Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jądra Drosophila to potężny system modelowy do badania procesów biologicznych, w tym biologii komórek macierzystych, architektury nuklearnej, mejozy i rozwoju plemników. Jednak znakowanie immunologiczne całego jądra Drosophila często wiąże się ze znaczną niejednorodnością barwienia spowodowaną penetracją przeciwciał. Preparaty rozdrobnione tylko częściowo rozwiązują ten problem, ponieważ obniżają jakość 3D analiz. W niniejszym artykule opisano protokół całościowego montażu z użyciem NP40 i heptanu podczas utrwalania wraz z immunoznakowaniem w płynnych pożywkach. Zachowuje objętość odpowiednią do mikroskopii konfokalnej wraz z powtarzalnym i wiarygodnym znakowaniem. Pokazujemy różne przykłady rekonstrukcji 3D jąder spermatocytów z przekrojów konfokalnych. Odtwarzalność wewnątrz i między jądrami pozwala na kwantyfikację 3D i porównanie fluorescencji między pojedynczymi komórkami z różnych genotypów. Użyliśmy różnych składników wewnątrzjądrowej struktury MINT (Mad1-containing Intra Nuclear Territory), a także dwóch składników związanych z kompleksem porów jądrowych, aby zilustrować ten protokół i jego zastosowania na największych komórkach jądra, spermatocytach S4-S5.
Wprowadzenie
Jądra Drosophila są cennym modelem do badania architektury jądrowej. W mitotycznych spermatogoniach objętość jądra jest w dużej mierze zajęta przez chromatynę. Komórki te przechodzą cztery rundy podziału, wytwarzając torbiel 16 pierwotnych spermatocytów. W ciągu następnych kilku dni spermatocyty przechodzą przez 6 etapów rozwojowych (S1-S6), znacznie zwiększając swoją objętość, około 20-krotnie1,2. Zmieniają również swoją morfologię jądrową. Zarys jądra, odsłonięty przez laminę Dm0, staje się nieregularny i pokazuje głębokie wgłębienia1,3. Towarzyszą temu rozległe zmiany i modyfikacje ekspresji genów w organizacji chromatyny1,4,5,6,7. Chromosomy interfazowe są dobrze zdefiniowane w stadium S4-S5, tworząc trzy odrębne masy odpowiadające 2 głównym autosomom biwalentnym i parze X-Y zadokowanej do jąderka.
Mad1 został pierwotnie wyizolowany jako kluczowy składnik mitotycznego punktu kontrolnego (przejrzane w8). W interfazie jest opisany jako zlokalizowany głównie w otoczce jądrowej, ale także w nukleoplazmie9,10,11. W jądrach Drosophila stwierdziliśmy, że Mad1 jest widoczny w nukleoplazmie, ściśle związany z dwiema głównymi masami chromatyny autosomalnej i, w mniejszym stopniu, z chromatyną XY. Zdefiniowaliśmy tę strukturę związaną z chromatyną jako MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Cztery inne białka były związane z MIT w spermatocytach: nukleoporyna Mtor/Tpr, peptydaza SUMO Ulp1, białko mitotycznego punktu kontrolnego Mad2 i podjednostka kompleksu podobnego do Polycomb Raf212.
Aby uzupełnić opis MINTs, musieliśmy użyć przeciwciał i zostaliśmy skonfrontowani z problemami technicznymi, które zazwyczaj występują przy barwieniu immunologicznym w jądrach: słaba przepuszczalność skutkująca znaczną niejednorodnością barwienia w głębi jądra, szczególnie w dużych spermatocytach. Stłumionepreparaty zwiększały dostęp przeciwciał, ale prowadziły do skompresowanych obrazów, ograniczając analizy 3D i uniemożliwiając pomiar fluorescencji ilościowej, w tym kolokalizację. Problem przenikania przeciwciał można również rozwiązać za pomocą środków permeabilizacyjnych, takich jak 0,3% Na deoxycholate13, ale ta procedura w naszych rękach nie przyniosła powtarzalnych wyników. Ponieważ przeprowadziliśmy wiele eksperymentów ze wspólnym znakowaniem, staraliśmy się ulepszyć protokół przepuszczalności. Połączenie 1% NP40 i heptanu skutkowało większą odtwarzalnością, szczególnie w badaniu dużych spermatocytów.
Ten protokół przeprowadza utrwalanie i barwienie immunologiczne jąder w zawiesinie, poprawiając jakość próbki, jak również zwiększając odtwarzalność, i czyniąc go odpowiednim do mikroskopii konfokalnej. Wykorzystaliśmy ten protokół, aby lepiej zdefiniować relacje przestrzenne niektórych białek otoczki jądrowej ze strukturami nukleoplazmatycznymi dużych spermatocytów. Metoda ta pozwoli na lepsze badanie zmian towarzyszących rozwojowi spermatocytów, na przykład dynamicznych zmian strukturalnych jądra, w tym chromatyny, nukleoplazmy i porów jądrowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Kolekcja Drosophila testes
UWAGA: Młode samce (0-15 godzin po eklozji) są niezbędne do badania diploidalnych komórek rozrodczych (tj. spermatogonii i spermatocytów).
- Wybieraj młode muchy tak bardzo, jak to możliwe, aby zminimalizować zakłócenia związane z rozwojem plemników.
- Znieczulenie much poprzez krótką ekspozycję na dwutlenek węgla i przeniesienie do muchy na muchy14,15.
- Pod mikroskopem preparacyjnym (10-krotne powiększenie) użyj kleszczy, aby usunąć głowę.
- Przenieś od 5 do 10 odciętych głów much do 100 μl buforu Ringera (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, kompletny inhibitor białka, pH 6,8) na szkiełku podstawowym pokrytym silikonem na czarnym podłożu.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przy 40-krotnym powiększeniu użyj jednej pary kleszczy numer 5, aby przytrzymać muchę między klatką piersiową a brzuchem, a innymi kleszczami odciągnij brzuch od klatki piersiowej. Szybko wyizoluj jądra i przyległe tkanki od tuszy muchy15 i umieść w nowej kropli buforu Ringera na tym samym szkiełku.
- Gdy wszystkie jądra będą gotowe, oczyść je z pozostałych tkanek (gruczołu dodatkowego i zewnętrznych narządów płciowych).
- Usunąć nadmiar buforu z kropli zawierającej wycięte jądra. Zazwyczaj używa się pipety p200 z końcówką o pojemności 10 μl umieszczoną na końcówce o pojemności 200 μl. Pozwala to na usunięcie nadmiaru cieczy przez mały otwór. Umieść kroplę 4% utrwalacza paraformaldehydu na kropli zawierającej wycięte jądra, a następnie szybko przenieś jądra do probówki zawierającej świeży roztwór utrwalacza.
2. Utrwalanie paraformaldehydu
- Przygotuj 2 ml roztworu utrwalającego tuż przed użyciem: 600 μl 4% paraformaldehydu rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 30 μl NP40 20% plus 1200 μl heptanu w 2 ml silikonowanej probówce do mikrowirówki. Stosować 4% paraformaldehydu w PBS przygotowanym w 600 μl podwielokrotności i przechowywanym w temperaturze -20°C.
Uwaga: Heptan i paraformaldehyd są toksyczne i należy z nimi obchodzić się pod wyciągiem. Zutylizuj je zgodnie z regulaminem instytutu goszczącego. - Przenieść jądra za pomocą mikropipety p200 z końcówką o szerokim otworze do roztworu PFA/NP40/heptanu. Potrząsaj ręcznie rurką w górę iw dół przez 30 sekund. Kontynuuj utrwalanie jąder na mieszalniku obrotowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Zatrzymaj mieszalnik obrotowy i umieść probówkę w stojaku na probówki, aby umożliwić separację faz i aby jądra osiadły na dnie probówki.
- Usuń cały heptan i roztwór utrwalający i szybko przepłucz jądra trzy razy za pomocą 1x PBS.
- Przenieść do czystej pojedynczej probówki o pojemności 200 μl. Wykonaj wszystkie inkubacje w tych małych probówkach, aby zminimalizować ilość stosowanych przeciwciał.
- Usunąć nadmiar buforu za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl z dołączoną końcówką P200 i P10. Uważaj, aby nie zassać jąder.
- Trzymaj jądra w 1x PBS na lodzie, aż wszystkie próbki będą gotowe.
3. Barwienie przeciwciał w roztworze
- Wyrzuć PBS i pozostaw jądra w 0,3% PBS-T na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przeniknąć przez błony komórkowe.
- Wstępną inkubację w tym samym buforze plus 5% normalnej surowicy koziej (NGS) przez 1 godzinę.
- Dodać 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 0,3% PBS-T plus 5% NGS (tabela materiałów).
- Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C (lub w temperaturze pokojowej), delikatnie mieszając na bujaku.
- Prać 3 razy w 0,3% PBS-T przez 15 minut na bujaku w temperaturze pokojowej. Pozwól jądrom opaść na dno probówki pod wpływem grawitacji.
- Dodać 200 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w stosunku 1:500 z serii sprzężonej DyLight.
- Inkubować przeciwciało drugorzędowe w ciemnej komorze przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
- Prać w 0,3% PBS-T przez 15 min na bujaku w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz z 0,2% PBS-T i 0,1% PBS-T, za każdym razem przez 30 minut na bujaku w temperaturze pokojowej. Wykonaj końcowe pranie w 1x PBS przez 30 minut, aby usunąć detergent.
- Dodaj 180 μl roztworu DAPI o stężeniu 1 μg/ml w 1x PBS przez 15 min. Roztwór podstawowy to 10 mg/ml w H2O. Należy unikać sporządzania roztworu podstawowego w PBS, który może zmniejszyć sygnał barwienia DAPI na rozproszonej chromatynie w większych spermatocytach.
- Prać 3x po 5 min.
- Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystym szkiełku.
- Odessać jądra i umieścić je na szkiełku. Wstępne płukanie końcówki o szerokim otworze 0,1% PBS-T zapobiega przywieraniu jąder do końcówki. Usuń nadmiar PBS.
- Dodać kroplę (około 100 μl) Citifluor AF1.
- Delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczce, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza.
- Przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.
- Obserwuj szkiełka pod mikroskopem.
4. Analizy kolokalizacyjne
- Pozyskiwanie obrazów konfokalnych. Użyliśmy mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 710 (olej planapochromatyczny 63x) o rozdzielczości z 0,5 lub 1 μm.
- Wybierz różne komórki z niezależnych jąder.
- Importuj obrazy do oprogramowania do przetwarzania (np. Imaris).
- Zdefiniuj jądro przez ręczną segmentację, aby wykluczyć sąsiednie jądra. Użyj oprogramowania Coloc; zbiera współczynniki korelacji Pearsona (PCC) w całej objętości między 2 fluoroforami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Główną przeszkodą w uzyskaniu odpowiedniego barwienia jąder Drosophila jest ograniczona przenikalność przeciwciał, co zostało częściowo rozwiązane poprzez zastosowanie preparatów zgniatanych (squashed preparations), jednak kosztem ograniczenia analiz 3D (na przykład reprezentacji 3D lub pomiaru kolokalizacji). Niniejsza procedura umożliwia równomierne znakowanie i zachowuje objętość wszystkich komórek jądra. W tej pracy skupiliśmy się na zilustrowaniu metody za pomocą reprezentacji 3D spermatocytów S4-S5, ponieważ są to ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten zapewnia metodę skutecznego znakowania immunologicznego całych jąder dorosłego Drosophila. Jak podano w innych procedurach, należy wykorzystać młode samce (nawet skróciliśmy wiek do mniej niż 20 godzin po eklozji), aby zminimalizować obecność rozwijających się plemników, co grozi niedrożnością spermatocytów. Rozwarstwienie powinno być szybkie, a rozcieńczenie przeciwciał musi być dostosowane tak, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu 21,22,23....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy P. Verrijzerowi, J. Johansenowi H., Okhurze za przeciwciała i A. Debecowi, centrom hodowlanym w Bloomington i Wiedniu za muchy. Podziękowania dla C. Jacksona za sugestie i inspirujące dyskusje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paryż, Francja) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 15 maja; 124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Wiedeńskie Centrum RNAi Drosophila |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Roztwór podstawowy należy przygotować w H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Końcówki do pipet o szerokim otworze | Fisherbrand | 11917744 | Końcówka o szerokim otworze |
| Thermo Scientific 0,2 ml Individual Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml mikroprobówki wirówkowe | Sigma | T3531-200EA | Silikonowana tubka o pojemności 2 ml |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normalna surowica kozia (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyd 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyd (4%) rozpuszczony w PBS 1X ; podwielokrotność przez 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 DPBS, bez wapnia, bez magnezu | |
| 0,1% (0,2 lub 0,3%) PBS-T | PBS 1X zawierający 0,1% (0,2 % lub 0,3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, do biologii molekularnej, | Sigma | T8787 | |
| Przeciwciała | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Mysz anty-Mtor | 1/40 prezent od J. Johansena, Iowa State University | ||
| Szczur anty-NUP62 | 1/200 prezent od H. Ohkura (Uniwersytet w Edynburgu, Wielka Brytania | ||
| Świnka morska anty-Ulp1 | 1/200 prezent od C. P. Verrijzera, Uniwersytet Erazma, Rotterdam | ||
| Królik anty-Raf2 | 1/200 prezent od C. P. Verrijzera, Uniwersytet Erazma, Rotterdam | ||
| Seria sprzężona DyLight | Thermo | 1/500 Przeciwciała przeciwko osłom (świnka morska, mysz, królik lub szczur) jako drugie przeciwciała |
Bibliografia
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
