Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2

28K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61054

⸱

22 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) to nowatorskie podejście do ilościowego wykrywania endogennych i egzogennie stosowanych wariantów białka MeCP2, które daje wysoce ilościowe, dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz- i międzytestowym w szerokim zakresie roboczym. W tym miejscu opisano protokół dla MeCP2-ECLIA w formacie 96-dołkowym.

Streszczenie

ECLIA to wszechstronna metoda, która jest w stanie określić ilościowo ilości endogennych i rekombinowanych białek w formacie 96-dołkowym. Aby wykazać skuteczność ECLIA, test ten wykorzystano do analizy wewnętrznych poziomów MeCP2 w tkance mózgowej myszy oraz wychwytu TAT-MeCP2 w ludzkich fibroblastach skóry. MeCP2-ECLIA zapewnia bardzo dokładne i powtarzalne pomiary z niskim błędem wewnątrz i między testami. Podsumowując, opracowaliśmy ilościową metodę oceny wariantów białka MeCP2, która może być wykorzystana w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych.

Wprowadzenie

Test immunologiczny elektrochemiluminescencji (ECLIA) opiera się na procesie, który wykorzystuje etykiety zaprojektowane do emitowania luminescencji podczas stymulacji elektrochemicznej. Jest to technika o szerokim zastosowaniu do ilościowego wykrywania analitów biologicznych w przemyśle podstawowym i badaniach akademickich, przemyśle spożywczym, a także w diagnostyce klinicznej1. Zwykle stosuje się jednorazową 96-dołkową płytkę z elektrodami z tuszem węglowym. Elektrody te działają jako nośnik fazy stałej dla testu immunologicznego. Przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone ze znacznikiem elektrochemiluminescencyjnym, a po przyłożeniu energii elektrycznej do systemu wyzwalana jest emisja światła znacznika chemicznego. Urządzenie sprzężone z ładunkiem o bardzo niskim poziomie szumów (CCD) rejestruje natężenie światła, które jest wprost proporcjonalne do antygenu związanego z przeciwciałem wychwytującym, co skutkuje kwantyfikacją docelowego analitu próbki2. W porównaniu z testem immunoenzymatycznym (ELISA), ECLIA jest uważana za korzystną, ponieważ oferuje wyższą czułość i odtwarzalność, a także lepszą automatyzację i spójność3.

Tutaj przeanalizowaliśmy poziomy białka wiążącego metylo-CpG 2 (MeCP2) w próbkach ludzkiego i mysiego pochodzenia, a także różne warianty rekombinowanego białka, korzystając z nowo opracowanego systemu ECLIA. MecP2 jest białkiem wiążącym kwasy nukleinowe sprzężonym z chromosomem X, o którym wiadomo, że oddziałuje z metylowanymi sekwencjami DNA. Białko to jest zaangażowane w regulację ekspresji genów4,5. Mutacje powodujące utratę funkcji w genie kodującym to białko są głównymi winowajcami powodującymi zespół Retta (RTT), poważne zaburzenie neurorozwojowe6. Inne zaburzenie związane z MeCP2, zespół duplikacji MECP2, również prowadzi do objawów neurologicznych, które mogą pokrywać się z objawami RTT7. Warto zauważyć, że kobiety są najczęściej dotknięte RTT, podczas gdy mężczyźni są głównie dotknięci zespołem duplikacji MECP26,7.

Te zaburzenia są związane z niewystarczającym lub nadmiernym poziomem MeCP2 odpowiednio w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W związku z tym opcje leczenia RTT, które obejmują zwiększenie poziomu MeCP2 w OUN, musiałyby unikać szkodliwych skutków związanych z nadmiarem MeCP27. Z tego powodu bardzo czuła i dokładna kwantyfikacja poziomów białka MeCP2, dostarczana przez system ECLIA, ma kluczowe znaczenie dla postępu badań nad RTT oraz zespołem duplikacji MECP2. W niniejszej pracy przedstawiono precyzyjne pomiary endogennych i egzogennych poziomów MeCP2 z ludzkich linii komórkowych i próbek tkanek myszy, a także rekombinowanego białka składającego się z ludzkiej izoformy B MeCP2 (znanej również jako izoforma e1) oraz minimalnej N-końcowej domeny transdukcji HIV-TAT (TAT-MeCP2), która ma potencjał do przekraczania bariery krew-mózg8,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgoda na pobieranie biopsji skóry do celów badawczych została uzyskana od Komitetu Etyki Badań Klinicznych Szpitala Dziecięcego w Westmead, Australia. Austriackie Federalne Ministerstwo Nauki, Badań Naukowych i Gospodarki uzyskało zgodę na przeprowadzanie doświadczeń na zwierzętach, które zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

UWAGA: Zasada działania systemu ECLIA jest przedstawiona w Rysunek 1.

1. Wybór przeciwciał

  1. Oceń stosunek sygnału do szumu dla szeregu różnych przeciwciał MeCP2 i zidentyfikuj najlepszą siłę sygnału i najwyższą swoistość w połączeniu pierwotnego mysiego przeciwciała monoklonalnego MeCP2 (klon Mec-168) i króliczego poliklonalnego przeciwciała wykrywającego MeCP2 (wykonane na zamówienie). W przypadku przeciwciała drugorzędowego należy użyć przeciwciała swoistego dla układu (tabela materiałów), które również zostało zweryfikowane doświadczalnie.
    UWAGA: Tabela 1 zawiera przegląd wszystkich zweryfikowanych przeciwciał podczas opracowywania MeCP2-ECLIA oraz ich testowanych zakresów rozcieńczenia.
funkcjanazwaklonRozcieńczeniu
podstawowyMysz anty-MeCP2Zobacz materiał MEC-1681:500−1:10 000
podstawowyMysz anty-MeCP2Pozycja 4B61:250−1:4,000
podstawowyMysz anty-MeCP2Mężczyźni-81:500−1:4,000
podstawowyMysz anty-MeCP2pozycji 1B111:500−1:4,000
podstawowyKrólik, anty-MeCP2D4F31:500−1:4,000
wtórnyKrólik, anty-MeCP2poliklonalny1:2 000−1:20 000
wtórnyKrólik, anty-MeCP2poliklonalny1:2 000−1:20 000
wykrywanieSULFO-TAG oznaczony anty-królikiempoliklonalny1:500−1:1,000

Tabela 1: Lista przeciwciał i użytych rozcieńczeń roboczych.

  1. Alternatywnie, użyj każdej pary przeciwciał MeCP2, która dobrze współpracuje z konwencjonalnym testem ELISA.

2. Leczenie HDF białkiem fuzyjnym TAT-MeCP2

UWAGA: TAT-MeCP2 był rekombinowany w Escherichia coli i oczyszczany przy użyciu standardowych technik chromatograficznych, jak wcześniej opisano8 i przechowywany w temperaturze -80 °C.

  1. Umieść 1 x 106 ludzkich komórek fibroblastów skórnych (HDF) na 100 mm szalkach i hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aż osiągną około 90% zbieżności.
  2. Wyjąć jedną fiolkę z białkiem fuzyjnym TAT-MeCP2. Rozmrozić na lodzie i delikatnie wymieszać.
  3. Rozcieńczyć TAT-MeCP2 do końcowego stężenia 500 nM w 50 ml pożywki hodowlanej HDF.
  4. Wyjąć pożywkę z szalek o średnicy 100 mm i inkubować komórki z 500 nM TAT-MeCP2 w temperaturze 37 °C przez różne okresy inkubacji do 24 godzin.
  5. Usunąć roztwór TAT-MeCP2 z komórek. Umyj komórki 2x wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
  6. Potraktuj komórki 2 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C10.
  7. Dodaj 6 ml pożywki hodowlanej HDF, aby dezaktywować trypsynę i zebrać komórki w probówkach o pojemności 15 ml.
  8. Granulować komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Usuń supernatant i umyj komórki 2x lodowatym DPBS. Przechowuj granulki na lodzie i przystąp do przygotowania próbki.

3. Przygotowanie próbki

  1. Lizaty HDF
    1. Określ najwyższe poziomy białka MeCP2 za pomocą metody REAP do subkomórkowego frakcjonowania do cytoplazmatycznych i jądrowych przedziałów subkomórkowych zgodnie z Suzuki et al.11. Ogranicz frakcjonowanie do nie więcej niż sześciu próbek na eksperyment.
  2. Lizaty mózgu myszy
    1. Przygotować 100 ml każdego hipotonicznego odczynnika do lizy i buforu ekstrakcyjnego.
      1. W przypadku odczynnika do lizy hipotonicznej dobrze wymieszaj 10 mM HEPES, 1,5 mM chlorku magnezu i 10 mM chlorku potasu.
      2. W celu uzyskania buforu ekstrakcyjnego dobrze wymieszaj 20 mM HEPES, 1,5 mM chlorku magnezu, 0,42 M chlorku sodu, 0,2 mM EDTA i 25% (v/v) glicerolu.
      3. Dostosować pH obu do 7,9.
      4. Dodaj 1 mM ditiotreitol (DTT) i 1x koktajl inhibitorów proteazy do obu na świeżo. Przed użyciem schłodzić na lodzie.
    2. Zawiesić 100 mg całkowitego mózgu myszy (szczep: C57BL/6J, samiec i samica typu dzikiego oraz B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygotyczny samiec i heterozygotyczna samica; wiek: 4−8 tygodni) w 1 ml lodowatego hipotonicznego odczynnika do lizy
      3. .
    3. Homogenizuj mózg za pomocą wstępnie schłodzonego, całkowicie szklanego homogenizatora tkankowego Dounce za pomocą 15 pociągnięć homogenizatora A (luźny, dla dużego klirensu) i B (ciasny, dla małego prześwitu).
    4. Przenieść homogenizowane komórki do czystej probówki i odwirować przy 10 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant (lub zachować go jako frakcję cytoplazmatyczną do dalszego wykorzystania).
    5. Zawiesić osad w 140 μl buforu ekstrakcyjnego na 100 mg materiału wyjściowego. Umieścić probówkę we wstępnie schłodzonym termobloku i delikatnie mieszać przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odwirować probówkę o masie 16 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (tj. frakcję jądrową) do nowej, wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia><. UWAGA: Stężenie białek w lizatach pochodzących z mózgu myszy i HDF można ocenić za pomocą testu białka BCA.

4. Protokół MeCP2-ECLIA

  1. Przygotowanie roztworu myjącego, buforu blokującego i roztworu rozcieńczalnika do oznaczania (dzień 1)
    1. Dodaj 500 μL Tween 20 do 1 L PBS, aby przygotować 0,05% roztwór Tween 20 in PBS, energicznie wymieszaj i oznacz jako "roztwór myjący".
      UWAGA: Upewnij się, że używany jest tylko świeżo przygotowany bufor myjący.
    2. Przygotować roztwór blokujący 3% blokera A (tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Wymieszaj delikatnie mieszając, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w lodówce do czasu użycia przez maksymalnie dwa tygodnie.
    3. Dodać 5 ml roztworu blokującego do 10 ml PBS, aby przygotować roztwór rozcieńczalnika do oznaczania (1% bloker A w PBS).
  2. Powlekanie płyt o wysokim stopniu wiązania
    1. Wyjmij 96-dołkową, wielomacierzową płytkę z pojedynczym miejscem wiązania.
      UWAGA: Płyty o wysokim wiązaniu mają większą zdolność wiązania, a tym samym większy zakres dynamiki niż standardowe płyty z powierzchniami hydrofobowymi.
    2. Rozmrozić mysie przeciwciało monoklonalne anty-MeCP2 na lodzie i zmieszać 0,67 μl przeciwciała z 4 ml PBS (rozcieńczenie przeciwciała 1:6 000 w PBS). Zmieszaj roztwór przeciwciała, aby dobrze wymieszał i oznacz probówkę jako "roztwór powlekający".
    3. Ostrożnie dozować 25 μl roztworu powlekającego w dolnym rogu każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego; nazywa się to metodą powlekania roztworem. Delikatnie postukaj w 96-dołkową płytkę z każdej strony, aby upewnić się, że roztwór powlekający pokrywa dno każdej studzienki.
    4. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i inkubować płytkę w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc (12−16 godzin).
  3. Blokowanie (dzień 2)
    1. Wyjmij talerz z lodówki i zdejmij folię.
    2. Usuń roztwór powlekający przeciwciało, wrzucając go do kosza na śmieci i postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby usunąć cały roztwór powlekający z dołków.
    3. Dodać 125 μl roztworu blokującego do studzienki. Ponownie uszczelnij płytkę i umieść ją na orbitalnej wytrząsarce do mikropłytek.
    4. Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej ze stałym wytrząsaniem przy 800 obr./min.
  4. Przygotowanie wzorców i próbek
    1. W czasie inkubacji należy przygotować wzorce białkowe MeCP2 i/lub TAT-MeCP2 oraz różne próbki.
      UWAGA: Bufor do lizy stosowany do rozcieńczania standardowego musi być taki sam, jak stosowany w analizowanych próbkach.
    2. Wyjąć jedną fiolkę z roztworem podstawowym białka MePC2 i/lub TAT-MeCP2 (250 μg/ml), lizatami mózgu myszy i lizatami HDF w temperaturze od -80 °C. Rozmrozić je na lodzie.
    3. Rozcieńczyć wzorcowy roztwór podstawowy (MeCP2 i/lub TAT-MeCP2) w czystych probówkach zgodnie z tabelą 2.
    4. Rozcieńczyć próbki w buforze do lizy w następujący sposób: 1−20 μg lizatu mózgu myszy na 25 μl buforu do lizy i 0,25−1 μg lizatu HDF na 25 μl buforu do lizy. Przygotować objętość każdej próbki wystarczającą do przeprowadzenia analizy w trzech egzemplarzach.
normakoncentracjaRozcieńczeniu
Norma 11 800 ng/ml1,08 μl wzorcowego roztworu podstawowego + 148,92 μl buforu do lizy
Standardowy 2600 ng/ml50 μL Standard 1 + 100 μL Bufor do lizy
Norma 3200 ng/ml50 μL Standard 2 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 466,67 ng/ml50 μL Standard 3 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 522,22 ng/ml50 μL Standard 4 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 67,41 ng/ml50 μL Standard 5 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 72,47 ng/ml50 μL Standard 6 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 80,82 ng/ml50 μL Standard 7 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 90,27 ng/ml50 μL Standard 8 + 100 μL Bufor do lizy
Standardowy 100 ng/ml150 μl Bufor do lizy

Tabela 2: Standardowe serie od 0 do 1,800 ng/ml.

  1. Dodawanie próbek i roztworów wzorcowych
    1. Usuń roztwór blokujący, wrzucając go do kosza na śmieci i postukaj talerzem o ręcznik papierowy, aby usunąć cały roztwór blokujący z dołków.
    2. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.
    3. Dodaj 25 μl wzorców i próbek do dolnego rogu studzienki za pomocą pipety jednokanałowej.
    4. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min.
  2. Nieznakowane przeciwciało wykrywające
    1. Rozmrozić poliklonalne królicze przeciwciało anty-MeCP2 na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:6 000 w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania.
    2. Wyjmij wzorce i próbki, wrzucając je do kosza na śmieci i postukając talerzem o ręcznik papierowy.
    3. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.
    4. Dodać 25 μl nieznakowanego przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę z ciągłym wstrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze pokojowej.
  3. Swoiste przeciwciało sprzężone
    1. Wyjmij określone przeciwciało drugorzędowe (tabela materiałów) z lodówki i umieść je na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:666.67 w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania i delikatnie wymieszać.
    2. Usuń wolne, nieoznakowane przeciwciało drugorzędowe, wrzucając je do kosza na śmieci i postukając w płytkę o ręcznik papierowy.
    3. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.
    4. Dodać 25 μl specyficznego sprzężonego przeciwciała (tabela materiałów) do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę z ciągłym wytrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze pokojowej.
  4. Odczytywanie tabliczki
    1. Usuń wolne sprzężone przeciwciało (tabela materiałów), wrzucając je do kosza na śmieci i postukając płytką o ręcznik papierowy.
    2. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego.
    3. Dodaj 150 μl 1x bufor do odczytu złota na bazie Tris (tabela materiałów) ze środkiem powierzchniowo czynnym zawierającym tripropyloaminę jako koreagent do wytwarzania światła do płytki. Należy unikać pęcherzyków powietrza, stosując techniki pipetowania wstecznego.
    4. Umieść płytkę na platformie do wykrywania mikropłytek (Tabela materiałów) i natychmiast rozpocznij pomiar. Użyj ustawień do akwizycji płytki 96-dołkowej.
    5. Przechwytywanie sygnałów elektrochemiluminescencyjnych przez wbudowaną kamerę CCD w systemie detekcji elektrochemiluminescencji (Tabela materiałów) i rejestrowanie liczby sygnałów, które odpowiadają względnym jednostkom światła (RLU) i są wprost proporcjonalne do natężenia światła.
      UWAGA: Po stymulacji elektrochemicznej etykieta rutenu związana z elektrodą węglową emituje światło luminescencyjne o długości fali 620 nm. Analizuj dane za pomocą oprogramowania dołączonego do przyrządu (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zasadę działania systemu ECLIA przedstawiono na Rysunku 1. Krzywe wzorcowe dla dwóch wariantów MeCP2 pokazano na Rysunku 2. Dokładna kwantyfikacja była możliwa w szerokim zakresie stężeń (1−1 800 ng/mL). Na Rysunku 3 zanalizowano poziomy białka MeCP2 w lizatach pochodzących z mózgu myszy i z HDF. Porównano ekspresję MeCP2 w lizatach jądrowych mózgu myszy heterozygotycznych, typu dzikiego oraz z linii knock-out na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zmierzyć endogenne poziomy MeCP2, rekombinowanego MeCP2 i TAT-MeCP2, opracowano 96-dołkową płytkę ECLIA. Wykazano, że utrata funkcji białka MeCP2 prowadzi do zespołu RTT6, w przypadku którego leczenie jest obecnie ograniczone do leczenia objawów i fizjoterapii. Jedną z obiecujących metod leczenia jest tak zwana terapia zastępcza białkami, w której poziom MeCP2 może być miareczkowany do wymaganego stężenia 12,13,14,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni dr Brigitte Sturm za jej wsparcie przy użyciu instrumentu ECLIA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-Ditiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnikaBio-Rad Laboratories Inc.500-0006Przygotowanie próbki
Wykrywanie AB SULFO-TAG oznakowane anty-króliczymMezo Scale DiagnosticsR32AB-1
Środowisko pracy do odkrywania przeciwciał 4.0Oprogramowanieskali Mezo
DMEM (1X)gibco firmy Life Technologies41966-029Przygotowanie próbki
Dulbecco' s PBS (sterylne)Sigma-AldrichD8537-500MLPrzygotowanie próbki, roztwór myjący, roztwór powlekający
EDTASigma-AldrichEDSBufor ekstrakcyjny
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF9665Przygotowanie próbki
GlicerolSigma-AldrichG2025Bufor ekstrakcyjny
do odczytu złota T (1x) ze środkiem powierzchniowo czynnymMeso Scale DiagnostykaR92TGMeCP2 Protokół ECLIA
HEPESSigma-AldrichH3375Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny
Zestaw młynków do tkanek KIMBLE DounceSigma-AldrichD8938Przygotowanie próbki
Wytrząsarka laboratoryjna, ruch kołyszący (niska prędkość)GFL3014Protokół MeCP2 ECLIA
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny
MeCP2 (Human) Rekombinowane białko (P01)Abnova CorporationH00004204-P01Leczenie komórkami
Pieczęć Microseal BBio-Rad Laboratories Inc.MSB1001do uszczelniania płytek
Monoklonalny anty-MeCP2, produkowany w myszy, klon Mec-168, oczyszczona immunoglobulinaSigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075Przeciwciało, roztwór powlekający
Bloker MSD Diagnostykaskali mezo BlokerR93BA-4Imager
MSD SECTOR Diagnostyka wskali mezoI30AA-0MeCP2
Wielomacierzowa 96-dołkowa płytkaDiagnostyka w skali mezoL15XB-3/L11BX-3MeCP2 Protokół ECLIA
Penicylina-Streptomycynagibco firmy Life Technologies15140122Przygotowanie próbki
Poliklonalny anty-MeCP2, wyprodukowany w królikuEurogentec S.A.specjalnie zaprojektowaneprzeciwciało
Chlorek potasu (KCl)Merck KGaA1049361000Odczynnik do lizy hipotonicznej
Primary AB Mouse, anty-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296Przeciwciało
pierwotne AB Mouse, anty-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411
Przeciwciało pierwotne AB Mouse, anty-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075
Przeciwciało pierwotne AB Mouse, anty-MeCP2 (Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235
Przeciwciało pierwotne AB Rabbit, anty-MeCP2 (D4F3)Technologia sygnalizacji komórkowej3456S; RRID:AB_2143849
Koktajl inhibitorów proteazy przeciwciał (100X)Sigma-Aldrich8340Odczynnik do lizy hipotonicznej, Bufor ekstrakcyjny
wtórny AB, Królik, anty-MeCP2Eurogentec S.A.niestandardowe
Przeciwciało Wtórne AB, Królik, anty-MeCP2Przeciwciało Merck07-013Chlorek
sodu (NaCl)Sigma-AldrichS3014Bufor ekstrakcyjny
SULFO-TAG Znakowane przeciwciało anty-królicze (koza)Diagnostyka w skali mezo PrzeciwciałoW0015528S
Białko fuzyjne TAT-MeCP2własnej produkcjiLeczenie komórkowe
Trypsyna EDTA 0,25% (1X)gibco firmy Life Technologies25200-056Leczenie komórkowe
Tween 20Sigma-AldrichP9416Roztwór myjący
do odkrywania EDS w 2400 Protokół ECLIA

Bibliografia

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test elektrochemiluminescencyjnyoznaczanie ilo ci bia ka MeCP2format 96 do kowypor wnanie z Western blotpor wnanie z ELISAroztw r pior cy Tween 20roztw r blokuj cy Blocker Amonoklonalne przeciwcia o anty MeCP2orbitalny wstrz sarka do mikrop ytekbufor odczytowy Tris Base Gold
Test oparty na elektrochemiluminescencji dla wariantów białka MeCP2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.