Artykuł metodologiczny

Przewodnik po cięciu, rdzeniowaniu i przetwarzaniu obrazów do wysokoprzepustowego pobierania i analizy próbek kości korowych do synchrotronowej mikrotomografii komputerowej

DOI:

10.3791/61081

⸱

12 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowaliśmy protokół geologicznego (rdzeniowego) pobierania próbek, aby pozyskać próbki kości korowej o jednakowej wielkości do eksperymentów SRμCT z przedniej strony ludzkiej kości udowej. Metoda ta jest minimalnie destrukcyjna, wydajna, daje w wyniku cylindryczne próbki, które minimalizują artefakty obrazowania z nieregularnych kształtów próbek oraz poprawiają wizualizację i analizę mikroarchitektoniczną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kość to dynamiczna i mechanicznie aktywna tkanka, której struktura zmienia się w ciągu życia człowieka. Produkty procesu przebudowy kości zostały dokładnie przebadane przy użyciu tradycyjnych technik dwuwymiarowych. Ostatnie postępy w technologii obrazowania rentgenowskiego za pomocą stacjonarnej mikrotomografii komputerowej (μCT) i mikrotomografii komputerowej promieniowania synchrotronowego (SRμCT) pozwoliły na uzyskanie trójwymiarowych (3D) skanów o wysokiej rozdzielczości o większym polu widzenia (FOV) niż inne techniki obrazowania 3D (np. SEM), zapewniając pełniejszy obraz mikroskopijnych struktur w ludzkiej kości korowej. Próbka powinna być jednak dokładnie wyśrodkowana w obrębie pola widzenia, aby ograniczyć pojawianie się artefaktów smug, o których wiadomo, że wpływają na analizę danych. Wcześniejsze badania donosiły o pozyskiwaniu prostoliniowych bloków kostnych o nieregularnych kształtach, które powodują artefakty obrazowania z powodu nierównych krawędzi lub obcięcia obrazu. Zastosowaliśmy protokół pobierania próbek geologicznych (rdzeniowanie) w celu uzyskania próbek rdzenia kostnego kory kostnej o spójnej wielkości do eksperymentów SRμCT z przedniej części ludzkiej kości udowej. Ta metoda rdzeniowania jest wydajna i minimalnie destrukcyjna dla tkanek. Tworzy jednolite cylindryczne próbki, które zmniejszają artefakty obrazowania ze względu na to, że są izometryczne podczas obrotu i zapewniają jednolitą długość ścieżki dla wiązek promieniowania rentgenowskiego podczas skanowania. Przetwarzanie obrazowe danych tomograficznych rentgenowskich próbek rdzeniowych i o nieregularnych kształtach potwierdza potencjał tej techniki w zakresie poprawy wizualizacji i analizy mikroarchitektury kości korowej. Celem tego protokołu jest dostarczenie niezawodnej i powtarzalnej metody ekstrakcji rdzeni kostnych kory mózgowej, którą można dostosować do różnych typów eksperymentów obrazowania kości w wysokiej rozdzielczości. Nadrzędnym celem prac jest stworzenie ustandaryzowanego procesu pozyskiwania kości korowej do SRμCT, który będzie przystępny cenowo, spójny i prosty. Procedura ta może być dalej adaptowana przez badaczy z pokrewnych dziedzin, którzy zwykle oceniają twarde materiały kompozytowe, takie jak antropologia biologiczna, nauki o Ziemi lub nauki o materiałach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki najnowszym postępom w technologii obrazowania, możliwe jest teraz pozyskiwanie danych z obrazowania rentgenowskiego o bardzo wysokiej rozdzielczości. Stacjonarne systemy mikrotomografii komputerowej (μCT) są obecnie standardem w obrazowaniu kości gąbczastej ze względu na ich nieniszczący charakter1. Jednak podczas obrazowania cech mikrostrukturalnych kości korowej zastosowanie μCT jest bardziej ograniczone. Ze względu na ograniczenia rozdzielczości systemy stacjonarne nie mogą osiągnąć rozdzielczości wymaganej do obrazowania cech mikrostrukturalnych mniejszych niż pory korowe, takich jak luki w osteocytach. Do tego zastosowania SRμCT jest idealny ze względu na większą rozdzielczość tych systemów1. Na przykład eksperymenty przeprowadzone w Canadian Light Source (CLS) na liniach badawczych BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) 2 dały obrazy z wokselami o wielkości zaledwie 0,9 μm. Poprzednie badania1,3,4,5 używały tej rozdzielczości do pozyskiwania projekcji i kolejnych trójwymiarowych (3D) renderingów z próbek kości korowych z ludzkich kości długich (Rysunek 1) w celu ilościowego określenia gęstości lakunarnej osteocytów4,6,7,8,9 oraz różnice w kształcie i rozmiarze lakunarnym3 w zależności od długości życia człowieka i płci. Dalsze badania wykazały obecność pasm osteonowych u ludzi10, zjawisko wcześniej uznane za związane tylko ze ssakami innymi niż ludzie w literaturze sądowej antropologicznej.

Aby osiągnąć wyjątkową rozdzielczość, wiązka promieniowania rentgenowskiego musi być precyzyjnie skupiona w polu widzenia (FOV), co często ogranicza maksymalny rozmiar próbki do kilku milimetrów średnicy. Obecnie nie ma kompleksowych, ustandaryzowanych procedur opisanych w literaturze opisującej pobieranie próbek kości, które spełniałyby te ograniczenia. Wyśrodkowanie próbek w polu widzenia ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że 1) próbka pozostaje wyśrodkowana, gdy obraca się o 180° podczas obrazowania, oraz 2) artefakty skanowania są ograniczone, ponieważ nie ma obcięcia obrazu. Innymi słowy, żadne części próbki poza polem widzenia nie zakłócają wiązki wchodzącej w jej ognisko wewnątrz pola widzenia. W takim przypadku algorytm rekonstrukcji zostaje pozbawiony części danych tłumienia potrzebnych do w pełni poprawnej rekonstrukcji. Warto również zauważyć, że skany 360° (pełny obrót) minimalizują skutki utwardzania wiązki, ale zwiększają artefakty spowodowane niewspółosiowością i ruchem próbki podczas obrazowania. W związku z tym, podczas gdy skanowanie 360° zazwyczaj generuje czystsze dane, czas obrazowania jest podwojony, dlatego należy zająć się kompromisem między kosztami eksperymentu a jakością danych.

Ważnym i często pomijanym aspektem eksperymentów z obrazowaniem kości jest dokładna i powtarzalna technika przygotowania próbki wykonywana przed skanowaniem. Badania, które włączają metody SRμCT do swoich eksperymentów, krótko wspominają o protokole pobierania próbek, ale autorzy podają niewiele lub nie podają żadnych szczegółów na temat konkretnej metodologii użytej do zebrania próbek. Wiele takich badań wspomina o cięciu prostoliniowych bloków kostnych o dowolnych wymiarach, ale generalnie nie dostarczają żadnych dalszych informacji na temat użytych narzędzi lub materiałów do osadzania3,4,10,11,12,13,14. Niektórzy badacze często używają ręcznych narzędzi obrotowych (np. Dremel) do usuwania prostoliniowych bloków kości z obszaru zainteresowania (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Ta metoda skutkuje próbkami o niejednolitych rozmiarach, które mogą być większe niż pole widzenia, co zwiększa prawdopodobieństwo artefaktów skanowania i obcięcia obrazu. Takie próbki często wymagają dalszej rafinacji przy użyciu precyzyjnej piły diamentowej (np. Buehler Isomet). Pozyskiwanie próbek o stałych wymiarach (z dokładnością do dwóch setnych/mm) ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że pozyskane zestawy danych są najwyższej jakości, a późniejsze wyniki są powtarzalne.

Ograniczone raportowanie metodologii pobierania próbek dodatkowo utrudnia próbę zastosowania i/lub walidacji metod przeprowadzonych w poprzednim badaniu. Obecnie badacze muszą kontaktować się bezpośrednio z autorami w celu uzyskania dalszych informacji na temat procedur pobierania próbek. Szczegółowo opisany tutaj protokół zapewnia badaczom biomedycznym dokładnie udokumentowaną, powtarzalną i opłacalną technikę pobierania próbek. Głównym celem tego artykułu jest przedstawienie kompleksowego samouczka dotyczącego sposobu pozyskiwania próbek rdzenia kostnego kory kostnej o stałej wielkości za pomocą frezarki-wiertarki i diamentowego wiertła rdzeniowego w celu dokładnej wizualizacji i ekstrakcji danych mikroarchitektonicznych. Metoda ta jest zmodyfikowana w stosunku do procedur stosowanych do rutynowego zbierania jednolitych cylindrów o małej średnicy (1-5 mm) z bloków twardych materiałów w mechanice skał wysokociśnieniowych 15,16,17,18,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki pochodziły od zabalsamowanych zwłok z Uniwersytetu w Toledo, College of Medicine and Life Sciences oraz Northeast Ohio Medical University (NEOMED), za świadomą zgodą samego dawcy lub jego najbliższej rodziny. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu w Akron ds. Ochrony Ludzi (IRB) uznała te okazy za zwolnione z pełnej oceny IRB, ponieważ nie zostały pozyskane od żywych osób. Informacje demograficzne, w tym wiek, płeć i przyczyna zgonu, były dostępne dla wszystkich dawców. Wybrane osoby nie miały udokumentowanych schorzeń wpływających na kości ani ekspozycji na schematy leczenia, które mogły mieć wpływ na przebudowę kości w momencie śmierci. Próbki kości korowych pobrano z kości udowej zwłok współczesnych mężczyzn i kobiet w wieku od 19 do 101 lat (średnia = 73,9 lat). Trzon kości udowej był szeroko badany, w tym badania zmienności porowatości kory mózgowej20,21,22,23,24 i gęstość materiału tkanki kostnej25,26,27, i tym samym stała się powszechnie używaną stroną dla analizy mikrostrukturalne.

1. Pobieranie tkanek i maceracja

  1. Użyj piły oscylacyjnej wyposażonej w ostrze z węglika spiekanego do cięcia wgłębnego (do materiałów kompozytowych), aby uzyskać bloki kostne o długości ~7,5 cm ze środkowej części trzonu lewej kości udowej.
  2. Bloki kości udowej moczyć w szklanym naczyniu żaroodpornym wypełnionym sproszkowanym enzymem proteazy i roztworem wody z kranu przez 1 godzinę w inkubatorze ustawionym na temperaturę 45 °C.
  3. Po inkubacji ostrożnie usuń wszelkie pozostałe tkanki miękkie i okostną za pomocą sekcji lub narzędzi dentystycznych.
    UWAGA: Unikaj używania ostrych narzędzi (np. skalpela) do usuwania tkanek miękkich. Takie instrumenty mogą powodować uszkodzenia kości, które są wykrywalne w skanach μCT, wpływając na zachowanie próbki i jakość danych skanowania.
  4. Usuń zanieczyszczenia lub okluzje w jamie szpikowej, umieszczając bloki kostne w myjce ultradźwiękowej na 5-10 minut z 20:1 częściami wody z kranu do roztworu czyszczącego (patrz Tabela materiałów) lub za pomocą ręcznego irygatora do wody (np. Waterpik).
  5. Zanurz blok kostny w pojemniku na próbkę i napełnij 70% etanolem. Pozwól kości moczyć się przez co najmniej 24 godziny, aby usunąć lipidy.
    UWAGA: Ksyleny mogą być również używane do usuwania lipidów. Długotrwałe moczenie w ksylenach może jednak sprawić, że kość stanie się krucha lub kredowa, ponieważ jest to emulgator.
  6. Po 24 godzinach wyjmij bloki kostne z etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze otoczenia przez 24-48 godzin.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany.

2. Podział tkanek

  1. Umieść szkiełko mikroskopowe o wymiarach 75 x 25 mm na płycie grzejnej ustawionej na 140 °C. Rozpuść dużą ilość termicznej żywicy epoksydowej (patrz Tabela materiałów) na środku szkiełka.
    1. W przypadku przygotowywania dodatkowych cienkich skrawków do mikroskopii (<50 μm) może być konieczne osadzenie bloku kostnego w dwuczęściowej żywicy epoksydowej w celu zachowania beleczków. Ponadto, podczas wdrażania tego protokołu w przypadku delikatnych próbek (np. kości diagenetycznych lub próbek o wysokiej beleczkowaniu), konieczne jest osadzenie próbek w żywicy epoksydowej.
      UWAGA: Próbki kości użyte w tym protokole zostały pobrane z zabalsamowanych próbek zwłok. Jeśli świeże próbki są pobierane podczas autopsji lub z przypadku chirurgicznego w celu zbadania struktur tkanek miękkich (np. układu krwionośnego) za pomocą SRμCT, impregnacja żywicą epoksydową może wywołać uszkodzenie takich tkanek. W takich przypadkach zalecany jest alternatywny klej lub środek montażowy (np. taśma dwustronna, plastelina).
  2. Wciśnij dolną część bloku kostnego w termiczną żywicę epoksydową na szkiełku mikroskopowym, tak aby długość kości była prostopadła do szkiełka. Przesuwaj próbkę do przodu i do tyłu, aby pokryć spód kości i zapewnić bezpieczne przyleganie do szkiełka.
  3. Pozostaw zamontowaną próbkę na płycie grzejnej przez ~ 5 minut, aby żywica epoksydowa termiczna mogła wsiąknąć w pory i/lub pęknięcia.
    UWAGA: Żywica epoksydowa na szkiełku powinna być wolna od pęcherzyków powietrza, aby zapewnić najlepszą przyczepność. Aby usunąć pęcherzyki, przesuwaj próbkę do przodu i do tyłu na szkiełku. Bąbelki często tworzą się w wyniku ucieczki i parowania wody i/lub etanolu uwięzionego w kości.
  4. Wyjmij szkiełko z zamontowaną próbką z płyty grzejnej za pomocą kleszczy i pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez ~10 minut. Usuń żywicę epoksydową z krawędzi prowadnicy za pomocą żyletki, aby upewnić się, że uchwyt prawidłowo chwyta suwak.
  5. Przymocuj szkiełko z przyklejoną próbką do szklanego uchwytu ślizgowego i zamontuj uchwyt na ramieniu obrotowym wolnoobrotowej piły do cięcia (patrz Tabela materiałów, Rysunek 2).
    UWAGA: Chociaż w tym protokole zastosowano piłę Buehler IsoMet, dostępne są inne precyzyjne piły do cięcia, które mogą być używane zamiast IsoMet (np. Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Wyreguluj ramię obrotowe za pomocą pokrętła pozycjonującego, aby upewnić się, że ostrze styka się i przenika próbkę. Ustawić próbkę w taki sposób, aby przekrój kości został przecięty prostopadle do jej długości.
  7. Dodaj obciążniki po drugiej stronie ramienia tnącego, aby zrównoważyć ciężar ramienia.
    UWAGA: Jeśli używana jest niewystarczająca przeciwwaga, sample może przycisnąć się do ostrza i spowodować pęknięcie ostrza.
  8. Dodaj płyn chłodząco-smarujący (20:1 części wody do płynu obróbkowego) do zbiornika płynu piły.
  9. Mocno dokręć diamentowe ostrze waflowe i upewnij się, że poziom płynu zanurza część tnącą ostrza. Ustaw prędkość na 200 obr./min i powoli opuść próbkę na ostrze (Rysunek 3).
  10. Upewnij się, że ostrze i uchwyt nie chwieją się i/lub nie podskakują. W przypadku zauważenia nadmiernego ruchu, przed wznowieniem cięcia należy natychmiast zatrzymać pilarkę i dokręcić zespół ostrza i/lub ramienia uchwytu. Dodaj dodatkowe przeciwwagi, jeśli uchwyt agresywnie porusza się w górę iw dół. Nadmierny ruch, w tym widoczny ruch na boki, może spowodować pęknięcie ostrza.
  11. Pierwszy gruby przekrój to "cięcie odpadowe", które zapewnia dobrze zdefiniowaną powierzchnię równoległą do każdego dodatkowego cięcia. Po wstępnym cięciu odpływu podnieś ramię obrotowe i przesuń uchwyt w kierunku ostrza o 5 mm za pomocą pokrętła pozycjonującego. Za pomocą tej metody można dalej pobierać dalsze grube przekroje (~1 mm) do mikroskopii.
    UWAGA: W celu zaoszczędzenia cennych tkanek można pominąć cięcie odpadów. Jednak podczas cięcia próbki o nierównej krawędzi bardzo ważne jest, aby szczyt próbki był ustawiony stycznie do krawędzi wiertła rdzeniowego.
    1. Pamiętaj, aby wziąć pod uwagę rzaz ostrza podczas cięcia. Na przykład, aby uzyskać przekrój 5 mm z ostrza o rzazie 0,5 mm, przesuń próbkę i uchwyt o 5,5 mm w kierunku ostrza.
  12. Po zakończeniu cięcia umieść szkiełko z zamontowaną próbką na płycie grzejnej, aby stopić termiczną żywicę epoksydową. Pozwala to na szybkie usunięcie bloków kostnych ze szkiełka.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Próbkowanie rdzenia

  1. Zamontuj 5 mm odcinki kości do dna płytkiej aluminiowej puszki (o średnicy ~8 cm) przy użyciu techniki termicznego łączenia epoksydowego, jak opisano w krokach 2.2-2.4.
  2. Umieść cynę na stole maszyny XY frezarko-wiertarki (patrz Tabela materiałów) i ręcznie dokręć zaciski mocujące (Rysunek 4).
  3. Włóż wiertło rdzeniowe jubilera o średnicy wewnętrznej 2 mm z drążonym wałem z diamentową końcówką (patrz Tabela materiałów) do uchwytu wiertarskiego. Dostosuj ogranicznik głębokości, aby zapobiec przebijaniu się przez cynę (Rysunek 5).
  4. Wyrównaj środkową przednią część próbki kości pod wiertłem, unikając bliskiego kontaktu z okostną, śródkrwistym lub silnie beleczkowanymi obszarami.
    UWAGA: Automatyczna selekcja środkowej przedniej części kory udowej nie jest możliwa, ponieważ grubość kory różni się u poszczególnych osób, zwłaszcza wraz z wiekiem.
  5. Napełnij puszkę wodą destylowaną, aby całkowicie przykryć próbkę. Zapobiega to gromadzeniu się ciepła, spaleniu próbki i/lub uszkodzeniu wiertła podczas wiercenia.
    UWAGA: Aby ocenić możliwość uszkodzenia cieplnego spowodowanego rdzeniem, użyto termometru na podczerwień w celu uzyskania odczytów temperatury z wody destylowanej, gdy wiertło rdzeniowe najpierw wnikało w powierzchnię kości. Temperatura wahała się o 1 °C, od 22,9 do 23,9 °C wśród dziesięciu próbek wydrążonych do tego testu. Dlatego twierdzimy, że uszkodzenia wywołane ciepłem są znikome.
  6. W pierwszych kilku przypadkach kontaktu między rdzeniem wiertniczym a kością należy delikatnie docisnąć, aby założyć pierścień na górną powierzchnię kości. Zapobiega to ugięciu wiertła na początku procesu wiercenia i zapewnia prawidłowe umieszczenie wiertła.
  7. Podczas wiercenia należy wsuwać i wyjmować wiertło z próbki, trzymając końcówkę wiertła pod powierzchnią wody. Kontynuuj tę technikę co kilka sekund, aby wypłukać uwięziony pył kostny i upewnić się, że zanieczyszczenia nie zasłaniają wiertła.
    UWAGA: Jeśli rdzeń tworzy stożkowy kształt, jest to prawdopodobnie spowodowane 1) niewystarczającym czasem na wypłukanie pyłu kostnego z wiertła rdzeniowego oraz 2) rdzeniowanie następuje zbyt szybko. Zwiększona prędkość może oderwać duże kawałki od próbki i sproszkować lepszy aspekt.
  8. Po zakończeniu rdzeniowania, powstały rdzeń kostny może utknąć w wiertle z wydrążonym trzpieniem (Rysunek 6). Użyj pary kleszczyków z cienką końcówką lub małego klucza imbusowego, aby usunąć rdzeń z wiertła (Rysunek 2).
  9. Przechowuj wydrążoną próbkę w oznakowanej probówce mikrowirówkowej w chłodnym i suchym miejscu do czasu obrazowania.

4. Procedury przetwarzania obrazu do oceny parametrów mikroarchitektury kości z rdzeni kostnych kory mózgowej

  1. Rekonstrukcja obrazów μCT
    1. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję NRecon na stronie https://www.bruker.com/products/microtomography.html w celu rekonstrukcji obrazów projekcyjnych SRμCT.
    2. Wybierz skrót NRecon na pulpicie, a pojawi się powiązany GPUReconServer.
    3. Otwórz żądany zestaw danych w wyskakującym okienku. Jeśli okno nie zostanie wyświetlone, wybierz ikonę folderu w lewym górnym rogu okna przeglądarki danych.
    4. Wybierz pierwszą projekcję z akwizycji SRμCT. W obszarze Output (Wyjście) usuń wybrane opcje Use ROI (Użyj ROI) i Scales ON.
    5. Wybierz miejsce docelowe pliku rekonstrukcji. Wybierz pozycję Przeglądaj i utwórz nowy folder o nazwie Recon. Wybranym formatem pliku powinno być BMP(8).
    6. Sprawdź kompensację niewspółosiowości.
      UWAGA: To oszacowanie jest często bliskie poprawności. Przybliżony render 3D można dostosować ręcznie, przesuwając strzałki w górę i w dół, aby przesunąć nakładające się obrazy tak, aby prawa i lewa krawędź były wyrównane tak blisko, jak to możliwe.
    7. W obszarze Ustawienia wybierz żądane opcje, aby zastosować algorytmy Wygładzanie, Utwardzanie belki, Obrót CS, Obiekt większy niż FOV i Artefakty pierścieniowe.
    8. Dostosuj histogram w obszarze Wyjście, wybierając opcję Auto.
      UWAGA: Wynikowy obraz może być przyciemniony.
    9. Wybierz opcję Uruchom, aby rozpocząć przetwarzanie rekonstrukcji.
    10. Użyj standardowej nomenklatury dla wskaźników lakunarnych kanałów/osteocytów28. Mogą to być między innymi: całkowita objętość tkanki VOI (TV), objętość kanału (Ca.V), całkowita liczba kanałów (Ca.N), średnia średnica kanału (Ca.Dm), porowatość kory mózgowej (Ca.V/TV), podawana w procentach, całkowita liczba luk (N.Lc) i średnia objętość lakunarna (Lc.V). Aby określić gęstość lakunarną namm3 (N.Lc/BV), objętość kości (BV) oblicza się jako objętość całkowitą minus objętość kanału (TV-Ca.V).
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Zbieranie danych mikroarchitektonicznych ze zrekonstruowanych obrazów
    1. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję CTAnalyser pod adresem https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html do analizy parametrów mikroarchitektonicznych.
      UWAGA: Darmowa wersja CTAnalyser ma ograniczoną funkcjonalność. W związku z tym zaleca się zakup pełnej licencji w celu wykonywania bardziej szczegółowych analiz.
    2. W obszarze Obraz | Właściwości | Zmień rozmiar piksela, upewnij się, że rozmiar piksela jest zgodny z zastosowanym protokołem obrazowania μCT.
      UWAGA: W przypadku edytowania obrazów w programie ImageJ lub podobnym programie należy pamiętać, że po zapisaniu nagłówek osadzony w pliku TIFF zostanie zmodyfikowany, a oprogramowanie analityczne zmieni rozmiar piksela podczas importowania zestawu danych.
    3. Wybierz opcję Przetwarzanie niestandardowe, aby utworzyć listę zadań (patrz Materiały dodatkowe) w celu przeanalizowania mikroarchitektury kości na podstawie zestawu danych skanowania. Ogólny protokół parametrów sieci lakunarnej osteocytów przy użyciu wtyczek zastrzeżonych dla CTAnalyser znajduje się tutaj:
      UWAGA: Lista zadań wtyczki działa dobrze w przypadku zestawów danych, w których próbka jest jedynym tematem widocznym w polu widzenia. Jeśli próbka jest otoczona pustą przestrzenią, wymagane jest zastosowanie zwrotu z inwestycji. W przeciwnym razie wartości zebrane w Analizie 3D i Analizie poszczególnych obiektów zostaną sztucznie zaniżone.
      1. Ponownie załaduj obrazy, aby zresetować i/lub dostosować wszelkie modyfikacje (np. z edycji w ImageJ lub podobnym) przed otwarciem menu Przetwarzanie niestandardowe w oprogramowaniu do analizy.
      2. Aby zredukować szumy na obrazach, zastosuj gaussowski filtr dolnoprzepustowy w przestrzeni 3D z okrągłym jądrem i promieniem 2-3,
        UWAGA: Te ustawienia zostały zastosowane do zestawów danych z raportowanych eksperymentów SRμCT za pomocą testów prób i błędów. Celem było uzyskanie jak najlepszej jakości rekonstrukcji danych. Dostosuj ustawienia rekonstrukcji, aby dopasować je do każdej unikalnej konfiguracji eksperymentalnej.
      3. Zastosuj globalny próg skali szarości do obrazów, wybierając niskie i wysokie wartości, aby wyróżnić kanały naczyniowe. Zrekonstruowane wycinki widoczne na rysunkach 8B i 8D przedstawiają przykładowy próg 0-155,
        UWAGA: Podobnie jak w kroku 4.2.3.2, zastosowane tutaj ustawienia progowe zostały wybrane metodą szeroko zakrojonych prób i błędów. Progi powinny być dostosowane do każdej zastosowanej konfiguracji eksperymentalnej i systemu obrazowania μCT.
      4. Despeckle (odszumianie) w celu usunięcia białych plamek w przestrzeni 3D, które mieszczą się w zakresie rozmiarów pikseli wolumetrycznych (wokseli) luk osteocytów, tylko w celu wyizolowania kanałów.
        UWAGA: W przypadku skanu SRμCT ludzkiej kości korowej wykonanego przy rozmiarze piksela 0,9 μm, dolna granica luk w osteocytach wynosi 13 wokseli.
      5. Usuń plamki, aby usunąć wszelkie czarne plamki w przestrzeni 2D, aby usunąć artefakty w kanałach. Mogą one być dość duże w 2D, usuwając w ten sposób cechy o rozdzielczości <15 000 pikseli.
      6. Rozszerz pory w przestrzeni 3D za pomocą funkcji operacji morfologicznej z okrągłym jądrem o promieniu 2 lub 3, w zależności od jakości obrazów, w celu wyizolowania wszelkich tkanek miękkich uwięzionych w kanałach.
      7. Wykonaj dodatkową funkcję usuwania plamek przy użyciu tych samych ustawień, co w kroku 4.2.3.5, aby usunąć izolowane tkanki miękkie w obrębie kanałów.
      8. Erodować dylatację z kroku 4.2.3.6. za pomocą funkcji operacji morfologicznej przy użyciu okrągłego jądra o promieniu 2 lub 3. Promień dla tego etapu musi być zgodny z promieniem zastosowanym w procedurze 4.2.3.6.
      9. Uruchom analizę 3D i wybierz parametry, które mają zostać obliczone dla objętości kanałów naczyniowych. Ogólnie rzecz biorąc, podstawowe wartości dostarczą wystarczających informacji.
      10. Zapisz przetworzone obrazy za pomocą opcji Zapisz bitmapy w niestandardowym podfolderze w katalogu.
        UWAGA: W przypadku tworzenia obrazu rekonstrukcji 3D z przetworzonych obrazów za pomocą programu takiego jak Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti itp., zaleca się zapisanie obrazów jako monochromatycznych (1 bit).
      11. Oblicz liczbę kanałów naczyniowych i opisz ich rozmiar, kształt i orientację za pomocą funkcji Analiza poszczególnych obiektów.
      12. Powtórz kroki 4.2.3.1 – 4.2.3.3., aby zresetować obraz do analizy lakunarnej osteocytów.
      13. Usuń białe plamki w przestrzeni 3D za pomocą funkcji Despeckle, upewniając się, że takie artefakty są mniejsze niż dolna granica rozmiaru lakunarnego. Ten krok usuwa szumy ze skanu, które mogą wydawać się porami korowymi, zachowując jednocześnie prawdziwe luki w osteocytach. W przypadku skanów SRμCT o rozmiarze piksela 0,9 μm ten dolny limit wynosi 13 wokseli.
      14. Ponownie usuń plamki, aby usunąć białe plamki, które są większe niż górna granica rozmiaru lakunarnego. W przypadku zestawów danych SRμCT dla ludzi z ustawieniami wymienionymi w kroku 4.2.3.13 limit ten wynosi 2743 woksele.
      15. Wykonaj analizę 3D, aby wyodrębnić informacje mikrostrukturalne dotyczące luk w osteocytach.
      16. Wybierz opcję Zapisz mapy bitowe, aby zapisać przetworzone obrazy w celu wyizolowania luk w osteocytach.
      17. Wykonaj analizę poszczególnych obiektów, aby obliczyć liczbę osteocytów w 3D w obrębie wybranej objętości zainteresowania (VOI).
        UWAGA: Po ustaleniu i przetestowaniu listy zadań, CTAnalyser posiada funkcję menedżera wsadowego (BatMan), którą można wykorzystać do przyspieszenia ekstrakcji danych i zapewnienia jednolitego przetwarzania obrazu. Lista zadań z przykładowymi ustawieniami dla Procedury 4.2.3. można znaleźć w materiałach uzupełniających.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda próbkowania rdzenia okazała się bardzo skuteczna i wydajna. Rdzeniowanie próbek przy użyciu tego protokołu pozwoliło na pozyskanie >300 próbek o stałej wielkości do eksperymentów na linii badawczej CLS BMIT-BM2, o polu widzenia ~2 mm przy rozmiarze woksela 1,49 μm. Aby potwierdzić spójność średnicy rdzenia, wykonano trzy pomiary wzdłuż długości (góra, środek, dół) podzbioru ludzkich rdzeni przedniej części kości udowej (n = 69). Średnia średnica rdzeni wynosiła 1,96 ± 0,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie istnieje kompleksowy, ustandaryzowany protokół pozyskiwania jednolitych i cylindrycznych próbek rdzenia kostnego kory mózgowej do obrazowania SRμCT o wysokiej rozdzielczości z ograniczonymi ustawieniami pola widzenia. Opisany tutaj protokół wypełnia tę lukę, zapewniając obszerny samouczek dotyczący sposobu pozyskiwania próbek rdzenia kostnego o stałej wielkości do obrazowania SRμCT oraz późniejszej dokładnej wizualizacji i ekstrakcji danych mikroarchitektonicznych. Wykazaliśmy, że nasz protokół zapewnia bardziej usta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tym artykule zostały przeprowadzone w ośrodku BMIT w Kanadyjskim Źródle Światła, które jest wspierane przez Kanadyjską Fundację Innowacji, Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Research Council of Canada, University of Saskatchewan, Rząd Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, National Research Council Canada oraz Canadian Institutes of Health Research. Autorzy chcieliby podziękować naukowcom z Canadian Light Source, w szczególności Adamowi Webbowi, Denise Miller, Sergeyowi Gasilovowi i Ning Zu za pomoc w konfiguracji i rozwiązywaniu problemów z systemami SkyScan SRμCT i mikroskopu białej wiązki. Pragniemy również podziękować Beth Dalzell z University of Toledo College of Medicine and Life Sciences oraz dr Jeffreyowi Wenstrupowi z Northeast Ohio Medical University za dostęp do próbek zwłok do tego badania. JM Andronowski jest wspierany przez fundusze badawcze na rozpoczęcie działalności zapewniane przez Uniwersytet w Akron oraz grant National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes (2018-DU-BX-0188). RA Davis jest wspierany przez asystenturę dla absolwentów zapewnianą przez Uniwersytet w Akron. Sprzęt i materiały używane do rdzeniowania i piłowania zostały zakupione dzięki funduszom startowym zapewnionym przez Uniwersytet w Akron i grantowi NSF EAR-1624242 dla CW Holyoke.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-1/8" węglik spiekany do kompozytówWarrior6181228,6 mm wgłębny
70% etanoluFisher ScientificBP82015003,8 litra
Kleszcze z końcówkąFisher Scientific10-300
Probówki wirówkoweThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 Żywica epoksydowaTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Pobierz i zainstaluj w https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Zestaw narzędzi dentystycznychAmazon787269885110
Diamentowy brzeszczot do wafli do materiałów kompozytowychBuehler#11-4247
WiertarkaJet Mill / Wiertarka350017Model: JMD-15, wiertarki stołowe są odpowiednimi substytutami, ale zazwyczaj brakuje im przekładalnego stołu maszynowego do umieszczania próbek pod trzpieniem wiertła
Kleszcze z cienką końcówkąFisher Scientific22-327379
Zaciski mocujące do stołu maszyny XY do frezarki/wiertarkiMSC Industrial Supply#04804571
Szkiełka mikroskopoweszklane Ted Pella26005Szkiełka 75x50mm, grubość 1mm
Uchwyt do prowadnic szklanychBuehler#112488Wystarczająco duży, aby pomieścić szkiełka o wymiarach 75x50mm
Płyta grzejna o prędkości 140 stopni CInkubatorHP88850105
NAPCOModel 4200
Isocut Płynnapełniania111193032smarem; 30mL
Wiertło diamentowe jubileraOtto Frei#119.050Wiertło rdzeniowe z pustym trzpieniem o średnicy wewnętrznej 2 mm
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Pobierz i zainstaluj pod adresem https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Piła oscylacyjnaHarbor Freight62866
Naczynia szklane nadające się do pieczenia w piekarnikuPyrex1117715Szklany pojemnik do przechowywania żywności
Precyzyjna piła wolnoobrotowa (Isomet 1000)Buehler111280160
ŻyletkiAmazon25181
Płytkie puszki aluminioweAmazonkaKubkiśrednicy B01MRWLD0R ~ 8 cm
Amazon616784425436 885334344729
Tergazyme detergentAlconox1304-1Pudełko 1,8 kg
Myjka ultradźwiękowaMTI CorporationKJ201508006
ThermoScientific do na próbki o

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691(2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420(2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210(1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pozyskiwanie ko ci korowejpobieranie rdzeni kostnychsekcjonowanie i wycinanie rdzenianaliza wysokoprzepustowaprzygotowanie preparat w kostnychredukcja artefakt w w mikro CTcylindryczne pr bki kostneanaliza mikroarchitektury ko ci

Powiązane artykuły