Artykuł metodologiczny

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61055

⸱

4 maja 2020

 ,  , 
1Research Unit Analytical BioGeoChemistry, Helmholz Zentrum München-German Research Center for Environmental Health, 2Department of Hematology and Medical Oncology, University Medical Center Göttingen (UMG), 3Institute of Pathology, University Medical Center Göttingen (UMG), 4RECIPE Chemicals + Instruments GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda specjacji żelaza redoks opiera się na elektroforezie kapilarnej - spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z układaniem próbek połączonym z krótką analizą w jednym przebiegu. Metoda szybko analizuje i zapewnia niskie limity oznaczalności dla form redoks żelaza w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych.

Streszczenie

Dyshomeostaza metabolizmu żelaza jest uwzględniona w patofizjologicznych ramach wielu chorób, w tym raka i kilku schorzeń neurodegeneracyjnych. Nadmiar żelaza powoduje powstawanie wolnego redoks aktywnego Fe(II) i może powodować niszczące skutki w komórce, takie jak stres oksydacyjny (OS) i śmierć w wyniku peroksydacji lipidów, znanej jako ferroptoza (FPT). Dlatego ilościowe pomiary żelaza (Fe(II)) i żelaza (Fe(III)) zamiast całkowitego oznaczania żelaza jest kluczem do bliższego wglądu w te szkodliwe procesy. Ponieważ oznaczanie Fe(II)/(III) może być utrudnione przez szybkie zmiany stanu redoks i niskie stężenia w odpowiednich próbkach, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), powinny być dostępne metody, które szybko analizują i zapewniają niskie granice oznaczalności (LOQ). Elektroforeza kapilarna (CE) ma tę zaletę, że umożliwia szybkie oddzielanie Fe(II)/Fe(III) i działa bez fazy stacjonarnej, która mogłaby zakłócać równowagę redoks lub powodować przywieranie analitu. CE w połączeniu ze spektrometrią mas ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS) jako detektorem zapewnia dalszą poprawę czułości i selektywności wykrywania. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się 20 mM HCl jako elektrolit tła i napięcie +25 kV. Kształty pików i granice wykrywalności stężeń są ulepszane dzięki układaniu w stosy przewodności i pH. W celu redukcji 56[ArO]+, ICP-MS operowano w trybie dynamicznej komory reakcyjnej (DRC) z NH3 jako gazem reakcyjnym. Metoda ta pozwala osiągnąć granicę wykrywalności (LOD) na poziomie 3 μg/L. Ze względu na układanie w stosy, możliwe było uzyskanie większych objętości iniekcji bez utrudniania separacji, ale z poprawą LOD. Kalibracje związane z powierzchnią piku były liniowe do 150 μg/L. Precyzja pomiaru wynosiła od 2,2% (Fe(III)) do 3,5% (Fe(II)). Precyzja czasu migracji wynosiła <3% dla obu gatunków, oznaczona w rozcieńczonych w stosunku 1:2 lizatach komórek ludzkiego nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y). Eksperymenty z odzyskiem z dodatkiem wzorca wykazały dokładność 97% Fe(III) i 105% Fe(II). W rzeczywistych próbkach biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy, czas migracji może się różnić w zależności od różnej przewodności (tj. zasolenia). W ten sposób identyfikacja piku jest potwierdzona przez dodanie wzorca.

Wprowadzenie

Dzisiaj najbardziej oczywiste jest, że stres oksydacyjny (OS) za pośrednictwem żelaza odgrywa kluczową rolę w wielu zaburzeniach, szczególnie w neurodegeneracyjnych zaburzeniach mózgu, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, a także w raku1,2,3,4. OS jest ściśle związany ze stanem i równowagą pary redoks Fe(II)/Fe(III). Podczas gdy Fe(III) jest nieaktywny redoks, Fe(II) silnie generuje reaktywne formy tlenu (ROS) poprzez katalizowanie rozkładuH2O2, po którym następuje produkcja rodników hydroksylowych i peroksydacja lipidów błonowych5,6. Na poziomie molekularnym ROS generowane przez Fe(II) i peroksydowane fosfolipidy stanowią silny atak na integralność białek, lipidów i DNA7,8. Wykazano, że taka szkodliwa dysfunkcja komórkowa indukuje dysfunkcję mitochondriów ze zmniejszoną zawartością ATP9 i może nawet wywołać zaprogramowaną martwiczą śmierć komórki, znaną jako ferroptoza (FPT)10,11. Dlatego ilościowa specjacja redoks Fe(II)/(III) ma ogromne znaczenie w szerokim spektrum zaburzeń związanych z redoks.

Specjacja chemiczna jest sprawdzonym narzędziem do badania biologicznej roli pierwiastków śladowych i metabolizmu w ogóle7,8 jak również w stanach neurodegeneracyjnych12,13,14,15,16,17. Metody specjacji Fe-redoks znalezione w literaturze są zwykle oparte na rozdzielaniu metodą chromatografii cieczowej (LC). W części literatury wykorzystuje się spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) jako detektor selektywny pierwiastków. Jednak w rutynowych pracach LC konieczne były zbyt długie czasy czyszczenia między cyklami. Jeszcze bardziej problematyczne jest to, że zmienność kolumn LC z partii na partię wymusiła ponowną optymalizację warunków elucji po każdej zmianie kolumny. Problemy te utrudniają wysoką przepustowość. Potrzebny jest dodatkowy czas, aby uzyskać akceptowalną wiarygodność i ponownie dokładnie ocenić metodę.

Aby obejść te wady, przedstawiono tutaj metodę specjacji redoks Fe(II)/Fe(III) opartą na elektroforezie kapilarnej ze spektrometrią mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (CE-ICP-MS). CE oferuje różne zalety w porównaniu do LC18. Kapilary nie mają fazy stacjonarnej, a zatem nie zależą (prawie) od tożsamości partii. Po starzeniu lub zablokowaniu są szybko wymieniane, wykazując zwykle niezmienioną wydajność. Etapy przedmuchiwania i czyszczenia między próbkami są skuteczne i krótkie, a czas analizy na próbkę jest również krótki.

Przedstawiona metoda jest wiarygodna z dobrymi wartościami merytorycznymi. Jako dowód słuszności zasady, metoda ta została zastosowana do lizatu komórkowego ludzkiego nerwiaka dopaminergicznego (SH-SY5Y), rodzaju próbki ważnej w neurodegeneracji, a także w badaniach nad rakiem19.

Protokół

OSTRZEŻENIE: W metodzie zastosowano kwas solny (HCl, rozcieńczalnia z czystości ultrapure, stężenie 1 M) oraz wodorotlenek tetrametylammonium (TMAH, rozcieńczalnia z czystości ultrapure, stężenie 25%). Obie substancje są silnie żrące. Należy stosować ochronę skóry i oczu.

1. Przygotowanie elektrolitów

  1. Przygotowanie elektrolitów HCl: elektrolit tła (20 mM HCl), elektrolit odpływowy (5 mM HCl) oraz elektrolit kończący (0,05 mM HCl)
    1. Przygotowanie 20 mM HCl w kolbie 100 mL: Odmierzyć pipetą 2 mL 1 M HCl do kolby, uzupełnić wodą ultrapure do kreski i delikatnie wymieszać.
    2. Przygotowanie 5 mM HCl w kolbie 100 mL: Odmierzyć pipetą 500 µL 1 M HCl do kolby, uzupełnić wodą ultrapure do kreski i delikatnie wymieszać.
    3. Przygotowanie 0,05 mM HCl w dwóch etapach: Odmierzyć pipetą 1 mL 20 mM HCl do kolby 100 mL, następnie uzupełnić wodą ultrapure do kreski i delikatnie wymieszać. Następnie odmierzyć pipetą 2,5 mL otrzymanego roztworu do probówki stożkowej 15 mL (Tabela materiałów) i dodać 7,5 mL wody ultrapure, a następnie delikatnie wymieszać.
  2. Przygotowanie elektrolitu wiodącego 12% TMAH w probówce stożkowej 15 mL: Odmierzyć pipetą 4,8 mL 25% TMAH do probówki, dodać 5,2 mL wody ultrapure i delikatnie wymieszać.
    UWAGA: Roztwór 12% TMAH służy do płukania i czyszczenia kapilary przed każdym pomiarem oraz jako elektrolit wiodący przed wstrzykniętą próbką).

2. Przygotowanie i przechowywanie standardów i próbek

  1. Standardy
    1. Dla Fe(II) odważyć 35,61 mg Fe(II)Cl2·4H2O do kolby 100 mL i dopełnić do kreski 100 mL wodą ultrapure, aby uzyskać stężenie roztworu zapasu 100 mg Fe(II)/L. Wstrząsać delikatnie aż do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Dla Fe(III) odważyć 29,04 mg Fe(III)Cl3 do kolby 100 mL i dopełnić do kreski 100 mL wodą ultrapure, aby uzyskać stężenie roztworu zapasu 100 mg Fe(III)/L. Wstrząsać delikatnie aż do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Rozcieńczyć każdy roztwór standardowy zgodnie z Tabelą 1, aby przygotować robocze roztwory standardowe.
      UWAGA: Po przygotowaniu dziennych roztworów zapasowych z roztworu zapasu 100 mg/L, ten ostatni należy przechowywać w zamrożeniu. Po przygotowaniu dziennych standardów zgodnie z Tabelą 1, roztwór zapasu 1 mg/L należy rozdzielić na alikwoty o objętości 1,5 mL i przechowywać w zamrożeniu (najlepiej bez pęcherzyków powietrza nad powierzchnią cieczy) w probówkach 1,5 mL. Każdego nowego dnia rozmraża się jedną porcję zapasu do przygotowania dziennych standardów, a po użyciu jest ona usuwana.
Stężenie początkoweObjętość pipetowanaDopełnić wodą Milli-QStężenie końcoweObjętość końcowaZastosowanie roztworu
100 mg/L50 µL4950 µL1 mg/L50 mLCodzienny roztwór zapasowy
1 mg/L200 µL1800 µL100 µg/L2 mLStandard
100 µg/L
1 mg/L100 µL1900 µL50 µg/L2 mLStandard
50 µg/L
1 mg/L50 µL1950 µL25 µg/L2 mLStandard
25 µg/L
1 mg/L25 µL1975µL12.5µg/L2 mLStandard
12.5 µg/l
1 mg/L20 µL1980µL10 µg/L2 mLStandard
10 µg/L
02000 µL0 µg/L2 mLPróba ślepa

Tabela 1: Schemat pipetowania do przygotowania standardów.

  1. Lizat komórek SH-SY5Y
    UWAGA: Lizat komórkowy (SH-SY5Y) posłużył jako bio-matryca istotna dla Fe(II)/(III) w celu wykazania wydajności i niezawodności metody.
    1. Należy wykorzystać lizat z wcześniej przeprowadzonych eksperymentów16. Należy przestrzegać tej procedury przygotowania lizatu komórkowego, unikając zmian pH lub stosowania chemikaliów, które mogłyby wpłynąć na równowagę redoks. Należy użyć zmodyfikowanego buforu do lizy dla testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (PBS pH 7.4, 0,5% deoksycholan sodu, 1% NP-40), unikając chelatorów metali (takich jak EDTA), czynników redukujących (takich jak DTT, 2-merkaptoetanol) oraz anionowych detergentów powierzchniowo czynnych i środków kompleksujących metale (takich jak SDS), aby zminimalizować zmiany stosunku Fe(II)/Fe(III) po pobraniu próbek.
    2. Należy pracować w atmosferze N2, aby zahamować utlenianie przez O2 z powietrza otoczenia, oraz pracować w lodzie, aby zminimalizować jakąkolwiek autooksydację, aż do momentu jak najszybszego przechowywania lizatu w temperaturze -80 °C w atmosferze azotu.

3. Konfiguracja aparatury do sprzężenia CE z ICP-MS

  1. Przygotuj aparat do elektroforezy kapilarnej.
    UWAGA: W tej sekcji czytelnik jest odsyłany głównie do instrukcji obsługi odpowiedniego urządzenia dostępnego w laboratorium.
    1. Zainstaluj kapilarę o odpowiedniej długości, aby sięgała od fiolki wlotowej urządzenia CE do nebulizera ICP-MS. Zainstaluj kapilarę tylko po stronie wlotowej i wyprowadź ją na zewnątrz urządzenia w stronę interfejsu CE-ICP-MS.
      UWAGA: W celu połączenia CE z ICP-MS w niniejszym protokole zastosowano kapilarę kwarcową o długości 90 cm (średnica wewnętrzna 50 µm) zainstalowano zgodnie z ogólnym opisem konfiguracji aparatury. Zazwyczaj wymagane będą kapilary o długości od 70 do 100 cm, w zależności od rozmieszczenia przyrządów w laboratorium.
    2. Dezaktywuj w oprogramowaniu mechanizm podnoszenia wylotu instrumentu CE, aby zapewnić płynną pracę, ponieważ nie jest on używany, gdy kapilara jest skierowana na zewnątrz do interfejsu CE-ICP-MS.
    3. Podłącz kabel wyzwalający z wyjścia trigger-OUT instrumentu CE do wejścia trigger-IN instrumentu ICP-MS.
    4. Wybierz pozycje dla wszystkich niezbędnych roztworów (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), wzorców i próbek w próbniku. & rotor z roztworami do instrumentu i zdefiniuj ich pozycje w oprogramowaniu instrumentu zgodnie z procedurą (zob. instrukcję obsługi instrumentu).
    5. Ustaw temperaturę rotora i kapilary na taką samą wartość wynoszącą 20 °Cjako tożsamą z kontrolowaną temperaturą laboratoryjną.
      UWAGA: Wewnątrz i na zewnątrz urządzenia CE nie występuje gradient temperatury w częściach kapilarnych.
  2. Konfiguracja instrumentu ICP-MS
    1. Zoptymalizuj instrument ICP-MS zgodnie z codziennymi procedurami konfiguracji i eksploatacji standardów instrumentalnych. Należy zastosować protokół producenta.
    2. Zastosuj technologię dynamicznej komory reakcyjnej (DRC) z użyciem NH33 jako gaz DRC, z przepływem NH3 wynoszącym 0,6 ml/min3–natężenie przepływu oraz wartość RPq = 0,45.
      UWAGA: W celu określenia formy żelaza zaprogramowano metodę z 56Fe, będąc najliczniejszym izotopem Fe (obfitość względna 91,754%), wykazuje jednak silne zakłócenia spowodowane przez [40Ar16O]+ klaster. ICP-MS oparty na kwadrupolu w trybie standardowym jest praktycznie nieczuły, a detektor ulega nasyceniu przy tym izotopie. Dzięki powyższym ustawieniom (patrz krok 3.2.2) uzyskano niskie linie bazowe i wysoką czułość (dla standardowego oznaczania całkowitej zawartości żelaza osiągnięto granicę wykrywalności LOD w niskim zakresie ng/L).
    3. Wybierz czas przebywania (dwell time) dla każdego izotopu wynoszący 50 ms, aby monitorować nawet wąskie i krótkie piki podczas rozdziału metodą elektroforezy kapilarnej (CE).
    4. Zaprogramuj metodę ICP-MS tak, aby była uruchamiana automatycznie przez instrument CE.
  3. Konfiguracja interfejsu CE-ICP-MS
    UWAGA: Istnieją głównie dwie opcje połączenia kapilary CE z ICP-MS. W przypadku użycia komercyjnego interfejsu należy postępować zgodnie z dostarczonymi opisami konfiguracji. Niniejszy protokół wykorzystuje prosty, wykonany samodzielnie interfejs, oparty na wcześniejszej publikacji po wprowadzeniu modyfikacji.20Kluczowymi kwestiami są efektywna nebulizacja z możliwie mniejszym rozcieńczeniem wypływu kapilarnego, poza dostosowaniem całkowitego natężenia przepływu do nebulizera w celu uzyskania optymalnej nebulizacji. Ponadto niezbędne są minimalizacja przepływu ssącego przez kapilarę oddzielającą, wywołanego samoczynnym zasysaniem z nebulizera, oraz zapewnienie połączenia elektrycznego uziemowanej elektrody wylotowej z końcem kapilary.
    1. Wybór nebulizatora
      1. Należy użyć nebulizatora koncentrycznego o niskiej objętości samozasysającej (np. 100 µL/min), który pasuje do komory rozpylnej o małej objętości.
        UWAGA: Niski poziom poboru spowoduje jedynie umiarkowane rozcieńczenie wypływu kapilarnego, przebiegającego równolegle do wciąż optymalizowanej nebulizacji. Połączenie elektryczne elektrody wylotowej jest realizowane poprzez przepływ elektrolitu wokół elektrody wylotowej oraz końcówki kapilary.
      2. Wykorzystaj samozasysanie nebulizatora, aby zminimalizować ssanie przez kapilarę rozdzielającą i dostosować natężenie przepływu do optymalnej wartości wymaganej przez nebulizator.
      3. Przygotuj następujące części z Tabela 2 do zamontowania tego interfejsu własnej konstrukcji.
    2. Konfiguracja prostego interfejsu
      UWAGA: Użyj Rysunek 1 należy postępować zgodnie z opisem montażu części dla prostego interfejsu. Numery w Rysunek 1 oraz w poniższym tekście odnosić się do numerów w Tabela 2.
      1. Rozpocznij montaż interfejsu, łącząc dwa żeńskie złącza Luer 3-drożne (nr 3) za pomocą męskiego złącza stożkowego Luer (nr 4). Połącz lewy koniec dolnej listwy Luer 3-drożnej z złączem męskim, a następnie go ze środkowym przyłączem górnego złącza Luer 3-drożnego.
      2. Na drucie platynowym (nr 7) umieść rurkę o długości 1 cm (nr 1), a następnie na powyższych elementach oraz na dyszy męskiego złącza Luer (nr 2) umieść rurkę silikonową o długości 1 cm (nr 5). Cały zespół przymocuj do środkowego przyłącza dolnego trójdrożnego złącza Luer (nr 3), stosując charakterystyczny dla złączy Luer ruch obrotowy wkręcający.
      3. Nasunąć rurkę o długości 1 cm (nr 1) na koniec wylotowy kapilary CE i ustawić ją w odległości około 8–9 cm od końca.
      4. Nałóż rurkę silikonową o długości 1 cm (nr 5) na wspomniany element oraz na dyszę męskiego złącza Luer (nr 2).
      5. Przełóż cały zestaw z lewej strony przez ramię górnego trójnikowego złącza T, a następnie zamocuj męski konektor Luer oraz lewy koniec żeńskiego trójnikowego konektora Luer (nr 3), wykonując typowy dla złączy Luer ruch skręcania.
      6. Przymocuj 25-centymetrową rurkę silikonową (nr 5) do króćca męskiego złącza Luer (nr 2), a następnie przymocuj cały zespół do dolnego (prawego) końca pręta, łącząc go z dolnym 3-drożnym złączem Luer (nr 3) poprzez typowy dla złączy Luer ruch obrotowy wkręcający.
      7. Należy wziąć 1-centymetrową rurkę silikonową (nr 6) i ciasno nasunąć ją na końcówkę nebulizatora na odległość 5 mm, podczas gdy drugi męski konektor Luer (nr 4) musi być szczelnie wciśnięty w wystającą część rurki silikonowej.
      8. Następnie przesuń zamontowaną część interfejsu wraz z wystającą kapilarą CE do stożka męskiego nebulizera. Ostrożnie wprowadź kapilarę CE przez stożek męski, a następnie przez szerszą część kapilary nebulizera, aż do miejsca jej zwężenia. Jeśli długość wystającej części kapilary została dobrana odpowiednio, górny żeński trójdrożny konektor Luer powinien teraz ściśle przylegać do stożka męskiego.
      9. W razie potrzeby skorygować długość wystającej kapilary, przesuwając ją (do przodu/do tyłu) w rurce (nr 1) w miejscu wchodzenia do wykonanego samodzielnie interfejsu.
        UWAGA: Optymalne położenie kapilary CE na początku kapilary nebulizatora nie jest kwestią krytyczną. Należy jednak uważać, aby nie wsunąć kapilary CE zbyt głęboko w zwężającą się część kapilary nebulizatora. Mogłoby to utrudnić lub zablokować przepływ elektrolitu wylotowego. Ponadto przerwałoby to połączenie elektryczne z elektrodą wylotową i zwiększyło ssanie przez kapilarę CE, co doprowadziłoby do zaburzenia rozdziału. Z drugiej strony, koniec kapilary CE nie może znajdować się zbyt daleko od kapilary nebulizatora, ponieważ w przeciwnym razie wąskie piki rozdziału uległyby poszerzeniu, a rozdzielczość zostałaby utracona.
      10. Użyj soczewki, aby zidentyfikować optymalną pozycję.
        UWAGA: Rycina 1 (prawy dolny róg) przedstawia optymalne położenie kapilary CE wewnątrz nebulizatora.

figure-protocol-1
Rycina 1: Schemat i montaż interfejsu CE-ICP-MS. Schemat przedstawia poszczególne elementy służące do etapowego montażu prostego i taniego interfejsu CE-ICP-MS. Okno pokazuje zdjęcie optymalnego rozmieszczenia kapilary CE w nebulizatorze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Nie.Częśćstosowane do
1Przewód (kod kolorystyczny zielono-pomarańczowy), 2 x ok. 1 cmmocowanie kapilary CE i elektrody wylotowej w elementach Luer oraz zapewnienie ich szczelności
2Luer, męski, 3 szt., odpowiedni do rurek silikonowych o średnicy wewnętrznej 1,6 mmpodłączenie rurki silikonowej do wylotu elektrolitu oraz jako pomoc w mocowaniu kapilary CE i elektrody z drutu Pt
3zawór trójdrożny Luer, żeński, 2 xTrójniki do połączenia elektrody, kapilary i wylotu przepływu ssącego
4stożek Luera, męski, 2 xłączenie ze sobą żeńskich złączy Luer oraz ich połączenie z nebulizatorem
5Rurka silikonowa, ID 1,6 mm, ścianka 0,8 mm, 2 x 1 cm, 1x ok. 25 cma)      1 cm; mocowanie kapilary CE do interfejsu,
b)      1 cm; mocowanie drutu platynowego (Pt) do interfejsu
c)      25 cm; połączenie od wylotu kolby z elektrolitem do interfejsu
6Rurka silikonowa, 3 mm średnicy wewnętrznej, ścianka 1,2 mm, ok. 1 cmdokręcanie stożka Luera do nebulizatora
7Drucik platynowyElektroda wylotowa

Tabela 2: Części do budowy prostego, samodzielnie wykonanego interfejsu CE-ICP-MS. Numery odnoszą się również do Rysunku 1 oraz opisu w tekście.

4. Przygotowanie do pomiaru

UWAGA: Przed pomiarem kapilarę należy przepłukać silnym roztworem zasadowym (tutaj: 12% TMAH) w celu oczyszczenia, a następnie wypełnić elektrolitem tła. W celu poprawy rozdziału, wokół próbki tworzona jest warstwa buforu do zagęszczania (stacking buffer sandwich) w oparciu o gradienty przewodności i pH. Tabela 3 podsumowuje kolejne etapy przygotowania kapilary, które są realizowane automatycznie przez instrument zgodnie z zaprogramowaną metodą:

Nr krokuKrokchemicznywarunek
 Przygotowanie kolumny do elektroforezy kapilarnej (CE)
Przygotowanie 1Czyszczenie kapilar12% TMAH4 bary, 1 min.
Przygotowanie 2Płukanie kapilary elektrolitem tła20 mM HCl4 bary, 1 min.
Przygotowanie 3Stosowanie: elektrolit wiodący12% TMAH150 mbar, 3 s
Przygotowanie 4WstrzykiwaniePróbka150 mbar, 3 s
Przygotowanie 5Układanie: elektrolit końcowy0,05 mM HCl150 mbar, 3 s

Tabela 3: Etapy przygotowania kapilary przed pomiarem. Kroki te są zaprogramowane w oprogramowaniu systemu CE w ramach metody CE i obejmują wtryskiwanie próbki pod ciśnieniem oraz tworzenie tzw. „kanapki przeładunkowej” (stacking sandwich) wokół próbki.

  1. Zaprogramuj metodę CE, która będzie kolejno wykonywać kroki podane w Tabeli 3.
  2. Zdefiniuj tabelę próbek oraz sekwencję w oprogramowaniu CE, a następnie skopiuj tę sekwencję do oprogramowania ICP-MS.

5. Pomiar i ewaluacja danych

  1. Uruchom metodę w urządzeniu do elektroforezy kapilarnej (CE). Po zaprogramowanym przygotowaniu i napełnieniu kapilary pomiar rozpoczyna się automatycznie, gdy fiolka wejściowa zawierająca 20 mM HCl znajdzie się w pozycji przy wlocie kapilary. Do spektrometru ICP-MS wysyłany jest sygnał startowy („Start-trigger”), który uruchamia monitorowanie izotopów Fe w trybie on-line.
    UWAGA: Rozdział odbywa się przy napięciu +25 kV. Zwiększona długość kapilary, niezbędna do połączenia urządzenia CE ze spektrometrem ICP-MS, powoduje niepotrzebne wydłużenie czasu rozdziału. Dlatego rozdziałowi wspomaga niskie ciśnienie 250 mbar na wlocie. Elektrolitem samoczynnie zasysanym na wylocie jest 5 mM HCl. Całkowity czas analizy dla próbek o umiarkowanej przewodności wynosi 3 minuty. W oknie sygnału oprogramowania ICP-MS podczas pomiaru można obserwować elektroferogram. Po analizie każdej próbki automatycznie generowane są dwa pliki danych: jeden dostępny wyłącznie w oprogramowaniu urządzenia z wewnętrznej bazy danych, a drugi w folderze eksportu w formacie „.xl” lub „.txt”, dostępny za pomocą funkcji importu w standardowym oprogramowaniu do chromatografii.
  2. W celu eksportu plików do oprogramowania do chromatografii należy zapoznać się z instrukcją obsługi oprogramowania urządzenia ICP-MS.

Wyniki

Pomiary wzorców i kalibracja
Czasy migracji określono poprzez pojedyncze wstrzyknięcia wzorców: wzorzec Fe(III) monitorowano przy czasie migracji 118 s, a wzorzec Fe(II) przy czasie migracji 136 s. Granice wykrywalności obliczono przy użyciu kryterium 3σ w odniesieniu do szumu linii bazowej i stężenia wzorca 50 µg/L. LOD(Fe(II) wyniosła 3,1 µg/L, a LOD(Fe(III) wyniosła 3,2 µg/L. Kalibracja oparta na powierzchni piku dla obu form żelaza była liniowa od LOD do 150 µg/L. Podczas gdy liniowość Fe(III) została potwierdzona również dla wyższych stężeń, nachylenie krzywej kalibracyjnej dla Fe(II) zmalało. Górną granicę stężenia 150 µg/L uznano za wystarczającą, ponieważ próbki biologiczne istotne dla oznaczania Fe(II)/(III) zazwyczaj charakteryzują się niższym stężeniem Fe. W przypadku wyższych stężeń próbki można odpowiednio rozcieńczyć. Kalibracja oparta na wysokości piku została sprawdzona do 600 µg/L i wykazała liniowość w całym testowanym zakresie. Przedstawiono to na Rysunku 2.

figure-results-1
Rysunek 2: Krzywe kalibracyjne (wysokość piku) dla Fe(III) i Fe(II). Kalibracje związane z wysokością piku dla obu gatunków redoks Fe są liniowe ze nachyleniem wynoszącym ok. 161 *X Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza lizatu komórek SH-SY5Y
Analiza lizatu komórek SH-SY5Y wykazała nieco wolniejszą migrację form redoks żelaza ze względu na nieco wyższą przewodność. Fe(III) monitorowano w 124 s czasu migracji, a Fe(II) w 158 s czasu migracji. Precyzja czasu migracji w lizacie komórek SH-SY5Y wyniosła 2% dla Fe(III) i 3% dla Fe(II). Ilościowe pomiary Fe(II) i Fe(III) tą metodą ujawniły stężenie Fe(III) na poziomie 330 µg/L oraz stężenie Fe(II) wynoszące 84 µg/L, co w obu przypadkach dało stosunek Fe(II)/Fe(III) równy 0,25. Odpowiedni elektroferogram selektywny dla 56Fe przedstawiono na Rysunku 3.

figure-results-2
Rysunek 3: 56Fe-specyficzny elektrogram lizatu komórek SH-SY5Y. Fe(III) jest monitorowane w 123 s, osiągając wysokość piku 58025 cps, będąc wyraźnie oddzielonym od Fe(II) w 158 s, osiągającego 22800 cps Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ponieważ żelazo odgrywa znaczącą rolę w progresji OS, ułatwiając w ten sposób dysfunkcję mitochondriów lub FTP, w artykule przedstawiono wszechstronną metodę ilościową opartą na CE-ICP-MS do jednoczesnej specjacji Fe(II)/Fe(III), a jej zastosowanie zostało przykładowo wykazane w lizatach komórkowych. Metoda ta zapewniła krótki czas analizy, a wartości liczbowe (LOQ, precyzja, odzysk) są odpowiednie dla próbek istotnych dla specjacji redoks żelaza, szczególnie w badaniach nad neurodegeneracją i rakiem. W porównaniu z poprzednimi metodami opartymi na LC, ta metoda oparta na CE jest praktycznie niezależna od partii kolumn i wcześniej obserwowanych problemów z odtwarzalnością po zmianie kolumny LC. Przygotowanie kapilarne przed każdym serią trwa <4 minuty, a czas analizy na próbkę o umiarkowanym zasoleniu do 3 minut. Oprócz ładunku i wielkości cząsteczki, czas migracji w CZE zależy od przewodności w czopie próbki, co powoduje zmiany w czasie migracji lub przesunięcia, gdy same próbki mają znaczny wpływ na przewodność. Takie przesunięcia w czasie migracji są dobrze znane w elektroforezie kapilarnej. Jest to problem CZE-immanentny, znany z literatury 21,22. Wzorce i lizaty komórkowe SH-SY5Y charakteryzowały się umiarkowaną i jednorodną przewodnością. W związku z tym czasy migracji wykazały tylko niewielkie zmiany z dobrą precyzją. Jednak w przypadku próbek o wysokiej przewodności można zaobserwować wydłużony czas migracji do 5 minut. W związku z tym zaleca się stosowanie standardowych dodatków w celu jednoznacznej identyfikacji gatunków.

Krytycznym zagadnieniem w specjacji żelaza redoks jest stabilność gatunkowa (tj. utrzymanie równowagi Fe(II)/(III)) podczas przygotowywania próbki 8,13. Niewłaściwe pH lub chelatujące chemikalia, a także niewłaściwe warunki przechowywania, takie jak tlen (powietrze) w kontakcie z próbką lub przerwa w przechowywaniu w głębokim mrożeniu, mogą łatwo zmienić równowagę Fe(II)/(III). Dlatego do przygotowania lizatów komórkowych SH-SY5Y wybrano bufor do lizy bez żadnych chelatujących substancji chemicznych, fizjologicznego pH, ale nałożono gaz obojętny podczas przygotowania próbki, w pojemnikach na próbki, a do tych próbek zastosowano natychmiastowe głębokie mrożenie.

W piśmiennictwie można znaleźć półilościowe podejścia do monitorowania Fe(II). Aby lepiej zrozumieć rolę żelaza w stresie oksydacyjnym, kilka grup badawczych opracowało sondy specyficzne dla Fe(II) do półilościowego monitorowania i wizualizacji nieprawidłowego wzrostu żelaza żelazowego in vitro. Należy jednak zauważyć, że takie sondy nie uwzględniają Fe(III) i nie określają ilościowo, ale podają tylko "więcej" lub "mniej" Fe(II)). Do tej pory dostępnych jest tylko kilka biomarkerów do określenia OS i FPT, co wynika z braku wiarygodnych metod jednoczesnego ilościowego oznaczania gatunków redoks Fe(II)/Fe(III)23,24. Mając to na uwadze, przedstawiona metoda - ułatwiająca szybkie oznaczanie ilościowe zarówno Fe(III), jak i Fe(II) w jednym przebiegu - może stać się obiecującym narzędziem do pogłębienia wglądu w procesy molekularne zależne od żelaza.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

VV było wspierane przez grant badawczy (Forschungsförderung) Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Getyndze oraz program badawczy Else Kröner Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Serwis chromatografii kapilarnej CELangerwehe, Niemcy105180-25
System CETechnologie PrinCe0005.263model PrinCe 760
Stożkowe probówki Superclear 15 mlAnalytics-shop.com firmy Altmann AnalytikPEN0777704
Stożkowe probówki Superclear 50 mlAnalytics-shop.com firmy Altmann AnalytikPEN0777694
FeCl2 * 4H2OMerck103861
FeCl3Merck803945
Fluidflex Silikon HG-SchlauchProLiquid4001106HG
Kapilara z topionej krzemionki OD 360 µ m, ID 50 i mikro; mChromatographie Service GmbH105180-25
kwas solny, 1 MMerck1101652500
ICP-MSPerkin ElmerN814003
Luer, 3-drożny żeńskiBioRad7318229
Luer, stożek męskineoLab Migge2-1895
Luer, męskineoLab Migge2-1880
Oprogramowanie do oceny wartości szczytowych PeakfitSystatPeakFit 4.12
Pt-wireCarl Roth0737.1
Rura PVCProLiquid6000002
bufor RIPAAbcamab156034
Wodorotlenek tetrametyloamonu, 25 %Merck814748
rura TYGON R-3607ProLiquid3700203A
,

Bibliografia

  1. Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
  2. Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
  3. Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
  4. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
  5. Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
  6. Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
  7. Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
  8. Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
  9. Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
  10. Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
  11. Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
  12. Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
  13. Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
  14. Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
  15. Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
  16. Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
  17. Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
  18. Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
  19. Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  20. Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
  21. Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
  22. Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
  23. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
  24. Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Detekcja ICP MSoznaczanie ilo ciowe Fe II i Fe IIIuk ad przewodno pH stakowaniedynamiczna komora reakcyjnagranica wykrywalno cikrzywe kalibracyjneprecyzja czasu migracjimetoda dodatku wzorca

Powiązane artykuły