowane EB do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozwolić im osiąść na dnie probówki pod wpływem grawitacji. Ostrożnie zassać nośnik.
    4. Ponownie zawiesić EB w 2 ml pożywki etapu 2.
    5. Przenieś 10-15 EB (nie więcej niż 15) do studzienki pokrytej żelatyną zawierającej 2,5 ml pożywki etapu 2.
    6. Inkubować EB w temperaturze 37 °C i 5% CO2 powietrza.
    7. Zmieniaj podłoża na platerowanych EB co 3-4 dni przez 2-3 tygodnie.
    8. Po 2-3 tygodniach EB zaczynają uwalniać nieprzylegające komórki krwiotwórcze do zawiesiny.
      nuta: Ten okres uwalniania komórek zawiesiny może się różnić i jest zależny od linii komórkowej. Komórki w tej zawiesinie mogą być zbierane i dojrzewać do postaci makrofagów (patrz Etap 3) (Rysunek 2A).
  4. Etap 3: Końcowe dojrzewanie makrofagów
    1. Zebrać zawiesinę komórek krwiotwórczych i uzupełnić pożywkę (pożywkę etapu 2) na płytce EB.
    2. Odwirować komory zawiesiny przy 200 x g przez 3 min.
    3. Zawiesić komórki zawiesinowe w pożywce etapu 3 (X-VIVO15 uzupełniony 100 ng / ml CSF1, 2 mM glutamax i 1% penicyliny-streptomycyny).
    4. Na płytce zebrano komórki i odwirowano je na nieprzetworzonych plastikowych płytkach bakteriologicznych o długości 10 cm (10 ml) lub niepowlekanych 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych (3 ml) o gęstości 0,2 x 106 komórek/ml.
    5. Przechowuj komórki na pożywce etapu 3 przez 9–11 dni, zmieniając pożywkę co 5 dni.
      nuta: Etapy 3.4.1–3.4.5 z etapu 3 można powtarzać co 3–4 dni, a komórki zawiesiny pobierać z oryginalnej płytki EB przez okres do 3 miesięcy.
  5. Polaryzacja makrofagów
    1. Aby aktywować makrofagi do fenotypu M (LPS + IFNg), stymuluj komórki za pomocą LPS (stężenie końcowe: 100 ng / ml) i IFNg (stężenie końcowe: 10 U / ml) przez 48 godzin. Aby aktywować komórki do fenotypu M(IL4), stymuluj komórki IL4 (końcowe stężenie: 20 ng / ml). Aby aktywować do fenotypu M(IL10), stymuluj makrofagi IL10 (końcowe stężenie: 5 ng / ml).

4. Kontrola jakości makrofagów pochodzących z iPSC

  1. Określ liczbę komórek zawiesiny hematopoetycznej wytworzonych na 6-dołkową płytkę EB, licząc je za pomocą hematocytometru.
  2. Oceń morfologię makrofagów zgodnie z wcześniejszym opisem (np. komercyjne barwienie zestawu)8,9.
  3. Wykrywanie ekspresji markerów specyficznych dla makrofagów i markerów polaryzacji za pomocą analiz ekspresji genów i cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej8,9.
    1. W przypadku eksperymentów cytometrii przepływowej na jednym dołku 6-dołkowej płytki makrofagów, należy zebrać komórki, zasysając ich pożywkę dojrzewającą, przemyć 2 ml PBS i inkubować je z 2 ml buforu dysocjacji komórek wolnych od enzymów przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć i zebrać makrofagi.
    2. Policz komórki za pomocą hematocytometru i ponownie zawieś je w 80 μl 2% BSA, 0,5 mM roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)-PBS.
    3. Dodać 20 μl ludzkiegoblokera FC MACS.
    4. Inkubować na lodzie przez 20 minut i chronić przed światłem.
    5. Dodać odpowiednią objętość 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS roztworu, aby doprowadzić stężenie komórek do 1 x 106 makrofagów/ml.
    6. Wybarwić 1 x 105 komórek w 100 μl 2% roztworu BSA, 0,5 mM EDTA PBS z odpowiednim przeciwciałem (patrz UWAGA poniżej) i inkubować przez 15 minut w temperaturze RT, chroniąc przed światłem.
    7. Przemyć 1x co najmniej 100 μL 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
    8. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
    9. Dodać 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI, rozcieńczony 1:1,000) jako żywy martwy barwnik. Inkubować 3 min.
    10. W przypadku analiz cytometrii przepływowej bramka na głównej populacji, następnie pojedyncze komórki, a następnie żywe komórki. W populacji żywych komórek widoczna jest ekspresja markera związanego z makrofagami (Rysunek 3A).
      nuta: Przeciwciała należy dokładnie miareczkować dla każdej linii komórkowej używanej do otrzymywania makrofagów. Przeciwciała przedstawione w sekcji wyników znajdują się w Tabeli Materiałów. Uwzględniono również współczynnik rozcieńczenia dla testów cytometrii przepływowej makrofagów pochodzących z SFCi55.

5. Wysokoprzepustowy test fagocytozy

  1. Zbierz makrofagi pochodzące z iPSC (iPSC-DMs), odsysając pożywkę, dodając lodowaty bufor dysocjacji komórek wolny od enzymów i inkubując przez 5 minut. Zebrać makrofagi przez wielokrotne pipetowanie.
  2. Płytka 8 x 104 iPSC-DM w studzience obrazowania na płytkach 96-dołkowych do kultur tkankowych (np. Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) co najmniej 2 dni przed obrazowaniem wysokoprzepustowym w 200 μl pożywki etapu 3.
  3. Przygotować biocząstki pHrodoGreen Zymosan-A poprzez ponowne zawieszenie jednej fiolki w 2 ml PBS ("Roztwór 1"). Roztwór wirowy przez 10 s.
  4. Rozcieńczyć 2 ml zawiesiny kulek PBS w stosunku 1:5 większą ilością PBS ("roztwór 2").
  5. Sonicate Solution 2 przez 8 s i roztwór wirowy przez 10 s. Przechowywać w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie zostanie użyte w kroku 5.11.
  6. Wyjmij nośnik z platerowanych iPSC-DM i umyj go PBS.
  7. Barwienie iPSC-DM roztworem PBS zawierającym Hoechst 33342 rozcieńczonym w stosunku 1:20. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Umyj komórki PBS.
  9. Barwienie roztworem PBS zawierającym ciemnoczerwone barwienie błony plazmatycznej rozcieńczone w stosunku 1:1,000 (patrz Tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  10. Umyj komórki PBS.
  11. Dodać 100 μl roztworu kulek utrzymywanego w temperaturze 4 °C do każdego dołka iPSC-DMs. Płytki są teraz gotowe do obrazowania.
  12. Zobrazuj płytkę za pomocą systemu obrazowania o wysokiej zawartości i uzyskaj trzy lub więcej pól w poprzek studni, aby uzyskać dobre odwzorowanie studni.
  13. Określ ilościowo fagocytozę za pomocą oprogramowania Columbus (oprogramowanie systemu analizy High-Content Imaging). Można opracować specjalny algorytm do jednoznacznej analizy wsadowej obrazu:
    1. Zmierz intensywność koloru niebieskiego i zdefiniuj w oprogramowaniu, że niebieski sygnał wskazuje jądra.
    2. Zmierz intensywność czerwieni i zdefiniuj w oprogramowaniu, że czerwony sygnał wskazuje na cytoplazmę.
    3. Zdefiniuj, że jądro i cytoplazma razem odpowiadają komórce.
    4. Zmierz intensywność zieleni w komórkach i ustal ścisłą wartość odcięcia/progu, aby uznać komórkę za fagocytarną.
    5. Określ ilościowo frakcję komórek fagocytarnych i średni indeks fagocytarny na komórkę. Ponieważ intensywność koloru kulek jest proporcjonalna do liczby kulek, aktywność fagocytarną można zmierzyć liczbą połkniętych kulek.
    6. Zastosuj algorytm/potok do wszystkich obrazów w każdym polu i we wszystkich uzyskanych punktach czasowych, umożliwiając solidne i bezstronne podejście wsadowe w celu określenia zdolności fagocytarnych komórek.
      nuta: Columbus to oprogramowanie do analizy o wysokiej zawartości, które oferuje analizę segmentacji komórek w celu fenotypowania komórek i testów funkcjonalnych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postęp różnicowania, liczba makrofagów i morfologia
Przedstawione wyniki pochodzą z różnicowania ludzkiej linii iPSC SFCi55, która została opisana i wykorzystana w wielu badaniach8,9,10,26. Proces różnicowania IPSC w kierunku makrofagów można monitorować za pomocą mikroskopii optycznej. Kolonie iPSC, ciała zarodkowe (EB), komórki zawiesiny hematopoetycznej i dojrzałe makrofagi były morfologicznie różne (Figura 2A). Morfologię dojrzałych makrofagów można dodatkowo zweryfikować poprzez barwienie odwirowanych preparatów cytospinowych. Makrofagi pochodzące z IPSC były duże i miały pojedyncze małe owalne jądra i obfitą cytoplazmę zawierającą wiele pęcherzyków (Ryc. 2B).

Pierwsze 2 tygodnie pobierania komórek zawiesiny hematopoetycznej (dni 16-28) z jednej pełnej 6-dołkowej płytki EB zawierającej średnio 2,59 x 106 ± 0,54 komórek. Po 28 dniu wyprodukowano średnio 4,64 x 106 ± 0,94 komórek zawiesinowych na 6-dołkową płytkę EB. Począwszy od 80 dnia, liczba komórek zawiesiny zaczęła spadać, gdy EB stają się wyczerpane (Rysunek 2C). Zaleca się przerwanie protokołu różnicowania, gdy liczba prekursorów spadnie poniżej 3 x 106 prekursorów na zbiór na 6-dołkową płytkę EB.

Wyrażenie markerów powierzchni komórek makrofagów pochodzących z IPSC
Cytometria przepływowa pozostaje najpowszechniejszą metodą stosowaną do oceny fenotypu ludzkich makrofagów. Strategia bramkowania w celu oceny ekspresji markerów powierzchni komórki polega na bramkowaniu głównej populacji komórek przy użyciu parametrów fizycznych, takich jak rozmiar i ziarnistość, a następnie bramkowaniu pojedynczych komórek, a następnie żywych komórek (Rysunek 3A). Dojrzałe makrofagi pochodzące z iPSC powinny wyrażać marker linii CD45 i marker dojrzewania makrofagów 25F9 oraz być ujemne dla markera monocytów/niedojrzałych makrofagów CD93. Jest to zgodne z naszymi obserwacjami (Rysunek 3A). Makrofagi pochodzące z IPSC były również dodatnie dla markerów szpikowych linii CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 i CD169 (Figura 3B). Byli dodatni dla markera modulacji immunologicznej CD86, a niewielka część z nich wyrażała receptory chemokiny CX3CR1, CCR2, CCR5 i CCR8 w stanie naiwnym (Figura 3B). Wykresy zostały uzyskane na podstawie danych opublikowanych wcześniej przez nasze laboratorium8.

Fagocytoza i polaryzacja makrofagów pochodzących z iPSC
Jedną z kluczowych cech makrofagów w obronie gospodarza i homeostazie tkanek jest ich zdolność do fagocytozy patogenów, komórek apoptotycznych i szczątków27. Szybkość fagocytozy jest ściśle związana z określonymi stanami fenotypowymi28. Aby ocenić zdolność fagocytarną iPSC-DM, użyliśmy podejścia opartego na systemie obrazowania o wysokiej zawartości8,9,11, który wykorzystuje mikroskop operetkowy PerkinElmer i biocząstki zymosanu pHrodo (koniugaty barwnika wrażliwe na pH). Biocząstki były niefluorescencyjne po dodaniu do kultur (Figura 4A), ale fluoryzowały na jasnozielono w wewnątrzkomórkowym kwaśnym pH (Figura 4B). Mikroskop Operetka do obrazowania na żywo został ustawiony na obrazowanie co 5 minut po dodaniu kulek przez łączny czas 175 minut. Na platformie Columbus wykorzystano następnie wysokowydajny i bezstronny potok analizy obrazu w celu ilościowego określenia aktywności pod względem frakcji fagocytarnej, która reprezentuje proporcję komórek, które fagocytozowały kulki, oraz indeksu fagocytarnego, który jest miarą liczby kulek, które każda komórka połknęła.

Makrofagi mogą reagować i zmieniać swój fenotyp w zależności od sygnałów środowiskowych. Aby ocenić ich zdolność do reagowania i zmiany na bodźce środowiskowe, iPSC-DM można leczyć LPS i IFNg, IL4 lub IL10. Po 48 godzinach leczenia zmienili fenotyp, określany tutaj jako M (LPS + IFNg), M (IL4) i M (IL10), odpowiednio29. Analiza ekspresji genów jest użytecznym narzędziem do badania stanu polaryzacji makrofagów. Po stymulacji LPS i IFNg makrofagi zwiększały ekspresję mRNA genów CD40, VCAM1 i TNFA (Figura 5A). Po stymulacji IL4 komórki zwiększyły ekspresję mRNA genów CD68, CD84 i MRC1 (Figura 5B). Po stymulacji IL10 iPSC-DM zwiększyły ekspresję MRC1 (Figura 5B). Jeśli chodzi o fagocytozę, makrofagi leczone LPS + IFNg lub IL4 wykazywały znacznie niższy odsetek komórek fagocytarnych w porównaniu z wcześniejszymi makrofagami. iPSC-DM leczone IL10 wykazały zwiększony odsetek komórek fagocytarnych i indeks fagocytarny (Figura 5C-E).

różnicowanie iPSC w makrofagi; diagram przepływu; Protokoły BMP4, VEGF, SCF, IL3, CSF1.
Rycina 1: Graficzne podsumowanie różnicowania iPSC do dojrzałych funkcjonalnych makrofagów. Schemat narysowany za pomocą Biorenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Proces różnicowania komórek: obrazy mikroskopowe, hodowle komórkowe; Wykres wzrostu pokazuje liczby prekursorów.
Rycina 2: Różnicowanie iPSC w kierunku makrofagów oraz liczby i morfologii iPSC-DM. (A) Obrazy jasnego pola uzyskane z (od lewej do prawej): kolonii IPSC, ciał zarodkowych (EB), pobranych komórek zawiesinowych i dojrzałych makrofagów. Podziałka = 100 μm. (B) Obraz cytospinów makrofagów wybarwionych zestawem Kwik-diff. Podziałka = 25 μm. (C) Liczba komórek zawiesiny zebranych podczas zbioru na jedną 6-dołkową płytkę EB. Wykres pokazuje średnią + SEM; (n = 6 biologicznie niezależnych doświadczeń). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram cytometrii przepływowej z procesem sortowania komórek i histogramami markerów linii do analizy immunologicznej.
Rycina 3: Fenotyp markera powierzchni komórek makrofagów. (A) Strategia bramkowania do analizy dojrzałych makrofagów pochodzących z iPSC. Pojedyncze, żywe komórki poddano bramce, a następnie przeanalizowano pod kątem ekspresji markerów powierzchniowych komórek CD45, CD93 i 25F9. Bramki dla markerów powierzchni komórek narysowano przy użyciu kontroli fluorescencji minus jeden (FMO). (B) Reprezentatywne histogramy cytometrii przepływowej dla pojedynczych barwień iPSC-DM (niebieskie) i kontrolne izotypy (szare) dla markerów linii i szpiku, markerów modulacji immunologicznej, markerów dojrzewania i receptorów chemokin. Wykresy są reprezentatywne dla n = 5 biologicznie niezależnych eksperymentów dla wszystkich linii i markerów szpikowych, z wyjątkiem CD105 i CD206 (n = 3); markery dojrzewania (n = 5); markery immunomodulacji (n = 3); i receptory chemokiny (n = 3). Wykresy korzystają z wcześniej opublikowanych danych8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Proces fagocytozy z obrazami mikroskopowymi, frakcją fagocytarną i wykresami indeksowymi w czasie.
Ryc. 4: Testy polaryzacji i fagocytozy IPSC-DM. Reprezentatywne obrazy iPSC-DMs (A) bezpośrednio po dodaniu zielonych kulek Zymosan pHrodo i (B) 175 minut po dodaniu kulek. Niebieski reprezentuje jądra komórek; Kolor czerwony reprezentuje cytoplazmę komórek. Kolor zielony oznacza połknięte koraliki (pasek skali = 20 μm). (C) Frakcja makrofagów fagocytarnych i (D) indeks fagocytarny/intensywność zieleni na makrofag fagocytarny w czasie w stanie naiwnym (n = 6 biologicznie niezależnych eksperymentów). Wykresy pokazują wartość średnią, a słupki reprezentują SEM. Wykresy wykorzystują wcześniej opublikowane data8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza ekspresji genów w makrofagach; wykresy słupkowe, mikroskopia konfokalna, wykresy aktywności fagocytarnej.
Rysunek 5: Ocena stanów polaryzacji iPSC-DM. Względna kwantyfikacja analiz RT-PCR naiwnych i spolaryzowanych iPSC-DM w celu oceny ekspresji (A) M (LPS + IFNΥ); (B) Geny związane z M(IL4) i M (IL10) (n = 6 biologicznie niezależnych doświadczeń; Jednoczynnikowa ANOVA i wielokrotne porównania Holma-Sidaka po teście. Grupy spolaryzowane porównywano statystycznie tylko z grupą naiwną). Wykresy pokazują wartość średnią, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. ND na wykresach = nie wykryto transkrypcji. Dane dla tych wykresów zostały wcześniej opublikowane8. (C) Reprezentatywne obrazy iPSC-DM 175 minut po dodaniu kulek pHrodo z iPSC-DM traktowanych (od lewej do prawej): brak cytokin, LPS + IFN-Y, IL-4 i IL-10 (pasek skali = 20 μm). (D) Frakcja makrofagów fagocytarnych i (E) indeks fagocytarny/intensywność zieleni na makrofagi fagocytarne w naiwnych i spolaryzowanych zabiegach makrofagowych 175 minut po dodaniu kulek (n = 12 biologicznie niezależnych eksperymentów, jednoczynnikowa ANOVA i wielokrotne porównania Holma-Sidaka po teście. Grupy spolaryzowane porównywano statystycznie tylko z grupą naiwną). Wykresy pokazują wartość średnią, a słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół wytwarzania iPSC-DM jest solidny i pozwala na produkcję dużej liczby jednorodnych komórek ze stosunkowo niewielkiej liczby iPSC. Po początkowym różnicowaniu około 1 x 106 iPSC, kolejne kultury można zbierać co 4 dni przez okres do 2–3 miesięcy, co daje w tym czasie produkcję co najmniej 6,5 x 107 makrofagów. Te ludzkie makrofagi generowane in vitro są morfologicznie podobne do pierwotnych ludzkich makrofagów, wyrażają kluczowe markery powierzchniowe komórek makrofagów i wykazują aktywność fagocytarną. Protokół różnicowania makrofagów jest powtarzalny i może być stosowany do innych linii komórkowych hiPSC i hESC, ale dokładny czas pierwszego zbioru prekursorów makrofagów i bezwzględna liczba komórek, które można wygenerować, różnią się w zależności od linii iPSC.

Wykazano, że makrofagi mogą być generowane z iPSC, które zostały poddane manipulacji genetycznej. Na przykład kasetę transgenu składającą się z fluorescencyjnego reportera ZsGreen pod kontrolą konstytutywnego promotora CAG wprowadzono do locus AAVS1 linii iPSC SFCi55, a następnie wykazano, że ta linia iPSC może być zróżnicowana w makrofagi wykazujące ekspresję ZsGreen8. Te fluorescencyjne makrofagi mogą być wykorzystywane w przyszłości do śledzenia migracji i stabilności makrofagów terapeutycznych w modelach chorób. W innym badaniu makrofagi zostały wygenerowane z linii iPSC, która została genetycznie zmodyfikowana w celu ekspresji czynnika transkrypcyjnego indukowanego tamoksyfenem, KLF1. Aktywacja KLF1 w makrofagach pochodzących z iPSC spowodowała produkcję makrofagów o fenotypie porównywalnym do makrofagów wyspy erytroidalnej9. Potencjalnie strategia ta może zostać wykorzystana do genetycznego programowania makrofagów pochodzących z iPSC w fenotypach związanych z innymi populacjami makrofagów specyficznymi dla tkanki, takimi jak komórki Kupffera w wątrobie lub komórki Langerhansa w skórze. Byłoby to możliwe po zidentyfikowaniu kluczowych czynników transkrypcyjnych, które definiują te typy komórek.

Jeśli chodzi o protokół, bardzo ważne jest, aby pamiętać, że stan początkowej populacji iPSC ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego różnicowania. Ludzkie kultury iPSC mogą być przepełnione kariotypowo nieprawidłowymi subpopulacjami w ciągu kilku pasaży, dlatego zaleca się solidną selekcję stad iPSC i dużych partii wzorcowych poddanych kontroli jakości genomu. W naszych rękach opisane tutaj protokoły konserwacji mogą utrzymać kariotypowo normalne iPSC przez okres do 2 miesięcy w ciągłej hodowli, ale może się to różnić dla różnych linii komórkowych i w różnych laboratoriach. W przypadku wystąpienia problemów zaleca się użycie świeżej fiolki z niezróżnicowanymi iPSC do każdego eksperymentu różnicowania. Ponadto początkowa hodowla niezróżnicowanych iPSC nie powinna być zlewająca się w więcej niż 80%. Na etapie posiewu EB należy posiać tylko 10–15 EB na studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i bardzo ważne jest, aby te EB były równomiernie rozłożone w studzience. Większa liczba EB i/lub zlepianie się EB w środku studni miało negatywny wpływ na liczbę generowanych makrofagów. Należy zachować ostrożność podczas uzupełniania pożywki i pobierania monocytopodobnych komórek zawiesinowych progenitorów z kultur EB, aby uniknąć zakłócenia przylegania EB do powierzchni powlekanych płytek hodowlanych. Liczba wytwarzanych komórek zawiesiny krwiotwórczej stopniowo wzrasta z każdym zbiorem, przy optymalnej produkcji między 40 a 72 dniem różnicowania (ryc. 2). Produkcja stopniowo spada po 68 dniu, a płyty mają tendencję do wyczerpywania się po 2,5 miesiąca, chociaż dokładny czas może się różnić w zależności od linii iPSC.

Jednym z ograniczeń naszego protokołu jest to, że nie było możliwe dokonanie kriokonserwacji komórek zawiesiny hematopoetycznej wytworzonych pod koniec etapu 2. Protokoły, które opierają się na egzogennej aktywacji WNT, zgłaszają około 40% wskaźnik odzysku po krioprezerwacji, ale protokoły te zgłaszają tylko jeden zbiór komórek, więc bezwzględna liczba wygenerowanych makrofagów wynosi zaledwie30. Opisany tutaj protokół, indukujący sygnalizację endogenną poprzez tworzenie EB, może być zbierany co dwa tygodnie, co daje znacznie wyższą całkowitą wydajność makrofagów.

Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół produkcji funkcjonalnych makrofagów pochodzących z iPSC. Przeprowadzanie eksperymentów in vitro z makrofagami pochodzącymi z iPSC w celu zbadania biologii makrofagów w zdrowiu i chorobie ma wiele zalet w porównaniu z eksperymentami z makrofagami pochodzącymi z monocytów (MDM). Do zalet tych należy łatwość dostępu do materiału (np. nie są wymagani dawcy), możliwość wyprodukowania bardzo dużych ilości makrofagów oraz wyprodukowanie genetycznie modyfikowanych makrofagów jest wykonalne i stosunkowo proste. Co więcej, makrofagi pochodzące z iPSC mogą być lepszym źródłem do badań nad biologią makrofagów rezydujących w tkankach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Fionie Rossi i Claire Cryer za pomoc w cytometrii przepływowej, Eoghanowi O'Duibhirowi i Bertrandowi Vernayowi za mikroskopię. Ta praca została sfinansowana przez CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) i Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD Scholarshipship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. i J.W.P. były wspierane przez Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) oraz COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol (50 mM)Invitrogen31350010
Abtibody CD64-APC -CY7Biolegend305026Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało 25F9-EFLUOR 660Ebioscience15599866Współczynnik rozcieńczenia: 1:20
Przeciwciało CCR2-PE-Cy7Biolegend357212Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CCR5 PEBiolegend313707Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CCR8 PEBiolegend360603Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CD11b-PEBiolegend301305Współczynnik rozcieńczenia: 1:50
Przeciwciało CD14-APCEbioscience10669167Współczynnik rozcieńczenia: 1:20
Przeciwciało CD163-PE-CY7BIolegend 333614Współczynnik rozcieńczenia: 1:25
Przeciwciało CD169-APCBiolegend346007Współczynnik rozcieńczenia: 1:25
Przeciwciało CD206-PEBiolegend321106Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CD209-PE-CY7Biolegend3310114Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CD274-PE-CY7Biolegend329718Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CD43-PEEbioscience10854419Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CD45-APCEbioscience15577936Współczynnik rozcieńczenia: 1:20
Przeciwciało CD86-APCBiolegend305412Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CD93-PEEbioscience10804637Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało CX3CR1-PEBiolegend307650Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Przeciwciało HLA-DR-BV650Biolegend307650Współczynnik rozcieńczenia: 1:100
Antiboy CD115-PEBiolegend347308Współczynnik rozcieńczenia: 1:40
Bufor dysocjacyjny komórek, wolny od enzymówThermofisher
bez enzymów, PBSGibco13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates, poddany hodowli tkankowej,, 96-dołkowyPerkinElmer6055302
CellMask Deep Red Plasma Membrane StainThermofisherC10046Media do kriokonserwacji
Cryostor CS10SigmaC2874
CTS CELLstart SubstrateInvitrogenA1014201Podłoże komórek macierzystych
DAPIMerckD9542-1MGStężenie końcowe 1 μ g/ml
DPBS, wapń, magnez (500 ml)Thermofisher14040091
Odczynnik blokujący FcR, ludzkiMACS Miltenyi Biotec130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinowane białko ludzkieThermofisherPHG0021
Suplement GlutaMAXThermofisher35050061
Ludzki rekombinowany IFNYThermofisher14-8319-80
Albuminum ludzkiej surowicyIrvine Scientific9988
Lipopolisacharyd (LPS) z E. ColiSigmaL2630
NucBlue (Hoechst33342)ThermofisherR37605
pHrodo Zielone biocząstki zymosanu sprzężone z fagocytoząThermofisherP35365
Skóra świni ŻelatynaSigmaG9136
Rekombinowane ludzkie białko BMP4 R& D314-BP-010
Rekombinowany ludzki IL10Preprotech200-10
Rekombinowany ludzki IL3Preprotech200-03-10
Rekombinowany ludzki IL4Preprotech200-04
Rekombinowany ludzki MCSF (bez nośnika) 100 μ gBiolegend574806
Rekombinowane ludzkie białko VEGFR& D293-VE-010
Inhibitor skał Y-27632MerckSCM075
SCF (C-Kit Ligand) Rekombinowane białko ludzkieThermofisherPHC2111
StemPro hESC SFMThermofisherA1000701
StemPro EZPassage Jednorazowe narzędzie do pasażowania komórek macierzystychThermofisher23181010
Płytki mocujące Ultralow: Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 6-dołkowa, powierzchnia odstraszająca komórki w kształcie gwiazdyGreiner657970
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
X-Vivo 15 Butelka 500 mlLonzaBE02-060F
Bufor do dysocjacji komórek 13151014,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).">Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).">Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).">Focosi, D., Amabile, G. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).
  4. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).">Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  5. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).">Lachmann, N., et al. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).
  6. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).">Kuhn, A., et al. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  7. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).">Ackermann, M., et al. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).
  8. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).">Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).
  9. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881(2019).">Lopez-Yrigoyen, M., et al. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881(2019).
  10. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).">Cassetta, L., et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).
  11. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).">Haideri, S. S., et al. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).
  12. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098(2013).">van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).">Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  14. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).">Douvaras, P., et al. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  15. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).">Heideveld, E., et al. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).
  16. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).">Leary, A. G., et al. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).
  17. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).">Robin, C., et al. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).
  18. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56(2008).">Moldenhauer, A. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56(2008).
  19. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).">Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).
  20. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).">Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).
  21. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).">Klimchenko, O., et al. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).
  22. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , August 1-15 (2015).">Alasoo, K., et al. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , August 1-15 (2015).
  23. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).">Buchrieser, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  24. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).">Vanhee, S., et al. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).
  25. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).">Abud, E. M., et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  26. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).">Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
  27. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).">Karavitis, J., Kovacs, E. J. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).
  28. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).">Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  29. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).">Murray, P. J., et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  30. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).">Cao, X., et al. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

makrofagi pochodz ce z iPSCcytometria przep ywowaaktywno fagocytarnar nicowanie kom rekmanipulacja genetycznamarker CD45marker 25F9obrazowanie wysokotre ciowe

Powiązane artykuły