Kontrolowanie morfologii polimerów elektroprzędzonych w inżynierii tkankowej przy użyciu linii komórkowej hepG2

Summary

Ta metoda dostarcza środków do testowania różnych morfologii i topografii włókien polikaprolaktonowych na potrzeby inżynierii tkankowej. Małe i duże włókna są wytwarzane z losowymi orientacjami, wyrównanymi orientacjami, a także porowatymi kriogenicznie elektroprzędzonymi strukturami i wykorzystywane jako platformy do hodowli komórek.

Abstract

Elektroprzędzenie daje naukowcom możliwość wytwarzania powtarzalnych włókien polimerowych w skali mikro i nano. Włóknista architektura 3D elektroprzędzonych polimerów jest uważana za strukturalną imitację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W związku z tym elektroprzędzone włókna wytwarzane z biokompatybilnych polimerów były szeroko badane przez naukowców zajmujących się inżynierią tkankową pod kątem ich potencjalnej roli jako sztucznego ECM do kierowania wzrostem tkanek zarówno in vitro, jak i in vivo. Wszystkie komórki są bardzo wrażliwe na środowisko mechaniczne. Wykazano to poprzez odkrycie wielu szlaków mechanotransdukcji nierozerwalnie związanych z włóknami aktyny cytoszkieletu. Cytoszkielet działa jak czujnik mechaniczny, który może kierować funkcjonalnością i różnicowaniem komórki gospodarza w zależności od sztywności i morfologii jej substratu. Włókna elektroprzędzone można dostroić zarówno pod względem wielkości włókien, jak i morfologii, aby łatwo modulować środowisko mechaniczne w rusztowaniu z polimeru włóknistego. W tym miejscu opisano metody elektroprzędzenia polikaprolaktonu (PCL) dla trzech różnych morfologii przy dwóch różnych średnicach włókien. Kategorie włókien morfologicznych składają się z włókien zorientowanych losowo, włókien wyrównanych i porowatych włókien przędzonych kriogenicznie o średnicach 1 μm i 5 μm. Metody wyszczególnione w tym badaniu są proponowane jako platforma do badania wpływu architektury włókien elektroprzędzonych na wytwarzanie tkanek. Zrozumienie tych efektów pozwoli naukowcom zoptymalizować właściwości mechaniczne włókien przędzonych elektrycznie i dokładniej zademonstrować potencjał tej technologii.

Introduction

Metody inżynierii tkankowej rozwinęły się w ostatnich dziesięcioleciach, aby zapewnić komórkom środowisko biomimetyczne w celu zachęcenia do udanej regeneracji tkanek, zarówno dla modeli tkanek in vitro, jak i technik regeneracyjnych in vivo. Metody te zazwyczaj zachęcają komórki do tworzenia agregatów 3D, samodzielnie lub za pomocą rusztowania prowadzącego¹. Rusztowania mogą być wytwarzane jako porowate lub włókniste nano/mikrostruktury polimerowe lub jako wysoce absorbujące wodę hydrożele^2,3,4. Elektroprzędzenie polimerów jest powszechną techniką wytwarzania, która pozwala uzyskać nietkane matryce z włókien polimerowych w nanomikroskali, które mogą naśladować włóknistą architekturę natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁵. W procesie elektroprzędzenia stosuje się wiele biokompatybilnych polimerów; W związku z tym włókna elektroprzędzione są popularnym medium ułatwiającym regenerację tkanek^6,7,8. Włókna elektroprzędzione zostały wykorzystane w hodowli wielu różnych tkanek, demonstrując obiecującą drogę dla niedrogich i powtarzalnych platform rusztowań^{9,10,11,12,13}.

Komórki mają wyostrzoną wrażliwość na swoje mechaniczne otoczenie. Wcześniejsze badania podkreśliły ten ważny związek, określany mianem mechanotransdukcji, który może wpływać na funkcjonowanie, morfologię i różnicowanie komórek^14,15. Podstawa eukariotycznego cytoszkieletu komórkowego jest zbudowana z nitkowatej aktyny i odgrywa kluczową rolę mechaniczną w podziale komórkowym, adhezji, migracji, skurczu i morfologii. Jest manipulowany przez zewnętrzne bodźce mechaniczne poprzez połączenie z zewnątrzkomórkowymi białkami powierzchniowymi^16,17,18. Morfologiczny wpływ na różnicowanie komórek macierzystych został wykazany w licznych badaniach poprzez zmianę kształtu dołączanego substratu, który jest następnie w stanie kontrolować kształt komórki i kierować procesem różnicowania^19,20. Co więcej, sztywność podłoża, do którego przyczepiają się komórki, również wpływa na los i linię komórek macierzystych^21,22. Oprócz komórek macierzystych, zaobserwowano również, że efekty te wpływają na komórki o różnych liniach^23,24. Trójwymiarowe metody inżynierii tkankowej wykazały wyniki podobne do tych, które znaleziono w badaniach mechanotransdukcji 2D zarówno z hydrożelami, jak i rusztowaniami fibrylarnymi^25,26,27. Co więcej, mechanika substratów jest komunikowana za pośrednictwem agregatów komórek 3D za pośrednictwem sygnalizacji komórka-komórka²⁸. Mechanika materiałowa odgrywa kluczową rolę w kierowaniu funkcjonalnością komórkową i dlatego powinna być głównym czynnikiem w projektowaniu rusztowań dla tkanek inżynieryjnych.

Celem tej metody jest zrozumienie wpływu wielkości i morfologii włókien polikaprolaktonu (PCL) elektroprzędzonych na hodowle komórkowe in vitro. Metoda ta została zaadaptowana z wcześniejszych badań skoncentrowanych na inżynierii tkankowej nerek⁹. Bardziej szczegółowy protokół krok po kroku jest tutaj oferowany w celu ułatwienia rekonstrukcji rusztowania i opracowania ustandaryzowanej metody, która ma zastosowanie do wszystkich typów komórek. Tą metodą skonstruowano sześć grup rusztowań: trzy to duże włókna 5 μm (LG), a pozostałe trzy małe włókna 1 μm (SM), przy użyciu różnych stężeń PCL. W obrębie tych grup LG i SM występują trzy różne konstrukcje morfologiczne: włókna losowe (RA), włókna wyrównane (AL) i porowate włókna kriogeniczne (CR). Wszystkie te grupy rusztowań mają z natury różne struktury, a tym samym zapewniają unikalne lokalne środowiska mechaniczne, do których przyczepiają się komórki. Aby zademonstrować efekt morfologiczny, jaki wywiera to na komórki, linię komórkową hepG2 wysiewano na każdej grupie rusztowań jako reprezentatywne badanie. Metoda ta jest oferowana jako analiza bazowa dla projektowania rusztowań elektroprzędzonych dla wszystkich typów komórek, od komórek macierzystych po linie komórkowe i komórki pierwotne.

Protocol

1. Przygotowanie roztworu

1. Duże (losowe, wyrównane i kriogeniczne) włókna
   1. Przygotować chloroform i metanol w stosunku 5:1, mieszając 50 ml chloroformu i 10 ml metanolu w szklanej butelce odpornej na rozpuszczalniki za pomocą szklanej pipety serologicznej.
      UWAGA: Chloroform i metanol są toksycznymi rozpuszczalnikami i mieszanie należy przeprowadzać w dygestorium.
   2. Aby uzyskać 19% w/v% roztwór PCL w chloroformie: metanol w proporcji 5:1, należy odważyć 1,9 g PCL i dodać do 10 ml chloroformu:metanolu w proporcji 5:1 w szklanej fiolce odpornej na rozpuszczalniki. Dwukrotnie zamknąć fiolkę folią parafinową i pozostawić fiolkę na rolce na noc, aby PCL całkowicie się rozpuścił.
      UWAGA: Mieszanie należy przeprowadzać w dygestorium.
2. Małe (losowe i wyrównane) włókna
   1. Aby przygotować 7% w/v% roztwór PCL w heksafluoroizopropanolu (HFIP), odważyć 0,7 g PCL i wymieszać z 10 ml HFIP w szklanej fiolce odpornej na rozpuszczalniki. Dwukrotnie zamknąć fiolkę folią parafinową i pozostawić na rolce na noc, aby PCL całkowicie się rozpuścił.
      UWAGA: HFIP jest wysoce toksyczny i mieszanie musi odbywać się w dygestorium.
3. Małe włókna kriogeniczne
   UWAGA: Mieszanie należy przeprowadzać w dygestorium.
   1. Przygotować chloroform i metanol w stosunku 3:1, mieszając 30 ml chloroformu i 10 ml metanolu w szklanej butelce odpornej na rozpuszczalniki za pomocą szklanej pipety serologicznej.
   2. Aby uzyskać 14% w/v% roztwór PCL w chloroformie: metanol w proporcji 3:1, odważ 1,4 g PCL i dodaj do 10 ml chloroformu:metanolu w proporcji 3:1 w szklanej fiolce odpornej na rozpuszczalniki. Dwukrotnie zamknąć fiolkę folią parafinową i pozostawić na rolce na noc, aby PCL całkowicie się rozpuścił.

2. Konfiguracja elektroprzędzenia

UWAGA: Parametry muszą być ustawione przed rozpoczęciem procesu elektroprzędzenia.

1. Rozmiar i umiejscowienie igły
   1. W przypadku dużych włókien (losowych, wyrównanych i kriogenicznych) użyj mosiężnej igły o średnicy zewnętrznej 1 mm / średnicy wewnętrznej 0,8 mm i umieść igłę w odległości 230 mm od powierzchni trzpienia.
   2. W przypadku małych włókien należy użyć mosiężnej igły o średnicy zewnętrznej 1 mm / średnicy wewnętrznej 0,4 mm i umieścić igłę w odległości 15 mm od powierzchni trzpienia.
2. Boczny ruch igły
   UWAGA: Rusztowania wyszczególnione w Rysunek 1 zostały wykonane z 100-milimetrowym trawersem igły z prędkością 50 mm/s, z powtarzającymi się ruchami w lewo i w prawo przez cały proces.
   1. Aby ustawić ruch boczny, naciśnij Ruch | TNS 1 i ustaw pozycję startową [mm] na -50, odległość [mm] na 100, prędkość [mm/s] na 50 i opóźnienie skrętu [ms] na 750.
3. Natężenie przepływu pompy strzykawkowej
   1. W przypadku dużych włókien (losowych, wyrównanych i kriogenicznych) naciśnij zakładkę Materiał w interfejsie użytkownika i ustaw pompę strzykawkową na 4 ml/h.
   2. W przypadku małych (losowych i wyrównanych) włókien ustaw pompę strzykawkową na 0,8 ml/h.
   3. W przypadku małych włókien kriogenicznych ustaw pompę strzykawkową na 2,5 ml/h.
4. Ustawienia napięcia
   1. W przypadku dużych światłowodów należy ustawić napięcie igły na +15 kV, a napięcie trzpienia na -4 kV, naciskając zakładkę Napięcie na interfejsie użytkownika i zmieniając wartości napięcia dodatniego i ujemnego.
   2. Dla małych (losowych i wyrównanych) włókien należy ustawić napięcie igły na +17 kV, a napięcie trzpienia na -4 kV.
   3. Dla małych włókien kriogenicznych należy ustawić napięcie igły na +18 kV, a napięcie trzpienia na -4 kV.
5. Obrót trzpienia (duże i małe włókna)
   1. W przypadku losowych włókien naciśnij Ruch | Wyceluj i ustaw prędkość obrotową trzpienia na 250 obr./min.
   2. W przypadku wyrównanych włókien ustaw prędkość obrotową trzpienia na 1,800 obr./min.
   3. W przypadku włókien kriogenicznych ustaw prędkość obrotową trzpienia na 180 obr./min.

3. Elektroprzędzenie losowych i wyrównanych włókien (dużych i małych włókien)

1. Włóż igłę (patrz rozdział 2.1 w celu uzyskania informacji na temat rozmiaru i umieszczenia igły) w rurkę PTFE o średnicy 1 mm i zabezpiecz w uchwycie igły elektroprzędzarki.
2. Pod wyciągiem przenieść 10 ml roztworu polimeru do strzykawki z polipropylenu lub szkła (odpornego na rozpuszczalniki). Upewnij się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki, pozostawiając strzykawkę na pozycji stojącej przed zalaniem.
3. Podłączyć strzykawkę do igły za pomocą rurki z PTFE i zamocować strzykawkę w pompie strzykawkowej. Po podłączeniu zalej rurkę PTFE, ściskając tłok strzykawki i napełniając rurkę roztworem polimeru.
4. Owiń trzpień folią aluminiową i przymocuj do urządzenia obracającego trzpień.
5. Włącz obrót trzpienia, naciskając Ruch | Cel | Obróć i pompę strzykawkową, naciskając Materiał | Uruchomić pompę 1.
6. Gdy na końcu igły utworzy się mała kulka polimeru, włącz napięcie, naciskając AKTYWUJ WYSOKIE NAPIĘCIE. Strumień polimeru powinien być następnie wyemitowany ze stożkowego występu roztworu polimeru, zwanego stożkiem Taylora. Sprawdź trzpień, aby potwierdzić osadzanie się włókien na powierzchni trzpienia.
7. Uruchom proces elektroprzędzenia, aż żądana ilość roztworu PCL zostanie elektroprzędzona.
   UWAGA: Dla rusztowań przedstawionych w klasie Rysunek 1, 4 ml roztworu było elektroprzędzone.
8. Po zakończeniu elektroprzędzenia należy zdjąć z trzpienia folię aluminiową pokrytą włóknem i pozostawić na noc w dygestorium, aby umożliwić nadmierne odparowanie rozpuszczalnika.
9. Po odparowaniu przechowuj włókna w temperaturze pokojowej (RT).

4. Elektroprzędzenie włókien kriogenicznych

1. Do kriogenicznego elektroprzędzenia należy użyć trzpienia krioprzędzalnego. Powtórz kroki 3.1-3.3, a następnie przejdź do następujących kroków.
2. Zawiń trzpień w folię aluminiową.
3. Napełnij trzpień granulkami suchego lodu. Przymocuj osłonę trzpienia kriowirującego do trzpienia, aby upewnić się, że suchy lód nie może wydostać się z trzpienia, ale ciśnienie może uciec. Kryształki lodu powinny tworzyć się na powierzchni trzpienia niemal natychmiast.
   UWAGA: Podczas pracy z suchym lodem należy używać rękawic ochronnych, aby uniknąć oparzeń zimnem.
4. Przymocuj trzpień do urządzenia obracającego trzpień i natychmiast włącz obrót trzpienia, naciskając Ruch | Cel | Obróć i pompę strzykawkową, naciskając Materiał | Uruchomić pompę 1.
5. Gdy na końcu igły utworzy się kulka polimeru, włącz napięcie, naciskając AKTYWUJ WYSOKIE NAPIĘCIE. Następnie powinien zostać wyemitowany strumień polimeru ze stożkowego występu roztworu polimeru (tj. stożka Taylora). Sprawdź trzpień, aby potwierdzić osadzanie się włókien na powierzchni trzpienia.
6. Po 1 godzinie elektrowirowania zatrzymaj proces, naciskając STOP ALL i uzupełnij trzpień suchym lodem. Zapewnić odpowiednią ochronę przed oparami rozpuszczalnika podczas napełniania trzpienia. Wykonaj to w sumie 3x, co daje łącznie 4 godziny łącznego czasu elektrowirowania.
   UWAGA: Elektrowirowanie można wznowić, powtarzając kroki 4.4 i 4.5.
7. Po zakończeniu elektrowirowania ostrożnie wyjmij trzpień i natychmiast umieść go w liofilizatorze na 24 godziny, aby sublimować kryształki lodu na powierzchni trzpienia.
8. Po sublimacji zdejmij folię pokrytą włóknem z trzpienia i przechowuj w temperaturze RT, uważając, aby nie zgniecić.

5. Uderzanie w rusztowania

1. Przebij rusztowania z arkusza włókien za pomocą stempla biopsyjnego 10−12 mm. Jeśli włókna pozostają przyklejone do folii aluminiowej, umieść rusztowania w 70% etanolu, aby ułatwić oderwanie.

6. Sterylizacja i powlekanie plazmowe

1. Umieść rusztowania (1 rusztowanie na studzienkę) na płytce 24 lub 48-dołkowej i umyj je 3x w 70% etanolu. Pozostaw zanurzone w końcowym praniu, wstaw do zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostaw do zamrożenia.
2. Po zamrożeniu umieść płytkę w liofilizatorze i liofilizuj przez 24 godziny. Wysuszone rusztowania mogą być teraz powlekane plazmą.
   UWAGA: Jeśli nie ma dostępu do powlekarki plazmowej, zanurzyć rusztowania w 1% antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (Anti-Anti) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pozostawić do inkubacji w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Umieść płytkę w komorze plazmowej i zdejmij pokrywę. Uruchom powlekarkę plazmową z prędkością 500 mTorr i średnią częstotliwością radiową (RF) przez 30 s.
4. Po pokryciu plazmowym zanurz rusztowania w 1 ml PBS i 1% Anti-Anti. Rusztowania powinny łatwo wchłonąć roztwór PBS.
   UWAGA: Rusztowania są teraz gotowe do zasiania komórkami.

7. Przygotowanie i zasiewanie komórek

UWAGA: Podstawowa technika hodowli komórkowej przedstawiona poniżej dotyczy komórek hepg2 używanych do celów demonstracyjnych w reprezentatywnych wynikach. Zasady te można zastosować do dowolnego przylegającego typu komórki; Jednak różne ogniwa mogą wymagać różnych materiałów i różnych procesów. Postępowanie z komórkami musi odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego, z zachowaniem techniki aseptycznej.

1. Weź 1 x 10⁶ kriokonserwowanych komórek hepg2 i wysiew do kolby do hodowli komórek T75 z 12 ml kompletnej pożywki składającej się z minimalnej ilości niezbędnych pożywek Eagle'a (EMEM) uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 5 mM L-glutaminy i 1% aminokwasów endogennych.
2. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odłącz komórki od kolby hodowlanej, przemywając 3x w PBS i inkubując w 2 ml trypsyny w temperaturze 37 °C przez 4 minuty. Po stuknięciu w kolbę komórki powinny się odczepić.
3. Dezaktywuj trypsynę, dodając 8 ml kompletnej pożywki. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować komórki w wirówce o stężeniu 120 x g przez 5 minut.
4. Usunąć supernatant znajdujący się nad osadem komórkowym za pomocą pipety zasysającej i zastąpić 5 ml kompletnej pożywki. Zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
5. Policz otrzymaną zawiesinę komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego. Weź 100 μl zawiesiny komórkowej i dodaj do 100 μl błękitu trypanowego w fiolce o pojemności 1,5 ml. Wprowadzić mieszaninę do hemocytometru pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym i policzyć komórki pod mikroskopem.
6. Dostosuj stężenie komórek do 2,6 x 10⁶ komórek/ml, dodając lub usuwając całe media. Aby usunąć pożywkę, odwiruj komórki o stężeniu 220 x g przez 5 minut, usuń wymaganą pożywkę i ponownie zawieś komórki.
7. Odessać 1% Anti-Anti in PBS z płytki dołka i wysiać 50 μl zawiesiny komórek 2,6 x 10⁶ komórek/ml na powierzchnię rusztowania za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
8. Pozostawić komórki do przyczepienia się w inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1-3 godziny, upewniając się, że nie wysychają. Po połączeniu dodać 300 μl (dla płytki 48-dołkowej) lub 500 μl (dla płytki 24-dołkowej) pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: Od tego momentu można stosować standardowe techniki hodowli komórkowych do czasu dalszej analizy funkcjonalnej.

Results

Rysunek 1 pokazuje obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) zarówno małych (~1 μm), jak i dużych włókien (~5 μm) wykonanych z roztworów PCL. Włókna były napylane złotem-palladem (60:40) przez 30 s przy użyciu napylarki przed obrazowaniem SEM. Duże włókna wyprodukowano przy użyciu wysokiego stężenia PCL 19 w/v% w roztworze chloroformu i metanolu w proporcji 5:1, aby stworzyć roztwór PCL o wysokiej lepkości. Ten roztwór o wysokiej lepkości był następnie elektroprzędzony przy dużym natężeniu przepływu, aby wyemitować dużą nić roztworu polimerowego w polu elektrycznym. W związku z tym konieczna była duża odległość 230 mm między igłą a trzpieniem, aby zapewnić skuteczne odparowanie rozpuszczalnika przed osadzeniem na trzpieniu. I odwrotnie, mniejsze włókna wyprodukowano przy użyciu niskiego stężenia 7 w/v% PCL w HFIP, aby stworzyć roztwór PCL o niskiej lepkości. Elektroprzędzenie roztworu PCL o niskiej lepkości przy niskim natężeniu przepływu zapewniło, że cieńsza nić roztworu PCL została wyemitowana z igły w polu elektrycznym. Cieńszy gwint ułatwiał szybsze odparowywanie rozpuszczalnika, a igła musiała znajdować się bliżej trzpienia na wysokości 70 mm, aby zapewnić stabilne osadzanie się włókien. W przypadku elektroprzędzenia małych włókien kriogenicznych zmiana roztworu PCL była konieczna, aby uzyskać niezawodny protokół. PCL w HFIP elektroprzędzony na trzpieniu kriogenicznym wielokrotnie powodował rozpad struktury włókien. Elektroprzędzenie o stężeniu 14 w/v% PCL w chloroformowym metanolu 3:1 rozwiązało ten problem; Spowodowało to jednak większą różnicę w rozmiarze włókien w całym rusztowaniu. Zakres wyrównania włókien (promień i orientacja światłowodu) dla każdego rusztowania został przeanalizowany za pomocą wtyczki ImageJ DiameterJ²⁹ i pokazany w Rysunek 2 i Rysunek 3.

Rysunek 1: Obrazy SEM przedstawiające cechy morfologiczne każdej grupy rusztowań. Górny rząd pokazuje małe włókna, a dolny rząd duże włókna. Grupy morfologiczne są wymienione od lewej do prawej odpowiednio jako włókna losowe, włókna wyrównane i włókna kriogeniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Dane dotyczące promienia światłowodu (po lewej) i orientacji światłowodu (po prawej) z wtyczki DiameterJ dla małego zestawu włókien. Morfologia wymieniona od góry do dołu odpowiednio jako włókna losowe, włókna wyrównane i włókna kriogeniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dane dotyczące promienia światłowodu (po lewej) i orientacji światłowodu (po prawej) z wtyczki DiameterJ dla dużego zestawu włókien. Morfologia wymieniona od góry do dołu odpowiednio jako włókna losowe, włókna wyrównane i włókna kriogeniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ta metoda zaoferowała nam zestaw rusztowań o sześciu wyraźnie różnych właściwościach rozciągania, określonych za pomocą maszyny do prób rozciągania zgodnie z wcześniej opisanymi metodami⁹. Jak pokazano w tabeli 1, moduły Youngsa w skali makro wahają się od 46,94 ± 3,48 MPa w dużych wyrównanych włóknach do 0,20 ± 0,01 MPa w dużych włóknach kriogenicznych. Fizjologiczne wartości sztywności tkanki wahają się od 100 Pa (tkanka nerwowa) do 2−4 GPa (tkanka kostna)³⁰; Wszystkie podane tutaj wartości sztywności rusztowania mieściły się w tym zakresie.

Rusztowanie	Moduł Youngsa (MPa) dla odkształcenia%
	0–2%	2–4%	4–6%	6–8%	8–10%
Sm. Ra	11,14 ± 2,13	9,31 ± 0,43	6,75 ± 0,64	4,75 ± 0,59	3,32 ± 0,40
Sm. Al	27,94 ± 8,63	od 28.27 ± 7.36	16.34 ± 4.87	9,10 ± 3,75	5,85 ± 3,11
SM.CR	0,27 ± 0,11	0,31 ± 0,44	0,31 ± 0,65	0,29 ± 0,59	0,26 ± 0,40
Lg. Ra	9,23 ± 0,78	8,22 ± 0,87	5,96 ± 0,68	3,96 ± 0,59	2,63 ± 0,45
Lg. Al	46,94 ± 3,48	38.03 ± 2.46	27,69 ± 1,22	16.10 ± 1.61	7,87 ± 1,32
LG.CR	0,20 ± 0,01	0,16 ± 0,01	0,12 ± 0,01	0,10 ± 0,01	0,09 ± 0,01

Tabela 1: Dane z prób rozciągania dla każdej grupy rusztowań w odstępach 2% odkształceń. SM. RA = Mały losowy, SM. AL = Mały wyrównany, SM. CR = Mały kriogeniczny, LG. RA = Duży losowy, LG. AL = Duży wyrównany i LG. CR = Duży kriogenik. Dane przedstawione jako średnia ± SD, n = 5.

Rysunek 4 pokazuje barwienie DAPI i falloidyny używane do wizualizacji morfologii komórek. Zastosowana metoda barwienia jest znana w literaturze^11,12. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu (Tabela Materiałów) z obiektywem o powiększeniu 40x. Obrazy pokazują, że wyrównane włókna wytworzone tą metodą wydłużyły morfologię komórek hepG2 i skierowały proliferujące komórki wzdłuż długości włókien, tworząc kierunkowość w kulturze komórkowej. W przeciwieństwie do tego, komórki hepG2 na losowych włóknach nie wykazywały kierunkowej proliferacji i wydłużenia obserwowanej w wyrównanych strukturach. Na losowych strukturach komórki hepG2 wykazywały bardziej regularną morfologię z wydłużonymi wypukłościami przyczepiającymi się do otaczających włókien PCL.

Rycina 4: DAPI (niebieskie) i falloidyna (zielone) barwione komórkami hepG2 na różnych morfologiach rusztowania: losowym (po lewej), wyrównanym (w środku) i kriogenicznym (po prawej). Górny rząd pokazuje małe włókna, a dolny rząd pokazuje duże włókna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Stworzenie różnych rozmiarów włókien osiągnięto dzięki połączeniu różnych rozpuszczalników, stężeń PCL i parametrów elektroprzędzenia. Rodzaj polimeru, jego masa cząsteczkowa i rozpuszczalnik silnie wpływają na lepkość i właściwości ładunkowe otrzymanego roztworu, a zatem mają duży wpływ na właściwości elektroprzędzenia³¹. Napięcia wyświetlane w tej metodzie mogą ulec zmianie w zależności od warunków, w jakich prowadzone jest elektroprzędzenie. Temperatura i wilgotność wpływają na zachowanie procesu elektroprzędzenia³². Dlatego zaleca się, aby czytelnik był przygotowany na zmianę napięcia, aby przeciwdziałać wszelkim przeszkodom i uzyskać stabilny stożek Taylora. Zaleca się umieszczenie elektroprzędzarki w obudowie do kontroli środowiskowej, aby zmniejszyć zmienność między partiami w procesie elektroprzędzenia.

Osiągnięcie różnych morfologii przedstawionych w tej metodzie jest możliwe dzięki możliwościom urządzenia do elektroprzędzenia IME. Trzpień o zmiennej prędkości jest niezbędny do kontrolowania wyrównania włókien. Obrót trzpienia przy niskich obrotach na minutę (<250 obr./min) daje losowo zorientowane włókna ze względu na zachowanie strumienia polimeru. Kiedy naładowany roztwór polimeru jest emitowany z igły, ładunki wewnętrzne i siły aerodynamiczne wywołują chaotyczny efekt biczowania, który jest wykorzystywany do ułożenia chaotycznego układu włókien na trzpieniu^33,34. Ten efekt ubijania można zniwelować, zwiększając prędkość obrotową trzpienia powyżej 1 800 obr./min. Włókna osadzone na trzpieniu o tak wysokiej prędkości obrotowej wykazują wyrównaną strukturę, ponieważ prędkość powierzchniowa jest wystarczająca, aby skutecznie przeciwdziałać wszelkim ruchom poprzecznym wykazywanym przez włókno biczowe. Ważne jest, aby pamiętać, że gdy stosowane są wysokie prędkości trzpienia, może to zakłócić otaczające powietrze, co może mieć niekorzystny wpływ na produkcję stabilnego stożka Taylora.

Wysoce porowate rusztowania kriogeniczne powstają poprzez wypełnienie trzpienia suchym lodem w temperaturze -78,5 °C. Obniża to temperaturę trzpienia i sprzyja kondensacji i zamarzaniu kropelek wody na powierzchni. Utworzone kryształy wykazują piki, które wyłaniają się z powierzchni trzpienia, a włókna są osadzane w szczytach. Po sublimacji kryształków lodu na trzpieniu^35,36 pozostaje porowata struktura włókien. Waga i kruchość kryształów ograniczają zdolność do tworzenia porowatych, wyrównanych włókien, ponieważ zbyt wysokie prędkości trzpienia (>250 obr./min) powodują odrywanie się kryształów i włókien od trzpienia z powodu nadmiernych sił dośrodkowych i aerodynamicznych. Możliwe jest napotkanie trudności z tą metodą ze względu na kruchość powstałych struktur. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z trzpieniem, a także podczas późniejszego przenoszenia rusztowań, ponieważ struktury są podatne na spłaszczanie się podczas ściskania i składania podczas wyjmowania z płynów. Istnieje również możliwość, że rozwiązania, które z powodzeniem elektrowirują bez trzpienia kriogenicznego, mogą zostać śmiertelnie zakłócone przez zmianę temperatury i struktury krystaliczne. Podczas kriowirowania ilość lodu tworzącego się na powierzchni trzpienia jest w dużym stopniu zależna od wilgotności, co powoduje zmienność końcowego wyniku. Dlatego zdecydowanie zaleca się przechowywanie procesu elektroprzędzenia w obudowie do kontroli środowiska.

Aby ocenić wydajność komórkową na tych rusztowaniach, konieczne jest wcześniejsze wysterylizowanie materiału. Dostępnych jest wiele opcji sterylizacji polimerów, w tym metody chemiczne, metody promieniowania i metody oparte na cieple^37,38. Ważne jest, aby ocenić skuteczność każdej metody i przydatność zarówno do zastosowania materiału, jak i do samego materiału. Protokół ten wykorzystuje sterylizację w 70% etanolu przed liofilizacją, obróbką plazmową i zanurzeniem w 1% roztworze Anti-Anti. Zastosowanie etanolu pozwala na denaturację i odwodnienie białek i mikroorganizmów, nie zakłócając przy tym materiału PCL³⁷. Użycie silniejszych rozpuszczalników może spowodować rozpuszczenie PCL. Powlekanie plazmowe zostało włączone do tej metody przede wszystkim w celu zwiększenia hydrofilowości PCL, który jest notorycznie hydrofobowy, i poprawy przyczepiania komórek^39,40. Dogodnie działa to również jako dodatkowy etap sterylizacji, ale należy zachować ostrożność, aby utrzymać rusztowania w sterylnym środowisku przed i po obróbce plazmowej. Metoda ta okazała się odpowiednia do badań in vitro z pożywkami poddanymi działaniu antybiotyków. Jednak w przypadku zastosowań in vivo należy rozważyć bardziej niezawodne opcje, takie jak tlenek etylenu (EtO) i ekspozycja na promieniowanie gamma. Po przeprowadzeniu sterylizacji komórki można wysiać na rusztowanie, a standardowe techniki hodowli komórkowych można zastosować w celu utworzenia kultur komórkowych 3D in vitro.

Należy zauważyć, że wartości sztywności należy przypisać różnym mikrostrukturom utworzonym w rusztowaniach. Materiał sypki (PCL) pozostaje niezmienny między rusztowaniami. W związku z tym sztywność materiału sypkiego nie zmienia się między grupami. Rusztowania kriogeniczne wykazują znacznie niższą sztywność niż inne grupy ze względu na ograniczoną łączność w matrycy światłowodowej, co można zobaczyć w tabeli 1. Uważa się, że zmniejszona łączność indukuje deformację bardziej zdominowaną przez zginanie, w przeciwieństwie do deformacji zdominowanej przez rozciąganie w strukturze włóknistej⁴¹. Co ciekawe, sztywność rusztowania nie jest silnie zależna od wielkości włókien w grupach losowych i kriogenicznych. Jednak sztywność wzdłużna wyrównanych włókien wykazuje znacznie większą zależność od wielkości włókien, przy czym moduł Youngsa przy odkształceniu 0-2% wynosi 27,94 ± 8,63 MPa dla małych włókien i 46,94 ± 3,48 MPa dla dużych włókien. Ze względu na rozciągający charakter próby rozciągania, oznacza to większą masową gęstość PCL w przekroju wzdłużnym. Konieczne jest powtórzenie, że przedstawione tutaj dane mechaniczne są makroskalowym mechanicznym obrazem architektur włóknistych. Dalsza charakterystyka mikromechaniczna byłaby korzystna, aby w pełni zrozumieć mechaniczne wpływy na skalę komórkową.

W tej metodzie uwzględniono zarówno losowe, jak i dopasowane architektury, aby zapewnić porównanie morfologii izotropowych i anizotropowych. Zakres wyrównania włókien można zaobserwować na obrazach SEM na rysunku 2 oraz w analizach włókien przedstawionych na rysunku 2 i rysunku 3. Właściwości anizotropowe obserwuje się w wielu tkankach organizmu. W szczególności jest to powszechnie obserwowane w wyrównanych strukturach komórkowych, takich jak te znajdujące się w tkankach mięśniowych i nerwowych. Wyrównane struktury włókien polimerowych oferują możliwość rekapitulacji tych wyrównanych struktur in vitro^42,43. Jak opisano wcześniej, funkcja komórki jest wrażliwa na zmiany morfologiczne i mechaniczne, dlatego należy przeprowadzić dalszą analizę funkcjonalną na komórkach związanych z rusztowaniem w celu określenia wpływu biologicznego każdego typu rusztowania.

W porównaniu z innymi istniejącymi technikami wytwarzania rusztowań, metoda ta zapewnia prosty sposób wytwarzania struktur rusztowań w mikroskali przy stosunkowo wysokiej kontroli nad właściwościami mechanicznymi i morfologią. Alternatywne metody wytwarzania rusztowań PCL, takie jak separacja faz, ługowanie soli i spienianie gazowe, pozwalają na kontrolę morfologiczną pod względem pustej przestrzeni i wielkości porów. Jednak pory i geometria konstrukcyjna pozostają w dużej mierze takie same 44,45,46,47. Dlatego cechy takie jak poziom izotropii nie mogą być zmienione tak łatwo w porównaniu z elektroprzędzeniem. Materiały hydrożelowe, popularne w produkcji rusztowań, zapewniają środki do zmiany sztywności podłoża polimerowego poprzez zmianę poziomu usieciowanych łańcuchów polimerowych⁴⁸. Możliwe jest również drukowanie 3D różnymi metodami, zapewniając doskonałą kontrolę nad morfologią⁴⁹. Jednak osiągnięcie rozdzielczości skali elektroprzędzenia w biokompatybilnych materiałach hydrożelowych pozostaje wyzwaniem do praktycznego wdrożenia^50,51. Rusztowania elektroprzędzone były powszechnie wykorzystywane w badaniach nad inżynierią tkankową w ciągu ostatniej dekady, a wprowadzenie nowych materiałów i zastosowań z różnymi typami komórek jest zawsze badane. Podczas gdy nowe materiały są stale opracowywane na potrzeby rusztowań elektroprzędzenia, nadal istnieją możliwości dalszej charakterystyki biologicznej istniejących materiałów i metod elektroprzędzenia. Opisana metoda jest proponowana jako metoda ułatwiająca prowadzenie badań biologicznych in vitro, ponieważ ma bezpośrednie zastosowanie do podstawowych technik hodowli komórkowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dziurkacz do biopsji 10 mm	Acuderm	P1025
15 ml Probówka Falcon	Thermo-scientific	339650
20 ml szklana fiolka	Fisherbrand	11513542
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Greiner Bio-one	677180
Anti-Anti 100X	Gibco	15240062
Chloroform	Acros Organics
DAPI	Sigma-aldrich	D9542
Eagles Minimum Essential Media	Gibco	11090081
Electrospinner	IME Technologies	EC-DIG
Płodowa surowica bydlęca	GE Healthcare	SH30071.03
Złoto-palladowa powlekarka do napylania	Emscope	SC500A
HepG2 linia	Sigma-aldrich	85011430
Heksafluoroisopropanol (HFIP)	Manchester Organics	G26383
L-glutamina 200 mM	Gibco	25030081
MEM Aminokwasy endogenne	Gibco	11140050
Metanol	Acros Organics	11984591
Penicylina-Streptomycyna 10 000 U/ml	Gibco
Phalloidin	Abcam	ab176754
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-aldrich	P4417-100TAB
Powlekarka plazmowa	Harrick Plasma	PDC-002
Polikaprolakton (średnio MW 80 000)	Sigma-aldrich	440744
Strzykawka PTFE	Fisherbrand	12941031
Skaningowy mikroskop elektronowy	Hitachi	S4700
T75 Kolba hodowlana	Corning	CLS430641
Trypan niebieski (0,4%)	Gibco	15250061