Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Podsumowanie

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Streszczenie

Rotawirusy to duża i rozwijająca się populacja segmentowanych dwuniciowych wirusów RNA, które powodują ciężkie zapalenie żołądka i jelit u młodych ssaków i ptaków, w tym u ludzi. Wraz z niedawnym pojawieniem się systemów odwróconej genetyki rotawirusów, możliwe stało się wykorzystanie mutagenezy ukierunkowanej do badania biologii rotawirusów, modyfikowania i optymalizacji istniejących szczepionek przeciwko rotawirusom oraz opracowywania wielodocelowych wektorów szczepionkowych rotawirusów. W tym raporcie opisujemy uproszczony system genetyki odwrotnej, który umożliwia wydajną i niezawodną regenerację rekombinowanych rotawirusów. System opiera się na kotransfekcji wektorów transkrypcyjnych T7 wyrażających pełnowymiarowe RNA rotawirusa (+) oraz wektora CMV kodującego enzym cappingujący RNA do komórek BHK konstytutywnie wytwarzających polimerazę T7 RNA (BHK-T7). Rekombinowane rotawirusy są amplifikowane przez nadmierne wysiewanie transfekowanych komórek BHK-T7 komórkami MA104, linią komórkową nerki małpy, która jest wysoce pobłażliwa dla wzrostu wirusa. W tym raporcie opisujemy również podejście do generowania rekombinowanych rotawirusów, które wyrażają oddzielne fluorescencyjne białko reporterowe poprzez wprowadzenie translacyjnego elementu zatrzymania-ponownego uruchomienia 2A do segmentu genomu 7 (NSP3). Takie podejście pozwala uniknąć usuwania lub modyfikowania którejkolwiek z otwartych ramek odczytu wirusa, umożliwiając w ten sposób produkcję rekombinowanych rotawirusów, które zachowują w pełni funkcjonalne białka wirusowe podczas ekspresji białka fluorescencyjnego.

Wprowadzenie

Rotawirusy są głównymi przyczynami ciężkiego zapalenia żołądka i jelit u niemowląt i małych dzieci, a także u młodych wielu innych gatunków ssaków i ptaków¹. Jako członkowie rodziny Reoviridae, rotawirusy mają segmentowany genom dwuniciowego RNA (dsRNA). Segmenty genomu są zawarte w bezotoczkowym dwudziestościennym wirionie utworzonym z trzech koncentrycznych warstw białka². Na podstawie sekwencjonowania i analizy filogenetycznej segmentów genomu zdefiniowano dziewięć gatunków rotawirusów (A−D, F−J)³. Szczepy zawierające rotawirusy typu A są odpowiedzialne za zdecydowaną większość chorób u ludzi⁴. Wprowadzenie szczepionek przeciwko rotawirusom do programów szczepień dziecięcych począwszy od ostatniej dekady jest skorelowane ze znacznym zmniejszeniem śmiertelności i zachorowalności na rotawirusy. Przede wszystkim liczba zgonów w dzieciństwie związanych z rotawirusami zmniejszyła się z około 528 000 w 2000 r. do 128 500 w 2016 r^4,5. Szczepionki przeciwko rotawirusom są opracowywane z żywych atenuowanych szczepów wirusa, przy czym dzieciom do 6 miesiąca życia podaje się od 2 do 3 dawek. Duża liczba genetycznie zróżnicowanych szczepów rotawirusów krążących wśród ludzi i innych gatunków ssaków, w połączeniu z ich zdolnością do szybkiej ewolucji poprzez mutagenezę i reasortację, może prowadzić do zmian antygenowych w typach rotawirusów infekujących dzieci^6,7,8. Takie zmiany mogą podważyć skuteczność istniejących szczepionek, wymagając ich wymiany lub modyfikacji.

Dopiero niedawno udało się osiągnąć rozwój w pełni opartych na plazmidach systemów genetyki odwrotnej, umożliwiających manipulację dowolnym z 11 segmentów genomu rotawirusa⁹. Dzięki dostępności tych systemów możliwe stało się odkrycie szczegółów molekularnych replikacji i patogenezy rotawirusów, opracowanie ulepszonych, wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych dla związków przeciw rotawirusom oraz stworzenie nowych, potencjalnie skuteczniejszych klas szczepionek przeciwko rotawirusom. Podczas replikacji rotawirusa, zamknięte wirusowe (+)RNA nie tylko kierują syntezą białek wirusowych, ale także służą jako matryce do syntezy segmentów genomu potomstwa dsRNA^10,11. Wszystkie opisane do tej pory systemy genetyki odwrotnej rotawirusów opierają się na transfekcji wektorów transkrypcyjnych T7 do linii komórkowych ssaków jako źródła (+)RNA pochodzących z cDNA, używanych do odzyskiwania rekombinowanych wirusów^9,12,13. W wektorach transkrypcyjnych wirusowe cDNA o pełnej długości są umieszczane między rybozymem wirusa T7 w górę a rybozymem wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV) w taki sposób, że wirusowe (+) RNA są syntetyzowane przez polimerazę RNA T7, która zawiera autentyczne 5' i 3'-końce (Figura 1A). W systemie genetyki odwrotnej pierwszej generacji rekombinowane wirusy wytworzono poprzez transfekcję komórek nerki chomika młodego eksprymującego polimerazę RNA T7 (BHK-T7) z 11 wektorami transkrypcyjnymi T7 (pT7), z których każdy kierował syntezą unikalnego (+)RNA małpiego szczepu wirusa SA11 i trzech plazmidów ekspresyjnych promotora CMV, jednego kodującego białko fuzyjne p10FAST reowirusa ptaków i dwie podjednostki kodujące kompleks enzymów cappingujących wirusa krowianki D1R-D12L⁹. Rekombinowane wirusy SA11 generowane w transfekowanych komórkach BHK-T7 amplifikowano przez nadmierne wysiewanie komórkami MA104, linią komórkową dopuszczającą wzrost rotawirusa. Opisano zmodyfikowaną wersję systemu genetyki odwróconej pierwszej generacji, która nie używa już plazmidów pomocniczych¹². Zamiast tego zmodyfikowany system z powodzeniem generuje rekombinowane rotawirusy po prostu poprzez transfekcję komórek BHK-T7 z 11 wektorami transkrypcyjnymi SA11 T7, z zastrzeżeniem, że wektory dla bloków budulcowych fabryki wirusa (wiroplazmy) (białka niestrukturalne NSP2 i NSP5) są dodawane na poziomach 3-krotnie wyższych niż inne wektory^14,15. Opracowano również zmodyfikowane wersje systemu genetyki odwrotnej, które wspierają regenerację ludzkich szczepów rotawirusa KU i Odelia^16,17. Genom rotawirusa jest niezwykle podatny na manipulacje za pomocą odwrotnej genetyki, z rekombinowanymi wirusami wygenerowanymi do tej pory z mutacjami wprowadzonymi do VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21, oraz NSP5^22,23. Do najbardziej użytecznych wirusów wygenerowanych do tej pory należą te, które zostały zaprojektowane do ekspresji fluorescencyjnych białek reporterowych (FPs)^{9,12,21,24,25}.

W tej publikacji przedstawiamy protokół dla systemu genetyki odwrotnej, którego używamy w naszym laboratorium do generowania rekombinowanych szczepów rotawirusa SA11. Kluczową cechą naszego protokołu jest kotransfekcja komórek BHK-T7 z 11 wektorami transkrypcyjnymi pT7 (zmodyfikowanymi tak, aby obejmowały 3-krotne poziomy wektorów pT7/NSP2SA11 i pT7/NSP5SA11) oraz wektorem ekspresyjnym CMV kodującym enzym cappingujący wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV) NP868R²¹ (Rysunek 2). W naszych rękach obecność plazmidu NP868R prowadzi do wytwarzania wyższych mian rekombinowanych wirusów przez transfekowane komórki BHK-T7. W tej publikacji przedstawiamy również protokół modyfikacji plazmidu pT7/NSP3SA11 w taki sposób, aby można było wytworzyć rekombinowane wirusy, które wyrażają nie tylko produkt białkowy segmentu 7 NSP3, ale także oddzielny FP. Osiąga się to poprzez przeprojektowanie otwartej ramki odczytu NSP3 (ORF) w plazmidzie pT7/NSP3SA11 tak, aby zawierała dalszy translacyjny element zatrzymujący-restartujący 2A, po którym następuje FP ORF (Rysunek 1B) < sup class="xref">24^,26. Dzięki takiemu podejściu wygenerowaliśmy rekombinowane rotawirusy wykazujące ekspresję różnych FP: UnaG (zielony), mKate (daleki czerwony), mRuby (czerwony), TagBFP (niebieski), CFP (cyjan) i YFP (żółty)^24,27,28. Te rotawirusy z ekspresją FP są wytwarzane bez usuwania ORF NSP3, co daje wirusy, które mają kodować pełny zestaw funkcjonujących białek wirusowych.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i utrzymanie hodowli komórkowych

1. Uzyskaj komórki nerki chomika młodego z konstytutywną ekspresją polimerazy RNA T7 (BHK-T7) i komórki MA104 nerki afrykańskiej zielonej małpy.
   UWAGA: Komórki BHK-T7 (lub BSR-T7) nie są dostępne na rynku, ale są powszechną linią komórkową laboratoriów wykorzystujących genetykę odwrotną do badania biologii wirusa RNA. Linia komórkowa BHK-T7 użyta w tym protokole została uzyskana od dr Ursuli J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), współtwórcy oryginalnej linii komórkowej BHK eksprymującej polimerazę T7 RNA ²⁹. Komórki MA104 są dostępne w Europejskiej Kolekcji Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych (ECACC) oraz w Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typu (ATCC).
2. Przygotować następujące podłoża hodowlane w sterylnym środowisku, najlepiej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Przechowuj nośniki w ciemności w temperaturze 4 °C i ogrzej je do 37 °C bezpośrednio przed użyciem.
   UWAGA: Źródła składników mediów są podane w Tabeli materiałów.
   1. Aby przygotować niekompletną pożywkę DMEM, połącz 500 ml zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywki Eagle's Minimum Essential (MEM) zawierającej 4,5 g/l glukozy i 1% glutaminy z 5 ml 100x paciorkowcem.
   2. Aby przygotować kompletną pożywkę DMEM, połącz 500 ml niekompletnej pożywki DMEM z 25 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   3. Aby przygotować niekompletną pożywkę GMEM, połącz 500 ml minimalnej pożywki egzodakcyjnej z Glasgow, 5 ml 100x glutaminy, 50 ml bulionu fosforanowo-tryptozowego (TPB), 5 ml 100x aminokwasów endogennych (NEAA) i 5 ml 100x paciorkowca długopisowego.
   4. Aby przygotować kompletną pożywkę GMEM, połącz 500 ml niekompletnej pożywki GMEM z 25 ml inaktywowanego termicznie FBS.
   5. Aby przygotować kompletną pożywkę GMEM+G, dodaj 10 ml 50 mg/ml genetycyny (G418) do 500 ml kompletnej pożywki GMEM.
   6. Aby przygotować niekompletną pożywkę SMEM, połącz 500 ml zmodyfikowanego MEM Eagle'a Joklika, 5 ml 100x glutaminy, 50 ml TPB, 5 ml 100x NEAA i 5 ml 100x paciorkowca pióra.
3. Hodowla komórek MA104 w kolbach T75 lub T175 zawierających odpowiednio 12 lub 25 ml kompletnej pożywki DMEM. Aby przejść komórki MA104, które osiągnęły 100% konfluencji, przepłucz monowarstwę komórki 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dysocjuj roztworem trypsyny (0,05%)-EDTA (0,1%) i ponownie zawieś w 5 (kolba T75) lub 10 ml (kolba T175) niekompletnego podłoża DMEM.
   1. Umieścić 0,5-1,0 ml zawieszonych komórek w świeżych kolbach i doprowadzić do odpowiedniej objętości końcowej, dodając kompletną pożywkę DMEM. Umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
4. Rozmnażaj komórki BHK-T7 w kolbach T75, naprzemiennie stosując GMEM i kompletną pożywkę GMEM+G przy każdej rundzie przejścia. Aby subkulturować komórki BHK-T7, które osiągnęły 100% konfluencji, przepłucz monowarstwę komórki 2x PBS, zdysocjuj roztworem trypsyny-EDTA i ponownie zawieś w 5 ml pożywki.  
   1. Po umieszczeniu 15 ml kompletnej pożywki GEM lub GMEM+G w świeżej kolbie T75, dodaj cztery krople ponownie zawieszonych komórek BHK-T7. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}

2. Przygotowanie plazmidu

1. Otrzymaj następujące plazmidy eksprymujące RNA rotawirusa SA11 (+) z Addgene: pT7 / VP1SA11, pT7 / VP2SA11, pT7 / VP3SA11, pT7 / VP4SA11, pT7 / VP6SA11, pT7 / VP7SA11, pT7 / NSP1SA11, pT7 / NSP2SA11, pT7 / NSP3SA11, pT7 / NSP4SA11 i pT7 / NSP5SA11. Uzyskaj plazmid eksprymujący enzym blokujący ASFV (pCMV/NP868R) od autorów²¹.
   UWAGA: Zmodyfikowane plazmidy pT7/NSP3SA11 zaprojektowane do ekspresji FP poprzez aktywność elementu translacyjnego 2A (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) można również uzyskać od autorów^24,26. Dostępne są plazmidy pT7/NSP3-2A-3xFL-FP wyrażające następujące FP: UnaG (zielony), mKate (daleki czerwony), mRuby (czerwony), TagBFP (niebieski), CFP (cyjan) i YFP (żółty)²⁴.
2. Przekształć plazmidy w kompetentne E. Coli DH5α i rozprowadzić bakterie na płytkach agarowych bulionu Luria zawierających odpowiedni antybiotyk. Hoduj kultury bakterii wybrane z poszczególnych kolonii i przygotuj mniejsze ilości plazmidu (20 μg) za pomocą zestawu do oczyszczania spin miniprep (tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj większe ilości plazmidu z kultur bakteryjnych za pomocą zestawów do oczyszczania midi i maxi (tabela materiałów).
   UWAGA: Plazmidy odpowiednie do stosowania w systemie genetyki odwrotnej zostały również przygotowane z innymi zestawami do oczyszczania plazmidów. Nie jest konieczne przygotowywanie plazmidów przy użyciu zestawów specjalnie zaprojektowanych do generowania materiału wolnego od endotoksyn.
3. Dostosuj stężenia oczyszczonych plazmidów do 1 mg / ml w wodzie klasy biologii molekularnej bez nukleaz. Sprawdź czystość plazmidu, potwierdzając współczynnik absorbancji 260/280 ~1,8 za pomocą spektrofotometru. Zastosuj również elektroforezę na 0,8% żelach agarozowych, aby sprawdzić, czy plazmidy są głównie superskręcone.
4. Oczyszczone plazmidy rozmieścić w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml, z których każda zawiera 10 μl. Plazmidy należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Generowanie rekombinowanego wirusa

UWAGA: Badania nad ludzkimi i zwierzęcymi rotawirusami, w tym nad generowaniem i charakteryzacją rekombinowanych szczepów rotawirusów, muszą być prowadzone zgodnie z warunkami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) i wymagają uprzedniej zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC). Odpowiednie warunki laboratoryjne BSL-2 są opisane w Bezpieczeństwie biologicznym w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) opracowanym przez Centers for Disease Control and Prevention (CDC)³⁰.

1. Dzień 1: wysiew komórek BHK-T7 do płytek 12-dołkowych
   1. Przepłukać świeżo zlewającą się monowarstwę komórek BHK-T7 zawartą w kolbie T75 2x PBS. Rozbić monowarstwę komórek roztworem trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki GMEM.
   2. Użyj automatycznego licznika komórek i roztworu trypan-niebieski, aby określić stężenie żywotnych komórek BHK-T7 w pożywce. Komórki nasienne na 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, z których każda zawiera 2 x 10⁵ komórek w całkowitej objętości 1 ml kompletnego podłoża GMEM (wolnego od G418). Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Komórki powinny osiągnąć 80-90% konfluencji do 2 dnia.
2. Dzień 2: transfekcja komórek BHK-T7 mieszaninami plazmidowymi
   1. Aby przygotować mieszaninę plazmidów, połącz następujące elementy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml, używając zapasów plazmidów dostosowanych do 1 mg/ml: po 0,8 μl plazmidów SA11 pT7 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 i NSP4, po 2,4 μl plazmidów SA11 pT7 NSP2 i NSP5 oraz po 0,8 μl plazmidów pCMV/NP868R. Delikatnie wymieszaj plazmidy, stukając w probówkę i zbierz zawartość przez wirowanie impulsowe. Aby przygotować rekombinowane wirusy wykazujące ekspresję FPs, zastąp pT7/NSP3SA11 odpowiednim plazmidem pT7/NSP3-2A-3xFL-FP.
      UWAGA: Mieszaniny plazmidów należy przechowywać na lodzie do czasu użycia. Do każdej transfekcji należy przygotować osobną rurkę.
   2. W celu przygotowania mieszaniny plazmidu/pożywki o zredukowanej surowicy/odczynnika do transfekcji: Dodać 110 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) zredukowanej pożywki surowicy (tabela materiałów) do każdej mieszaniny plazmidu i wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie dodać 32 μl odczynnika do transfekcji (tabela materiałów) do każdej mieszaniny plazmidu/pożywki o zredukowanej surowicy; daje to stężenie 2,5 μl odczynnika do transfekcji na μg plazmidu w mieszaninach. Delikatnie wirować mieszaniny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   3. Podczas 20-minutowego okresu inkubacji przepłukać komórki BHK-T7 na 12-dołkowych płytkach (przygotowanych w dniu 1) raz za pomocą 2 ml niekompletnej pożywki GMEM. Następnie dodać 1 ml niekompletnej pożywki SMEM do każdej studzienki i wstawić płytki z powrotem do inkubatora.
   4. Po 20-minutowym okresie inkubacji dodać mieszaninę plazmid/zredukowana pożywka surowica/mieszanina transfekcji kropla po kropli do każdego dołka z 12-dołkowych płytek za pomocą pipetora o pojemności 200 μl. Delikatnie rozkołysać płytki i wrócić do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
3. Dzień 4: nadsiewanie transfekowanych komórek BHK-T7 komórkami MA104
   1. Przepłukać świeżo zlewającą się monowarstwę komórek MA104 zawartą w kolbie T75 2x PBS. Rozbić monowarstwę za pomocą roztworu trypsyny-EDTA i ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnego podłoża DMEM.
   2. Za pomocą automatycznego licznika komórek i roztworu trypan-błękit określ stężenie żywotnych komórek MA104 w pożywce. Dostosuj stężenie do 8 x 10⁵ komórek MA104 / ml w niekompletnym pożywce DMEM i dodaj kroplami 0,25 ml zawieszonych komórek (2 x 10⁵ komórek) do studzienek zawierających transfekowane komórki BHK-T7.
   3. Dostosuj stężenie trypsyny (trzustki świńskiej typu IX) w pożywce do ~0,5 μg/ml, dodając 0,8 μl 1 mg/ml trypsyny do każdego dołka.
      UWAGA: Zapasy trypsyny powinny być przygotowane w PBS, porcjowane i przechowywane w temperaturze -20 °C.
   4. Użyj pozostałych komórek MA104 do przygotowania 6-dołkowych płytek, które będą potrzebne w 7 dniu do amplifikacji rekombinowanych wirusów. Aby wysiać płytki 6-dołkowe, rozcieńczyć zawieszone komórki MA104 do stężenia 1,5 x 10⁵ komórek/ml w kompletnym podłożu DMEM i umieścić 2 ml w każdym dołku. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Dzień 7: odzysk i amplifikacja rekombinowanego wirusa z transfekowanych komórek
   1. Poddaj komórki BHK-T7 / MA104 na płytkach 12-dołkowych trzem cyklom zamrażania i rozmrażania w sterylnych warunkach, przesuwając płytki między zamrażarką o temperaturze -20 °C a powierzchnią o temperaturze pokojowej. Po przeniesieniu lizatów do probówek o pojemności 1,5 ml, probówki wirować przez 10 minut w temperaturze 500 x g (4 °C) w celu osadzenia dużych szczątków komórkowych. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub -20 °C (długotrwale).
   2. Przemyć monowarstwy MA104 w płytkach 6-dołkowych (przygotowanych w 4 dniu) 2x PBS. Umieść 2 ml niekompletnego podłoża DMEM w każdym dołku, który zawiera 0,5 μg / ml trypsyny. Dodać 300 μl supernatantu odzyskanego z lizatów komórkowych BHK-T7/MA104 do studzienek i umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   3. Inkubować płytki przez 7 dni lub do momentu zaobserwowania całkowitych efektów cytopatycznych (CPE). Lizować komórki MA104 na płytkach 6-dołkowych w trzech cyklach zamrażania i rozmrażania, a następnie przenieść lizaty do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać duże resztki komórkowe przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 500 x g (4 °C). Przenieść oczyszczone lizaty komórkowe do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Izolacja płytki nazębnej wirusów rekombinowanych

1. Aktywować wirusy w 100 μl oczyszczonych lizatów komórkowych poprzez dodanie trypsyny do końcowego stężenia 10 μg/ml i inkubację w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przygotować 10-krotną serię seryjnych rozcieńczeń w zakresie od ^10-1 do ^10-7 (po 1 ml każdy) w niekompletnym podłożu DMEM.
2. Przepłukać monowarstwy MA104 na płytkach 6-dołkowych 2x 2 ml PBS i raz niekompletnym podłożem DMEM. Dodać 400 ml rozcieńczeń lizatu w dwóch egzemplarzach do płytek. Inkubować płytki przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ , kołysząc co 10-15 minut w celu rozprowadzenia rozcieńczeń w monowarstwie.
3. Przygotować roztwór nakładki agarozowo-MEM, łącząc równe objętości 2x minimalnej pożywki egzogennej Eagle'a (EMEM; wstępnie podgrzanej do 37 °C) z 1,5% agarozą, która została stopiona w wodzie za pomocą kuchenki mikrofalowej i wstępnie schłodzona do 45 °C. Utrzymuj roztwór nakładki w temperaturze 42 °C za pomocą łaźni wodnej i dostosuj do końcowego stężenia 0,5 μg/ml trypsyny bezpośrednio przed umieszczeniem na komórkach.
4. Odciągnąć rozcieńczenia lizatu z płytek 6-dołkowych, a następnie raz przepłukać komórki 2 ml niekompletnego DMEM. Delikatnie nałożyć 3 ml roztworu nakładki agarozowo-MEM na monowarstwę komórkową zawartą w każdym dołku. Poczekaj, aż nakładka agarozowa stwardnieje w temperaturze pokojowej, a następnie włóż płytki z powrotem do inkubatora.
5. Trzy dni później przygotować roztwór nakładki agarozowo-MEM, jak w kroku 4.3 i doprowadzić do temperatury 42 °C. Bezpośrednio przed użyciem dostosować roztwór do końcowego stężenia 50 μg/ml czerwieni obojętnej (tabela materiałów).
6. Dodać 2 ml roztworu nakładającego na istniejącą warstwę agarozy w płytkach 6-dołkowych. Po pozostawieniu nowej warstwy agarozy do stwardnienia, włóż płytki z powrotem do inkubatora. Roztwory i płytki zawierające neutralną czerwień należy chronić przed działaniem światła.
7. W ciągu następnych 6 godzin zidentyfikuj blaszki rotawirusowe w płytkach 6-dołkowych za pomocą kasetonu świetlnego. Pobieraj wyraźnie zarysowane płytki za pomocą jednorazowych pipet transferowych, odzyskując czopy agarozowe, które rozciągają się całkowicie do warstwy komórkowej.
8. Wyrzucić zatyczkę do 1,5 ml probówki zawierającej 0,5 ml niekompletnej pożywki DMEM i wirować próbkę przez 30 s. Amplifikować wirusa wyizolowanego z płytki nazębnej wymytego do pożywki przez rozmnażanie na monowarstwach MA104 na płytkach 6-dołkowych lub kolbach T25 zawierających niekompletne podłoże DMEM i 0,5 μg/ml trypsyny.
   UWAGA: Dodatkowe informacje dotyczące izolacji i mianowania rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej są dostępne w Arnold et al.³¹.

5. Elektroforeza żelowa wirusowego dsRNA

1. Umieścić 600 μl oczyszczonych lizatów zakażonych komórek i 400 μl tiocyjanianu guanidyny w 1,5 ml probówek do mikrowirówek, wirować przez 30 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać 200 μl chloroformu, wirować przez 30 s i inkubować przez 3 min. Po odwirowaniu przez 5 minut w temperaturze 13 000 x g (4 °C) przenieść ~550 μl górnej fazy wodnej do świeżych probówek.
2. Odzyskaj wirusowe dsRNA z fazy wodnej, dodając 2 objętości (~900 μL) zimnego alkoholu izopropylowego i probówki odwracające 4−6x. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, probówki wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g (4 °C). Odrzuć supernatanty i zachowaj osady RNA.
3. Umyj granulki, dodając 1 ml 75% etanolu do probówki, odwracając raz i odwirowując przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g (4 °C). Po ostrożnym usunięciu płukania etanolem za pomocą pipetora, pozostaw granulki RNA do wyschnięcia na powietrzu na stole laboratoryjnym przez 5-10 minut. Rozpuść granulki RNA w 15 μl wolnej od nukleaz wody klasy biologii molekularnej i przechowuj w temperaturze -20 °C.
4. Połącz 10 μl rozpuszczonych próbek RNA z 2 μl 6x buforu ładującego DNA, załaduj na prefabrykowane 10% mini żele poliakrylamidowe (lub ręcznie odlewane odpowiedniki) i rozpuść RNA przez elektroforezę w buforze Tris-glicyna przez 2 godziny pod stałym prądem (16 mA). Moczyć żele przez 5-10 minut w wodzie zawierającej ~1 μg/ml bromku etydyny i wykrywać segmenty genomu rotawirusa za pomocą transiluminatora UV.

6. Odzyskiwanie i sekwencjonowanie wirusowego dsRNA

1. Zlokalizuj wirusowe pasma dsRNA na żelach poliakrylamidowych, najlepiej przy użyciu światła UV o niskiej intensywności o długiej długości fali, aby uniknąć generowania wiązań krzyżowych z kwasami nukleinowymi. Za pomocą świeżej żyletki wytnij fragmenty żelu zawierające prążki dsRNA i przenieś do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
2. Po dodaniu 10-20 μl wody wolnej od RNaz, zmiażdż każdy fragment za pomocą jednorazowego tłuczka do granulek bez RNaz, zaprojektowanego tak, aby pasował do probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml lub przeciągając w górę iw dół przez igłę 18 G. Rozdrobnione fragmenty inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Odzyskać 3 μl płynu z probówek zawierających pokruszone fragmenty żelu. Wygeneruj cDNA wirusowych dsRNA za pomocą jednoetapowego zestawu do reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) (tabela materiałów) i odpowiednich starterów oligonukleotydowych.
   UWAGA: Produkty PCR są oczyszczane żelem za pomocą zestawu do czyszczenia PCR (Tabela materiałów) i wysyłane do sekwencjonowania nocnego, wraz ze starterami, przez komercyjne usługi sekwencjonowania DNA.

7. Analiza immunoblot białek wirusowych

1. Wysiewaj 6-dołkowe płytki z 3 x 10⁵ komórkami MA104 na dołek w łącznej objętości 2 ml kompletnego podłoża DMEM. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i pozostawić do momentu, aż komórki osiągną zlewność (3-5 dni).
   UWAGA: Studnie z konfluentnymi monowarstwami będą zawierały ~1,2 x 10⁶ komórek.
2. Oczyszczone supernatanty należy traktować przez inkubację z 10 μg/ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu aktywacji zawartych w nich rekombinowanych cząstek rotawirusa.
3. Przepłukać monowarstwy MA104 w płytkach 6-dołkowych 2x za pomocą 2 ml PBS. Infekować komórki, dodając do każdej studzienki 200 μl inokulum zawierającego 3-5 jednostek tworzących blaszki (PFU) na komórkę rotawirusa aktywowanego trypsyną w niekompletnym pożywce DMEM. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora.
4. Co 10 minut wyjmuj płytki i delikatnie kołysz, aby ponownie rozprowadzić inokulum w monowarstwie komórki. Po 1 godzinie zastąp inokulum 2 ml niekompletnego podłoża DMEM.
5. Po 8 godzinach od zakażenia przepłukać komórki na płytkach 6-dołkowych 2x PBS. Zeskrobać komórki do 750 μl PBS i przenieść objętość do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przepłukać płytkę kolejnym 750 μl PBS i połączyć z poprzednio pobraną próbką o objętości 750 μl.
6. Granulki w próbce przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odrzuceniu supernatantu granulki komórkowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ich dalszej obróbki.
7. Przygotuj bufor do lizy komórek zawierający 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 i 1x kompletny inhibitor proteazy wolny od EDTA. Po dodaniu 300 μl buforu do lizy do zamrożonych granulek komórkowych, należy na krótko zagwirować próbki i inkubować na lodzie przez 10 minut.
8. Powtórzyć proces wirowania i inkubacji próbek na lodzie 3x. Następnie odwirować próbki o masie 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, następnie zebrać supernatanty i przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Białka zawarte w objętościach 20 μl próbek supernatantu rozpuścić metodą elektroforezy na prefabrykowanych liniowych mini żelach poliakrylamidowych o stężeniu 8−16% i przenieść na membrany nitrocelulozowe. Blokować błony przez inkubację z roztworem PBS-Tween 20 (0,02%) zawierającym 5% odtłuszczonego mleka w proszku.
10. Sonduj błony przez inkubację z jednym lub więcej przeciwciałami pierwszorzędowymi (np. surowicami odpornościowymi anty-NSP3 lub anty-VP6 świnki morskiej, mysimi przeciwciałami monoklonalnymi anty-Flag M2 lub monoklonalnymi przeciwciałami anty-PCNA królika). Wykryj przeciwciała pierwszorzędowe poprzez inkubację błon z końskim anty-mysim IgG, anty-świnka morska IgG lub kozich przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową i anty-króliczą IgG, a następnie substratem chemiluminescencji chrzanu o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Wizualizacja sygnałów luminescencyjnych za pomocą systemu obrazowania żelowego (tabela materiałów) lub kliszy rentgenowskiej.

8. Obrazowanie żywych komórek zakażonych wirusami wykazującymi ekspresję FP

1. Wysiewaj 6-dołkowe płytki z 3 x 10⁵ komórkami MA104 na dołek w sumie 2 ml kompletnego podłoża DMEM. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i pozostawić do momentu, aż komórki osiągną zlewność (3-5 dni).
   UWAGA: Studnie z konfluentnymi monowarstwami będą zawierały ~1,2 x 10⁶ komórek.
2. Aktywować próbki rotawirusów o znanym mianie przez inkubację z 10 μg/ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
3. Przepłukać płytki 6-dołkowe monowarstwami MA104 2x po 2 ml PBS. Infekować komórki, dodając do każdej studzienki 200 μl inokulum zawierającego 3-5 PFU na komórkę rotawirusa aktywowanego trypsyną w niekompletnym pożywce DMEM. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze i delikatnie kołysz płytki, aby ponownie rozprowadzić inokulum w monowarstwie komórki co 10 minut.
   UWAGA: Studnie, które są pozorowane zainfekowane inokulum DMEM wolnym od wirusów, powinny być włączone jako kontrole.
4. Po 1 godzinie adsorpcji wirusa przepłukać monowarstwę 2x PBS i zastąpić pożywkę 0,5 ml na studzienkę niekompletnego podłoża DMEM. Po 7,5 godziny od zakażenia zastąp pożywkę hodowlaną DMEM o niskiej fluorescencji tła (tabela materiałów). Po 8 godzinach od infekcji użyj imagera żywych komórek, aby zbadać komórki w 20-krotnym powiększeniu pod kątem zielonego, czerwonego lub niebieskiego sygnału fluorescencji.

Wyniki

Protokół odwrotnej genetyki opisany w tym artykule przechodzi przez wiele odrębnych etapów: (1) kotransfekcja komórek BHK-T7 z wektorami transkrypcyjnymi rotawirusa pT7 i plazmidem ekspresyjnym pCMV/NP868R, (2) nadmierne rozsiewanie transfekowanych komórek BHK-T7 komórkami MA104, (3) amplifikacja rekombinowanych wirusów obecnych w lizatach komórek BHK-T7/MA104 przy użyciu komórek MA104, oraz (4) izolacja płytki nazębnej rekombinowanego wirusa przy użyciu komórek MA104 (Rysunek 2). W naszych rękach pro...

Dyskusja

W naszym laboratorium rutynowo polegamy na opisanym tutaj protokole genetyki odwrotnej w celu wytworzenia rekombinowanych rotawirusów SA11. Dzięki takiemu podejściu osoby z niewielkim doświadczeniem w technikach biologii molekularnej lub pracy z rotawirusami odzyskują rekombinowane wirusy już przy pierwszej próbie. Wygenerowano blisko 100 rekombinowanych wirusów zgodnie z tym protokołem, w tym te z genomami, które zostały przeprojektowane w celu ekspresji obcych białek (np. FP) i które zawierają dodatki sekwencji, delecj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nerka chomika - T7 RdRP (BHK-T7) Kontakt z komórkami			: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Poliakrylamid Mini-Gel	Bio-Rad	45608105
Celometr AutoT4 Żywotny licznik komórek	Nexcelom
ChemiDoc MP System obrazowania żelu	Bio-Rad
Chloroform	MP	194002
Przejrzystość Zachodni Wzmocniony substrat chemiluminescencji (ECL)	Bio-Rad	170-5060
Kompetentne bakterie E.coli DH5alpha	Lucigen	60602-2
Kompletny inhibitor proteazy	Pierce	A32965
Jednorazowe pipety transferowe, ultracienkie przedłużone końcówki	MTC Bio	P4113-11
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)	Lonza	12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)	Quality Biological	115-073-101
Etanol, Absolutny (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Roztwór bromku etydyny (10 mg / ml)	Invitrogen	15585-011
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Corning	35-010-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowane termicznie	Corning	35-011-CV
Flag M2, mysi monoklonalny	zestaw plazmidowy Sigma-Aldrich	F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep	Sigma	NA0200-1KT
Geneticin (G-418)	Invitrogen	10131-027
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM z niskim tłem fluorescencja
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)	Gibco	11710-035
Kozia IgG Anty-Królicza, Peroksydaza Chrzanowa (HRP) Sprzężona	technologia sygnalizacji komórkowej	7074S
Świnka morska Anti-NSP3 Antysurowica	Pattona partia laboratoryjna	55068
Świnka morska Anti-VP6 Antierum	Patton lab	lot 53963
Koń Anty-Pig PigG Świnia Morska, Peroksydaza chrzanowa (HRP) Sprzężona	KPL	5220-0366
Końska IgG Przeciw Myszy, eroksydaza chrzanowa (HRP) Sprzężona	technologia sygnalizacji komórkowej	7076S
iNtRON Biotechnologia e-Myco Mycoplasma PCR Detection	JH Science	25235
Alkohol izopropylowy	Macron	3032-02
Roztwór L-glutaminy ( 100x)	Gibco	25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)	Produkty badawcze RPI	L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Pożywka	Hyclon	Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)	Lonza	04-719Q
Komórki Monkey Kidney (MA104)	ATCC	ATCC CRL-2378.1
Spektrofotometr NanoDrop One	ThermoScientific
Neutralny czerwony roztwór (0,33%)	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
Nieistotny roztwór aminokwasów (100x)	Gibco	11140-050
Novex 10% Tris-glicynowy mini-żel poliakryloamidowy	Invitrogen	XP00102BOX
Woda klasy biologii molekularnej bez nukleaz	Invitrogen	10977-015
Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCR	Takara	740609.25
Opti-MEM Zredukowane podłoże surowicy	Gibco	31985-070
Tłuczek do granulek (bez RNaz, jednorazowe)	Fisher	12-141-368
Roztwór penicyliny i streptomycyny, (100x penn-strep)	Corning	30-002-Cl
Fosforan Buforowana sól fizjologiczna (PBS), 10x	Bioodczynniki Fisher	BP399-20
Trypsyna wieprzowa, typ IX-S	Sigma-Aldrich	T0303
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Qiagen Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
SA11 pT7 Wektory transkrypcyjne	Addgene	89162-89172
SA11 pT7 / NSP3 Wektory transkrypcyjne wyrażające białka			Kontakt: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose	Lonza	50000	Do elektroforezy
żelowej SeaPlaque agaroza	Lonza	50100	Do oznaczania
płytki nazębnejIndeks górny III Jednoetapowy zestaw RT-PCR	Invitrogen	12574-035
Zestaw do transferu nitrocelulozy Trans-Blot Turbo	Bio-Rad	170-4270
System Turbotransferu Trans-Llot	Odczynnik
Mirus		MIR2306
Tris-Glycine-SDS Żelowy bufor do biegania (10x)	Bio-Rad	161-0772
Triton X 100	Bioodczynniki Fisher	BP151-500
Odczynnik do ekstrakcji RNA Trizol	Ambion	15596026
Trypan niebieski	Corning	25-900-CI
Trypsyna (0,05%)-EDTA (0,1%) Jakość roztworu do dysocjacji komórek	Biologiczny	118-087-721
Rosół z fosforanu tryptozy	Gibco	18050-039
Tween-20	VWR	0777-1L
Rozpuszczalnik Vertrel VF	Zoro	G0707178
Fluorescencyjny obrazownik żywych komórek	Zoe Bio-Rad