Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie klonów ludzkich regulatorowych komórek T

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61075

⸱

17 maja 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, New York University School of Medicine, 2Immunobiology and Immunotherapy in Chronic Diseases, Institute for Advanced Biosciences, Université Grenoble Alpes, Inserm U1209/CNRS UMR 5309, 3Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje klonowanie i ekspansję ludzkich regulatorowych limfocytów T w celu wytworzenia ultra-wysokiej czystości żywotnego ludzkiego Treg ze stabilną demetylacją w regionie demetylacji specyficznym dla Treg (TSDR) i cechach fenotypowych specyficznych dla Treg.

Streszczenie

Ludzkie regulatorowe limfocyty T (Treg) są niezwykle trudne do wyizolowania w wysokiej czystości, biorąc pod uwagę obecne metody wzbogacania Treg. Metody te opierają się na identyfikacji Treg za pomocą kilku zależnych od aktywacji markerów powierzchni komórkowej o różnych poziomach ekspresji w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Populacje izolowane jako "Treg" często zawierają zatem znaczną liczbę komórek efektorowych innych niż Treg (tj. Teff), co utrudnia precyzyjną charakterystykę fenotypową i funkcjonalną tych komórek, ich charakterystykę genomiczną i proteomiczną, ich wiarygodne wyliczenie w różnych stanach zdrowia i choroby, a także ich izolację i ekspansję w celach terapeutycznych. Zwłaszcza ta ostatnia pozostaje główną przeszkodą, ponieważ niezamierzona ekspansja komórek efektorowych naprowadzających się na przedziały komórkowe istotne dla Treg (np. limfocyty T CD4 + CD25 +) może sprawić, że immunoterapia oparta na Treg stanie się nieskuteczna, a nawet szkodliwa. Praca ta przedstawia metodę, która omija problemy związane z populacyjną izolacją i ekspansją Treg i pokazuje, że generowanie potencjalnych klonów Treg z późniejszą selekcją, hodowlą i ekspansją tylko starannie sprawdzonych komórek monoklonalnych, umożliwia wytworzenie ultraczystego produktu komórkowego Treg, który może być przechowywany w hodowli przez wiele miesięcy. Umożliwienie dalszych badań tych komórek, w tym pod kątem możliwych zastosowań terapeutycznych.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest umożliwienie rozmnażania in vitro ultra-czystego, klonalnego ludzkiego Treg. Izolacja populacji wzbogaconych w Treg i późniejsze klonowanie pozwala na wybór pożądanych fenotypów Treg i ich ekspansję w celu dalszych badań biologii tych komórek, zbadania ich potencjalnej przydatności terapeutycznej i innych zastosowań eksperymentalnych.

Klonowanie Treg zapewni znacznie lepszą czystość Treg niż metody izolacji i ekspansji poliklonalnej. Wynika to między innymi z wiarygodnego, kontrolowanego wykluczenia komórek efektorowych T o podobnych lub różnych fenotypach z oczyszczonej populacji, w tym między innymi z ekspresją FOXP3 (FOXP3intCD45RAnegCD25int) bez Treg i CD4+ CD25+ FOXP3- Teff1. Uzyskane w ten sposób klonalne linie komórkowe nie borykają się z problemem przerostu szybko ekspnujących się klonów innych niż Treg, które sprawiają, że bardzo długotrwała ekspansja (tj. kilka miesięcy) i hodowla in vitro komórek jest praktycznie niemożliwa lub co najmniej niezwykle trudna. Clonal Treg pozwala również na obszerną weryfikację ich cech fenotypowych po ekspansji, w tym za pomocą metod uznanych za standardowe do oceny cech epigenetycznych wskazujących na ludzką naturalną moc Treg1,2,3,4 (np. stabilna demetylacja w TSDR).

Ekspansja Treg była głównie przeprowadzana w formie ekspansji komórek poliklonalnych, zarówno w celach badawczych, jak i terapeutycznych5,6,7. Problemy z zanieczyszczeniem Teff są główną przeszkodą w pomyślnym wdrożeniu metod immunoterapii opartej na komórkach Treg. Wcześniejsze próby ekspansji/generowania monoklonalnego Treg w literaturze są rzadkie i nie wykazały utrzymania cech Treg w dłuższej perspektywie8.

Ta metoda będzie interesująca dla każdego, kto bada komórkowe, molekularne i metaboliczne właściwości prawdziwych ludzkich Treg. Ultraczysty produkt Treg uzyskany dzięki zastosowaniu tego protokołu w szczególności nadaje się do analiz z wykorzystaniem metod genomicznych. Biorąc pod uwagę stosunkowo niskie tempo ekspansji, które ogólnie charakteryzuje ludzką limfocyty Treg, metoda ta może być ograniczona dla tych, którzy dążą do szybkiej ekspansji ogromnej liczby komórek. Jednak biorąc pod uwagę niezwykle wysoką czystość Treg generowanego za pomocą tego protokołu, mniejsza liczba Treg może mieć podobną lub nawet lepszą skuteczność niż większe ekspansje poliklonalnych linii komórkowych, które zawierają komórki efektorowe, które ograniczają ogólny potencjał supresyjny wytworzonego produktu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego prowadzenia badań z wykorzystaniem próbek ludzkich. Praca z komórkami ludzkimi i innymi produktami z krwi ludzkiej musi odbywać się co najmniej w środowisku z certyfikatem BSL-2, zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa BLS-2.

1. Wstępne wzbogacenie komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej dla komórekhi CD4+CD127loCD25

UWAGA: Używaj sterylnej techniki przez cały czas. Ostre przedmioty należy natychmiast wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty. Wybielać wszystko, co miało kontakt z krwią i/lub produktami krwiopochodnymi przed usunięciem. Praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Uzyskać ludzką krew obwodową lub produkty krwiopochodne wstępnie wzbogacone dla ludzkich leukocytów (tj. "leukopaków") z pobrania krwi obwodowej lub leukaferezy. Natychmiast przetwarzaj komórki.
    UWAGA: Jeśli nie można uniknąć przechowywania przez noc, przechowuj i transportuj ogniwa w temperaturze pokojowej (RT). Unikaj ekspozycji na zimno.
  2. Wyizoluj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) przez wirowanie gradientowe na pożywce o gradiencie gęstości, jak opisano wcześniej9.
  3. Dokładnie policz PBMC za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Jeśli to możliwe, użyj co najmniej 300 x 106 PBMC, aby kontynuować izolację Treg.
  4. Zawiesić PBMC w buforze izolacyjnym (2% zbiorcza ludzka surowica AB [PHS-AB] z 1,5 mM EDTA w buforowanym roztworem soli fizjologicznej [PBS]) w stężeniu 50 x 106 komórek/ml i kontynuować sortowanie magnetyczne zgodnie z instrukcjami producenta zastosowanego zestawu sortującego. Na przykład użyj sortowania komórek magnetycznych (tabela materiałów) do ujemnej izolacji populacji komórek TCD4 + CD127, a następnie sortowania z pozytywną selekcją dla komórek CD25 +.
    UWAGA: Do magnetycznego oczyszczania Treg można stosować różne produkty, w tym podejścia oparte na kolumnach i bez kolumn. Alternatywnie można przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) z bramkowaniem na limfocytach T CD127loCD25o wysokiej zawartości CD4 +. Pełna sterylność nie jest możliwa w przypadku standardowego sprzętu FACS, co stwarza jednak znaczne ryzyko zanieczyszczenia. Ponadto nie można wykluczyć stresu komórkowego i uszkodzeń spowodowanych przez system fluidics, a lasery przyrządów mogą mieć wpływ na wyniki.
  5. Sprawdź uzyskaną populację wzbogaconą w Treg pod kątem czystości poprzez barwienie CD4, CD3, CD127 i CD25 (Rysunek 1). Aby uzyskać dokładny wynik, należy wybrać przeciwciało anty-ludzkie CD25, które rozpoznaje domenę wiążącą CD25 inną niż ta używana w zestawie sortującym, taką jak ta określona w Tabeli materiałów. Wybarwiaj i utrwalaj komórki przy użyciu standardowego protokołu barwienia powierzchni, takiego jak ten opisany w Nowatzky et al.10.

2. Klonowanie Treg z CD127loCD25hi wstępnie wzbogaconej ludzkiej zawiesiny limfocytów T CD4+

  1. Zawiesić komórki wzbogacone w Treg (CD4 + CD127loCD25hi) uzyskane w kroku 1.4 w pożywce z limfocytów T ([TCM]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% streptomycyna/penicylina, 1% HEPES, 1% aminokwasy endogenne i 1% glutamina) z 300 IU / ml ludzkiej rekombinowanej interleukiny-2 (IL-2) (tabela materiałów) dążąc do stężenia ~ 1−3 x 106 komórek / ml i liczby. Uzyskaj co najmniej trzy oddzielne liczby komórek i oblicz średnią liczbę komórek przed kontynuowaniem, ponieważ dokładne zliczanie jest absolutnie kluczowe.
  2. Przygotuj zawiesinę jednokomórkową komórek w dwóch stężeniach: (1) 3 komórki/ml i (2) 6 komórek/ml. Załadować pięć okrągłodennych 96-dołkowych płytek ze 100 μl/studzienkę zawiesiny 1 i pięć płytek z zawiesiną 2. Zachowaj szczególną ostrożność, aby utrzymać komórki w zawieszeniu podczas ładowania płytek, aby zapewnić rozkład odpowiednio 0,3 i 0,6 ogniwa/studzienkę.
    UWAGA: Nie należy zwiększać stężenia komórek do 1 komórki / studzienkę, ponieważ zwiększa to ryzyko uzyskania oligoklonalnych linii komórkowych, a nie prawdziwych klonów.
  3. Przygotować komórki zasilające ze świeżo wyizolowanych ludzkich allogenicznych PBMC otrzymanych przez wirowanie w gradiacji gradientu gęstości, jak w kroku 1.2.
  4. Przygotować co najmniej 10 x 106 komórek zasilających na płytkę klonującą do napromieniania poprzez ponowne zawieszenie ludzkich allogenicznych PBMC w TCM bez IL-2 w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml w stężeniu ~10 x 106 PBMC/ml. Szczelnie zamknąć rurkę i napromieniować 35 Gy promiennikiem promieniowania gamma lub urządzeniem do napromieniania rentgenowskiego.
    UWAGA: Napromieniowanie wyzwala wydzielanie dużych ilości cytokin z karmników, które ułatwiają proliferację Teff, ale mogą niekorzystnie wpływać na ekspansję Treg. Zostaną one następnie usunięte przez pranie.
  5. Odwirować komórki przy 450 x g i RT przez 5 minut po napromieniowaniu i odessać supernatant. Umyj komórki, ponownie zawieszając je w TCM bez IL-2, używając co najmniej 10-krotności objętości granulowanej komórki zasilającej nośnika/PBS.
    UWAGA: Zaleca się określenie profilu ekspresji ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) komórek dawcy, które mają być klonowane. Można to zrobić poprzez proste barwienie jednego lub kilku typów HLA, które są powszechne w populacji, z której pochodzi dany dawca (tj. HLA-A2 lub HLA-A24). PBMC stosowane jako komórki karmicielskie nie powinny wykazywać ekspresji tego HLA, aby umożliwić ponowną identyfikację/izolację komórek docelowych z kultur ekspandacyjnych przed apoptozą karmów wywołaną napromieniowaniem.
  6. Ponownie zawiesić napromieniowane i przemyte komórki zasilające w TCM za pomocą 300 j.m./ml IL-2 w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
  7. Dodać fitohemaglutyninę-L (PHA-L) (tabela materiałów) w stężeniu 4 μg/ml (2x wymagane stężenie w hodowli) i szybko przejść do kroku 2.8.
  8. Dodać 100 000 napromieniowanych komórek zasilających w 100 μL TCM z 4 μg/mL PHA-L i 300 IU/mL IL-2 do posianych komórek wzbogaconych Treg, co daje całkowitą objętość 200 μl i stężenie PHA-L 2 μg/ml w każdym dołku. Dobrze wymieszaj, pipetując 5x w górę i w dół. Ograniczyć czas ekspozycji komórek zasilających na PHA-L przed ich dodaniem do Treg do niezbędnego minimum i przechowywać w zawiesinie do momentu ich platerowania.
    UWAGA: Zapewnić stężenie PHA-L 2 μg/ml w kulturze na początkowym etapie wysiewu, ale przy kolejnym rozrastaniu klonów Treg należy użyć niższego stężenia 1 μg/ml. Stosować 300 j.m./ml IL-2 w całym tekście.
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C. Zmienić 50% pożywki za pomocą TCM z 300 j.m./ml IL-2, ale bez PHA-L w dniach 5−7.

3. Ekspansja Treg i utrzymanie klonów w kulturze

  1. Począwszy od 12 dnia, sprawdzaj kultury pod kątem obecności osadów proliferujących komórek.
    UWAGA: Będą osady utworzone przez komórki karmicielskie, ale w badaniu mikroskopowym będą one wyglądać jak małe, okrągłe, umierające lub martwe komórki, podczas gdy proliferujące limfocyty T będą większe, z jasnym kontrastem i zdrowym wyglądem, często tworząc skupiska sąsiednich komórek, które wydają się brązowe w badaniu makroskopowym.
  2. Kontynuuj badanie kultur co 1-2 dni. Wyizoluj proliferujące się niepewne klony, przenosząc je do pojedynczych studzienek. Umieść każdy wstępny klon na pojedynczej płytce z 96 dołkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego danego wstępnego lub ustalonego klonu poprzez niezamierzony transfer komórek z innych studzienek.
  3. Utrzymuj komórki przez 50% wymiany pożywki co 2-3 dni i dziel w razie potrzeby. Uważnie monitoruj komórki.
    UWAGA: Opóźnianie zmian pożywki i rozszczepienie może uszkodzić komórki, a "nadmierne dzielenie" może zatrzymać ich proliferację i spowodować śmierć komórki.
  4. Ponownie stymuluj komórki napromieniowanymi allogenicznymi podajnikami, jak opisano w krokach 2.3−2.9, ale używaj niższych stężeń PHA-L (tj. 1 μg / ml w TCM z 300 IU / ml IL-2). Ponownie stymuluj, gdy rozmiar komórki zmniejsza się, a komórki stają się okrągłe, w przeciwieństwie do wydłużonego owalu, który zwykle występuje po 2-3 tygodniach.
    UWAGA: Utrzymuj oryginalną kulturę klonowania przez co najmniej 6-8 tygodni. Wiele "wczesnych" klonów, które stają się widoczne w ciągu 2 tygodni lub wkrótce po 2 tygodniach, zwykle nie są prawdziwymi limfocytami Treg, ale szybko proliferującymi komórkami innymi niż Treg / Teff i są bardziej podatne na niepowodzenie weryfikacji niż "późne" komórki, z których niektóre potrzebują więcej niż 1 miesiąca, aby widocznie pojawić się w hodowli.

4. Weryfikacja wstępnych klonów Treg

  1. Rozpocznij weryfikację wstępnych klonów, gdy rozmnożą się do ~1 x 106 komórek pod kątem monoklonalności i statusu metylacji TSDR.
  2. Opcjonalnie, wstępne badanie ekspansji komórek przez barwienie pod kątem CD3, CD4, CD127 i CD25 w celu zidentyfikowania tych, które są przedmiotem zainteresowania (tj. CD3+CD4+CD127loCD25hi) w celu dalszej oceny (Rysunek 2).
  3. Ustalenie monoklonalności poprzez identyfikację obecności pojedynczego łańcucha Vβ w produkcie komórkowym poprzez barwienie Vβ przy użyciu zestawów dostępnych w handlu przeciwciał barwiących (Tabela materiałów; Rysunek 3) zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że uzyskałeś co najmniej 1 x 106 zdarzeń podczas badania próbek na cytometrze przepływowym w celu wiarygodnej analizy, tak aby można było wykryć niewielkie populacje zanieczyszczeń. Użyj barwnika żywotności.
  4. Mieć status metylacji TSDR w locus FOXP3 oceniony przez dostawców komercyjnych lub in-house11,12. Uzyskaj co najmniej 1 x 105 komórek, aby uzyskać odpowiednie wyniki.
  5. Po potwierdzeniu tożsamości i klonalności limfocytów Treg w krokach 4.3 i 4.4, należy dokonać krioprezerwacji komórek lub użyć ich do dalszych zastosowań.
    UWAGA: Alternatywne, ale znacznie mniej wiarygodne podejścia do weryfikacji polegają na określaniu fenotypu Treg za pomocą barwienia FACS1,10 oraz testów supresji in vitro lub in vivo13,14. Unikaj nadmiernego polegania na testach supresji limfocytów Treg13. Testy są zazwyczaj, ale nie wyłącznie, oparte na kokulturze Treg w stopniowanych liczbach z odpowiadającymi limfocytami T (tj. PBMC lub oczyszczonymi limfocytami T, czasami zubożonymi w Treg) w obecności komórek prezentujących antygen stron trzecich lub CD3 / CD28 z rozcieńczeniem barwnika reprezentującym proliferację jako odczyt. Wiele z tych testów ma poważne ograniczenia i może zawyżać lub zaniżać rzeczywisty stopień supresji, w którym pośredniczy Treg. Status metylacji TSDR pozostaje najbardziej pewną/wiarygodną miarą fenotypu Treg lub "tożsamości"3,15,16. Należy zauważyć, że FOXP3 znajduje się na chromosomie X, a u kobiet jeden chromosom X jest inaktywowany przez metylację DNA, co wpływa na wyniki analizy metylacji TSDR.

5. Kriokonserwacja Treg

UWAGA: Treg może być przechowywany długoterminowo po udanej kriokonserwacji za pomocą DMSO i PHS-AB.

  1. Określ liczbę kriowialiów wymaganych do kriokonserwacji komórek. Jest to równe całkowitej końcowej objętości zawiesiny komórek (w ml) do krioprezerwacji, ponieważ 1 ml zamraża się na fiolkę. Dodać 10% margines bezpieczeństwa do tej objętości, aby uwzględnić straty spowodowane pipetowaniem/napięciem powierzchniowym.
    UWAGA: Komórki można kriokonserwować w szerokim zakresie stężeń, zwykle w zakresie 0,1-100 x 106 komórek/ml.
  2. Oznacz kriowiale.
  3. Wygeneruj roztwór A (SA): wymieszaj 50% RPMI i 50% PHS-AB lub ludzkie osocze. Jeśli używane jest osocze, wirować z prędkością 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Objętość SA powinna wynosić 75% całkowitej końcowej objętości zawiesiny komórek do kriokonserwacji, jak określono w kroku 5.1.
  4. Wytworzyć roztwór B (SB): zmieszać 60% (v/v) PBS lub RPMI i 40% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO).
    UWAGA: Objętość SB powinna wynosić 25% całkowitej końcowej objętości zawiesiny komórek do kriokonserwacji, jak określono w kroku 5.1.
  5. Schłodzić oba roztwory do temperatury 4 °C.
  6. Przygotować pożywkę do zamrażania, mieszając cały SB z równymi częściami SA i trzymać na lodzie.
  7. Wirować Treg od kroku 4.5 w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić pożywkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w pozostałym lodowatym SA i trzymać na lodzie.
  8. Powoli dodawać schłodzone medium zamrażające w stosunku 1:1 do komórek zawieszonych w SA w dużej probówce na lodzie, potrząsając probówką.
  9. Szybko podsycić do kriowialiów w ilości 1 ml na fiolkę. Natychmiast umieść kriowiale w szafce o temperaturze pokojowej i niezwłocznie przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Po 24 godzinach przenieść do płynuN2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne wdrożenie tego protokołu doprowadzi do powstania stabilnych klonów i linii ludzkich regulatorowych limfocytów T.

Preselekcja/wstępne wzbogacenie komórek hi CD4+CD127loCD25 było prostą metodą uzyskania populacji wyjściowej, która zawierała większość ludzkich Treg (Rysunek 1A–C). Nie wszystkie klony wykazywały fenotyp Treg. Wstępna selekcja klonów poprzez pomiar ekspresji CD25hiCD127lo była rozsą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje rozmnażanie ultraczystych ludzkich limfocytów T regulatorowych poprzez izolację, ekspansję i staranną weryfikację komórek uzyskanych w podejściu opartym na ograniczonym rozcieńczaniu i ekspansji opartej na komórkach zasilających z populacji wyjściowych zawierających Treg.

Kluczowymi krokami w tym podejściu są: 1) wybór odpowiedniej populacji wyjściowej. Ogólnie rzecz biorąc, przedziałhi CD127loCD25 limfocytów T CD4 + w ludzkim PBMC zawiera ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez National Eye Institute of the National Institutes of Health pod numerem K08EY025324 Award (Nowatzky) oraz przez Colton Scholar Award od Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m Stericup, 500 mLMillipore5500Przechowywanie i przygotowanie podłoża
100x Aminokwasy endogenneGibco11140-050Składnik podłoża
15 mL stożkowe probówki wirówkowe (50 sztuk w woreczku, opakowanie 500 sztuk)ThermoFisher Scientific339650
1M HEPESGibco15630-080Składnik podłoża
25 ml Basen do pipet jednostudzienkowychFischer Scientific13-681-508
Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml (25 / rękaw)ThermoFisher Scientific339652
50x Penicylina Streptomycyna SolnCorningCorning, 30-001-ClSkładnik podłoża
Fiolka CryoTube Int Gwint Okrągły Btm Starfoot PP Śruba Korek sterylny PP 1,8 mLNalge Nunc377267
DMSOCorning25-950-CQC
Zestaw do pozytywnej selekcji EasySep Human CD25Stemcell Technologies18231Alternatywą jest sortowanie kolumnowe FACS lub MACS
Zestaw do wstępnego wzbogacania komórek T EasySep Human CD4 + CD127 TechnologiaT Stemcell Technologies19231Alternatywą jest sortowanie kolumnowe FACS lub MACS
EasySep Human CD4 + CD127 lowCD25 + Zestaw do izolacji regulatorowych komórek T (alternatywa dla pozycji 12)Stemcell Technologies18063Alternatywą jest sortowanie kolumnowe FACS lub MACS
FicollGE Healthcare17-5442-03PBMC oczyszczanie produktów leukaferezy z krwi obwodowej; średni gradient gęstości
Ludzka surowica AB (PHS-AB)Valley Biomedical IncHP1022Komponent medialny
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich martwych komórek, do wzbudzenia UVThermo FischerL-34962Barwnik żywotności
Fitohemaglutynina-L (PHA-L)Milipore/Sigma11249738001Stymulacja limfocytów T
Rekombinowana IL-2 (np. PROLEUKINAâ )Stymulacja i utrzymanie limfocytów TPrometheus
RPMI 1640Gibco21870-076Składnik podłoża
Przeciwciała barwiące do cytometrii przepływowej (fenotypowanie Treg)Patrz "Komentarze""Komentarze"Przeciwciała barwiące są wymienione w: Nowatzky i in. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. W przypadku stosowania zestawu do selekcji dodatniej EasySep Human CD25, zabarwić przeciwciałem anty-CD25 2A3 lub BC96, np.: Przeciwciało anty-ludzkie CD25 Brilliant Violet 421 (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Zestaw repertuarowy; IOTest Beta MarkBeckman CoulterPN IM3497Weryfikacja ekspansji pod kątem monoklonalności
Płytka do hodowli tkankowej, 96 dołków, dno w kształcie litery U z pokrywką o niskiej parowaniuCorning353077
/ Składnik pożywkiPatrz

Bibliografia

  1. Miyara, M., et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity. 30 (6), 899-911 (2009).
  2. Polansky, J. K., et al. DNA methylation controls Foxp3 gene expression. European Journal of Immunology. 38 (6), 1654-1663 (2008).
  3. Toker, A., et al. Active demethylation of the Foxp3 locus leads to the generation of stable regulatory T cells within the thymus. The Journal of Immunology. 190 (7), 3180-3188 (2013).
  4. Garg, G., et al. Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation. Cell Reports. 26 (7), 1854-1868 (2019).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  6. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Science Translational Medicine. 3 (83), 41(2011).
  7. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), 189(2015).
  8. Dromey, J. A., et al. Generation and expansion of regulatory human CD4(+) T-cell clones specific for pancreatic islet autoantigens. Journal of Autoimmunity. 36 (1), 47-55 (2011).
  9. Sabado, R. L., et al. Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. Journal of Visual Experiments. (78), e50085(2013).
  10. Nowatzky, J., Stagnar, C., Manches, O. OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3 Expressing Human CD4(+) Treg Subsets. Cytometry A. 95 (3), 264-267 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Genome-wide DNA methylation analysis identifies hypomethylated genes regulated by FOXP3 in human regulatory T cells. Blood. 122 (16), 2823-2836 (2013).
  12. Spreafico, R., et al. A sensitive protocol for FOXP3 epigenetic analysis in scarce human samples. European Journal of Immunology. 44 (10), 3141-3143 (2014).
  13. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 21-37 (2011).
  14. Workman, C. J., et al. In vivo Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 119-156 (2011).
  15. Feng, Y., et al. Control of the inheritance of regulatory T cell identity by a cis element in the Foxp3 locus. Cell. 158 (4), 749-763 (2014).
  16. Toker, A., Huehn, J. To be or not to be a Treg cell: lineage decisions controlled by epigenetic mechanisms. Science Signaling. 4 (158), 4(2011).
  17. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  18. Fuhrman, C. A., et al. Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226. The Journal of Immunology. 195 (1), 145-155 (2015).
  19. Gu, J., et al. Human CD39(hi) regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions. Cellular & Molecular Immunology. 14 (6), 521-528 (2017).
  20. Genevee, C., et al. An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (V alpha 1-w29/V beta 1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction. European Journal of Immunology. 22 (5), 1261-1269 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limfocyty T regulacyjneizolacja Tregklony Tregklonowanie kom rekkom rki monoklonalneekspansja Tregcharakterystyka Tregczysto Treghodowla Tregselekcja Treg

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.