Artykuł metodologiczny

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/61050

⸱

17 listopada 2020

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane (MS) jest chorobą autoimmunologiczną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) spowodowaną kombinacją czynników środowiskowych i podatnego podłoża genetycznego. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest typowym modelem chorobowym stwardnienia rozsianego, szeroko stosowanym do badania patogenezy, w której limfocyty T specyficzne dla antygenów mielinowych inicjują reakcję zapalną w OUN. Bardzo ważna jest ocena, w jaki sposób limfocyty w OUN regulują rozwój choroby. Jednak podejście do pomiaru ilości i jakości naciekanych limfocytów w OUN jest bardzo ograniczone ze względu na trudności w izolowaniu i wykrywaniu naciekanych limfocytów z mózgu. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół, który jest przydatny do izolacji, identyfikacji i charakterystyki naciekających limfocytów z OUN i będzie pomocny w zrozumieniu, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako przewlekła choroba demielinizacyjna OUN, stwardnienie rozsiane dotyka około 2,5 miliona ludzi na całym świecie i nie ma leczenia 1. Jest również uważana za chorobę autoimmunologiczną, w której limfocyty T specyficzne dla antygenu mielinowego inicjują reakcję zapalną i prowadzą do demielinizacji i uszkodzenia aksonów w klasie CNS2. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest szeroko stosowane do badania mechanizmów patogennych SM jako klasyczny model autoimmunologicznej choroby demielinizacyjnej w CNS3. Istnieją dwa sposoby indukcji EAE: jeden to aktywne wywoływanie EAE poprzez uodparnianie zwierząt składnikami mieliny, drugi to transfer adoptywny poprzez transfer encefalitogennych limfocytów T do receptora2,4,5. Podatność na EAE jest różna w różnych szczepach zwierząt6. U myszy C57BL/6 prowokacja glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) 35-55 indukuje chorobę jednofazową z rozległą demielinizacją i stanem zapalnym w OUN, co jest często stosowane w eksperymentach na myszach ukierunkowanych na gen7.

Wytwarzanie reaktywnych limfocytów T specyficznych dla mieliny jest niezbędne do wystąpienia i rozwoju choroby w EAE i jest immunologicznym znakiem zarówno EAE, jak i MS. Aktywowane autoreaktywne limfocyty T przenikają przez barierę krew-mózg (BBB) do zdrowego OUN i inicjują chorobę EAE. W przypadku napotkania MOG 35–55 Ag te limfocyty T indukują stan zapalny i rekrutację komórek efektorowych do OUN, co prowadzi do demielinizacji i zniszczenia aksonów8,9. W modelu EAE istnieje wiele dowodów na to, że limfocyty T CD4 + specyficzne dla neuroantygenu mogą inicjować i podtrzymywać zapalenie i patologię nerwów3,10. W zależności od głównych wytwarzanych cytokin, limfocyty T CD4 + zostały sklasyfikowane w różnych podzbiorach: Th1 (charakteryzujący się wytwarzaniem interferonu-γ), Th2 (charakteryzujący się wytwarzaniem interleukiny 4) i Th17 (charakteryzujący się wytwarzaniem interleukiny 17). Uważa się, że aktywacja komórek Th1 i Th17 przyczynia się do indukcji, utrzymania i regulacji demielinizacji zapalnej w EAE i MS poprzez wydzielanie cytokin efektorowych IFN-γ i IL-17, które są zdolne do aktywacji makrofagów i rekrutacji neutrofili do miejsc zapalnych w celu przyspieszenia zmian chorobowych11.

Ponieważ autoreaktywne limfocyty T przenikają przez BBB do OUN i wywołują rozwój choroby w SM i EAE, bardzo ważne jest analizowanie limfocytów T w OUN. Istnieje jednak bardzo niewiele ustalonych protokołów izolacji limfocytów z klasy CNS12. W związku z tym opracowano metodę zoptymalizowaną do izolowania komórek jednojądrzastych z mózgu i analizy limfocytów T z markerami CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g i IL-17 do cytometrii przepływowej. Metoda wykorzystuje adiuwant MOG35–55 Mycobacterium tuberculosis H37 Ra i roztwór roboczy toksyny krztuścowej (PTX) w celu wywołania aktywnego modelu immunizacji EAE u myszy. Następnie stosuje się metody separacji mechanicznej i wirowania w gradiacji gęstości do izolacji komórek jednojądrzastych OUN. Wreszcie, zoptymalizowana strategia bramkowania cytometrii przepływowej jest stosowana do identyfikacji limfocytów T i podzbiorów z mózgu poprzez barwienie wielu markerów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez komitet ds. zwierząt Szkoły Podstawowych Nauk Medycznych, Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Użyj sekwencji MEVGWYRSPFSRVHLYRNGK MOG35-55, aby uzyskać liofilizowany peptyd ze źródeł komercyjnych. Upewnij się, że czystość peptydu wynosi >95%. Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego MOG w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować roztwór podstawowy M. tuberculosis H37 Ra o stężeniu 4 mg/ml, umieszczając jedną probówkę 100 mg M. tuberculosis H37 Ra w 25 ml kompletnego adiuwantu Freunda (CFA) i mieszając. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotuj 1 ng/μl roztworu roboczego toksyny krztuścowej (PTX), dodając 50 μg PTX do 50 ml PBS. Przechowywać roztwór roboczy w temperaturze -20 °C.
  4. Przechowuj wszystkie przeciwciała (tj. FITC anty-mysie CD3, PE/Cy7 anty-mysie CD4, PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD11b, Alexa Fluor700 anty-mysie CD45.2, PE anty-mysie IL-17A i APC anty-mysie IFN-γ) w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj bufor do barwienia cytometrią przepływową (FCS), dodając 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml PBS.

2. Obudowa myszy C57BL/6

  1. Użyj samic myszy C57BL/6 w wieku 8–12 tygodni.
  2. Myszy C57BL/6J należy aklimatyzować przez co najmniej 7 dni przed wstrzyknięciem.
  3. Myszy trzymane w pomieszczeniach dla zwierząt w warunkach wolnych od patogenów w stałej temperaturze i wilgotności w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność oraz zapewniają swobodny dostęp do wody i standardowego pokarmu w postaci granulek.

3. Immunizacja myszy C57BL/6

  1. Pozostaw wszystkie roztwory podstawowe na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby zapewnić całkowite nawodnienie.
  2. Rozcieńczyć 300 μl roztworu podstawowego peptydu MOG z 700 μl PBS w celu przygotowania roztworu roboczego o stężeniu 3 mg/ml.
  3. Umieścić 1 ml roztworu podstawowego M. tuberculosis H37 Ra i 1 ml roztworu roboczego peptydów MOG35–55 do oddzielnych strzykawek o pojemności 10 ml, a następnie użyć czterokierunkowego kurka zatrzymującego do emulgowania przez co najmniej 10 minut. Przed wstrzyknięciem należy zapewnić pełną emulgację.
  4. Znieczulenie myszy w szczycie EAE za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 1% pentobarbitalu sodu (50 mg / kg).
  5. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknij podskórnie myszom 100 μl emulsji MOG 35–55/CFA (300 μg/200 μl) w dwóch miejscach, oba z tyłu w pobliżu szyi. Podskórnie wstrzyknąć myszom kontrolnym 200 μl PBS.
  6. Tego samego dnia (dzień 0) i w 2 dniu po szczepieniu (PI) myszom wstrzykuje się dootrzewnowo 200 μl roztworu roboczego PTX o stężeniu 1 ng/μl. Myszy kontrolne wstrzyknąć dootrzewnowo za pomocą 200 μl PBS.
  7. Przenieś myszy do ich domowej klatki za pomocą podkładki rozgrzewającej.
  8. Badaj i oceniaj wszystkie myszy codziennie po wstrzyknięciu w sposób zaślepiony pod kątem objawów neurologicznych pokazanych w Tabeli 111,13. Poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli wyniki są gorsze niż stopień 4.
  9. Rejestruj zmiany masy ciała w trakcie przebiegu choroby. Jest to cenna dodatkowa miara aktywności choroby w modelu EAE11,13.
  10. Dodaj pierwszy dzień objawów klinicznych dla poszczególnych myszy i podziel przez liczbę myszy w grupie; wynikiem jest początek. Dodaj pierwszy dzień maksymalnego wyniku EAE dla poszczególnych myszy i podziel przez liczbę myszy w grupie; Rezultatem jest szczyt.

4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z mózgu

  1. Rozcieńczyć podłoże o gradiencie gęstości w stosunku 9:1 z PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać końcowy 100% roztwór.
  2. Znieczulenie myszy w szczycie EAE za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 1% pentobarbitalu sodu (50 mg / kg) i perfuzji dosercowej za pomocą 20 ml sterylnego, lodowatego PBS. Osiągnij to, powoli i równomiernie wstrzykując PBS do lewej komory serca za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i otwierając prawy przedsionek.
  3. Ostrożnie przeciąć czaszkę od nosa do szyi, a następnie wyjąć mózg z pudełka czaszkowego do 10 ml RPMI w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, aby usunąć przylegające czerwone krwinki. Następnie usuń pożywkę przez aspirację i dodaj 10 ml RPMI.
  4. Umieść mózgi i podłoże w naczyniu o średnicy 100 mm. Drobno posiekaj żyletką.
  5. Przenieś 6 ml z naczynia do lodowatego homogenizatora ze szkła spiekanego o pojemności 7 ml za pomocą czystej pipety. Unikaj pozostawiania dużych ilości tkanki w pipecie. Niewielka ilość jest nieunikniona.
  6. Najpierw zmielić mózg za pomocą "luźnego" tłoka tłuczka, następnie użyć "ciasnego" tłoka, aż zawiesina stanie się jednorodna, a następnie przelać do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i trzymać na lodzie.
  7. Po homogenizacji wszystkich próbek oszacuj objętość. Dostosuj głośność za pomocą RPMI do 7 ml. Następnie umieść 3 ml lodowatej 100% macierzy membranowej w schłodzonej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 7 ml homogenatu mózgu, aby uzyskać końcowe podłoże o gradiencie gęstości 30%. Wymieszaj kilka razy przez odwrócenie. Nie wirować.
  8. Aby zapewnić ostre interfejsy, ostrożnie i powoli dodawaj 1 ml podłoża o gradicynie gęstości podkładu o 70% w RPMI za pomocą pipety o pojemności 3 ml.
  9. Wirować przy 800 x g tylko przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić przyspieszenie na 1, a opóźnienie na 0. Po odwirowaniu należy odessać prawie całą górną fazę, uważając, aby całkowicie usunąć mielinę na górze (Rysunek 1).
  10. Wyjmij interfejs do nowej probówki wirówkowej 15. Dostosuj objętość do 10 ml za pomocą RPMI.
  11. Wirować przy 500 x g przez 10 min. Po odwirowaniu odessać supernatant. Zawiesić osad w ~200 μL buforu do barwienia cytometrią przepływową (FSC). Granulki są następnie gotowe do barwienia dla FACS.

5. Analiza cytometryczna przepływu pojedynczych komórek z mózgu

  1. Użyj hemocytometru i mikroskopu, aby policzyć komórki. Dodaj 10 μl komórek do 10 μl błękitu trypanowego, dobrze wymieszaj i umieść 10 μl na hemocytometrze, aby policzyć komórki. Następnie oblicz liczbę żywych komórek na mikrolitr pod mikroskopem odwróconym (np. Mikroskop odwrócony Olympus).
  2. Podwielokrotność około 2 x 106 komórek w RPMI do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce.
  3. Dodaj do studzienek 500-krotny koktajl stymulacji komórkowej oraz inhibitory transportu białek.
  4. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
  5. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FCS.
  6. Wstępnie inkubować komórki z anty-mysim blokiem Fc CD16/CD32 (1:33) przez 10 minut w temperaturze 4 °C przed barwieniem w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc.
  7. Markery powierzchniowe do barwienia bez mycia. Dodaj przeciwciała anty-mysie CD45.2 (1:200), anty-mysie CD11b (1:200), anty-mysie CD3 (1:200) i anty-mysie CD4 (1:200).
    UWAGA: Aby określić bramki dodatnie i ujemne, należy wybarwić fluorescencję minus jeden (FMO) dla każdego koloru i przeciwciało kontrolne izotypu.
  8. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Chronić przed światłem.
  9. Umyj komórki, dodając bufor FCS. Użyj 200 μl/dołek do płytek do mikromiareczkowania. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  10. Dodaj 200 μl wewnątrzkomórkowego buforu utrwalającego (IC) do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w roztworze.
  11. Inkubować 30–60 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.
  12. Odwirować próbki o masie 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  13. Dodać 200 μl 1x buforu permeabilizacyjnego do każdej studzienki i odwirować próbki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  14. Zawiesić osad w pozostałej objętości i dostosować objętość do około 100 μl za pomocą 1x buforu permeabilizacyjnego.
  15. Dodać przeciwciała anty-mysie IL-17A (1:200) i anty-mysie IFN-g (1:200) w celu wykrycia wewnątrzkomórkowych antygenów komórek.
  16. Inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.
  17. Dodać 100 μl 1x buforu permeabilizacyjnego do każdej studzienki i odwirować próbki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
  18. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
  19. Analiza metodą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Ustawienia lasera i kompensacji w cytometrze przepływowym są dostosowywane, próbki są umieszczane na cytometrze, a wszystkie zdarzenia są rejestrowane zgodnie z zaleceniami producenta.

6. Analiza danych

  1. Podkoszulki bramek wykorzystujące FSC-A vs. FSC-H i SSC-A vs. SSC-H.
  2. Bramkowanie komórek na żywo za pomocą FSC-A i SSC-A w zależności od rozmiaru.
  3. Następnie zidentyfikuj leukocyty, z wyłączeniem monocytów, poprzez bramkowanie na komórkach CD45 + CD11b.
  4. Następnie zidentyfikuj limfocyty T CD4 poprzez bramkowanie na komórkach CD3 + CD4 +.
  5. Na koniec zidentyfikuj podzbiory Th1 i Th17 poprzez bramkowanie na komórkach IFN-γ+ i komórkach IL-17+ osobno, a następnie określ populacje dodatnie i ujemne za pomocą kontroli izotypów i FMO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po szczepieniu myszy C57BL/6, wszystkie myszy były codziennie ważone, badane i oceniane pod kątem objawów neurologicznych. Reprezentatywny przebieg kliniczny EAE powinien skutkować krzywą choroby przedstawioną na rysunku Rysunek 2A oraz zmianą masy ciała u myszy, jak pokazano w Rysunek 2B. Myszy C57BL/6 zaszczepione MOG35-55 zwykle zaczynały rozwijać objawy choroby około 10-12 dnia i osiągały szczyt choroby około 15-21 dnia po aktywnym szczepieniu (Figura 2A). Z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu tym przedstawiono protokół indukcji i monitorowania EAE przy użyciu MOG35-55 u myszy C57BL / 6, które są uważane za typowy neuroimmunologiczny eksperymentalny model zwierzęcy SM. EAE można indukować w zależności od szczepów myszy lub rodzaju białka użytego do indukcji w zależności od celu badania. Na przykład stosowanie peptydu PLP139-151 u myszy SJL może wywołać rzutowo-remisyjny przebieg choroby EAE, który jest szczególnie dobrze przystosowany do oceny efektów terapeutycznych w nawrotach15

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31570921 dla ZJ, 81571533 dla LS), Miejską Komisję Zdrowia i Planowania Rodziny w Szanghaju (201540206 dla ZJ), grant badawczy dla Szpitala Ruijin North (2017ZX01 dla ZJ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor700 przeciw myszom CD45.2eBioscience56-0454-82
Anty-mysi blok CD16/CD32 FcBioLegend101302
APC przeciw myszom IFN-geBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
Dounce homogenizatorWheaton353107542
eBioscience Koktajl stymulacji komórek (plus inhibitory transportu białek) (500X)eBioscience00-4975-03
eBioscience Wewnątrzkomórkowe utrwalanie i Zestaw permeabilacyjnycheBioscience88-8824-00
FITC anty-mysi CD3BioLegend100203
FITC Rat IgG2b i kappa; Isotype Ctrl PrzeciwciałoBioLegend400605
Kompletny adiuwant Freunda (CFA)Sigma-AldrichF5881
Mysia kontrola izotypu IgG2a kappa (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscienceeBioscience56-4724-80
Mycobacterium tuberculosis H37 RaDifco Laboratories231141
PE anty-mysie IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 anty-mysi CD4BioLegend100422
PE/Cy7 Szczur IgG2b, κ Isotype Ctrl PrzeciwciałoBioLegend400617
PercollGE17-0891-01
PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl PrzeciwciałoBioLegend400631
toksyna krztuścowa (PTX)Sigma-AldrichP-2980
Kontrola izotypu szczura IgG1 kappa (eBRG1), APC, eBioscienceeBioscience17-4301-82
Kontrola izotypu szczura IgG2a kappa (eBR2a), PE, eBioscienceeBioscience12-4321-80
Szczur MOG35– 55 peptydówBiosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
  2. Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
  3. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  4. Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
  5. Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
  6. Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
  7. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  8. Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
  9. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
  10. McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394(2018).
  11. Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
  12. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44(2018).
  13. Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881(2019).
  14. Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
  15. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  16. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15 11(2007).
  17. Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

cytometria przep ywowaizolacja kom rekwirowanie w gradiencie g sto cibarwienie przeciwcia amianaliza cytokin wewn trzkom rkowychMOG 35 55myszy C57BL 6

Powiązane artykuły