Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61053

⸱

4 maja 2020

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

W tym artykule

Podsumowanie

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Streszczenie

Spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej (HDX-MS) jest potężną metodą biofizycznej charakterystyki zmian konformacyjnych enzymów i interakcji enzym-substrat. Wśród wielu zalet HDX-MS jest to, że zużywa tylko niewielkie ilości materiału, może być wykonywany w warunkach zbliżonych do natywnych bez konieczności znakowania enzymów/substratów i może dostarczyć przestrzennie rozdzielczych informacji na temat dynamiki konformacji enzymów - nawet w przypadku dużych enzymów i kompleksów wielobiałkowych. Metodę rozpoczyna się od rozcieńczenia enzymu będącego przedmiotem zainteresowania w buforze przygotowanym wD2O. Powoduje to wymianę protu w amidach wiązań peptydowych (N-H) z deuterem (N-D). W pożądanych punktach czasowych wymiany podwielokrotności reakcji są hartowane, enzym jest proteolizowany do peptydów, peptydy są rozdzielane za pomocą ultra-sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), a zmiana masy każdego peptydu (w wyniku wymiany wodoru na deuter) jest rejestrowana przez MS. Ilość wychwytu deuteru przez każdy peptyd jest silnie zależna od lokalnego środowiska wiązań wodorowych tego peptydu. Peptydy obecne w bardzo dynamicznych regionach enzymu bardzo szybko wymieniają deuter, podczas gdy peptydy pochodzące z dobrze uporządkowanych regionów ulegają wymianie znacznie wolniej. W ten sposób wskaźnik HDX informuje o lokalnej dynamice konformacyjnej enzymów. Zaburzenia poziomów wychwytu deuteru w obecności różnych ligandów można następnie wykorzystać do mapowania miejsc wiązania ligandów, identyfikacji sieci allosterycznych i zrozumienia roli dynamiki konformacyjnej w funkcji enzymu. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy HDX-MS, aby lepiej zrozumieć biosyntezę rodzaju naturalnych produktów peptydowych zwanych lantipeptydami. Lantipeptydy to genetycznie kodowane peptydy, które są modyfikowane potranslacyjnie przez duże, wielofunkcyjne, konformacyjnie dynamiczne enzymy, które są trudne do zbadania za pomocą tradycyjnych podejść biologii strukturalnej. HDX-MS stanowi idealną i adaptowalną platformę do badania właściwości mechanistycznych tego typu enzymów.

Wprowadzenie

Białka to strukturalnie dynamiczne cząsteczki, które próbkują różne konformacje w skalach czasowych, począwszy od wibracji wiązań w skali femtosekundowej, a skończywszy na rearanżacjach całych domen białkowych, które mogą wystąpić w ciągu wielu sekund1. Te fluktuacje konformacyjne są często krytycznymi aspektami funkcji enzymu/białka. Na przykład zmiany konformacyjne wywołane wiązaniem ligandów są często krytycznie ważne dla modulacji funkcji enzymu, albo poprzez organizowanie reszt miejsca aktywnego potrzebnych do katalizy, definiowanie miejsc wiązania substratu w sekwencyjnych mechanizmach kinetycznych, osłanianie reaktywnych produktów pośrednich przed środowiskiem, albo poprzez modulowanie funkcji enzymu za pośrednictwem sieci allosterycznych. Ostatnie badania wykazały również, że dynamika konformacyjna może być zachowana w trakcie ewolucji i że zakłócenia zachowanych ruchów molekularnych mogą być skorelowane ze zmianami specyficzności substratu i pojawieniem się nowych funkcji enzymów2,3.

W ostatnich latach spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej (HDX-MS) szybko stała się potężną techniką do badania, jak krajobrazy konformacyjne białek reagują na zakłócenia, takie jak wiązanie ligandów lub mutageneza4,5,6,7. W typowym eksperymencie HDX-MS (Rysunek 1), interesujące białko umieszcza się w buforze przygotowanym w D2O, co powoduje zastąpienie protonów wymiennych w rozpuszczalniku deuterią. Szybkość wymiany ugrupowania amidowego wiązań peptydowych zależy silnie od pH, lokalnej sekwencji aminokwasów oraz od lokalnego środowiska strukturalnego amidu8. Amidy, które są zaangażowane w interakcje wiązań wodorowych (takie jak te obecne w α-helisach i β-arkuszach) wymieniają się wolniej niż amidy w niestrukturalnych obszarach białka, które są wystawione na działanie rozpuszczalnika luzem. Tak więc stopień wychwytu deuteru jest odzwierciedleniem struktury enzymu. Oczekuje się, że enzymy, które są konformacyjnie dynamiczne lub które przechodzą przemiany strukturalne po związaniu liganda, dadzą mierzalną odpowiedź HDX.

Mechanistyczne podstawy powolnego kursu wymiany amidu strukturalnego są pokazane w Rysunek 25,8,9. Aby przejść HDX, region strukturalny musi najpierw przejściowo pobrać próbkę niesfałdowanej konformacji, tak aby cząsteczki rozpuszczalnika, które katalizują HDX wymieniać się poprzez określony mechanizm chemiczny kwas/zasada, miały dostęp do wymiennego amidu. Ostatecznie, względne wielkości chemicznego kursu wymiany (kchem) oraz szybkości składania i ponownego składania (kotwarcia i kzamknięcia) determinują szybkość HDX zmierzoną w eksperymencie5,8. Z tego prostego modelu kinetycznego jasno wynika, że zakres absorpcji deuteru będzie odzwierciedlał leżącą u jego podstaw dynamikę konformacyjną (zdefiniowaną przez kotwarcia i kzamknięcia). Większość eksperymentów HDX-MS jest przeprowadzana w przepływie pracy oddolnej, w którym, po reakcji wymiany, białko będące przedmiotem zainteresowania jest trawione na peptydy, a wychwyt deuteru przez każdy peptyd jest mierzony jako wzrost masy7. W ten sposób HDX-MS umożliwia mapowanie perturbacji dynamiki konformacyjnej enzymu w lokalnej skali przestrzennej peptydów, co pozwala badaczowi ocenić, w jaki sposób perturbacja zmienia dynamikę w różnych regionach enzymu będącego przedmiotem zainteresowania.

Korzyści płynące z podejścia HDX-MS do wyjaśnienia dynamiki strukturalnej białek są liczne. Po pierwsze, metoda może być wykonywana z małymi ilościami białka natywnego lub na kompleksach białkowych w układach o budowie czwartorzędowej10. Nie jest nawet konieczne, aby preparat enzymatyczny użyty w teście był wysoce oczyszczony11,12, o ile oddolny przepływ pracy HDX-MS zapewnia wystarczającą liczbę pewnie zidentyfikowanych peptydów, które pokrywają sekwencję białka będącą przedmiotem zainteresowania. Co więcej, HDX-MS może dostarczyć informacji na temat dynamiki konformacji w warunkach zbliżonych do natywnych bez konieczności znakowania białek specyficznego dla miejsca, co byłoby stosowane w badaniach fluorescencji pojedynczych cząsteczek13, i nie ma ograniczeń co do wielkości białka lub kompleksu białkowego, który można badać (co sprawia, że podejścia takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego [NMR] są trudne)7, 14. Wreszcie, metody HDX-MS z rozdzielczością czasową mogą być stosowane do badania wewnętrznie nieuporządkowanych białek, które są trudne do zbadania za pomocą krystalografii rentgenowskiej15,16,17,18. Głównym ograniczeniem HDX-MS jest to, że dane mają niską rozdzielczość strukturalną. Dane HDX-MS są przydatne do wskazywania miejsc, w których zmienia się dynamika konformacyjna i do ujawniania sprzężonych zmian konformacyjnych, ale często nie dostarczają zbyt wiele wglądu w dokładny mechanizm molekularny napędzający obserwowaną zmianę. Ostatnie postępy w połączeniu metod dysocjacji wychwytu elektronów z danymi HDX-MS białek okazały się obiecujące dla mapowania miejsc wymiany do reszt pojedynczych aminokwasów19, ale nadal często potrzebne są dalsze badania biochemiczne i strukturalne, aby zapewnić przejrzystość modeli strukturalnych przekazywanych przez dane HDX-MS.

Poniżej przedstawiono szczegółowy protokół rozwoju testu HDX-MS20. Przedstawione poniżej protokoły przygotowania próbek powinny mieć ogólne zastosowanie do każdego białka, które wykazuje dobrą rozpuszczalność w wodnych. Dla białek dostępne są bardziej specjalistyczne metody przygotowania próbek i przepływy pracy HDX-MS, niż te, które muszą być oznaczane w obecności detergentu lub fosfolipidów21,22,23,24. Instrumentalne ustawienia do zbierania danych HDX-MS są opisane dla kwadrupolowego spektrometru masowego czasu przelotu o wysokiej rozdzielczości sprzężonego z systemem chromatografii cieczowej. Dane o podobnej złożoności i rozdzielczości mogą być gromadzone w każdym z wielu dostępnych na rynku systemów chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Przedstawiono również kluczowe aspekty przetwarzania danych za pomocą dostępnego na rynku pakietu oprogramowania. Przedstawiamy również wytyczne dotyczące zbierania i analizy danych, które są zgodne z zaleceniami szerszej społeczności HDX-MS12. Opisany protokół służy do badania dynamicznych właściwości strukturalnych HalM2, syntetazy lantipeptydu, która katalizuje wieloetapowe dojrzewanie naturalnego produktu peptydu przeciwdrobnoustrojowego20. Pokazujemy, w jaki sposób HDX-MS może być wykorzystany do ujawnienia miejsc wiązania substratu i właściwości allosterycznych, które wymknęły się wcześniejszej charakterystyce. W ostatnich latach opublikowano kilka innych protokołów dotyczących białka HDX-MS25,26. Wraz z niniejszą pracą, te wcześniejsze wkłady powinny zapewnić czytelnikowi pewną elastyczność w projektowaniu eksperymentalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie deuterowanych odczynników i roztworów zapasowych enzymów

  1. Przygotować odczynniki niezbędne do reakcji HDX (w tym wszystkie bufory, sole, substraty, ligandy itp.) w formie 100−200-krotnych stężonych roztworów zapasowych w D2O (frakcja atomowa D 99,9%). Przygotować co najmniej 50 mL stężonego roztworu buforu zapasowego.
    UWAGA: Do charakterystyki HalM2 przygotowano następujące roztwory: 500 mM MgCl2, 100 mM tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP), 750 mM ATP (w buforze HEPES), 800 mM HEPES pD 7,1, 500 µM HalA2 oraz 500 mM AMPPNP.
  2. Zamrozić i liofilizować roztwory zapasowe do suchości.
  3. Ponownie rozpuścić w D2O i powtórzyć cykl liofilizacji co najmniej jeden dodatkowy raz, aby zastąpić jak największą liczbę protonów wymiennych deuteronami.
  4. Dostosować pD stężonego roztworu buforu HEPES z deuterowaniem do pożądanej wartości za pomocą stężonego NaOD/DCl, biorąc pod uwagę następującą zależność27:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Szybkość HDX amidów jest silnie zależna od pL roztworu (pL = pH lub pD)5. Różne partie stężonych roztworów buforów zapasowych muszą być przygotowywane, przechowywane i używane w identyczny sposób, aby uniknąć niewielkich dryftów pL między eksperymentami.
  5. Obliczyć ilość każdego odczynnika potrzebną do analizy HDX o objętości 300 µL i przechowywać w formie jednorazowych alikwotów w temperaturze -80 °C.
  6. Przygotować stężony roztwór zapasowy enzymu (~100−200 µM) w protowanym buforze do przechowywania enzymu, używając filtra odśrodkowego (Tabela materiałów) lub urządzenia równoważnego.
    UWAGA: Dokładny bufor oraz próg odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) filtra odśrodkowego będą zależeć od badanego białka/enzymu. HalM2 przechowuje się w 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl i 10% glicerolu. Do przygotowania stężonego enzymu użyto filtrów 10 kDa.
  7. Rozdzielić enzym na jednorazowe porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Ten etap może być punktem przerwania procedury. Wszystkie roztwory zapasowe opisane w sekcji 1 mogą zostać przygotowane z wyprzedzeniem przed reakcjami HDX. W temperaturze -80 °C większość enzymów/deuterowanych roztworów zapasowych będzie stabilna przez wiele miesięcy.

2. Kalibracja objętości quenchowania HDX

  1. Przygotować 300 µL reakcji HDX w D2O, wykorzystując deuterowane odczynniki oraz skoncentrowane zapasy enzymu przygotowane w sekcji 1.
    1. Zastosować końcowe stężenie enzymu w zakresie 1−5 µM.
    2. Zastosować końcowe stężenie deuterowanego buforu HEPES wynoszące co najmniej 50−100 mM.
    3. Upewnić się, że stężenia pozostałych składników są wystarczające do utrzymania pożądanej aktywności/funkcji enzymu.
  2. Przygotować 1 L roztworu do przerywania reakcji HDX (100 mM fosforanu, 0,8 M guanidyny-HCl, pH 1,9). Zamrozić i przechowywać zarówno w porcjach 50 mL (jako zapas długoterminowy), jak i w porcjach 1 mL (jako alikwoty do jednorazowego użycia).
    UWAGA: Dokładny skład buforu do przerywania reakcji zależy od enzymu użytego w etapie proteolizy w procedurze bottom-up HDX-MS (krok 3.3.3). Podany tutaj bufor do przerywania reakcji jest kompatybilny z pepsyną, najczęściej stosowaną proteazą w HDX-MS. W przypadku użycia innej proteazy należy skonsultować się z dostawcą proteazy w celu sprawdzenia kompatybilności z buforem.
  3. Skalibrować objętość buforu do przerywania reakcji potrzebną do dostosowania końcowego pL zmieszanego roztworu HDX po przerwaniu reakcji do wartości 2,3 odczytanej z pH-metru.
    UWAGA: Szybkość wymiany H/D rozpuszczalnika w wiązaniu N-H amidu peptydowego jest procesem zależnym od pH, który podlega katalizie zarówno kwasowej, jak i zasadowej. Minimalna szybkość wymiany występuje przy wartości pH 2,5 (odczyt z pH-metru = 2,3 dla mieszaniny H2O:D2O w stosunku 50:50). Zatem końcowa wartość pL bliska 2,5 zminimalizuje wsteczną wymianę wodoru, która zachodzi podczas analizy bottom-up LC-MS, co pozwoli zachować znakowanie deuterem w peptydach.
    1. Zmieszać 50 µL mieszaniny reakcyjnej HDX z kroku 2.1 z 50 µL buforu do przerywania reakcji i zmierzyć pL zmieszanej próbki za pomocą elektrody z mikrokońcówką.
    2. Zwiększać objętość roztworu do przerywania reakcji w razie potrzeby, aby dostosować końcowy odczyt z pH-metru do wartości 2,3.
    3. Po ustaleniu odpowiedniej objętości buforu do przerywania reakcji należy kilkakrotnie powtórzyć proces przerywania, wykorzystując świeże alikwoty 50 µL z reakcji HDX (krok 2.1), aby upewnić się, że po dodaniu stałej ilości buforu do przerywania reakcji uzyskuje się spójne końcowe pL.

3. Przygotowanie próbek referencyjnych i optymalizacja przepływu pracy LC-MS w podejściu bottom-up

  1. Przygotuj nieudeuterowane próbki referencyjne badanego białka w trzech powtórzeniach w probówkach 0,5 mL. Upewnij się, że końcowe warunki mieszaniny reakcyjnej są identyczne z warunkami stosowanymi w autentycznych reakcjach HDX (krok 2.1), z wyjątkiem tego, że reakcje są przygotowywane w H2O przy użyciu roztworów stokowych reagentów również przygotowanych w H2O.
  2. Zatrzymaj reakcję w próbkach zgodnie z krokiem 2.3, dodając odpowiednią objętość buforu stopującego, aby dostosować końcowe pH do 2,5. Próbki zamroź gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu analizy.
  3. Przeanalizuj protowane referencyjne próbki enzymu, stosując przepływ pracy LC-MS bottom-up.
    UWAGA: Przed wykonaniem tych kroków system LC-MS używany do akwizycji danych powinien być odpowiednio skalibrowany i gotowy do użycia. Czas i temperatura wszystkich etapów przepływu pracy LC-MS bottom-up muszą być ściśle kontrolowane, aby zminimalizować różnice w wymianie wstecznej (back exchange) między próbkami. Przy instrumentacji MS użytej w tym protokole (Tabela materiałów i Informacje uzupełniające), większość etapów może być kontrolowana za pomocą oprogramowania instrumentu. Aby zapewnić uzyskanie precyzyjnych powtórzeń, zaleca się zautomatyzowanie jak największej liczby etapów przepływu pracy.
    1. Wyjmij pojedynczą referencyjną próbkę enzymu (przygotowaną zgodnie z krokiem 3.2) z zamrażarki i rozmroź w temperaturze 37 °C przez 1 min w kąpieli wodnej.
    2. Dokładnie 2 min po wyjęciu próbki z zamrażarki i rozmrożeniu, wstrzyknij 40 µL porcję zatrzymanej próbki referencyjnej do kolumny do ultra-wydajnej chromatografii cieczowej (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 µM) zawierającej fazę stacjonarną funkcjonalizowaną pepsyną (proteazą stabilną w środowisku kwasowym).
    3. Przeprowadź trawienie próbki przy szybkości przepływu 100 µL/min przez 3 min w temperaturze 15 °C, stosując jako rozpuszczalnik 0,1% kwas mrówkowy w H2O (pH = 2,5).
    4. Zbiór peptydów pepsynowych w trakcie ich elucji z kolumny z pepsyną na kolumnę pułapkową C18 utrzymywaną w temperaturze 0,4 °C w celu zminimalizowania wymiany wstecznej.
    5. Przenieś odsolone peptydy pepsynowe z kolumny pułapkowej na analityczną kolumnę C18 (1 mm x 100 mm, 1,7 µM, 130 Å) utrzymywaną i obsługiwaną w temperaturze 0,4 °C w celu rozdziału peptydów pepsynowych.
      UWAGA: Kroki 3.3.3−3.3.5 mogą być zautomatyzowane przez niektóre systemy LC-MS używane do akwizycji danych HDX-MS. Alternatywnie, kroki te można wykonywać niezależnie, pamiętając, że czas i temperatura każdego etapu muszą być starannie kontrolowane, aby osiągnąć konsekwentnie niską wymianę wsteczną.
    6. Eluuj kolumnę C18 za pomocą systemu rozpuszczalników acetonitryl/woda/0,1% kwas mrówkowy. Zoptymalizuj gradient LC dla badanego białka, aby zmaksymalizować rozdział i zachować znakowanie deuterem w peptydach pepsynowych.
      UWAGA: Szczegóły elucji gradientowej znajdują się w Informacjach uzupełniających.
    7. Poddaj trawienie pepsynowe spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylanie elektrostatyczne (ESI).
      UWAGA: Warunki źródła podane w Informacjach uzupełniających zapewnią wystarczającą jonizację dla większości peptydów pepsynowych.
      1. Po zjonizowaniu w instrumencie MS, wykonaj rozdział jonów w fazie gazowej za pomocą mobilności jonowej, używając azotu jako gazu buforowego, aby zwiększyć pojemność piko-metody.
      2. Po rozdziale mobilności jonowej, poddaj jony prekursorowe peptydów pepsynowych przepływowi pracy MSE, obejmującemu naprzemienne cykle niskiej energii kolizyjnej (4 V) i wysokiej energii kolizyjnej (21−40 V).
        UWAGA: Naprzemienne reżimy niskiej i wysokiej energii kolizyjnej pozwalają na jednoczesne zbieranie danych MS (niska energia kolizyjna) oraz danych MSMS (wysoka energia kolizyjna). Pozwala to z kolei na korelację czasową jonów prekursorowych z ich odpowiednimi jonami fragmentacyjnymi. Korelacja ta jest niezbędna dla pewnej identyfikacji peptydów opisanej w sekcji 4.
      3. Wykrywaj jony prekursorowe i fragmentacyjne peptydów, używając analizatora mas o rozdzielczości co najmniej 20 000.
      4. Równolegle z akwizycją danych, zbierz dane MS dla zewnętrznego standardu [Glu-1]-fibrinopeptydu B (GluFib).
        UWAGA: Przepływ pracy MS opisany w kroku 3.3.7 nazywa się protokołem MSE. Pełne ustawienia instrumentu dla protokołu MSE odpowiedniego dla HDX-MS bottom-up znajdują się w Informacjach uzupełniających.
    8. Oceń jakość danych LC-MS.
      UWAGA: Stosując powyższy protokół oraz ustawienia instrumentu podane w Informacjach uzupełniających, próbki referencyjne powinny przynieść całkowity chromatogram jonowy z maksymalną intensywnością sygnału około 1 x 108. Powinno występować wiele peptydów pepsynowych eluujących między 3 a 9 min (Rysunek 3A−C).
    9. Wstrzyknij 40 µL próbek ślepych (0,1% kwasu mrówkowego w wodzie), aby oczyścić kolumny z pepsyną i analityczną kolumnę C18.
      UWAGA: Generalnie 2−3 próby ślepe powinny być wystarczające.
    10. Powtórz kroki 3.3.1−3.3.9 dla każdej z trzech powtórzeń referencyjnych próbek białka.

4. Przetwarzanie danych referencyjnych i definiowanie listy peptydów

  1. Przeanalizuj surowe dane MSE (krok 3.3.7) przy użyciu oprogramowania proteomicznego (Tabela materiałów). W oprogramowaniu proteomicznym przejdź do Libraries | Protein Sequence Databanks, aby zdefiniować bazę białek poprzez import sekwencji aminokwasowej białka docelowego.
    UWAGA: Celem tego kroku jest przeszukanie referencyjnych danych MS w poszukiwaniu peptydów pepsynowych pochodzących z białka docelowego oraz wykorzystanie danych MSMS (pozyskanych jednocześnie z danymi MS) do walidacji wszelkich przypuszczalnych identyfikacji peptydów.
  2. Nadaj nazwę sekwencji białka docelowego. Zaimportuj sekwencję białka (w formacie FASTA). Oprogramowanie przeprowadzi trawienie in silico białka z bazy danych, aby wygenerować listę peptydów, które zostaną wykorzystane do przeszukiwania danych LC-MS.
  3. Zdefiniuj parametry przetwarzania (znajdujące się w menu Library). Wybierz Electrospray MSE jako typ akwizycji danych. W polu Lock Mass for Charge 2 wprowadź wartość 785.8426 dla m/z jonu 2+ [Glu-1]-fibrinopeptydu B (GluFib) i kliknij finish.
  4. Zdefiniuj parametry Workflow (znajdujące się w menu Library).
    1. Wybierz Electrospray MSE jako typ wyszukiwania. W sekcji Workflow | Database Search Query, w polu Databank wybierz białko z bazy danych utworzone w kroku 4.2.
    2. Zmień Primary Digest Reagent na „nonspecific” i wyczyść pole Fixed Modifier Reagent, przytrzymując przycisk Ctrl i klikając na Carbamidomethyl C.
  5. Określ katalog wyjściowy, przechodząc do options | automation setup | Identity E. Zaznacz pola Apex 3D and Peptide 3D Output oraz Ion Accounting Output i wskaż żądany katalog.
  6. Przetwórz dane z próbek referencyjnych.
    1. Na lewym pasku narzędzi obszaru roboczego platformy proteomicznej utwórz nową płytkę, klikając prawym przyciskiem myszy na Microtiter Plate. Zaznacz trzy studzienki na płytce mikrotitracyjnej (po jednej dla każdej próbki referencyjnej pobranej w sekcji 3). Kliknij lewym przyciskiem myszy w jednej studzience, przytrzymaj i przeciągnij do trzech studzienek.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz add raw data. W oknie, które się pojawi, przejdź do katalogu zawierającego trzy referencyjne pliki z sekcji 3 i zaznacz je jednocześnie.
    3. Kliknij next i wybierz parametry przetwarzania zdefiniowane w kroku 4.3. Kliknij next i wybierz parametry workflow zdefiniowane w kroku 4.4. Następnie kliknij finish.
  7. Gdy surowe dane, parametry przetwarzania i parametry workflow zostaną przypisane do każdej studzienki na płytce, studzienki zmienią kolor na niebieski. Zaznacz studzienki, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz process latest raw data. Kliknij w prawym dolnym rogu okna, aby śledzić przetwarzanie danych. Gdy pojawi się komunikat No job to run, przetwarzanie jest całkowicie zakończone.
  8. Po zakończeniu przetwarzania danych studzienki na płytce zmienią kolor na zielony. Kliknij prawym przyciskiem myszy na studzienki i wybierz view workflow results. Dla każdego referencyjnego pliku danych zostanie otwarte osobne okno.
  9. Przejrzyj dane, aby upewnić się, że większość sygnałów MS w danych próbek referencyjnych została pomyślnie przypisana do peptydów przewidzianych na podstawie trawienia in-silico białka docelowego. Dopasowane peptydy będą zaznaczone na niebiesko w widmie wyjściowym (Rycina 4). Dwukrotnie kliknij OK filter i sprawdź, czy stopień pokrycia (percent coverage) przekracza 99%.
    UWAGA: Po przetwarzaniu dane wyjściowe zostaną automatycznie zapisane z rozszerzeniem pliku (raw_data_file_name_IA_final_peptide) w katalogu określonym w kroku 4.5.
  10. Zaimportuj wyniki z oprogramowania proteomicznego do oprogramowania do przetwarzania HDX (Tabela materiałów) w celu dodatkowego ustalenia progów.
    1. Kliknij Data w lewym rogu okna oprogramowania do przetwarzania HDX. Kliknij import PLGS results, a następnie kliknij ikonę dodawania. Wybierz przetworzone pliki danych z kroku 4.9, przechodząc do odpowiedniego katalogu.
    2. Kliknij Next i określ następujące parametry: minimum consecutive ions ≥ 2, mass error = 5 ppm oraz file threshold = 3. Kliknij finish.
  11. Po ustaleniu satysfakcjonujących parametrów progowania zapisz projekt HDX. Wszystkie dane HDX zostaną zaimportowane do tego projektu w celu analizy i prezentacji.
    UWAGA: Próbki z wymianą deuteru opisane w następnej sekcji będą wymagały przetwarzania za pomocą identycznego workflow LC-MS. Dlatego przed przystąpieniem do analiz HDX (sekcja 5) należy upewnić się, że przygotowanie próbek (sekcja 2), workflow LC-MS bottom-up (sekcja 3) oraz workflow przetwarzania danych (sekcja 4) zapewniają pożądaną powtarzalność i pokrycie sekwencji białka docelowego. Jeśli którykolwiek z tych procesów wymaga zmiany w celu poprawy pokrycia, zaleca się powrót do kroku 2.1, przygotowanie nowych próbek referencyjnych w trzech powtórzeniach i powtórzenie sekcji 2–4 (wprowadzając niezbędne korekty do protokołu), aby upewnić się, że każdy peptyd może być powtarzalnie generowany i wykrywany.

5. Przeprowadzanie reakcji HDX

  1. Przygotuj stanowisko pracy do reakcji HDX.
    1. Rozlej bufor zatrzymujący (quench buffer) do odpowiednio oznakowanych probówek 0,5 mL. Przygotuj osobną probówkę dla każdego punktu czasowego, każdego powtórzenia i każdego badanego stanu biochemicznego. Użyj odpowiedniej objętości buforu zatrzymującego z kroku 2.2, niezbędnej do dostosowania końcowego odczytu pH 50 µL porcji reakcji HDX do wartości 2,3.
    2. Krótko odwiruj probówki 0,5 mL, aby przenieść cały bufor zatrzymujący na dno probówki. Umieść probówki na lodzie.
    3. Napełnij mały naczynie Dewarowskie ciekłym azotem i trzymaj je obok stanowiska pracy.
  2. Przygotuj reakcje HDX. Upewnij się, że objętość reakcji jest wystarczająca do pobrania pożądanej liczby punktów czasowych wymiany (jedna porcja 50 µL dla każdego punktu czasowego). Pobierz co najmniej 4–5 punktów czasowych obejmujących 3–4 rzędy wielkości w skali czasu (np. czasy zatrzymania 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1 800 s [30 min] i 14 400 s [4 h] zapewniają odpowiedni zakres dynamiki wymiany dla większości enzymów).
    1. Wymieszaj wcześniej wszystkie zdeuteryowane komponenty (z wyjątkiem enzymu) z kroku 1.1 w D2O.
    2. Dla każdego badanego stanu biochemicznego (wolny enzym, enzym + ligand, enzym + inhibitor itd.) przygotuj reakcje HDX w co najmniej trzech powtórzeniach.
    3. Inkubuj mieszaniny reakcyjne w łaźni wodnej z kontrolowaną temperaturą 25 °C przez 10 min przed dodaniem enzymu.
      UWAGA: Enzym powinien być przygotowany jako stężony roztwór zapasowy (~100–200 µM, krok 1.6), aby zminimalizować wprowadzanie protium do analizy HDX.
    4. Po dodaniu enzymu do stężenia końcowego 1–5 µM uruchom stoper. Ostrożnie i szybko wymieszaj roztwór za pomocą pipety 200 µL, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenienie enzymu w próbce.
    5. W wybranych punktach czasowych wymiany pobierz porcje 50 µL z reakcji HDX i szybko oraz dokładnie wymieszaj je z wcześniej rozdzielonym, lodowatym buforem zatrzymującym w probówce 0,5 mL.
      UWAGA: Objętości i procedura mieszania muszą być tak precyzyjne i powtarzalne, jak to tylko możliwe, aby zapewnić szybkie osiągnięcie pożądanego końcowego pH zatrzymania 2,3 we wszystkich próbkach. Utrzymywanie buforu zatrzymującego w temperaturze lodowej pomoże zminimalizować wymianę wsteczną podczas denaturacji enzymu.
    6. Natychmiast po zatrzymaniu reakcji HDX zamknij probówkę i zamroź ją błyskawicznie w ciekłym azocie.
    7. Kontynuuj pobieranie punktów czasowych, aż wszystkie analizy zostaną zakończone, a następnie przenieś próbki do zamrażarki -80 °C w celu przechowywania.
      UWAGA: Może to być punkt przerwania procedury. Po pobraniu wszystkich punktów czasowych HDX próbki mogą być przechowywane w -80 °C do czasu analizy LC-MS. Idealnie byłoby przeprowadzić potrójne reakcje HDX dla wszystkich interesujących stanów biochemicznych tego samego dnia. W minimum wszystkie powtórzenia reakcji HDX dla danego stanu biochemicznego powinny być prowadzone równolegle tego samego dnia.
  3. Po pobraniu wszystkich zatrzymanych punktów czasowych HDX poddaj próbki zoptymalizowanemu procesowi LC-MS typu bottom-up, opracowanemu zgodnie z opisem w kroku 3.3. Wstrzykuj próbki HDX w losowej kolejności z odpowiednią liczbą prób pustych między próbkami, aby zapewnić minimalny przeniesienie peptydów (carry-over).
    UWAGA: Dane HDX nie muszą być zbierane w trybie MSE. W związku z tym segment wysokiej energii kolizyjnej (krok 3.3.7.2) powinien zostać usunięty z cyklu pracy MS. Powinna to być jedyna zmiana wprowadzona do procesu opisanego w kroku 3.3.
  4. Oceniaj jakość danych HDX w miarę ich gromadzenia.
    1. Upewnij się, że piki chromatograficzne widoczne w całkowitym chromatogramie jonowym próbek referencyjnych niezdeuteryzowanych pojawiają się w tym samym czasie retencji w próbkach zdeuteryzowanych (jak na Rysunku 3D–F).
    2. Upewnij się, że widma mas zsumowane w określonych odstępach czasu dla próbek referencyjnych i zdeuteryzowanych wykazują dowody na deuterację (tzn. przesunięcie obwiedni izotopowej poszczególnych peptydów w stronę wyższych wartości m/z w próbkach zdeuteryzowanych [Rysunek 6]).

6. Przetwarzanie danych HDX

  1. Zaimportuj dane HDX do projektu HDX utworzonego w kroku 4.11, klikając Data | MS Files na górnym pasku narzędzi.
    1. W razie potrzeby kliknij New State oraz New Exposure, aby odpowiednio zdefiniować stany biochemiczne (np. wolny enzym, enzym + ligand itp.) oraz czasy ekspozycji na deuter powiązane z analizą.
    2. Kliknij New Raw, aby wybrać pliki danych HDX do analizy. Przypisz odpowiednie czasy wymiany i stan biochemiczny do każdego zaimportowanego pliku danych surowych.
      UWAGA: Dane można importować i przetwarzać partiami lub wszystkie naraz. Dodanie danych do projektu nie cofnie żadnej analizy przeprowadzonej wcześniej w ramach tego projektu.
  2. Po dodaniu plików z danymi kliknij finish, aby rozpocząć przetwarzanie danych. Po krótkiej chwili oprogramowanie zapyta, czy użytkownik chce zapisać dane przed kontynuacją. Kliknij yes.
    UWAGA: Wstępne przetwarzanie może potrwać do kilku godzin, w zależności od liczby analizowanych próbek, liczby peptydów w końcowej liście peptydów (krok 4.10), szerokości okna chromatograficznego oraz częstotliwości akwizycji widm.
  3. W razie potrzeby zmień parametry przetwarzania w menu Configuration, aby zmodyfikować parametry wyszukiwania jonów. Upewnij się, że dla wszystkich danych w danym projekcie zastosowano te same parametry wyszukiwania jonów.

7. Analiza i wizualizacja danych HDX

UWAGA: Po zakończeniu wstępnego przetwarzania surowych danych (krok 6.2), oprogramowanie do przetwarzania HDX zlokalizuje peptydy z listy peptydów (wygenerowanej w kroku 4.10) w każdym z analizowanych plików danych surowych. Gdy rozkład izotopowy dla danego peptydu z listy zostanie zlokalizowany w pliku danych surowych, oprogramowanie do przetwarzania HDX reprezentuje każdy izotop za pomocą „słupka” (jak na Rysunku 6C−E). Względne intensywności słupków dla danego peptydu są następnie wykorzystywane do obliczenia poboru deuteru w odniesieniu do widm referencyjnych. Choć oprogramowanie do przetwarzania HDX radzi sobie bardzo dobrze z prawidłowym przypisywaniem „słupków” do większości peptydów, nadal wymagana będzie znacząca ręczna korekta wartości poboru deuteru.

  1. Analiza wartości pobierania deuteru przez peptydy
    1. Wybierz pierwszy peptyd z listy peptydów i otwórz skumulowany wykres widm z menu Views. Przewijaj okno skumulowanego wykresu widm w górę i w dół, aby zobaczyć widma mas dla wybranego peptydu w funkcji czasu wymiany deuteru (Rysunek 7D,E).
    2. Przypisuj i cofaj przypisania linii (sticks) w razie potrzeby, klikając myszką, aby upewnić się, że w danych zlokalizowano właściwy rozkład izotopowy i że każdy pik izotopowy został przypisany (przypisane linie będą koloru niebieskiego). Kliknięcie dowolnego z widm na skumulowanym wykresie widm (Rysunek 7D,E) pozwoli użytkownikowi na przypisywanie/cofanie przypisań linii w aktywnym oknie przeglądarki danych (Rysunek 7C).
    3. Sprawdź przypisania linii dla każdego stanu ładunku, przełączając stan ładunku na górze okna skumulowanego wykresu widm.
    4. Powtórz kroki 7.1.1−7.1.3 dla każdego interesującego stanu biochemicznego. Stan biochemiczny można również przełączyć na górze okna skumulowanego wykresu widm. Aby uzyskać najdokładniejsze pomiary różnic w pobieraniu deuteru, upewnij się, że linie są przypisane dla tego samego zestawu stanów ładunku dla każdego stanu biochemicznego.
    5. Powtórz kroki 7.1.1−7.1.4 dla każdego peptydu z listy peptydów.
    6. Sprawdź odchylenie standardowe wartości pobierania deuteru przez peptydy za pomocą mapy pokrycia.
      1. Otwórz mapę pokrycia z menu Views, która wyświetla każdy peptyd z listy peptydów zmapowany wzdłuż sekwencji aminokwasowej badanego białka (Rysunek 8C). Pokoloruj peptydy zgodnie z względnym odchyleniem standardowym (jednostki Da).
      2. Wyszukaj wizualnie na mapie peptydy odstające o wysokim względnym odchyleniu standardowym. Kliknij peptydy odstające na mapie pokrycia, aby wypełnić skumulowane wykresy widm (Rysunek 8B) i okno przeglądarki danych (Rysunek 8A) docelowym peptydem.
      3. Korzystając ze skumulowanego wykresu widm, dokładnie sprawdź, czy wszystkie stany ładunku i wszystkie punkty czasowe peptydu odstającego mają odpowiednio przypisane linie.
        UWAGA: Najczęściej peptydy o dużych odchyleniach standardowych (>0,3 Da) mają piki izotopowe, którym oprogramowanie nie przypisało linii w odpowiedni sposób (jak wskazano na Rysunku 8B). Przypisanie brakujących linii zazwyczaj pozwoli zredukować względne odchylenie standardowe peptydu do poziomu <0,3 Da.
      4. Ukryj peptyd z listy, jeśli względne odchylenie standardowe nie może zostać zredukowane do wartości poniżej 0,3 Da.
  2. Eksport danych o różnicach w HDX pomiędzy dwoma stanami biochemicznymi w celu zmapowania ich na model strukturalny badanego białka.
    1. Wyświetl interesującą różnicę na mapie pokrycia. Kliknij prawym przyciskiem myszy na mapie pokrycia, aby wyeksportować dane o różnicach do pliku .csv. Eksportuj dane stanu (w formacie .csv), przechodząc do Data | Export State Data w głównym pasku narzędzi.
      UWAGA: Odpowiedni format plików z danymi o różnicach i danych stanu znajduje się w Supporting Information.
    2. Zaimportuj dane o różnicach, dane stanu oraz plik pdb badanego białka do programu Deuteros28. Wybierz 99% przedział ufności, zaznacz enable sum i przetwórz dane.
      UWAGA: Program MATLAB musi być zainstalowany na komputerze, aby uruchomić Deuteros. Deuteros wykorzysta pomiary powtórzone w zestawie danych do obliczenia odchylenia standardowego danych pobierania dla każdego peptydu. Odchylenie standardowe to zostanie użyte do zdefiniowania przedziału ufności dla istotnej wymiany, który zostanie wyświetlony na wykresach.
    3. W opcjach PyMOL wybierz export uptake | export, aby wygenerować skrypt Pymol służący do mapowania obszarów istotnych różnic w wymianie na strukturę pdb badanego białka za pomocą oprogramowania PyMOL.
      UWAGA: Stosując opisany w tym protokole schemat pracy, 99% przedział ufności dla istotnej różnicy w pobieraniu deuteru dla danego peptydu w pojedynczym punkcie czasowym wynosi zazwyczaj 0,3−0,5 Da. 99% przedział ufności dla różnicy zsumowanej po wszystkich punktach czasowych wymiany wynosi zazwyczaj 0,7−1,0 Da.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konieczna jest ocena jakości trawienia proteolitycznego oraz powtarzalności procedury dla każdego zestawu wstrzykiwanych próbek. Dlatego przed przeprowadzeniem analiz HDX-MS niezbędne jest ustalenie optymalnych warunków proteolizy badanego białka, rozdziału peptydów przy użyciu chromatografii cieczowej w fazie odwróconej i mobilności jonowej w fazie gazowej oraz detekcji peptydów za pomocą MS. W tym celu w pierwszej kolejności należy zbadać próbki referencyjne badanego białka (pobrane w obecności deuteru) (sekcja 3). Dan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przepływ pracy HDX-MS przedstawiony w tym protokole zapewnia niezwykle solidną platformę do mapowania przestrzennego rozkładu strukturalnie dynamicznych elementów w białkach oraz do badania, jak ta dynamika zmienia się w odpowiedzi na zaburzenia (wiązanie ligandów, mutageneza enzymatyczną itp.). HDX-MS ma kilka wyraźnych zalet w porównaniu z innymi podejściami biologii strukturalnej, które są powszechnie stosowane do badania dynamiki konformacji. Przede wszystkim potrzebne są tylko niewielkie ilości białka. Korzystając z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Kanadyjską Fundację Innowacji oraz fundusze start-upowe Uniwersytetu McGill.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
[glu-1]-fibrynopeptyd B (Glu-Fib)BioBasicNA
0,5 ml Urządzenie do filtracji odśrodkowej Amicon Ultracel 10k (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
acetonitrylFisherA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
Kwas mrówkowyThermo Fisher28905
guanidyna-HClVWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
Chlorek magnezuSiGMA-Aldrich63068-250G
ChlorekpotasuBioBasicPB0440
fosforan potasuBioBasicPB0445
TCEP ChlorowodorekTRC CanadaT012500peptyd został zsyntetyzowany na żądanie
Nazwa materiału<strong>FirmaNumer katalogowyUwagi/Opis
software
DeuterosAndy M C Lau, et alwersja 1.08
DynamXWaterswersja 3.0
MassLynxWaterswersja 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Waterswersja 3.0.3
PyMOLSchrö dingerwersja 2.2.2
Nazwa materiałuFirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
Przyrząd i wyposażenie
ACQUITY UPLC BEH C18 analityczny Wody kolumnowe186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Wody przedkolumnowe186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX SystemWaters
HDX ManagerWaters
pHThermo Fisher13-620-291
Waters Enzymat Kolumna BEH lub solumn pepsynyWody186007233
Wody Synapt Wody
mikrokońcówka Elektroda G2-Si

Bibliografia

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dynamika konformacyjna bia ekoddzia ywania enzym substratultrawydajna chromatografia cieczowaanaliza spektrometri maspomiar poboru deuterubiosynteza lantipeptyd wcharakterystyka strukturalna bia ek
Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.