Artykuł metodologiczny

Mielinizacja i remielinizacja ex vivo w kulturach warstwowych móżdżku jako model ilościowy dla manipulacji rozwojowych i związanych z chorobą

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61044

⸱

12 czerwca 2020

 , 
1Department of Neuroscience, Genentech Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany jest protokół dla ilościowego modelu demielinizacji i remielinizacji ex vivo przy użyciu mysich kultur móżdżku. Metoda ta ściśle odwzorowuje model in vivo z pełnym zestawem typów komórek OUN w nienaruszonej tkance, przy jednoczesnym zachowaniu chemicznej, genetycznej i środowiskowej łagodności systemu in vitro.

Streszczenie

Badanie mielinizacji in vitro i in vivo stawia wiele wyzwań. Różnicowanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) in vitro, choć skalowalne, nie podsumowuje mielinizacji aksonów. Kokultury neuronów OPC i hodowle włókien OPC pozwalają na badanie mielinizacji in vitro, ale brakuje w nich dodatkowych typów komórek, które są obecne in vivo, takich jak astrocyty i mikroglej. Modele myszy in vivo są jednak mniej podatne na manipulacje chemiczne, środowiskowe i genetyczne oraz są znacznie bardziej pracochłonne. W tym miejscu opisujemy system ilościowy hodowli warstw móżdżku myszy ex vivo (CSC), który jest przydatny do: 1) badania mielinizacji rozwojowej, 2) modelowania demielinizacji i remielinizacji oraz 3) prowadzenia badań translacyjnych. Strzałkowe odcinki móżdżku i tyłomózgowia izoluje się od myszy 0-2 w dniu pourodzeniowym (P), po czym mielinizują się ex vivo przez 12 dni. W tym okresie plastrami można manipulować na różne sposoby, w tym dodawać związki w celu zbadania wpływu na mielinizację rozwojową. Ponadto tkankę można utrwalić do mikroskopii elektronowej w celu oceny ultrastruktury i zagęszczenia mieliny. Aby modelować chorobę, CSC można poddać ostremu niedotlenieniu w celu wywołania hipomielinizacji. Demielinizacja w tych eksplantatach może być również indukowana przez lizolecytynę, co pozwala na identyfikację czynników sprzyjających remielinizacji. Oprócz modyfikacji chemicznych i środowiskowych, CSC można wyizolować od myszy transgenicznych i reagują one na manipulacje genetyczne wywołane adenowirusami Ad-Cre i tamoksyfenem. Tak więc kultury warstwowe móżdżku są szybkim, powtarzalnym i wymiernym modelem rekapitulacji mielinizacji.

Wprowadzenie

mielinizacja aksonów umożliwia szybką propagację potencjałów czynnościowych, mechanizm znany jako przewodnictwo solne1. Znaczenie mieliny podkreślają choroby demielinizacyjne, takie jak stwardnienie rozsiane (SM), które obejmują szeroki zakres wyniszczających objawów, w tym utratę wzroku, problemy poznawcze i paraliż. Nie ma lekarstwa na stwardnienie rozsiane, a obecne terapie koncentrują się na ograniczaniu postępu choroby poprzez celowanie w obwodowe komórki odpornościowe. Uważa się, że niepełnosprawność w stwardnieniu rozsianym i chorobach pokrewnych jest spowodowana niepowodzeniem remielinizacji i postępującą neurodegeneracją. W szczególności demielinizację, atrofię i utratę aksonów obserwuje się w postępującym MS2,3. W związku z tym promowanie remielinizacji stanowi obiecującą strategię, która może być realizowana równolegle z obecnymi terapiami i przynieść dodatkowe korzyści terapeutyczne.

W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) mielinizacja jest przeprowadzana przez wyspecjalizowane komórki glejowe znane jako oligodendrocyty. Komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) różnicują się w dojrzałe, mielinizujące oligodendrocyty poprzez szereg wysoce zaaranżowanych etapów, w tym wzrost procesów stykających się z aksonami, wzrost złożoności morfologicznej, rozszerzenie błony mielinowej i wreszcie zagęszczenie osłonki mielinowej4. Tak więc interakcja między oligodendrocytami a neuronami jest bardzo intymna. Wzajemne interakcje między neuronami a oligodendrocytami są również wymagane dla zdrowia i utrzymania klasy CNS2. Aktywność aksonalna odgrywa rolę w stymulowaniu mielinizacji, a glejowe czynniki neurotroficzne wspierają integralność neuronów. Coraz częściej dostrzegane jest również znaczenie przesłuchów gleju-gleju w OUN5,6,7,8. Na przykład czynniki astrocytowe mogą wpływać na różnicowanie OPC i utrzymanie dróg istoty białej. Mikroglej odgrywa również rolę w modulowaniu różnicowania OPC, a także w usuwaniu resztek mieliny, co jest ważnym etapem procesu remielinizacji. Identyfikacja czynników autonomicznych dla komórek i zrozumienie wpływu innych typów komórek OUN na demielinizację i remielinizację będzie nieocenione dla opracowania terapii chorób demielinizacyjnych i dysmielinizacyjnych.

Tutaj opisujemy system ex vivo wykorzystujący mysie kultury plastrów móżdżku (CSC), który pozwala na manipulację i kwantyfikację nienaruszonej tkanki OUN. Zastosowanie CSC umożliwia mielinizację lub remielinizację po indukcji demielinizacji przez lizolecytynę9,10, przy użyciu metod tradycyjnie stosowanych w badaniach in vivo, takich jak barwienie immunologiczne i mikroskopia elektronowa11,12,13. Lizolecytyna jest substancją chemiczną naruszającą błonę, która powoduje szybką utratę mieliny i oligodendrocytów. Potencjalnym zastrzeżeniem, na które należy zwrócić uwagę, jest to, że lizolecytyna może również powodować redukcję innych typów komórek w pobliżu obszaru zmiany. Jednak w przeciwieństwie do eksperymentów in vivo, strzałkowymi wycinkami móżdżku można łatwo manipulować poprzez dodawanie związków lub modyfikować genetycznie za pomocą adenowirusów Ad-Cre. Metoda pozwala również na manipulowanie wyizolowaną tkanką od myszy transgenicznych lub myszy poddanych zniewagom środowiskowym, takim jak hipoksja11,12,13,14. Model CSC pozwala zatem na badanie mielinizacji rozwojowej, modelowanie choroby i identyfikację czynników, które promują lub hamują mielinizację, jednocześnie integrując wkład różnych typów komórek OUN w funkcję oligodendrocytów.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały autoryzowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Genentech.

1. Przygotowanie pożywek i materiałów do sekcji (~30–45 min)

  1. Przygotować i sterylnie przefiltrować pożywkę do hodowli warstw (SCM) i pożywkę do rozwarstwiania (DM), jak wyszczególniono w Tabeli 1. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Jeśli jakiekolwiek czynniki są testowane do testu mielinizacji, dodaj je do SCM tuż przed użyciem.
  2. Odpipetować 1 ml SCM do każdego dołka na płytce 6-dołkowej.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wkładkę organotypową w każdym dołku, upewniając się, że pod membraną nie utknęły pęcherzyki. Ogrzać płytkę z podłożem w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 7,5% CO2 .

2. Przygotowanie obszaru sekcji (~5–10 min)

  1. Wykonuj zabiegi w sterylnym okapie z przepływem laminarnym lub na blacie stołu z zachowaniem odpowiednich technik aseptyki na wszystkich etapach procedury. Wytrzyj wszystkie obszary do czysta 70% etanolem.
  2. Umieść nowe ostrze i silikonowy stolik do cięcia na rozdrabniaczu tkanek. Odpipetuj ~300 μL sterylnej wody lub 70% etanolu pod etapem cięcia, aby upewnić się, że pozostaje na swoim miejscu.
  3. Użyj bawełnianego wacika, aby delikatnie przetrzeć ostrze siekacza do tkanek i etap cięcia 70% etanolem. Wysuszyć przed użyciem rozdrabniacza do tkanek.
  4. Spryskaj wszystkie narzędzia do preparacji 70% etanolem i wysusz przed preparacją.
  5. Przygotuj dwie 10-centymetrowe szalki Petriego: jedną z 15–20 ml s.m., drugą z 10 ml SCM. Przechowywać na lodzie. Utrzymuj wszystkie podłoża i szalki Petriego na lodzie, gdy nie przeprowadzasz sekcji.

3. Sekcja kultur móżdżku (~15–20 min na szczeniaka)

  1. Umieść szalkę Petriego z DM pod mikroskopem preparacyjnym.
  2. Poddaj eutanazji młode myszy, dzień po urodzeniu P0-2, poprzez szybkie ścięcie głowy ostrymi nożyczkami.
  3. Umieść głowę na szalce Petriego z cukrzycą pod mikroskopem preparacyjnym, aby usunąć krew.
  4. Za pomocą cienkich nożyczek przetnij raz każdą boczną krawędź u podstawy czaszki.
  5. Trzymając głowę do góry nogami w DM, mocno dociśnij spód czaszki za pomocą kleszczy #5/45, wpychając nieuszkodzone tyłomózgowie przez otwór w czaszce.
  6. Pod mikroskopem preparacyjnym odetnij nadmiar tkanki za pomocą dwóch skalpeli #11. Upewnij się, że móżdżek pozostaje przyczepiony do leżącego poniżej fragmentu tyłomózgowia. Zobacz rysunek 1A, aby uzyskać szczegółowy schemat.
  7. Za pomocą szpatułki przenieś móżdżek do etapu cięcia rozdrabniacza tkanek z tkanką spoczywającą na powierzchni rostralnej tyłomózgowia i ogonowej powierzchni tyłomózgowia skierowanej w stronę badacza. Upewnij się, że przyśrodkowa płaszczyzna mózgu jest dokładnie równoległa do ostrza rozdrabniacza tkanek.
  8. Za pomocą pipety P200 usuń nadmiar podłoża wokół tkanki, upewniając się, że jest ono nadal wilgotne, ale nie unosi się na wodzie ani nie jest otoczone cieczą.
  9. Zamień szalkę Petriego zawierającą DM na szalkę Petriego zawierającą SCM pod mikroskopem preparacyjnym
    10. .
  10. Pokrój tkankę na plastry o grubości 350 μm za pomocą rozdrabniacza do chusteczek.
    UWAGA: Prędkość ostrza (np. około jednego cięcia na sekundę) i siła muszą być zoptymalizowane, aby zapewnić optymalne warunki cięcia. W rzadkich przypadkach tkanka zostanie zaczepiona o ostrze. Aby zminimalizować utratę skrawków tkanki, trzymaj kciuk na przycisku zasilania, aby w razie potrzeby szybko wyłączyć rozdrabniacz tkanek.
  11. Delikatnie odpipetuj 100 μl SCM pod chusteczkę, aby plastry unosiły się na wodzie. Przenieść pokrojoną tkankę za pomocą szpatułki na szalkę Petriego za pomocą SCM pod mikroskopem preparacyjnym.
  12. Użyj bawełnianego wacika, aby delikatnie przetrzeć ostrze siekacza do tkanek i etap cięcia 70% etanolem.
  13. Za pomocą skalpeli (strona) delikatnie oddziel plastry pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą skalpela i szpatułki przenieś plastry na membranę w płytce 6-dołkowej za pomocą SCM.
    UWAGA: Najbardziej przyśrodkowe odcinki często mają najlepszą mielinizację i integralność tkanek. Średnio z jednego mózgu myszy można wyciąć 4–6 plasterków.
  14. Inkubować plastry w SCM w temperaturze 37 °C w 7,5% CO2 .

4. Zmiany w kulturze i mediach (~15–30 min)

  1. Wymieniaj SCM co drugi dzień.
  2. Odpipetować 1 ml świeżej pożywki do każdego dołka nowej płytki 6-dołkowej i ogrzać w inkubatorze. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś membrany na nową płytkę, upewniając się, że pod spodem nie ma pęcherzyków. Włożyć płytki z powrotem do inkubatora.

5. Standardowa mielinizacja i remielinizacja

  1. Standardowy protokół mielinizacji (ryc. 1B).
    1. Wycinki kultury wypreparowane w sekcji 3 od 0 do 12 dni in vitro (DIV). Jeśli badany jest wpływ któregokolwiek czynnika na mielinizację, należy dodać go do pożywki w momencie hodowli (0 DIV) i uzupełniać przy każdej zmianie pożywki.
    2. Poprawka w 12 DIV (krok 7.1), punkcie czasowym zoptymalizowanym pod kątem niekompletnej mielinizacji11,12,13. Pozwala to na wykrycie wszelkich efektów wzmacniających lub blokujących mielinizację ze względu na czynnik dodany do pożywki. Reprezentatywny wynik dodatni po dodaniu 100 ng/ml aktywiny A pokazano na rysunku 2.
  2. Protokół remielinizacji (rysunek 1C)
    1. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem mielinizacji opisanym w sekcji 5.1 bez dodatkowych czynników do 14 DIV, momentu, w którym warstwy są w pełni zmielinizowane11,12,13.
    2. Przygotować zapas lizolecytyny (125 mg/ml) zgodnie z tabelą 1. Odpipetować 1 ml 0,5% lizolecytyny w SCM do każdego dołka nowej płytki 6-dołkowej i ogrzać w inkubatorze.
    3. Przenieś membrany na płytkę lizolecytyny i umieść w inkubatorze na noc na 16–18 godzin.
    4. Następnego dnia przygotuj nowe płytki ze świeżym SCM, dodając w razie potrzeby dowolny czynnik (czynniki) badany pod kątem efektów remielinizacji. Ciepłe talerze w inkubatorze.
    5. Aby zmienić pożywkę, delikatnie postukaj w membranę z boku studzienki, aby upewnić się, że całe podłoże lizolecytyny zostało usunięte. Uzupełniać badany czynnik(-i) przy każdej zmianie pożywki (sekcja 4).
    6. Napraw wycinki na 28 DIV (krok 7.1), punkcie czasowym zoptymalizowanym pod kątem niepełnej remielinizacji. Pozwala to na wykrycie wzmocnienia lub zablokowania remielinizacji ze względu na czynnik dodany do pożywki. Reprezentatywny wynik dodatni z dodatkiem 0,1 μM XAV939 przedstawiono na rysunku 3.

6. Zmiany w protokole mielinizacji i remielinizacji

  1. Protokół hipmielinizacji wywołanej niedotlenieniem (Rysunek 1D)11,13.
    UWAGA: Jest to przedstawione jako odmiana standardowego protokołu mielinizacji przedstawionego w sekcji 5.1.
    1. Plastry talerzowe w SCM bez czynników.
    2. Przenieść płytki z plastrami do inkubatora do hipoksyi (2% FiO2) na 24 godziny między 2–3 działkami.
    3. Następnego dnia przygotuj nowe płytki ze świeżym SCM, dodając w razie potrzeby dowolny czynnik(i) badany pod kątem potencjału mielinizacji. Ciepłe talerze w inkubatorze.
    4. Po posiewie w hipoksji zmienić pożywkę (sekcja 4) i zwrócić kultury do standardowego inkubatora hodowli (37 °C, 7,5% CO2 ). Uzupełniać wszystkie badane czynniki przy każdej kolejnej wymianie pożywki (sekcja 4).
    5. Napraw na 12 DIV (krok 7.1).
  2. Protokół manipulacji genetycznej (Rysunek 1E)13
    1. Wyizolować tkankę od myszy transgenicznych w celu wycięcia, jak w sekcji 3.
    2. W przypadku indukowalnych linii transgenicznych myszy, tamoksyfen (100 nM, dawka, która nie indukuje mielinizacji ani różnicowania OPC) lub adenowirus Ad-Cre mogą być dodawane do SCM podczas zmian pożywki dokonywanych w 1 DIV i 3 DIV.
    3. Po manipulacji genetycznej tamoksyfenem lub adenowirusem Ad-Cre należy kontynuować zmianę pożywki co drugi dzień, jak w punkcie 4 (w razie potrzeby dodając czynniki).
      UWAGI: Wszystkie plasterki z jednej myszy zmieszczą się na jednej błonie, co pozwoli na genotypowanie po sekcji, co ułatwi przeprowadzanie eksperymentów na transgenicznych myszach.

7. Przetwarzanie i analiza tkanek

  1. Utrwal plastry, delikatnie zanurzając membranę w 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Delikatnie spłukać, zanurzając w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Następnie zanurz w PBS w płytce 6-dołkowej.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Stałe plastry można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca. Jeśli nie przechowujesz plastrów, opłucz 2x w PBS przez 5 minut przed kontynuowaniem.
  3. Użyj skalpela, aby wyciąć membranę z pierścienia i przystąp do barwienia na płytce 6-dołkowej. Pamiętaj, aby trzymać plastry skierowane do góry (membraną do dołu) w celu barwienia i późniejszego montażu na szkiełkach.
  4. Blokuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w roztworze blokowym (3% inaktywowana termicznie surowica końska, 2% albumina surowicy bydlęcej i 0,25% Triton-X 100 rozcieńczony w PBS).
    UWAGA: Jeśli do barwienia przeciwciał konieczne jest pobranie antygenu (np. CC1/Olig2), można to zrobić na szklanych szalkach Petriego.
  5. Owinąć płytki folią parafinową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w roztworze blokującym.
  6. Umyć 3x w roztworze blokującym: 1) krótkie płukanie, 2) 15 min mycie i 3) 1 h mycia. W celu krótkiego płukania napełnij małą szalkę Petriego roztworem i delikatnie zanurz membranę za pomocą kleszczy przed przeniesieniem do świeżego roztworu. W przypadku dłuższych myć (tj. 15 min i 1 h) zanurz membranę w roztworze w płytce 6-dołkowej i umieść na delikatnym kołysku.
  7. Inkubować pod przykryciem od światła przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w przeciwciałach drugorzędowych rozcieńczonych w stosunku 1:500 w PBS.
  8. Prać 3x w PBS: 1) krótkie płukanie, 2) 15 min mycie i 3) 1 h prania.
  9. Jeśli potrzebne jest barwienie DAPI, zanurz w roztworze DAPI w stosunku 1:1,000 w temperaturze pokojowej na 7 minut. Spłucz krótko, a następnie myj przez 15 minut w PBS.
  10. Spłucz w wodzie podwójnie destylowanej.
  11. Zamontuj membrany na szkiełku z plastrami skierowanymi do góry (membraną do dołu).
    UWAGA: Zamontowane plastry można przechowywać w temperaturze 4 °C. Obrazowanie pod mikroskopem konfokalnym najlepiej wykonać w ciągu 1 tygodnia, zanim membrana stanie się nieprzezroczysta i trudna do zobrazowania.
  12. Plasterki obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej i ilościowe określanie zgodnie z wcześniejszym opisem11,12,13.

Wyniki

Kultury warstw móżdżku pochodzące od myszy P0-2 (Rysunek 1A) zostały wykorzystane do badania mielinizacji i oceny efektów dodania różnych czynników z 0-12 DIV (Rysunek 1B). Aby zbadać remielinizację, kultury warstwowe w 14 DIV najpierw zdemielinizowano lizoletyną i pozostawiono do remielinizacji przez 14 dodatkowych dni w hodowli z badanymi czynnikami (Figura 1C), po czym remielinizację określono ilościowo. Wpływ hipoksji na mielinizację badano również poprzez umieszczenie kultur warstwowych w inkubatorze hipoksyjnym FiO2 2% na 24 godziny, od 2-3 DIV (Figura 1D). Na koniec wykorzystano kultury warstwowe pochodzące od myszy transgenicznych do zbadania wpływu nokautów genów na mielinizację. W tym systemie rekombinację Cre indukowano przez dodanie tamoksyfenu lub adenowirusa Ad-Cre w 1 DIV i 3 DIV oraz kultur warstwowych ustalonych do analizy w 12 DIV (Figura 1E). Po utrwaleniu tkanek przeprowadzono kwantyfikację demielinizacji i remielinizacji za pomocą barwienia immunologicznego (ryc. 2, ryc. 3) i mikroskopii elektronowej11,12,13.

Reprezentatywne dane pokazane (Rysunek 2, Rysunek 3) ilustrują dynamiczny zakres mielinizacji i remielinizacji w kulturach warstwowych. Wskaźnik mielinizacji określono ilościowo za pomocą stosunku Caspr, markera przywęzłowego, który jest pośrednim odczytem zwartej mieliny, do białka neurofilamentu H (NFH), które barwi aksony. Ten wskaźnik mielinizacji został zweryfikowany pod kątem tworzenia zwartej mieliny za pomocą mikroskopii elektronowej i barwienia kanału sodowego12. Demielinizacja wywołana lizolecytyną 9,10 doprowadziła do całkowitego zaniku parawęzłów Caspr-dodatnich (wskaźnik mielinizacji = 0, Rysunek 3A) i utraty zwartej mieliny, która została przywrócona podczas remielinizacji11,12.

Aby wykazać pozytywny wynik mielinizacji, plastry hodowano z Activin A zgodnie z harmonogramem przedstawionym na rysunku 1B. Aktywina A angażuje receptory aktywiny na oligodendrocytach i napędza różnicowanie oligodendrocytów oraz zagęszczenie mieliny15. Reprezentatywne dane pokazują, że traktowanie plastrów 100 ng/ml aktywiny A podczas mielinizacji skutkowało wyższym wskaźnikiem mielinizacji (ryc. 2A, B). W związku z tym, leczenie aktywiną A przyspieszyło różnicowanie OPC, co określono ilościowo za pomocą stosunku dojrzałych oligodendrocytów CC1-dodatnich do komórek linii oligodendrocytów Olig2 + 11,13 (Figury 2C,D).

Wykazano, że małocząsteczkowy inhibitor tankyrazy, XAV939, wspomaga mielinizację i remielinizację poprzez stabilizację poziomu Axin2 w oligodendrocytach11. Po leczeniu lizolecytyną demielinizację zwizualizowano i określono ilościowo w kulturach plastrów przez barwienie fragmentarycznym podstawowym białkiem mieliny (MBP) i brak parawędzi Caspr-dodatnich (ryc. 3A). Leczenie 0,1 μM XAV939 podczas remielinizacji (15-28 DIV) znacznie zwiększyło wskaźnik mielinizacji w porównaniu z kontrolami nośnika, co określono ilościowo za pomocą stosunku barwienia Caspr do NFH (ryc. 3B, C). Model hodowli warstwowej może być zatem wykorzystany do zbadania i ilościowego określenia wpływu na różnicowanie OPC, mielinizację i remielinizację w nienaruszonej tkance.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat kultur warstw móżdżku przedstawiający kluczowe etapy procesu preparacji i ramy czasowe dla różnych protokołów hodowli warstw. (A) Przedstawienie etapów generowania kultur warstwowych: preparacja mózgów młodych myszy P0-2, przycinanie mózgu (jak pokazano), cięcie mózgu rozdrabniaczem tkanek w celu wytworzenia plastrów strzałkowych o wielkości 350 μm, umieszczanie wycinków na wkładkach do kultur organotypowych w naczyniu 6-dołkowym i inkubacja w temperaturze 37 °C i 7,5% CO2 . * oznacza móżdżek. (B) Kalendarium dla mielinizujących kultur warstwowych. Kultury plastrów inkubowano przez 12 dni przed utrwaleniem do analizy. (C) Oś czasu dla remielinizacji kultur warstwowych. Plastry traktowano lizolecytyną w 14 DIV przez 16-18 godzin w celu wywołania całkowitej demielinizacji i pozostawiono do remielinizacji do 28 DIV przed utrwaleniem do analizy. (D) Oś czasu mielinizacji po urazie niedotlenienia. Plastry były narażone na ostre niedotlenienie przez 24 godziny między 2-3 DIV, co powodowało hipomielinizację. (E) Oś czasu dla CSC od genetycznie zmodyfikowanych myszy. Tamoksyfen (Tam, 100nM) lub wirus Ad-Cre został dodany w 1 DIV i 3 DIV w celu wywołania modyfikacji genetycznej, a plastry analizowano w 12 DIV. Diagramy osi czasu zaadaptowane z poprzednich publikacji11,13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne dane pokazujące, że aktywina A sprzyja mielinizacji i różnicowaniu OPC. (A) Wzrost mielinizacji (MBP) i parawęźli (Caspr) po leczeniu aktywiną A w dawce 100 ng / mL, wykazany przez barwienie immunologiczne kultur warstwowych. (B) Kwantyfikacja wskaźnika mielinizacji (stosunek powierzchni barwionej dla parawęźli Caspr + do powierzchni barwionej dla aksonów NFH +). (C) Kwantyfikacja różnicowania OPC (stosunek oligodendrocytów CC1+ do komórek linii oligodendrocytów Olig2+). (D) Reprezentatywne obrazy barwienia CC1/Olig2. Pokazane wartości to średnia + odchylenie standardowe. P < 0,0001; niesparowany test T. Podziałka skali: A = 25 μm, D = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne dane pokazujące, że XAV939 sprzyja remielinizacji. (A) Obrazy przedstawiające demielinizację przez fragmentaryczne barwienie MBP i brak parawędeł Caspr w kulturach plastrów traktowanych lizolecytyną. (B) Wzrost remielinizacji (MBP) i parawęźli (Caspr) po leczeniu 0,1 μM XAV939 po demielinizacji wywołanej lizolecytyną, wykazanej przez barwienie immunologiczne kultur plastrów. (C) Kwantyfikacja wskaźnika mielinizacji (stosunek powierzchni barwionej dla parawęźli Caspr+ do powierzchni barwionej dla aksonów NFH+). Pokazane wartości to średnia + odchylenie standardowe. P < 0,0001; niesparowany test T. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pożywki do hodowli warstwowych (SCM) głośność Odczynnik 100 ml Minimum Essential Media (MEM), HEPES, bez glutaminy 50 ml Inaktywowana termicznie surowica konia 50 ml Zrównoważony roztwór soli Earle'a 2 ml Penicylina-streptomycyna 10 000 j./ml 2 ml Suplement diety GlutaMAX 2888 μL 45% roztwór glukozy 1 ml Strefa grzybów Sterylny filtr przez filtr 0,22 μm i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Podłoże preparacyjne (DM) głośność Odczynnik 100 ml MEM, HEPES, z solami Earle'a 1 ml Penicylina-streptomycyna 10 000 j./ml Sterylny filtr przez filtr 0,22 μm i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy. Zapas lizolecytyny (125 mg/ml) kwota Odczynnik 100 mg tabletki powlekania Lizolecytyna 0,8 ml Sterylny PBS Rozpuść 100 mg lizolecytyny w 0,8 ml sterylnego PBS. Przechowywać 80 μl podwielokrotności roztworu podstawowego w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić 80 μl porcji i rozpuścić w 20 ml SCM (0,5% lizolecytyny w SCM), ogrzanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 7,5% CO2. W razie potrzeby przeprowadź wir, aby rozpuścić lizolecytynę w SCM.

Tabela 1: Lista składników i protokół do sporządzania pożywki do hodowli plastrów (SCM), pożywki do rozwarstwiania (DM) i roztworu lizolecytyny.

Dyskusja

Protokół ten opisuje organtypowy model hodowli warstw móżdżku, który podsumowuje skład komórkowy in vivo z prostotą modelu in vitro. Protokół ten może być dalej rozwijany, aby stać się bardziej reprezentatywnym modelem patologii człowieka. CSC może być potencjalnie opracowywane jako modele urazów specyficznych dla choroby, takich jak uszkodzenie tkanek wywołane siłą, uszkodzenie wywołane przez przeciwciała specyficzne dla mieliny lub uszkodzenie oligodendrocytów w stwardnieniu rozsianym z dodatkiem obwodowych komórek odpornościowych. Protokół ten może być również zoptymalizowany pod kątem tkanek wypreparowanych z innych części mózgu i rdzenia kręgowego16,17. Podczas gdy protokół ten koncentruje się na histologicznej kwantyfikacji mielinizacji, CSC stanowi wygodny model do badania różnych eksperymentalnych punktów końcowych. Hodowle te można wykorzystać do scharakteryzowania różnych typów komórek za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, oceny ultrastruktury aksonów i osłonek mielinowych za pomocą mikroskopii elektronowej oraz badania dynamiki OPC poprzez przeprowadzanie obrazowania poklatkowego. Barwienie immunologiczne można również ominąć za pomocą transgenicznych linii reporterowych myszy18,19. Wreszcie, różne wieki młodych myszy, czas hodowli lub grubość skrawków mogą być wykorzystane do adaptacji CSC do modelowania różnych mechanizmów chorobowych 10,17,18,19,20,23.

Kultury Slice są idealne do testowania i ilościowego określania czynników wpływających na mielinizację i remielinizację, ale mają ograniczoną reprezentację OUN w niektórych kontekstach. Pochodzące z mózgów P 0-2, CSC pochodzą z mózgów, które są we wczesnym okresie rozwoju i mają ograniczone podobieństwa do starzejącego się lub neurodegeneracyjnego mózgu. Biorąc pod uwagę rosnącą świadomość znaczenia mieliny w zaburzeniach OUN, takich jak choroba Alzheimera21 i schizofrenia22, potrzebne są modele ilościowe i charakteryzujące mielinizację dla dorosłych lub starzejących się. Opublikowano inne protokoły izolujące tkanki od starszych gryzoni, choć nadal w stadiach rozwojowych 10,18,19,23. Ponadto mogą występować wewnętrzne i zewnętrzne różnice w oligodendrocytach i OPC w móżdżku w porównaniu z rdzeniem kręgowym i innymi drogami istoty białej w mózgu. CSC są również mniej odpowiednie niż systemy in vitro oparte na komórkach do badań przesiewowych CRISPR na dużą skalę lub małych cząsteczek. Ze względu na początkowe cięcie tkanek następuje również aktywacja wrodzonych komórek odpornościowych rezydujących w mózgu (tj. mikrogleju i astrocytów), co jest ważnym zastrzeżeniem dla systemu24. Wreszcie, obwodowe komórki odpornościowe odgrywają dużą rolę w patologii stwardnienia rozsianego25; CSC są pozbawione komórek obwodowych, chyba że komórki te są dodawane egzogennie, a zatem nie są idealnym modelem środowiska zapalnego OUN.

Część separcyjna tego protokołu jest być może najbardziej krytyczna. Etapy preparacji należy wykonywać z najwyższą ostrożnością, aby nie uszkodzić tkanki i leżącej pod nią struktury. Prawidłowe ustawienie mózgu wzdłuż ostrza rozdrabniacza tkanek zapewnia minimalne uszkodzenie tkanki i komórek. Ponadto ważne jest staranne rozcięcie i oddzielenie plastrów, a także ich przeniesienie do błon w celu hodowli. Ramy czasowe określone w tym protokole zostały zoptymalizowane dla opisanych badań, ale mogą wymagać dostosowania w celu uzyskania optymalnych wyników w różnych badaniach. Protokół ten będzie przydatny dla tych, którzy chcieliby badać rozwojową mielinizację i naprawę mieliny.

Warto zauważyć, że nie ma lekarstwa na stwardnienie rozsiane. Podczas gdy obecne terapie są dość skuteczne w tłumieniu adaptacyjnego układu odpornościowego, żadna obecna terapia nie jest w stanie zatrzymać postępu. Uważa się, że niepowodzenie remielinizacji i następująca po niej neurodegeneracja leżą u podstaw postępu SM2. Obecność OPC w przewlekłych zmianach chorobowych SM sugeruje, że niepowodzenie naprawy mieliny może być spowodowane zatrzymaniem różnicowania OPC. Zastosowanie CSC otwiera drogę do odkryć terapii naprawczych mieliny, które mogą pomóc w odwróceniu progresji stwardnienia rozsianego i przywróceniu funkcji. Terapia naprawcza mieliny może również pomóc w powrocie do zdrowia u pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, u których demielinizowane drogi hamują funkcje lokomotoryczne26. W związku z tym znaczenie CSC polega na jego przydatności do identyfikacji czynników wpływających na demielinizację i remielinizację ssaków w stosunkowo wysokiej przepustowości w porównaniu z modelami zwierzęcymi in vivo. Podczas gdy w wielu badaniach wykorzystano pierwotne OPC do badań przesiewowych związków wpływających na różnicowanie, generowanie i izolowanie pierwotnych OPC wymaga pracochłonnego i sekwencyjnego immunopanningu27. Ponadto testy komórkowe nie podsumowują różnorodności i interakcji typów komórek obecnych in vivo. Generowanie CSC z mysich szczeniąt jest szybkim i opłacalnym modelem do badania mielinizacji i remielinizacji, który nie wymaga drogiego sprzętu ani materiałów eksploatacyjnych. Kultury warstw móżdżku stanowią zatem nieoceniony model ilościowy do rekapitulacji mielinizacji ex vivo i umożliwiają odkrywanie leków oraz badania z zakresu nauk podstawowych.

Oświadczenia

Autorzy są pracownikami firmy Genentech, Inc., należącej do Grupy Roche.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Yun-An Shen, Roxanne Kyauk i Chrisowi Bohlenowi za konstruktywne komentarze i wkład w ten artykuł. Ponadto autorzy doceniają wkład Charlesa ffrench-Constanta, Andrew Jarjoura, Veronique Miron i Davida Rowitcha we wczesny rozwój pokrewnej metodologii opublikowanej wcześniej11,12,13.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5/45 KleszczeNarzędzia do nauki pięknej11251-35Narzędzia do preparowania
32% ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki50-980-495Utrwalacz do barwienia
45% roztworu glukozySigmaG8769Składnik pożywki hodowlanej Slice
6-dołkowe płytkihodowli tkankowych Corning3516Płytki do kultur
Alexa Fluor Goat anty-kurczak 647Thermo Fisher ScientificA21449Wtórne przeciwciało barwiące
Alexa Fluor Goat anty-myszy 647Thermo Fisher ScientificA21236Wtórne przeciwciało barwiące
Alexa Fluor Goat anty-królik 555Thermo Fisher ScientificA11006Wtórne przeciwciało barwiące
Alexa Fluor Goat anty-szczury 488Thermo Fisher ScientificA21428Przeciwciało do barwienia
wtórnego Ostrza, dwukrawędziowe, pokryte PTFE Stal nierdzewnaTed Pella121-6Ostrza do siekania
Surowica bydlęca Albumina (BSA)SigmaA9418Składnik roztworu blokującego
Przeciwciało anty-NFH kurczakaEncor BiotechCPCA-NF-HPrzeciwciało barwiące
Mikroskop konfokalnyZeissLSM780Konfokalny do obrazowania
System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania Corning 250 mL, 0,22 i mikro; m poreCorning431096Do przygotowania pożywki
Zbilansowany roztwór soli EarlaSigmaE2888Składnik pożywki do hodowli w plasterkach
Ostrze chirurgiczne z piórPióro2976#11Narzędzia do preparacji
FungizoneThermo Fisher Scientific15290-18Składnik podłoża preparacyjnego
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061Składnik pożywki do hodowli w plastrach
Inaktywowana termicznie surowica końskaThermo Fisher Scientific26050-88Składnik pożywki do hodowli w plastrach
LizolecytynaSigmaL4129
Lizofosfatydylocholina z żółtka jajakurzego SigmaL4129Do wywoływania demielinizacji
Rozdrabniacz do tkanek McIlwainTed Pella10180Rozdrabniacz do tkanek
MEM, Hepes, bez glutaminyThermo Fisher Scientific12360-038Składnik pożywki do hodowli warstwowych
MEM, Hepes, z solami Earle'aSigmaM7278Składnik pożywki preparacyjnej
Metalowa szpatułkaFisher Scientific470149-442Narzędzia do preparowania - wyginaj płaski koniec pod kątem do użytku
Wkładka do płytki hodowlanej Millicell 30 mm Organotypowy PTFEFisherPICM0RG50Wkładka hodowlana
Mysie przeciwciało anty-CC1MilliporeOP80-100UGPrzeciwciało barwiące
Noyes Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki precyzyjnej15012-12Narzędzia do preparacji
PBS pH 7,4Gibco10010023Do rozcieńczania utrwalacza
Penicylina-streptomycyna 10 000U/mlThermo Fisher Scientific15140-122Składnik podłoża hodowlanego Slice
Przeciwciało anty-Caspr królikaAbcamab34151Przeciwciało barwiące
Przeciwciało królika anty-Olig2MilliporeAB9610Przeciwciało barwiące
Przeciwciało anty-MBP Szczur PrzeciwciałoSerotecMCA409SPrzeciwciało barwiące
Rękojeść skalpela #3Narzędzia do10003-12Narzędzia do preparowania
Arkusz pianki z kauczuku silikonowegoMSC Industrial Direct Co31939176Podstawa tnąca
Mikroskop stereoskopowyOlympus Life SciencesSZ61Mikroskop do preparacji
Nożyczki chirurgiczne dla studentówNarzędzia do nauki precyzyjnej91401-12Narzędzia do preparacji
do nauki o sztuce

Bibliografia

  1. Purves, D., Augustine, G. J., Fitzpatrick, D. Increased Conduction Velocity as a Result of Myelination. Neuroscience 2nd edition. , Sunderland (MA): Sinauer Associates. (2001).
  2. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Progress in Neurobiology. 93 (1), 1-12 (2011).
  3. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder? Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).
  4. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  5. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  6. Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
  7. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
  8. Molina-Gonzalez, I., Miron, V. E. Astrocytes in myelination and remyelination. Neuroscience Letters. 713, 134532(2019).
  9. Keough, M. B., Jensen, S. K., Yong, V. W. Experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin. Journal of Visualized Experiments. (97), e52679(2015).
  10. Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
  11. Fancy, S. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
  12. Yuen, T. J., et al. Identification of endothelin-2 as an inflammatory factor that promotes CNS remyelination. Brain. 136, 1035-1047 (2013).
  13. Yuen, T. J., et al. Oligodendrocyte-encoded HIF function couples postnatal myelination and white matter angiogenesis. Cell. 158 (2), 383-396 (2014).
  14. Stokes, C. E., Murphy, D., Paton, J. F., Kasparov, S. Dynamics of a transgene expression in acute rat brain slices transfected with adenoviral vectors. Experimental Physiology. 88, 459-466 (2003).
  15. Dillenburg, A., et al. Activin receptors regulate the oligodendrocyte lineage in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (6), 887-906 (2018).
  16. Dean, J. M., et al. An organotypic slice culture model of chronic white matter injury with maturation arrest of oligodendrocyte progenitors. Molecular Neurodegeneration. 6, 46(2011).
  17. Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230 (1), 138-148 (2011).
  18. Hill, R. A., Medved, J., Patel, K. D., Nishiyama, A. Organotypic slice cultures to study oligodendrocyte dynamics and myelination. Journal of Visualized Experiments. (90), e51835(2014).
  19. Sherafat, A., Hill, R. A., Nishiyama, A. Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Proliferation, Fate, and Myelination. Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1791, 145-156 (2018).
  20. Croft, C. L., Noble, W. Preparation of organotypic brain slice cultures for the study of Alzheimer's disease. F1000Research. 7, 592(2018).
  21. Nasrabady, S. E., Rizvi, B., Goldman, J. E., Brickman, A. M. White matter changes in Alzheimer's disease: a focus on myelin and oligodendrocytes. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 22(2019).
  22. Flynn, S. W., et al. Abnormalities of myelination in schizophrenia detected in vivo with MRI, and post-mortem with analysis of oligodendrocyte proteins. Molecular Psychiatry. 38, 811-820 (2003).
  23. Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments. (145), e59163(2019).
  24. Gerlach, J., Donkels, C., Münzner, G., Haas, C. A. Persistent Gliosis Interferes with Neurogenesis in Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 131(2016).
  25. Reich, D. S., Lucchinette, C. F., Calabresi, P. A. Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 378 (2), 169-180 (2018).
  26. Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120, 27-37 (1997).
  27. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 854-868 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Kultura skrawków móżdżkukomórki prekursorowe oligodendrocytówmielinizacja rozwojowademielinizacjaremielinizacjamikroskopia elektronowaostra hipoksjatraktowanie lysolecytynąmyszy transgeniczneadenowirus Ad-Cre

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.