Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

Bernhard Michalke; Desiree Willkommen; Vivek Venkataramani

doi:10.3791/61055

Artykuł metodologiczny

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61055

⸱

4 maja 2020

Bernhard Michalke¹ , Desiree Willkommen¹^,⁴ , Vivek Venkataramani²^,³

¹Research Unit Analytical BioGeoChemistry, Helmholz Zentrum München-German Research Center for Environmental Health, ²Department of Hematology and Medical Oncology, University Medical Center Göttingen (UMG), ³Institute of Pathology, University Medical Center Göttingen (UMG), ⁴RECIPE Chemicals + Instruments GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda specjacji żelaza redoks opiera się na elektroforezie kapilarnej - spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z układaniem próbek połączonym z krótką analizą w jednym przebiegu. Metoda szybko analizuje i zapewnia niskie limity oznaczalności dla form redoks żelaza w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych.

Streszczenie

Dyshomeostaza metabolizmu żelaza jest uwzględniona w patofizjologicznych ramach wielu chorób, w tym raka i kilku schorzeń neurodegeneracyjnych. Nadmiar żelaza powoduje powstawanie wolnego redoks aktywnego Fe(II) i może powodować niszczące skutki w komórce, takie jak stres oksydacyjny (OS) i śmierć w wyniku peroksydacji lipidów, znanej jako ferroptoza (FPT). Dlatego ilościowe pomiary żelaza (Fe(II)) i żelaza (Fe(III)) zamiast całkowitego oznaczania żelaza jest kluczem do bliższego wglądu w te szkodliwe procesy. Ponieważ oznaczanie Fe(II)/(III) może być utrudnione przez szybkie zmiany stanu redoks i niskie stężenia w odpowiednich próbkach, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), powinny być dostępne metody, które szybko analizują i zapewniają niskie granice oznaczalności (LOQ). Elektroforeza kapilarna (CE) ma tę zaletę, że umożliwia szybkie oddzielanie Fe(II)/Fe(III) i działa bez fazy stacjonarnej, która mogłaby zakłócać równowagę redoks lub powodować przywieranie analitu. CE w połączeniu ze spektrometrią mas ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS) jako detektorem zapewnia dalszą poprawę czułości i selektywności wykrywania. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się 20 mM HCl jako elektrolit tła i napięcie +25 kV. Kształty pików i granice wykrywalności stężeń są ulepszane dzięki układaniu w stosy przewodności i pH. W celu redukcji ⁵⁶[ArO]⁺, ICP-MS operowano w trybie dynamicznej komory reakcyjnej (DRC) z NH₃ jako gazem reakcyjnym. Metoda ta pozwala osiągnąć granicę wykrywalności (LOD) na poziomie 3 μg/L. Ze względu na układanie w stosy, możliwe było uzyskanie większych objętości iniekcji bez utrudniania separacji, ale z poprawą LOD. Kalibracje związane z powierzchnią piku były liniowe do 150 μg/L. Precyzja pomiaru wynosiła od 2,2% (Fe(III)) do 3,5% (Fe(II)). Precyzja czasu migracji wynosiła <3% dla obu gatunków, oznaczona w rozcieńczonych w stosunku 1:2 lizatach komórek ludzkiego nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y). Eksperymenty z odzyskiem z dodatkiem wzorca wykazały dokładność 97% Fe(III) i 105% Fe(II). W rzeczywistych próbkach biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy, czas migracji może się różnić w zależności od różnej przewodności (tj. zasolenia). W ten sposób identyfikacja piku jest potwierdzona przez dodanie wzorca.

Wprowadzenie

Dzisiaj najbardziej oczywiste jest, że stres oksydacyjny (OS) za pośrednictwem żelaza odgrywa kluczową rolę w wielu zaburzeniach, szczególnie w neurodegeneracyjnych zaburzeniach mózgu, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, a także w raku1^,²^,³^,⁴. OS jest ściśle związany ze stanem i równowagą pary redoks Fe(II)/Fe(III). Podczas gdy Fe(III) jest nieaktywny redoks, Fe(II) silnie generuje reaktywne formy tlenu (ROS) poprzez katalizowanie rozkładu_H2O₂, po którym następuje produkcja rodników hydroksylowych i peroksydacja lipidów błonowych⁵^,⁶. Na poziomie molekularnym ROS generowane przez Fe(II) i peroksydowane fosfolipidy stanowią silny atak na integralność białek, lipidów i DNA⁷^,⁸. Wykazano, że taka szkodliwa dysfunkcja komórkowa indukuje dysfunkcję mitochondriów ze zmniejszoną zawartością ATP⁹ i może nawet wywołać zaprogramowaną martwiczą śmierć komórki, znaną jako ferroptoza (FPT)¹⁰^,¹¹. Dlatego ilościowa specjacja redoks Fe(II)/(III) ma ogromne znaczenie w szerokim spektrum zaburzeń związanych z redoks.

Specjacja chemiczna jest sprawdzonym narzędziem do badania biologicznej roli pierwiastków śladowych i metabolizmu w ogóle⁷^,⁸ jak również w stanach neurodegeneracyjnych¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Metody specjacji Fe-redoks znalezione w literaturze są zwykle oparte na rozdzielaniu metodą chromatografii cieczowej (LC). W części literatury wykorzystuje się spektrometrię mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) jako detektor selektywny pierwiastków. Jednak w rutynowych pracach LC konieczne były zbyt długie czasy czyszczenia między cyklami. Jeszcze bardziej problematyczne jest to, że zmienność kolumn LC z partii na partię wymusiła ponowną optymalizację warunków elucji po każdej zmianie kolumny. Problemy te utrudniają wysoką przepustowość. Potrzebny jest dodatkowy czas, aby uzyskać akceptowalną wiarygodność i ponownie dokładnie ocenić metodę.

Aby obejść te wady, przedstawiono tutaj metodę specjacji redoks Fe(II)/Fe(III) opartą na elektroforezie kapilarnej ze spektrometrią mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (CE-ICP-MS). CE oferuje różne zalety w porównaniu do LC¹⁸. Kapilary nie mają fazy stacjonarnej, a zatem nie zależą (prawie) od tożsamości partii. Po starzeniu lub zablokowaniu są szybko wymieniane, wykazując zwykle niezmienioną wydajność. Etapy przedmuchiwania i czyszczenia między próbkami są skuteczne i krótkie, a czas analizy na próbkę jest również krótki.

Przedstawiona metoda jest wiarygodna z dobrymi wartościami merytorycznymi. Jako dowód słuszności zasady, metoda ta została zastosowana do lizatu komórkowego ludzkiego nerwiaka dopaminergicznego (SH-SY5Y), rodzaju próbki ważnej w neurodegeneracji, a także w badaniach nad rakiem¹⁹.

Protokół

UWAGA: Metoda wykorzystuje kwas solny (HCl, rozcieńczenia początkowe z roztworu ultrapure, stężenie 1 M) oraz wodorotlenek tetrametylammoniumu (TMAH, rozcieńczenia początkowe z roztworu ultrapure, stężenie 25%). Obie substancje są silnie żrące. Należy stosować ochronę skóry i oczu.

1. Przygotowanie elektrolitów

Przygotowanie elektrolitów HCl: elektrolit tła (20 mM HCl), elektrolit wylotowy (5 mM HCl) oraz elektrolit kończący (0,05 mM HCl)
1. Przygotowanie 20 mM HCl w kolbie 100 mL: do kolby należy odpipetować 2 mL 1 M HCl, dopełnić do kreski wodą ultrapure i delikatnie wymieszać.
2. Przygotowanie 5 mM HCl w kolbie 100 mL: do kolby należy odpipetować 500 µL 1 M HCl, dopełnić do kreski wodą ultrapure i delikatnie wymieszać.
3. Przygotowanie 0,05 mM HCl w dwóch etapach: do kolby 100 mL należy odpipetować 1 mL 20 mM HCl, a następnie dopełnić do kreski wodą ultrapure i delikatnie wymieszać. Następnie do probówki stożkowej 15 mL (Tabela materiałów) należy odpipetować 2,5 mL otrzymanego roztworu i dodać 7,5 mL wody ultrapure, a następnie delikatnie wymieszać.
Przygotowanie elektrolitu prowadzącego 12% TMAH w probówce stożkowej 15 mL: do probówki należy odpipetować 4,8 mL 25% TMAH, dodać 5,2 mL wody ultrapure i delikatnie wymieszać.
UWAGA: 12% TMAH jest używany do płukania i czyszczenia kapilary przed każdym pomiarem oraz jako elektrolit prowadzący przed wstrzykniętą próbką).

2. Przygotowanie i przechowywanie wzorców i próbek

Standardy
1. W celu przygotowania standardu Fe(II), odważ 35,61 mg Fe(II)Cl₂·4H₂O do kolby miarowej o pojemności 100 mL i dopełnij do kreski wodą ultrapurystyczną, aby uzyskać stężenie roztworu zapasu 100 mg Fe(II)/L. Wstrząsaj delikatnie do całkowitego rozpuszczenia.
2. W celu przygotowania standardu Fe(III), odważ 29,04 mg Fe(III)Cl₃ do kolby miarowej o pojemności 100 mL i dopełnij do kreski wodą ultrapurystyczną, aby uzyskać stężenie roztworu zapasu 100 mg Fe(III)/L. Wstrząsaj delikatnie do całkowitego rozpuszczenia.
3. Rozcieńcz każdy roztwór standardowy zgodnie z Tabelą 1, aby przygotować robocze roztwory standardowe.
  UWAGA: Po przygotowaniu dziennych roztworów roboczych z roztworu zapasu 100 mg/L, ten ostatni należy przechowywać w zamrażarce. Po przygotowaniu dziennych standardów zgodnie z Tabelą 1, roztwór zapasu 1 mg/L należy rozdzielić na alikwoty o objętości 1,5 mL i przechowywać w zamrożeniu (najlepiej bez pęcherzyków powietrza u góry) w probówkach 1,5 mL. Każdego nowego dnia rozmraża się jedną porcję dziennego zapasu w celu przygotowania standardów dziennych, a po użyciu zostaje ona usunięta.

Stężenie początkowe	Objętość pipetowana	Uzupełnić wodą Milli-Q	Otrzymane stężenie	Objętość końcowa	Zastosowanie roztworu
100 mg/L	50 µL	4950 µL	1 mg/l	50 ml	Codzienny roztwór zapasowy
1 mg/L	200 µL	1800 µL	100 µg/L	2 mL	Standard
					100 µg/L
1 mg/L	100 µL	1900 µL	50 µg/L	2 mL	Standard
					50 µg/L
1 mg/L	50 µL	1950 µL	25 µg/L	2 mL	Standard
					25 µg/L
1 mg/L	25 µL	1975µL	12.5µg/L	2 mL	Standard
					12.5 µg/l
1 mg/L	20 µL	1980µL	10 µg/L	2 mL	Standard
					10 µg/L
	0	2000 µL	0 µg/L	2 mL	Puste

Tabela 1: Schemat pipetowania przy przygotowywaniu wzorców.

Lizat komórek SH-SY5Y
UWAGA: Lizat komórek (SH-SY5Y) posłużył jako bio-matryca istotna dla Fe(II)/(III) w celu wykazania wydajności i niezawodności metody.
1. Należy wykorzystać lizat z wcześniej przeprowadzonych eksperymentów¹⁶. Przygotowanie lizatu komórkowego powinno odbywać się z unikaniem zmian pH lub stosowania substancji chemicznych, które mogłyby wpłynąć na równowagę redox. Należy użyć zmodyfikowanego buforu do lizy w metodzie radioimmunoprecypitacji (RIPA) (PBS pH 7.4, 0.5% deoksycholan sodu, 1% NP-40), unikając chelatorów metali (takich jak EDTA), środków redukujących (takich jak DTT, 2-merkaptoetan) oraz anionowych detergentów powierzchniowo czynnych i czynników kompleksujących metale (takich jak SDS), aby zminimalizować zmiany stosunku Fe(II)/Fe(III) po pobraniu próbek.
2. Należy pracować w atmosferze N₂, aby zahamować utlenianie przez O₂ z powietrza otoczenia, oraz pracować na lodzie, aby zminimalizować autooksydację, aż do jak najszybszego przechowywania lizatu w temperaturze -80 °C w atmosferze azotu.

3. Konfiguracja aparatury do sprzężenia CE z ICP-MS

Konfiguracja instrumentu do elektroforezy kapilarnej.
UWAGA: W tej sekcji czytelnik jest odsyłany głównie do instrukcji obsługi odpowiedniego instrumentu dostępnej w laboratorium.
1. Zainstaluj kapilarę o odpowiedniej długości, aby sięgała od fiolki wlotowej instrumentu CE do nebulizatora ICP-MS. Zainstaluj kapilarę tylko od strony wlotowej i wyprowadź ją na zewnątrz instrumentu w stronę interfejsu CE-ICP-MS.
  UWAGA: W celu połączenia CE z ICP-MS w niniejszym protokole zainstalowano kapilarę kwarcową o długości 90 cm (ID 50 µm) zgodnie z ogólnym opisem konfiguracji instrumentu. Zazwyczaj wymagane będą kapilary o długości 70−100 cm, w zależności od rozmieszczenia instrumentów w laboratorium.
2. Dezaktywuj w oprogramowaniu windę wylotową instrumentu CE, aby zapewnić płynne działanie, ponieważ nie jest ona używana, gdy kapilara jest skierowana na zewnątrz do interfejsu CE-ICP-MS.
3. Zainstaluj kabel wyzwalający z wyjścia trigger-OUT instrumentu CE do wejścia trigger-IN instrumentu ICP-MS.
4. Wybierz pozycje dla wszystkich niezbędnych roztworów (20 mM HCl, 0.05 mM HCl, 12% TMAH), wzorców i próbek w rotorze na próbki i roztwory instrumentu oraz zdefiniuj ich pozycje w oprogramowaniu instrumentu w zwykły sposób (zgodnie z instrukcją obsługi instrumentu).
5. Ustaw temperaturę rotora i kapilary na taką samą wartość 20 °C, aby była ona tożsama z kontrolowaną temperaturą w laboratorium.
  UWAGA: Zapobiega to powstaniu gradientu temperatury między częściami kapilary wewnątrz i na zewnątrz instrumentu CE.
Konfiguracja instrumentu ICP-MS
1. Zoptymalizuj instrument ICP-MS zgodnie z codziennymi procedurami konfiguracji wzorców instrumentalnych i procedurami operacyjnymi. Skorzystaj z protokołu producenta.
2. Zastosuj technologię dynamicznej komory reakcyjnej (DRC) z NH₃ jako gazem DRC, przy przepływie NH₃ wynoszącym 0.6 mL/min i wartości RPq = 0.45.
  UWAGA: Dla specjacji żelaza zaprogramowano metodę dla ⁵⁶Fe, będącego najliczniejszym izotopem Fe (obfitość względna 91.754%), który jednak podlega silnym zakłóceniom ze strony klastra [⁴⁰Ar¹⁶O]⁺. ICP-MS oparty na kwadrupolu w trybie standardowym jest praktycznie ślepy, a detektor znajduje się w stanie przesterowania dla tego izotopu. Dzięki powyższym ustawieniom (patrz krok 3.2.2) uzyskuje się niskie linie bazowe i wysoką czułość (dla standardowego oznaczania całkowitego żelaza uzyskiwana jest granica wykrywalności LOD w niskim zakresie ng/L).
3. Wybierz czas zbierania sygnału (dwell time) na izotop wynoszący 50 ms, aby monitorować nawet wąskie i krótkie piki podczas rozdziału CE.
4. Zaprogramuj metodę ICP-MS tak, aby była uruchamiana przez wyzwalacz z instrumentu CE.
Konfiguracja interfejsu CE-ICP-MS
UWAGA: Istnieją głównie dwie opcje połączenia kapilary CE z ICP-MS. W przypadku użycia komercyjnego interfejsu należy postępować zgodnie z dostarczonymi opisami konfiguracji. Niniejszy protokół wykorzystuje prosty, wykonany samodzielnie interfejs oparty na wcześniejszej publikacji po wprowadzeniu modyfikacji²⁰. Kluczowe kwestie to wydajna nebulizacja z możliwie mniejszym rozcieńczeniem wypływu z kapilary, poza dostosowaniem całkowitego przepływu do nebulizatora w celu uzyskania najlepszej nebulizacji. Obowiązkowe jest również zminimalizowanie przepływu ssącego przez kapilarę rozdziałową wywołanego samoaspiracją z nebulizatora oraz zapewnienie połączenia elektrycznego uziemionej elektrody wylotowej z końcem kapilary.
1. Wybór nebulizatora
  1. Użyj nebulizatora koncentrycznego o niskiej objętości samoaspiracji (np. 100 µL/min), który pasuje do komory rozpylnej o małej objętości.
    NOTE: Niski pobór spowoduje jedynie umiarkowane rozcieńczenie wypływu z kapilary, przy jednoczesnym zachowaniu zoptymalizowanej nebulizacji. Połączenie elektryczne elektrody wylotowej jest realizowane poprzez przepływ elektrolitu wokół elektrody wylotowej i wokół końca kapilary.
  2. Wykorzystaj samoaspirację nebulizatora, aby zminimalizować ssanie przez kapilarę rozdziałową i dostosować szybkość przepływu do optymalnej wartości wymaganej przez nebulizator.
  3. Przygotuj następujące części z Tabeli 2 do zamontowania tego wykonanego samodzielnie interfejsu.
2. Konfiguracja prostego interfejsu
  UWAGA: W celu śledzenia opisu montażu części prostego interfejsu należy korzystać z Rysunku 1. Numery na Rysunku 1 oraz w poniższym tekście odnoszą się do numerów w Tabeli 2.
  1. Rozpocznij montaż interfejsu, łącząc dwa żeńskie złącza Luer 3-drożne (nr 3) za pomocą męskiego złącza Luer stożkowego (nr 4). Połącz lewy koniec dolnej szyny Luer 3-drożnej z złączem męskim, a to z rozmieszczeniem środkowym górnego Luer 3-drożnego.
  2. Nałóż rurkę o długości 1 cm (nr 1) na drucik Pt (nr 7), a następnie rurkę silikonową o długości 1 cm (nr 5) na ten ostatni oraz na dyszę męskiego złącza Luer (nr 2). Przymocuj zespół do środkowego przyłącza dolnego złącza Luer 3-drożnego (nr 3) za pomocą typowego dla złączy Luer dokręcania.
  3. Nasuń rurkę o długości 1 cm (nr 1) na koniec wylotowy kapilary CE i ustaw ją około 8-9 cm od końca.
  4. Nałóż rurkę silikonową o długości 1 cm (nr 5) na tę ostatnią oraz na dyszę męskiego złącza Luer (nr 2).
  5. Przełóż cały zespół od lewej strony przez szynę górnego złącza T 3-drożnego i przymocuj męskie złącze Luer oraz lewy koniec żeńskiego złącza Luer 3-drożnego (nr 3) za pomocą typowego dla złączy Luer dokręcania.
  6. Zamocuj rurkę silikonową o długości 25 cm (nr 5) na dyszy męskiego złącza Luer (nr 2) i przymocuj cały zespół na dolnym (prawym) końcu szyny z dolnego złącza Luer 3-drożnego (nr 3) za pomocą typowego dla złączy Luer dokręcania.
  7. Weź rurkę silikonową o długości 1 cm (nr 6) i ciasno nasuń ją na 5 mm na koniec nebulizatora, podczas gdy drugi męski złącze Luer stożkowe (nr 4) jest ciasno wetknięte w wystającą część rurki silikonowej.
  8. Przesuń powyżej zamontowaną część interfejsu wraz z wystającą kapilarą CE do stożka męskiego przy nebulizatorze. Ostrożnie wprowadź kapilarę CE przez stożek męski i dalej przez szerszą część kapilary nebulizatora, aż ta stanie się wąska. Zakładając, że wystająca długość kapilary została dobrana odpowiednio, górne żeńskie złącze Luer 3-drożne powinno teraz również ściśle przylegać do stożka męskiego.
  9. W razie potrzeby skoryguj długość wystającej kapilary, przesuwając kapilarę (do przodu/do tyłu) w rurce (nr 1) w miejscu wejścia do wykonanego samodzielnie interfejsu.
    UWAGA: Optymalna pozycja kapilary CE na początku kapilary nebulizatora nie jest zbyt krytyczna. Nie należy jednak wpychać kapilary CE zbyt blisko wąskiej części kapilary nebulizatora. Mogłoby to utrudnić lub zablokować przepływ elektrolitu wylotowego. Ponadto przerwałoby to połączenie elektryczne z elektrodą wylotową i zwiększyło ssanie przez kapilarę CE, co doprowadziłoby do zaburzenia rozdziału. Z kolei nie należy umieszczać końca kapilary CE zbyt daleko od kapilary nebulizatora, ponieważ wtedy ostro rozdzielone piki uległyby poszerzeniu i utracono by rozdzielczość.
  10. Użyj lupy, aby zidentyfikować najlepszą pozycję.
    UWAGA: Rysunek 1 (prawy dolny róg) pokazuje optymalną pozycję kapilary CE wewnątrz nebulizatora.

Schemat interfejsu CE-ICP-MS z nebulizatorem, komorą rozpylną, przepływem elektrolitu i pozycją kapilary.
Rycina 1: Schemat i montaż interfejsu CE-ICP-MS.Schemat przedstawia poszczególne części niezbędne do etapowego montażu prostego i taniego interfejsu CE-ICP-MS. Okno zawiera zdjęcie optymalnego rozmieszczenia kapilary CE w nebulizatorze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nie.	Część	wykorzystywany do
1	Przewody (kod kolorystyczny zielono-pomarańczowy), 2 x ok. 1 cm	mocowanie kapilary elektrody przeciwnej (CE) oraz elektrody wylotowej w elementach Luer i zapewnienie ich szczelności
2	Luer, męski, 3 szt., odpowiedni do rurek silikonowych o średnicy wewnętrznej 1,6 mm	podłączenie rurki silikonowej do wylotu elektrolitu oraz jej wykorzystanie jako wsparcie do mocowania kapilary CE i elektrody z drutu Pt
3	zawór trójdrożny Luer, gniazdo, 2 x	Trójniki do połączenia elektrody, kapilary i odpływu aspiracyjnego
4	stożek Luera, męski, 2 x	połączenie żeńskich złączy Luera ze sobą oraz z nebulizatorem
5	Rurka silikonowa, wewn. średnica 1,6 mm, ścianka 0,8 mm, 2 x 1 cm, 1 x ok. 25 cm	a) 1 cm; dokręcenie kapilary CE do interfejsu, b) 1 cm; przytwierdzenie drutu platynowego (Pt) do interfejsu c) 25 cm; połączenie od wylotu kolby z elektrolitem do interfejsu
6	Wężyk silikonowy, średnica wewnętrzna 3 mm, grubość ścianki 1,2 mm, ok. 1 cm	dokręcanie stożka Luera do nebulizatora
7	Drut platynowy	Elektroda odpływowa

Tabela 2: Części do budowy prostego, własnoręcznie wykonanego interfejsu CE-ICP-MS. Numery odnoszą się również do Rysunku 1 oraz opisu w tekście.

4. Przygotowanie do pomiaru

UWAGA: Przed pomiarem kapilarę należy przepłukać silnie zasadowym roztworem (tutaj: 12% TMAH) w celu oczyszczenia, a następnie wypełnić elektrolitem tła. Aby poprawić rozdzielczość, wokół próbki tworzy się tzw. „sandwich” z buforem do stakowania, oparty na gradientach przewodnictwa i pH. Tabela 3 podsumowuje kolejne etapy przygotowania kapilary, które są wykonywane automatycznie przez instrument zgodnie z zaprogramowaną metodą:

Krok nr	Krok	chemiczny	warunek
	Przygotowanie kolumny CE
Przygotowanie 1	Czyszczenie kapilar	12% TMAH	4 bary, 1 min.
Przygotowanie 2	Płukanie kapilary elektrolitem tła	20 mM HCl	4 bar, 1 min.
Przygotowanie 3	Stosowanie: elektrolit wiodący	12% TMAH	150 mbar, 3 s
Przygotowanie 4	Iniekcja	Próbka	150 mbar, 3 s
Przygotowanie 5	Układanie: elektrolit kończący	0,05 mM HCl	150 mbar, 3 s

Tabela 3: Etapy przygotowania kapilary przed pomiarem. Kroki te są zaprogramowane w oprogramowaniu systemu CE w ramach metody CE i obejmują wtryskiwanie próbki pod ciśnieniem oraz tworzenie tzw. „kanapki stosującej” (stacking sandwich) wokół próbki.

Zaprogramuj metodę CE, która będzie kolejno wykonywać kroki podane w Tabeli 3.
Zdefiniuj tabelę próbek i sekwencję w oprogramowaniu CE, a następnie skopiuj tę sekwencję do oprogramowania ICP-MS.

5. Pomiary i ewaluacja danych

Uruchom metodę na instrumencie CE. Po zaprogramowanym przygotowaniu i napełnieniu kapilary pomiar rozpoczyna się automatycznie, gdy fiolka wlotowa zawierająca 20 mM HCl znajdzie się w pozycji wlotowej kapilary. Do ICP-MS wysyłany jest sygnał „Start-trigger”, który uruchamia monitorowanie izotopów Fe w trybie on-line.
UWAGA: Rozdział odbywa się przy napięciu +25 kV. Zwiększona długość kapilary, niezbędna do połączenia instrumentu CE z ICP-MS, powoduje niepotrzebne wydłużenie czasu rozdziału. Dlatego rozdział jest wspomagany niskim ciśnieniem 250 mbar na wlocie. Elektrolitem zasysanym automatycznie na wylocie jest 5 mM HCl. Całkowity czas analizy dla próbek o umiarkowanej przewodności wynosi 3 minuty. W oknie sygnału oprogramowania ICP-MS podczas przebiegu można obserwować elektroferogram. Po każdej próbce automatycznie generowane są dwa pliki danych: jeden dostępny wyłącznie w wewnętrznej bazie danych oprogramowania instrumentu, a drugi w folderze eksportu w formacie „.xl” lub „.txt”, dostępny poprzez funkcję importu w standardowym oprogramowaniu do chromatografii.
W celu eksportu plików do oprogramowania do chromatografii należy zapoznać się z instrukcją obsługi oprogramowania instrumentu ICP-MS.

Wyniki

Pomiary wzorców i kalibracja
Czasy migracji określono poprzez pojedyncze wtryski wzorców: wzorzec Fe(III) monitorowano przy czasie migracji 118 s, a wzorzec Fe(II) przy czasie migracji 136 s. Granice wykrywalności obliczono z zastosowaniem kryterium 3σ w odniesieniu do szumu linii bazowej i stężenia wzorca 50 µg/L. LOD_(Fe(II) wyniosła 3,1 µg/L, a LOD_(Fe(III) wyniosła 3,2 µg/L. Kalibracja oparta na powierzchni piku dla obu form żelaza była liniowa od poziomu LOD do 150 µg/L. Chociaż liniowość Fe(III) została potwierdzona również dla wyższych stężeń, nachylenie krzywej kalibracyjnej dla Fe(II) uległo zmniejszeniu. Górną granicę stężenia 150 µg/L uznano za wystarczającą, ponieważ próbki biologiczne istotne dla oznaczania Fe(II)/(III) zazwyczaj charakteryzują się niższym stężeniem Fe. W przypadku wyższych stężeń próbki można odpowiednio rozcieńczyć. Kalibrację opartą na wysokości piku sprawdzono do stężenia 600 µg/L, co wykazało liniowość w całym badanym zakresie. Przedstawiono to na Rysunku 2.

Krzywa kalibracyjna stężenia Fe III i Fe II w funkcji wysokości piku; wykres regresji liniowej.
Rysunek 2: Krzywe kalibracyjne (wysokość piku) dla Fe(III) i Fe(II). Kalibracje związane z wysokością piku dla obu form redoks Fe są liniowe, ze nachyleniem ok. 161 *X Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza lizatu komórek SH-SY5Y
Analiza lizatu komórek SH-SY5Y wykazała nieco wolniejszą migrację form redoks żelaza ze względu na nieco wyższą przewodność. Fe(III) monitorowano w 124 s czasu migracji, a Fe(II) w 158 s czasu migracji. Precyzja czasu migracji w lizacie komórek SH-SY5Y wyniosła 2% dla Fe(III) oraz 3% dla Fe(II). Ilościowe pomiary Fe(II) i Fe(III) z wykorzystaniem tej metody ujawniły stężenie Fe(III) na poziomie 330 µg/L oraz stężenie Fe(II) na poziomie 84 µg/L, co w obu przypadkach dało stosunek Fe(II)/Fe(III) wynoszący 0,25. Odpowiedni elektroferogram selektywny dla ⁵⁶Fe przedstawiono na Rysunku 3.

Wyniki elektroforezy; wykres lizatu komórek SH-SY5Y pokazujący piki Fe(III) i Fe(II) w czasie migracji.
Rysunek 3: Elektroferogram lizatu komórek SH-SY5Y specyficzny dla ⁵⁶Fe. Fe(III) jest monitorowane w 123 s, osiągając wysokość piku 58025 cps, i jest wyraźnie oddzielone od Fe(II) w 158 s, które osiąga 22800 cps Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ponieważ żelazo odgrywa znaczącą rolę w progresji OS, ułatwiając w ten sposób dysfunkcję mitochondriów lub FTP, w artykule przedstawiono wszechstronną metodę ilościową opartą na CE-ICP-MS do jednoczesnej specjacji Fe(II)/Fe(III), a jej zastosowanie zostało przykładowo wykazane w lizatach komórkowych. Metoda ta zapewniła krótki czas analizy, a wartości liczbowe (LOQ, precyzja, odzysk) są odpowiednie dla próbek istotnych dla specjacji redoks żelaza, szczególnie w badaniach nad neurodegeneracją i rakiem. W porównaniu z poprzednimi metodami opartymi na LC, ta metoda oparta na CE jest praktycznie niezależna od partii kolumn i wcześniej obserwowanych problemów z odtwarzalnością po zmianie kolumny LC. Przygotowanie kapilarne przed każdym serią trwa <4 minuty, a czas analizy na próbkę o umiarkowanym zasoleniu do 3 minut. Oprócz ładunku i wielkości cząsteczki, czas migracji w CZE zależy od przewodności w czopie próbki, co powoduje zmiany w czasie migracji lub przesunięcia, gdy same próbki mają znaczny wpływ na przewodność. Takie przesunięcia w czasie migracji są dobrze znane w elektroforezie kapilarnej. Jest to problem CZE-immanentny, znany z literatury ^21,22. Wzorce i lizaty komórkowe SH-SY5Y charakteryzowały się umiarkowaną i jednorodną przewodnością. W związku z tym czasy migracji wykazały tylko niewielkie zmiany z dobrą precyzją. Jednak w przypadku próbek o wysokiej przewodności można zaobserwować wydłużony czas migracji do 5 minut. W związku z tym zaleca się stosowanie standardowych dodatków w celu jednoznacznej identyfikacji gatunków.

Krytycznym zagadnieniem w specjacji żelaza redoks jest stabilność gatunkowa (tj. utrzymanie równowagi Fe(II)/(III)) podczas przygotowywania próbki ^8,13. Niewłaściwe pH lub chelatujące chemikalia, a także niewłaściwe warunki przechowywania, takie jak tlen (powietrze) w kontakcie z próbką lub przerwa w przechowywaniu w głębokim mrożeniu, mogą łatwo zmienić równowagę Fe(II)/(III). Dlatego do przygotowania lizatów komórkowych SH-SY5Y wybrano bufor do lizy bez żadnych chelatujących substancji chemicznych, fizjologicznego pH, ale nałożono gaz obojętny podczas przygotowania próbki, w pojemnikach na próbki, a do tych próbek zastosowano natychmiastowe głębokie mrożenie.

W piśmiennictwie można znaleźć półilościowe podejścia do monitorowania Fe(II). Aby lepiej zrozumieć rolę żelaza w stresie oksydacyjnym, kilka grup badawczych opracowało sondy specyficzne dla Fe(II) do półilościowego monitorowania i wizualizacji nieprawidłowego wzrostu żelaza żelazowego in vitro. Należy jednak zauważyć, że takie sondy nie uwzględniają Fe(III) i nie określają ilościowo, ale podają tylko "więcej" lub "mniej" Fe(II)). Do tej pory dostępnych jest tylko kilka biomarkerów do określenia OS i FPT, co wynika z braku wiarygodnych metod jednoczesnego ilościowego oznaczania gatunków redoks Fe(II)/Fe(III)^23,24. Mając to na uwadze, przedstawiona metoda - ułatwiająca szybkie oznaczanie ilościowe zarówno Fe(III), jak i Fe(II) w jednym przebiegu - może stać się obiecującym narzędziem do pogłębienia wglądu w procesy molekularne zależne od żelaza.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

VV było wspierane przez grant badawczy (Forschungsförderung) Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Getyndze oraz program badawczy Else Kröner Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Serwis chromatografii kapilarnej CE	Langerwehe, Niemcy	105180-25
System CE	Technologie PrinCe	0005.263	model PrinCe 760
Stożkowe probówki Superclear 15 ml	Analytics-shop.com firmy Altmann Analytik	PEN0777704
Stożkowe probówki Superclear 50 ml	Analytics-shop.com firmy Altmann Analytik	PEN0777694
FeCl₂ * 4H₂O	Merck	103861
FeCl₃	Merck	803945
Fluidflex Silikon HG-Schlauch	ProLiquid	4001106HG
Kapilara z topionej krzemionki OD 360 µ m, ID 50 i mikro; m	Chromatographie Service GmbH	105180-25
kwas solny, 1 M	Merck	1101652500
ICP-MS	Perkin Elmer	N814003
Luer, 3-drożny żeński	BioRad	7318229
Luer, stożek męski	neoLab Migge	2-1895
Luer, męski	neoLab Migge	2-1880
Oprogramowanie do oceny wartości szczytowych Peakfit	Systat	PeakFit 4.12
Pt-wire	Carl Roth	0737.1
Rura PVC	ProLiquid	6000002
bufor RIPA	Abcam	ab156034
Wodorotlenek tetrametyloamonu, 25 %	Merck	814748
rura TYGON R-3607	ProLiquid	3700203A

Bibliografia

Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Detekcja ICP-MS oznaczanie ilościowe Fe(II) i Fe(III)układ przewodność-pH-stakowanie dynamiczna komora reakcyjna granica wykrywalności krzywe kalibracyjne precyzja czasu migracji metoda dodatku wzorca

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))