Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) spowodowaną kombinacją czynników środowiskowych i podatnego podłoża genetycznego. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest typowym modelem chorobowym stwardnienia rozsianego, szeroko stosowanym do badania patogenezy, w której limfocyty T specyficzne dla antygenów mielinowych inicjują reakcję zapalną w OUN. Bardzo ważna jest ocena, w jaki sposób limfocyty w OUN regulują rozwój choroby. Jednak podejście do pomiaru ilości i jakości naciekanych limfocytów w OUN jest bardzo ograniczone ze względu na trudności w izolowaniu i wykrywaniu naciekanych limfocytów z mózgu. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół, który jest przydatny do izolacji, identyfikacji i charakterystyki naciekających limfocytów z OUN i będzie pomocny w zrozumieniu, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.
Wprowadzenie
Jako przewlekła choroba demielinizacyjna OUN, stwardnienie rozsiane dotyka około 2,5 miliona ludzi na całym świecie i nie ma leczenia 1. Jest również uważana za chorobę autoimmunologiczną, w której limfocyty T specyficzne dla antygenu mielinowego inicjują reakcję zapalną i prowadzą do demielinizacji i uszkodzenia aksonów w klasie CNS2. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest szeroko stosowane do badania mechanizmów patogennych SM jako klasyczny model autoimmunologicznej choroby demielinizacyjnej w CNS3. Istnieją dwa sposoby indukcji EAE: jeden to aktywne wywoływ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez komitet ds. zwierząt Szkoły Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju.
1. Przygotowanie materiałów
- Użyj sekwencji MEVGWYRSPFSRVHLYRNGK MOG35-55, aby uzyskać liofilizowany peptyd ze źródeł komercyjnych. Upewnij się, że czystość peptydu wynosi >95%. Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego MOG w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować roztwór podstawowy M. tuberculosis H37 Ra o stężeniu 4 mg/ml, umieszczając jedną probówkę 100 mg M. tuberculosis H37 Ra ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po immunizacji myszy C57BL/6 wszystkie zwierzęta były codziennie ważone, badane i oceniane pod kątem objawów neurologicznych. Reprezentatywny przebieg kliniczny EAE powinien skutkować krzywą zachorowania przedstawioną na Rysunku 2A oraz zmianą masy ciała myszy przedstawioną na Rysunku 2B. Myszy C57BL/6 immunizowane MOG35-55 zazwyczaj zaczynały wykazywać objawy choroby około 10–12 dnia i osiągały szczyt zachorowania około 15–21 dnia po aktywnej immunizacji (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W badaniu tym przedstawiono protokół indukcji i monitorowania EAE przy użyciu MOG35-55 u myszy C57BL / 6, które są uważane za typowy neuroimmunologiczny eksperymentalny model zwierzęcy SM. EAE można indukować w zależności od szczepów myszy lub rodzaju białka użytego do indukcji w zależności od celu badania. Na przykład stosowanie peptydu PLP139-151 u myszy SJL może wywołać rzutowo-remisyjny przebieg choroby EAE, który jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny efektów terapeutycznych w nawrotach15
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31570921 dla ZJ, 81571533 dla LS), Miejską Komisję Zdrowia i Planowania Rodziny w Szanghaju (201540206 dla ZJ), grant badawczy dla Szpitala Ruijin North (2017ZX01 dla ZJ).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor700 przeciw myszom CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anty-mysi blok CD16/CD32 Fc | BioLegend | 101302 | |
| APC przeciw myszom IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizator | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Koktajl stymulacji komórek (plus inhibitory transportu białek) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Wewnątrzkomórkowe utrwalanie i Zestaw permeabilacyjnych | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anty-mysi CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b i kappa; Isotype Ctrl Przeciwciało | BioLegend | 400605 | |
| Kompletny adiuwant Freunda (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mysia kontrola izotypu IgG2a kappa (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anty-mysie IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anty-mysi CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Szczur IgG2b, κ Isotype Ctrl Przeciwciało | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Przeciwciało | BioLegend | 400631 | |
| toksyna krztuścowa (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Kontrola izotypu szczura IgG1 kappa (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Kontrola izotypu szczura IgG2a kappa (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Szczur MOG35– 55 peptydów | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
Bibliografia
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
