Prezentujemy metodę badania wczesnych zmian zwyrodnieniowych stawów na poziomie komórkowym w chrząstce stawowej za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do wykrywania wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biomechaniczne właściwości komórek i tkanek nie tylko regulują ich kształt i funkcję, ale są również kluczowe dla utrzymania ich żywotności. Zmiany elastyczności mogą rozprzestrzeniać się lub wywoływać początek poważnych chorób, takich jak rak lub choroba zwyrodnieniowa stawów (OA). Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się silnym narzędziem do jakościowego i ilościowego charakteryzowania właściwości biomechanicznych określonych biologicznych struktur docelowych w skali mikroskopowej, mierząc siły w zakresie od tak małych, jak pikonewton do mikroniutonów. Właściwości biomechaniczne mają szczególne znaczenie w tkankach mięśniowo-szkieletowych, które poddawane są dużym obciążeniom. Choroba zwyrodnieniowa chrząstki powoduje przerwanie macierzy okołokomórkowej (PCM) i przestrzenne przegrupowanie chondrocytów osadzonych w ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zakłócenia w PCM i ECM są związane ze zmianami we właściwościach biomechanicznych chrząstki. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy AFM do ilościowego określenia tych zmian w odniesieniu do specyficznych zmian wzorca przestrzennego chondrocytów. Przy każdej zmianie wzorca obserwowano znaczące zmiany elastyczności zarówno dla PCM, jak i ECM. Pomiar elastyczności miejscowej pozwala zatem na wyciągnięcie bezpośrednich wniosków na temat stopnia miejscowego zwyrodnienia tkanek w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
Wprowadzenie
Chrząstka stawowa to tkanka tętniakowa. Słabo rozproszone chondrocyty wytwarzają, organizują i utrzymują ekspansywną macierz zewnątrzkomórkową (ECM), w której są osadzone. Jako odrębna i wyspecjalizowana część ECM, chondrocyty są otoczone cienką warstwą wyspecjalizowanej macierzy znanej jako macierz okołokomórkowa (PCM). PCM działa jako mechanowrażliwy interfejs komórka-macierz1, który chroni chondrocyty2 i moduluje ich odpowiedź biosyntetyczną3. Jak opisano wcześniej4, w zdrowej chrząstce chondrocyty są ułożone w określone, odrębne wzory przestrzenne, które są specyficzne dla każdej warstwy tkanki i stawu4,5 i zależą od specyficznych dla stawu mechanizmów obciążenia mechanicznego6. Wzorce te zmieniają się z par i strun w zdrowej chrząstce na podwójne struny wraz z nadejściem choroby zwyrodnieniowej stawów (OA). Wraz z dalszym postępem choroby chondrocyty tworzą małe skupiska, które w zaawansowanej chorobie zwyrodnieniowej stawów stopniowo powiększają się do dużych skupisk. W końcowym stadium choroby zwyrodnieniowej stawów obserwuje się całkowitą utratę jakiejkolwiek struktury organizacyjnej i indukcję apoptozy. W ten sposób układ komórkowy chondrocytów może być używany jako oparty na obrazie biomarker progresji choroby zwyrodnieniowej stawów4.
Biomechaniczne właściwości komórek i tkanek nie tylko regulują ich kształt i funkcję, ale są również kluczowe dla utrzymania ich żywotności. Zmiany elastyczności mogą rozprzestrzeniać się lub wywoływać początek poważnych chorób, takich jak rak lub choroba zwyrodnieniowa stawów. Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się potężnym narzędziem do jakościowego i ilościowego charakteryzowania właściwości biomechanicznych określonych biologicznych struktur docelowych w skali mikroskopowej, mierząc szeroki zakres siły, od pikonewtona do mikroniutona. Głównym zastosowaniem AFM jest pomiar topografii powierzchni i właściwości mechanicznych próbek w rozdzielczości subnanometrowej7. Urządzenie pomiarowe składa się z trzech głównych elementów: 1) Sondy AFM, która jest ostrą końcówką zamontowaną na wsporniku i służy do bezpośredniej interakcji z powierzchnią próbki. Po przyłożeniu siły do wspornika następuje odkształcenie tego ostatniego zgodnie z właściwościami mierzonej tkanki. 2) Układ optyczny, który emituje wiązkę laserową na wspornik, która jest następnie odbijana do jednostki detektora. 3) Detektor fotodiody, który wyłapuje światło odchylone od wspornika. Przetwarza on otrzymane informacje dotyczące ugięcia lasera przez wspornik na krzywą siły, którą można analizować.
Tak więc, główną zasadą AFM jest wykrywanie siły działającej między sondą AFM a docelową strukturą próbki. Uzyskane krzywe siły opisują właściwości mechaniczne docelowych struktur na powierzchni próbki, takie jak elastyczność, rozkład ładunku, namagnesowanie, granica plastyczności i dynamika sprężystych odkształceń plastycznych8. Ważną przewagą AFM nad innymi technikami obrazowania jest to, że AFM może być stosowany do pomiaru właściwości mechanicznych żywych komórek w pożywce lub tkanek w stanie natywnym bez uszkadzania tkanki. AFM może pracować zarówno w warunkach płynnych, jak i suchych. Nie ma wymogu przygotowania próbki. AFM daje możliwość obrazowania próbki i jednoczesnego pomiaru jej właściwości mechanicznych w próbkach znajdujących się w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. W niniejszej pracy opisano nowatorskie podejście do oceny progresji choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez pomiar elastyczności PCM i ECM w natywnej chrząstce stawowej. Korelacja organizacji przestrzennej chondrocytów ze stopniem miejscowej degeneracji tkanek daje zupełnie nową perspektywę wczesnego wykrywania choroby zwyrodnieniowej stawów. Do tej pory nie oceniono jednak funkcjonalnej istotności tych wzorców. Ponieważ główną funkcją chrząstki stawowej jest przenoszenie obciążenia przy niskim tarciu, tkanka musi mieć właściwości elastyczne. AFM umożliwia pomiar nie tylko elastyczności ECM, ale także przestrzennych wzorców komórkowych osadzonych w ich PCM. Obserwowana korelacja elastyczności ze zmianą wzorca przestrzennego chondrocytów jest tak silna, że sam pomiar elastyczności może pozwolić na stratyfikację miejscowego zwyrodnienia tkanek.
Moduły sprężystości PCM i ECM oceniano w sekcjach o grubości 35 μm przy użyciu systemu AFM zintegrowanego z mikroskopem kontrastowym z odwróconą fazą, który umożliwiał jednoczesną wizualizację próbki chrząstki. Protokół ten opiera się na badaniu już opublikowanym przez nasze laboratorium9 i szczegółowo opisuje, jak scharakteryzować przestrzenny układ chondrocytów i jak zmierzyć elastyczność powiązanych z nimi PCM i ECM. Przy każdej zmianie wzorca chondrocytów można również zaobserwować znaczące zmiany elastyczności zarówno dla PCM, jak i ECM, co pozwala na zastosowanie tej techniki do bezpośredniego pomiaru etapu zwyrodnienia chrząstki.
To potwierdzone podejście otwiera nowy sposób oceny progresji choroby zwyrodnieniowej stawów i efektów terapeutycznych we wczesnych stadiach, zanim makroskopowa degradacja tkanek zacznie się pojawiać. Konsekwentne wykonywanie pomiarów AFM jest żmudnym procesem. W poniższym protokole opisujemy, jak przygotować próbkę do pomiaru przez AFM, jak wykonać rzeczywiste pomiary AFM zaczynając od przygotowania wspornika, jak skalibrować AFM, a następnie jak wykonać pomiary. Instrukcje krok po kroku dają jasne i zwięzłe podejście do uzyskania wiarygodnych danych oraz dostarczają podstawowych strategii ich przetwarzania i interpretacji. W sekcji dyskusji opisano również najczęstsze pułapki tej rygorystycznej metody i przedstawiono pomocne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Próbki ludzkiej chrząstki zostały pobrane od pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego na Oddziale Chirurgii Ortopedycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze, Niemcy, oraz w szpitalu Winghofer, Rottenburg a.N., Niemcy, na schyłkową staw zwyrodnieniową stawu kolanowego. Przed rozpoczęciem badania uzyskano pełną zgodę wydziałowej, instytucjonalnej i lokalnej komisji etycznej (numer projektu 674/2016BO2). Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Metody przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Przygotowanie próbki
- Przygotowanie chrząstki do cięcia kriotomii
- W celu oceny zmian zwyrodnieniowych stawu kolanowego należy pobrać od pacjentów próbki chrząstki stawowej pobrane ze strefy nośnej kłykci kości udowej po resekcji tkanki.
UWAGA: Próbki, które są badane, powinny nadal zawierać co najmniej cienką warstwę kości podchrzęstnej, aby umożliwić wyraźną identyfikację orientacji tkanki w odniesieniu do powierzchni wewnętrznej i zewnętrznej, umożliwiając w ten sposób również znormalizowane pobranie tkanki z najwyższej warstwy chrząstki. Chrząstka może być wykorzystana do pomiarów AFM do 24 godzin po zabiegu. Tkanka może być przechowywana w zmodyfikowanym podłożu Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco bez surowicy z 2% (v/v) penicyliną-streptomycyną i 1,2% (v/v) amfoterycyną B przed użyciem. Przechowywanie próbek przez ponad 24 godziny może jednak powodować artefakty w pomiarach AFM z powodu pęcznienia tkanek. - Za pomocą skalpela należy wyciąć chrząstkę stawową jako całość z kości podchrzęstnej, a następnie zanurzyć próbkę chrząstki w rozpuszczalnym w wodzie podłożu do zatapiania na pokrętle kriotomicznym, które zamarza w niskiej temperaturze, w urządzeniu do kriotomii.
UWAGA: Zamrożone podłoże stabilizuje tkankę, którą otacza. Powoduje to również zamrożenie próbki chrząstki wraz z podłożem do zatapiania. Podczas wycinania chrząstki z kości śledź orientację tkanki. Tkanka osadzona do kriosekcji musi być umieszczona w taki sposób, aby górna warstwa (tj. powierzchnia stawowa) chrząstki była skierowana w stronę ostrza. Należy pamiętać, że tkanka musi być całkowicie pokryta podłożem do zatapiania.
- W celu oceny zmian zwyrodnieniowych stawu kolanowego należy pobrać od pacjentów próbki chrząstki stawowej pobrane ze strefy nośnej kłykci kości udowej po resekcji tkanki.
- Kriotomia sekcja chrząstki
- Za pomocą standardowego kriotomu należy przeciąć tkankę o grubości 35 μm od najwyższej warstwy (tj. powierzchni stawowej) chrząstki stawowej, która jest osadzona w zamrożonym, rozpuszczalnym w wodzie podłożu do zatapiania.
UWAGA: W sumie można podzielić na sekcje do 300 μm (co odpowiada około dziewięciu sekcjom) i wykorzystać je do analiz. Proponowany limit 300 μm odpowiada głębokości penetracji wzrokowej, którą zwykle można uzyskać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w chrząstce szklistej, takiej jak chrząstka stawowa. W ten sposób możliwe jest sortowanie chrząstki zgodnie z dominującym lokalnym wzorcem przestrzennym, a następnie mierzenie tych wzorów w odpowiednich sekcjach. - Zebrać skrawki na szkiełku podstawowym i przepłukać je 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia rozpuszczalnego w wodzie podłoża do zatapiania.
- Za pomocą standardowego kriotomu należy przeciąć tkankę o grubości 35 μm od najwyższej warstwy (tj. powierzchni stawowej) chrząstki stawowej, która jest osadzona w zamrożonym, rozpuszczalnym w wodzie podłożu do zatapiania.
- Klejenie skrawków chrząstki na szalce Petriego kompatybilnej z AFM
UWAGA: Ponieważ AFM zbiera dane poprzez mechaniczne wgłębienie na próbce, sekcje muszą być zamocowane na miejscu, aby umożliwić precyzyjne pomiary.- Delikatnie przyklej skrawki o grubości 35 μm za pomocą biokompatybilnego kleju do próbek na szalkach do kultur tkankowych, które są kompatybilne z urządzeniem AFM. Aby to zrobić, weź 2-3 krople kleju i umieść je na naczyniu do hodowli tkankowej w miejscu, w którym skończy się krawędź sekcji. Teraz umieść część chrząstki na kleju i pozwól jej mocno przykleić się do powierzchni naczynia do hodowli tkankowej.
UWAGA: Odcinki szklistej chrząstki stawowej o grubości 35 μm nie są bardzo podatne na zwijanie się. Jeśli jednak podczas wyjmowania próbek z pożywki buforowej dojdzie do zwijania się, należy upewnić się, że do próbek przyklei się jak najmniej płynu. Gdy tylko nadmiar wody wyschnie, bezpośrednio rozprowadź tkankę na rozproszonych miejscach kleju, tak aby była przymocowana do powierzchni naczynia do hodowli komórkowych. Klej nakłada się cienką warstwą tylko na krawędziach próbki, a nie na całym przekroju. Mierz tylko tę część próbki, która znajduje się daleko od klejonego obszaru, aby wyeliminować możliwość zakłócania pomiarów przez klej. - Inkubuj skrawki w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty, aby klej i tkanka mogły się prawidłowo związać. Następnie przykryj skrawki pożywką L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy i bez wodorowęglanu sodu, tak aby były całkowicie zanurzone.
UWAGA: Nagłe ruchy próbki podczas utrwalania lub niewystarczające nałożenie kleju są częstymi błędami, które skutkują oderwaniem tkanki od naczynia hodowlanego. Ponadto nakładanie podłoża Leibowitz powinno odbywać się w delikatny sposób, aby nie odrywać próbki od powierzchni z powodu "fal" wytwarzanych przez podłoże. - Umieścić szalkę Petriego wraz ze sklejonymi sekcjami w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C do czasu wykonania pomiarów.
UWAGA: Upewnij się, że skrawki tkanki są stabilne i nie odrywają się od powierzchni naczynia do hodowli tkankowej, wykonując każdy krok powoli.
- Delikatnie przyklej skrawki o grubości 35 μm za pomocą biokompatybilnego kleju do próbek na szalkach do kultur tkankowych, które są kompatybilne z urządzeniem AFM. Aby to zrobić, weź 2-3 krople kleju i umieść je na naczyniu do hodowli tkankowej w miejscu, w którym skończy się krawędź sekcji. Teraz umieść część chrząstki na kleju i pozwól jej mocno przykleić się do powierzchni naczynia do hodowli tkankowej.
2. Przygotowanie wspornika (klejenie mikrosfer)
- Przygotowanie urządzenia AFM i rozcieńczanie mikrosfer
- Umieść wspornik na pustaku szklanym przeznaczonym do pomiarów powietrza, zamocuj go za pomocą sprężyny i zamontuj pustak szklany na głowicy AFM.
- Rozcieńczyć mikrosfery w 100% etanolu (100 cząstek/10 μl) i ultradźwięki przez 10 s, tak aby mikrosfery zostały oddzielone i nie zlepiały się ze sobą.
- Przygotowanie zestawu do klejenia
- Wyczyść szkiełko z 70% etanolem i zamontuj je na uchwycie próbki w urządzeniu AFM.
UWAGA: Czyszczenie szkiełka zapobiega gromadzeniu się drobinek kurzu, które mogłyby przeszkadzać w procesie klejenia, na powierzchni prowadnicy. - Umieść 2 μl zawiesiny mikrosfery na środku szkiełka i 2 μl kleju w pobliżu zawiesiny mikrosfery.
UWAGA: Zaleca się umieszczenie zawiesiny mikrosfery i kleju blisko siebie, aby umożliwić szybkie przejście wspornika między klejem a mikrosferami. Jeśli przejście między zanurzeniem wspornika w kleju a nawiązaniem kontaktu z mikrosferą jest zbyt długie, klej w końcu stwardnieje, tracąc w ten sposób swoje właściwości adhezyjne. - Pozwól, aby płynny etanol w zawiesinie mikrosfery wyschł na powietrzu, pozostawiając mikrosfery na miejscu.
- Wyczyść szkiełko z 70% etanolem i zamontuj je na uchwycie próbki w urządzeniu AFM.
- Klejenie mikrosfer na końcówce wspornika
- Zanurz wspornik ręcznie w kleju za pomocą silnika krokowego w krokach co 10 μm, aż końcówka zostanie pokryta klejem. Wykonaj ten krok szybko, ponieważ klej szybko wysycha.
- Ponownie wsunąć wspornik o 100 μm, przesunąć go w kierunku mikrosfer i ustawić końcówkę wspornika bezpośrednio nad pojedynczą mikrosferą.
- Uruchom pomiar spektroskopii sił, aby zanurzyć końcówkę wspornika na wybranej mikrosferze o parametrach pokazanych w tabeli 1.
UWAGA: Wykonując ten krok, pomiar powierzchni mikrosfery służy do nawiązania kontaktu między końcówką wspornika a mikrosferą. Stosunkowo długi czas kontaktu pokazany w tabeli 1 pozwala na długi czas wiązania kleju z mikrosferą. Krzywa siła-odległość uzyskana na tym etapie jest generowana jako produkt uboczny klejenia mikrosfery na końcówce wspornika i nie jest przetwarzana do dalszej analizy. - Po przymocowaniu mikrosfery do wspornika wsuń szklany blok z zamontowanym wspornikiem na górze, a następnie wyjmij głowicę AFM z mikroskopu. Na koniec zdemontuj pustak szklany i wspornik z głowicy AFM.
- Inkubować wspornik w temperaturze 65 °C przez 2 godziny i pozostawić do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem pomiarów.
UWAGA: Inkubacja wspornika poprawia właściwości adhezyjne kleju, dzięki czemu kompleks wspornikowo-mikrosferowy jest bardziej stabilny.
3. Przygotowanie urządzenia AFM do pomiarów
- Wyreguluj szklany blok przeznaczony do pomiaru w środowisku ciekłym na uchwycie AFM tak, aby górna powierzchnia była prosta i równoległa do uchwytu AFM.
- Za pomocą pęsety ostrożnie zamontuj wybrany wspornik na powierzchni pustaka szklanego, tak aby końcówka AFM z mikrosferą wystawała ponad wypolerowaną płaszczyznę optyczną.
UWAGA: Końcówka wspornika musi wystawać ponad wypolerowaną płaszczyznę, aby móc odbijać laser AFM na fotodetektorze. Zachowaj szczególną ostrożność podczas umieszczania wspornika na AFM, aby nie zarysować wypolerowanej powierzchni optycznej pustaka szklanego. Zarysowanie pustaka szklanego może skutkować trudnościami w regulacji ustawienia lasera i może zakłócić późniejsze pomiary. - Ponieważ wspornik będzie poddawany naciskowi mechanicznemu, należy go zamocować. Ustabilizuj wspornik na pustaku szklanym, wsuwając metalową sprężynę w rowek bloku i zaciskając górną część wspornika za pomocą sprężyny za pomocą pęsety.
- Ostrożnie umieść pustak szklany z wspornikiem na głowicy AFM i zabezpiecz go zintegrowanym mechanizmem blokującym. Upewnij się, że sprężyna jest skierowana w lewą stronę, tak aby wspornik był umieszczony we właściwej orientacji. Następnie zamontuj głowicę AFM wraz ze wspornikiem na urządzeniu AFM.
4. Ładowanie próbki i kalibracja wspornika
UWAGA: Tutaj kalibracja urządzenia odbywa się poprzez przeprowadzenie krzywej siły na czystej powierzchni szalki Petriego wypełnionej podłożem Leibovitza bez żadnej tkanki próbki. Kalibrację można również przeprowadzić przy użyciu oddzielnej kontrolnej czaszy AFM wypełnionej tylko pożywką AFM bez próbki.
- Montaż próbki na urządzeniu AFM
- Umieścić szalkę Petriego przygotowaną w kroku 1.3.3 na uchwycie na próbkę AFM.
- Włączyć podgrzewacz do szalek Petriego i ustawić go na 37 °C. Odczekać, aż naczynie do hodowli tkankowej osiągnie optymalną temperaturę (tj. 20 minut).
- Umieść folię ochronną na podstawie zespołu wspornika, aby uniknąć kondensacji medium w głowicy AFM.
- Kalibracja urządzenia
- Otwórz oprogramowanie (Tabela materiałów), a następnie okno wyrównywania laserowego i okno przedstawiające ustawienia parametrów podejścia. Następnie włącz silnik krokowy, światło laserowe i kamerę CCD.
- Użyj kamery CCD w mikroskopie, aby zwizualizować i zidentyfikować wspornik. Korzystając z funkcji silnika krokowego, opuszczaj wspornik w krokach co 100 μm, aż wspornik zostanie całkowicie zanurzony w medium.
UWAGA: Zanurzenie wspornika w cieczy można wizualnie zidentyfikować za pomocą kamery CCD. Kiedy przebija się przez powierzchnię wody, końcówka wspornikowa tworzy łatwo zauważalne okrągłe odbicia w wodzie. - Skieruj laser na szczyt wspornika za pomocą regulacyjnych.
UWAGA: Nie nawijaj, ponieważ spowoduje to uszkodzenie laserowego mechanizmu wyrównywania. Wspornik jest oglądany od dołu, a wiązka lasera pochodzi z góry. - Po umieszczeniu lasera na wsporniku należy wyregulować wiązkę lasera za pomocą w urządzeniu AFM tak, aby odbita wiązka padała na środek fotodetektora. Monitoruj położenie wiązki laserowej za pomocą funkcji wyrównywania lasera.
UWAGA: Detektor wychwytuje odchylenie wiązki laserowej odbitej przez wspornik i przekształca je w sygnał elektryczny. - Po laserowej regulacji wspornika sygnał sumy musi wynosić 1 V lub więcej, podczas gdy odchylenia boczne i pionowe muszą być bliskie 0. Jeśli te wartości nie zostaną uzyskane, wyreguluj fotodetektor.
- Uzyskiwanie krzywej siły kalibracyjnej
- W celu dotarcia do powierzchni czaszy AFM w celu rozpoczęcia pomiarów, należy uruchomić podejście skanerowe z parametrami podejścia podanymi w tabeli 2. Po dotarciu do dna naczynia do hodowli tkankowej wycofać wspornik o 100 μm.
UWAGA: W tym momencie sonda znajduje się dokładnie 100 μm powyżej dna naczynia do hodowli tkankowej. - Skonfiguruj parametry RUN i dostosuj parametry wyświetlane w tabeli 3. Kliknij przycisk URUCHOM, aby rozpocząć pomiar i uzyskać krzywą siła-odległość kalibracji.
UWAGA: Uzyskana tutaj krzywa siły jest pokazana na rysunku Rysunek 1. - Na krzywej siła-odległość kalibracji wybierz obszar dopasowania liniowego krzywej cofniętej w oprogramowaniu.
UWAGA: Dopasowanie liniowe jest wykonywane w celu zmierzenia czułości wspornika. Po wprowadzeniu dopasowania liniowego wartości zostaną zapisane przez oprogramowanie. Pomiar stałej sprężystości lub szum termiczny wspornika jest następnie obliczany przez oprogramowanie. - Ponieważ pomiary są wykonywane w medium o temperaturze 37 °C, ustaw zmienną temperatury na 37 °C w oprogramowaniu, aby jak najwierniej naśladować warunki fizjologiczne.
UWAGA: Pod koniec kalibracji odchylenie pionowe jest zapisywane i wyświetlane w jednostce siły, niutonach (N), zamiast w woltach (V), które są jednostką pierwotnej rejestracji przez detektor fotodiody.
- W celu dotarcia do powierzchni czaszy AFM w celu rozpoczęcia pomiarów, należy uruchomić podejście skanerowe z parametrami podejścia podanymi w tabeli 2. Po dotarciu do dna naczynia do hodowli tkankowej wycofać wspornik o 100 μm.
5. Biomechaniczna charakterystyka ECM i PCM poprzez wykonywanie pomiarów elastyczności za pomocą AFM
- Identyfikacja wzorców chondrocytów w części chrzęstnej
- Obserwuj wycinek chrząstki pod mikroskopem z kontrastem fazowym zintegrowanym z systemem AFM i zidentyfikuj specyficzne wzorce komórkowe10 chrząstki stawowej z choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego: pojedyncze struny (zdrowe obszary tkanek), podwójne struny (początkowa degeneracja tkanek), małe i duże skupiska (oba zaawansowane zwyrodnienie tkanek). Zobacz Rysunek 2A–D.
- Po zidentyfikowaniu konkretnego pożądanego wzorca, zmierz dwa miejsca na wybrany wzór na typ matrycy (PCM lub ECM) i wykonaj dziewięć powtórzeń pomiaru w każdym miejscu pomiaru (Rysunek 2E,F). Upewnij się, że wielkość próby jest wystarczająco duża, aby uwzględnić możliwe niedokładności.
UWAGA: W przypadku pomiarów PCM umieść wspornik w bliskiej odległości od komórek (jak pokazano w czerwonych kółkach w Rysunek 2E,F). Aby przeprowadzić pomiary ECM, wybierz obszar bez żadnych komórek (pokazany przez niebieski obszar w Rysunek 2E,F) i wykonaj wcięcie zgodnie z opisem w kroku 5.2.
- Wcięcie docelowej witryny
- Wykonać podejście, a następnie wycofanie tak, aby wspornik znajdował się 100 μm nad tkanką, która będzie pozycją wyjściową dla kolejnych pomiarów.
- Skoncentruj się na PCM lub ECM mierzonego wzoru i zamocuj w tym miejscu mysz komputerową.
UWAGA: Mysz będzie służyć jako wizualny znacznik docelowego miejsca wcięcia. Gdy uwaga przesunie się na końcówkę wspornika, struktury tkankowe staną się nierozróżnialne lub rozmyte. - Teraz skup się na sondzie i przesuń końcówkę sondy do punktu wcześniej ustalonego strzałką komputera. Następnie rozpocznij pomiary za pomocą RUN, używając parametru wartości zadanej uzyskanego przez kalibrację wspornika.
UWAGA: Przykładowa krzywa siły uzyskana z pomiaru PCM pojedynczej struny jest pokazana na rysunku uzupełniającym 1.
6. Przetwarzanie danych
UWAGA: Analiza danych lub określenie modułu sprężystości jest wykonywane przy użyciu modelu Hertz, jak opisano wcześniej11,12. Kształt wgłębnika był kulisty ze względu na zastosowanie mikrosfer na końcówce, a współczynnik Poissona został utrzymany na poziomie 0,5 w oparciu o wcześniejszą literaturę13,14,15.
- Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych (Tabela materiałów) kompatybilne z danymi uzyskanymi z urządzenia AFM.
- Wybierz model Hertz w oprogramowaniu do przetwarzania krzywych siła-odległość. Ustaw współczynnik Poissona na 0,5 i wybierz kształt końcówki jako sferyczny i promień końcówki 12,5 μm.
- Po dostosowaniu wszystkich parametrów wyniki są dopasowywane, a moduł Younga jest obliczany i wyświetlany przez oprogramowanie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W modelu fizjopatologicznym, przechodząc od pojedynczych nici do podwójnych nici, następnie do małych i wreszcie do dużych skupisk, moduły sprężystości zarówno ECM (Rysunek 3A), jak i PCM (Rysunek 3B) ulegały znacznemu zmniejszeniu przy każdej zmianie wzorca. Jedynym wyjątkiem była różnica w ECM między pojedynczymi a podwójnymi nićmi (p = 0.072). Wyniki pokazują, że stosunek ECM/PCM (Rysunek 4B) nie zmienił się istotnie, podczas gdy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykorzystując AFM jako nowatorską i potężną technikę pomiaru właściwości biomechanicznych materiałów biologicznych na poziomie nanoskali, zmierzyliśmy właściwości sprężyste ECM i PCM w ludzkiej chrząstce stawowej z chorobą zwyrodnieniową stawów. Próbki chrząstki wybrano zgodnie z ich dominującym wzorcem przestrzennym organizacji chondrocytów jako biomarkerem miejscowej degeneracji tkanek na podstawie obrazu. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano silny spadek wartości elastyczności zarówno ECM, jak i PCM wzdłuż przestrzen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy naszym współautorom z oryginalnej publikacji za pomoc i wsparcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amfoterycyna B | Merck | A2942 | |
| (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Niemcy | JPK00518 | |
| głowica AFM | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biokompatybilny klej do próbek | JPK Instruments AG, Berlin, Niemcy | H000033 | |
| Cantilever | końcówka C, k i frac14; 7,4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bułgaria | AIO-TL-10 | |
| Zmodyfikowane medium Eagle's Eagle (DMEM) firmy Dulbecco | , Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Niemcy | 41966052 | |
| Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazami (zintegrowany z AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Niemcy | L201306_03 | |
| Pożywka L-15 firmy Leibovitz bez L-glutaminy | (Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma | P4333 | |
| Podgrzewacz szalki Petriego związany z AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Niemcy | T-05-0117 | |
| Pióro skalpela | 2023-01 | ||
| Naczynia do hodowli tkankowych | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Szwajcaria | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holandia | SA6255012 |
Bibliografia
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409(2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
