Dwukomorowa ocena czynności serca i pętli ciśnienie-objętość za pomocą cewnikowania w zamkniętej klatce piersiowej u myszy

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół oceny dwukomorowej funkcji serca u myszy poprzez generowanie pętli ciśnienie-objętość (PV) z prawej i lewej komory u tego samego zwierzęcia za pomocą zamkniętego cewnikowania klatki piersiowej. Nacisk kładziony jest na techniczny aspekt chirurgii i pozyskiwania danych.

Streszczenie

Ocena funkcji serca jest niezbędna do przeprowadzenia badań przedklinicznych sercowo-naczyniowych i płucno-naczyniowych. Pętle ciśnieniowo-objętościowe (pętle PV) generowane przez rejestrowanie zarówno ciśnienia, jak i objętości podczas cewnikowania serca są niezbędne do oceny zarówno skurczowej, jak i rozkurczowej funkcji serca. Czynność lewego i prawego serca jest ze sobą ściśle związana, co znajduje odzwierciedlenie we współzależności komorowej. Dlatego rejestrowanie funkcji dwukomorowej u tego samego zwierzęcia jest ważne, aby uzyskać pełną ocenę czynności serca. W tym protokole przyjęto podejście do cewnikowania serca z zamkniętą klatką piersiową, zgodne ze sposobem, w jaki cewnikowanie jest wykonywane u pacjentów, u myszy. Chociaż jest to trudne, strategia zamkniętej klatki piersiowej jest podejściem bardziej fizjologicznym, ponieważ otwarcie klatki piersiowej powoduje poważne zmiany w obciążeniu wstępnym i następczym, które tworzą artefakty, w szczególności spadek ogólnoustrojowego ciśnienia krwi. Podczas gdy echokardiografia o wysokiej rozdzielczości jest stosowana do oceny gryzoni, cewnikowanie serca jest nieocenione, szczególnie przy ocenie ciśnienia rozkurczowego w obu komorach.

Opisana tutaj jest procedura wykonywania inwazyjnych, zamkniętych w klatce piersiowej, sekwencyjnych pętli ciśnienia i objętości (PV) lewej i prawej komory u tego samego zwierzęcia. Pętle fotowoltaiczne są pozyskiwane przy użyciu technologii admitancji z cewnikiem ciśnieniowo-objętościowym myszy i systemem akwizycji ciśnieniowo-objętościowej. Opisano procedurę, począwszy od rozwarstwienia szyi, które jest wymagane do uzyskania dostępu do prawej żyły szyjnej i prawej tętnicy szyjnej, do wprowadzenia i umiejscowienia cewnika, a na końcu do pozyskiwania danych. Następnie omówiono kryteria wymagane do zapewnienia nabycia wysokiej jakości pętli fotowoltaicznych. Na koniec pokrótce opisano analizę pętli PV lewej i prawej komory oraz różne parametry hemodynamiczne dostępne do ilościowego określenia skurczowej i rozkurczowej funkcji komory.

Wprowadzenie

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), choroby serca są główną przyczyną zgonów na całym świecie zarówno mężczyzn, jak i kobiet^1,2,3. Wiele badań koncentruje się na diagnozowaniu i poprawie upośledzonej funkcji serca⁴. W przypadku tych zastosowań kluczowa jest wysokiej jakości i powtarzalna ocena czynności serca. Do oceny zarówno odpowiedzi etiologicznej, jak i terapeutycznej wymagane są dane dotyczące cewnika o wysokiej wierności i odtwarzalności. Na przykład ocena czynności serca jest niezbędna do oceny skuteczności leków i innych metod leczenia w przedklinicznych modelach zawału mięśnia sercowego⁵. Podczas gdy wiele badań sercowo-naczyniowych koncentruje się na funkcji lewej komory, funkcja prawej komory jest również krytycznym wyznacznikiem zdolności funkcjonalnej i rokowania u pacjentów z chorobą płucno-naczyniową^6,7. U pacjentów z zaawansowaną niewydolnością serca utrzymujące się podwyższone ciśnienie napełniania po prawej i lewej stronie jest predyktorem łącznego ryzyka zgonu, hospitalizacji z przyczyn sercowo-naczyniowych i przeszczepu serca⁸. W połączonej chorobie zastawki aortalnej i mitralnej przedoperacyjna funkcja mięśnia sercowego (odzwierciedlona w parametrach takich jak indeks sercowy i frakcja wyrzutowa lewej komory) jest głównym predyktorem długoterminowego przeżycia⁹. Funkcja prawej komory jest głównym predyktorem zarówno zachorowalności, jak i śmiertelności w tętniczym nadciśnieniu płucnym^10,11. W związku z tym ocena funkcji prawej komory jest niezbędnym elementem kompleksowego badania przedklinicznego z wykorzystaniem modeli tętniczego nadciśnienia płucnego^12,13,14.

Funkcja lewej i prawej komory jest często badana niezależnie. Ponieważ jednak funkcje lewej i prawej komory są ściśle powiązane, idealnym rozwiązaniem jest uzyskanie dwukomorowej oceny funkcji skurczowej i rozkurczowej na podstawie jednego testu¹⁵. Na przykład prawa komora dzieli skośne włókna w przegrodzie międzykomorowej z lewą komorą, co stanowi jedno z mechanicznych połączeń między funkcją kurczliwości lewej i prawej komory^16,17. Zjawisko to, znane jako oddziaływanie skurczowe komory, umożliwia skurcz lewej komory w celu zwiększenia skurczu prawej komory. Ważne są również interakcje komorowe podczas rozkurczu. Podczas rozkurczu objętość jednej komory wpływa na objętość przeciwległej komory, a tym samym zmienia podatność rozkurczową i obciążenie wstępne^18,19. W stanach patologicznych zmniejszona funkcja jednej komory lub upośledzone obciążenie objętościowe może bezpośrednio lub pośrednio upośledzać funkcję drugiej komory²⁰. W wyniku skurczowej interakcji komorowej, globalny spadek funkcji lewej komory może zmniejszyć zdolność kurczliwości prawej komory¹⁵. U pacjentów z niewydolnością serca spowodowaną czynnością skurczową lewej komory i zwiększonym ciśnieniem rozkurczowym końcowym ciśnienie rozkurczowe jest podwyższone, co pośrednio zwiększa obciążenie następcze prawej komory^21,22. I odwrotnie, zwiększone ciśnienie w prawej komorze i przeciążenie objętościowe w ciężkim nadciśnieniu płucnym wywiera mechaniczny ucisk na lewe serce. To spłaszczenie lewej komory w kształcie litery D, spowodowane przesunięciem przegrody międzykomorowej w lewo, zmniejsza objętość lewej komory i upośledza funkcję skurczową i rozkurczową^{23,24,25,26,27}. W związku z tym ocena zarówno lewej, jak i prawej komory jest niezbędna do oceny globalnej funkcji serca w przedklinicznych modelach chorób człowieka.

Funkcja serca może być również oceniana za pomocą nieinwazyjnej echokardiografii, rezonansu magnetycznego (MRI) i inwazyjnego cewnikowania^28,29,30. Echokardiografia jest najczęściej stosowaną metodą obrazowania w badaniach sercowo-naczyniowych, ponieważ jest stosunkowo niedroga i dostępna³¹. Jednak echokardiografia ma kilka ograniczeń technicznych, w tym pośredni pomiar ciśnienia napełniania i ograniczoną zdolność do ilościowego określenia funkcji rozkurczowej. Ponadto jakość danych uzyskanych za pomocą echokardiografii jest w dużym stopniu zależna od operatora. Rezonans magnetyczny serca jest stosunkowo nowym dodatkiem do arsenału obrazowania przedklinicznego, który ma ogromny potencjał w ilościowej ocenie funkcji dwukomorowej. Kwantyfikacja za pomocą rezonansu magnetycznego serca jest dokładna, ponieważ nie przyjmuje geometrycznych założeń dotyczących kształtu komory, w przeciwieństwie do echokardiografii³². Jednak platforma do obrazowania MRI jest droga i rzadko dostępna. Co więcej, przetwarzanie danych MRI wymaga wykwalifikowanego wsparcia ze strony fizyka lub równoważnego naukowca, którego brakuje w wielu laboratoriach przedklinicznych³³. Podobnie, zastosowanie mikrotomografii komputerowej (MicroCT) w badaniach przedklinicznych dostarcza ilościowych trójwymiarowych (3D) danych anatomicznych o wysokiej rozdzielczości, które można uzyskać nieinwazyjnie, umożliwiając badania podłużne³⁴. Jednak obrazowanie MicroCT wymaga wstrzyknięcia środków kontrastowych, które często są drogie. Platforma do obrazowania MicroCT, podobnie jak rezonans magnetyczny, jest również kosztowna i wymaga wykwalifikowanego technika.

Natomiast cewnikowanie jest techniką inwazyjną, która polega na wprowadzeniu cewnika do prawej i/lub lewej komory w celu pomiaru ciśnienia i/lub objętości. Narzędzia wymagane do wykonania cewnikowania serca nie są tak drogie jak echokardiografia, tomografia komputerowa czy rezonans magnetyczny. Wymagana jest jednak znaczna biegłość techniczna w zakresie cewnikowania i znieczulania małych zwierząt. Cewnikowanie umożliwia bezpośrednią i dokładną ocenę czynności serca²⁸. W tym protokole do oceny czynności serca stosuje się cewnik PV do adentryjności. Technologia ta, oparta na odrębnych właściwościach przewodnictwa elektrycznego krwi i mięśnia sercowego, pozwala na jednoczesne rejestrowanie ciśnienia i objętości w jamie serca oraz generowanie pętli PV w czasie rzeczywistym^5,35. Krótko mówiąc, cewnik składa się zarówno z elektrod wzbudzających, jak i elektrod rejestrujących. Elektrody wzbudzające wytwarzają pole elektryczne wewnątrz prawej lub lewej komory. Wewnętrzna elektroda rejestrująca mierzy zmianę napięcia, która jest proporcjonalna do zmiany rezystancji. Wyznaczanie objętości komory opiera się na prawie Ohma (napięcie = prąd x rezystancja), na podstawie którego oblicza się przewodność (tj. odwrotność rezystancji). W tym ustawieniu zmierzona wartość przewodności jest kombinacją przewodnictwa krwi i przewodnictwa mięśniowego. W polu elektrycznym krew jest czysto oporna, podczas gdy mięśnie mają zarówno właściwości pojemnościowe, jak i rezystancyjne. Właściwość pojemnościowa mięśni powoduje opóźnienie czasowe mierzonego sygnału. Śledzenie tego opóźnienia, znanego jako kąt "fazy", informuje o wtargnięciu tkanki serca do pola w miarę kurczenia się serca. Pomiar ten jest największy przy skurczu, a najniższy przy rozkurczu. Ta właściwość pozwala na oddzielenie składnika mięśniowego przewodnictwa od składowej krwi i umożliwia ścisłe przybliżenie bezwzględnych objętości skurczowych i rozkurczowych. Pętle ciśnienie-objętość zapewniają szereg parametrów hemodynamicznych, które nie są łatwo mierzalne innymi metodami, takimi jak proste cewnikowanie wsteczne przy użyciu cewników wypełnionych płynem do pomiaru ciśnienia serca. Pętle ciśnienie-objętość mierzą ciśnienie w komorach, ale dostarczają również danych o kurczliwości, trwałości, mocy, energii i wydajności. Ponadto pętle fotowoltaiczne zapewniają solidne pomiary ilościowe³⁶. W związku z tym ocena czynności serca za pomocą pętli PV generowanych przez cewnikowanie stała się złotym standardem w badaniach przedklinicznych³⁷. Ponadto techniki przedkliniczne są istotne w chorobach ludzi, w których cewnikowanie serca, choć z cewnikami wypełnionymi płynem, jest powszechne. Jednak cewnikowanie serca u gryzoni wymaga nienagannego znieczulenia i doskonałej techniki, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi, hipowentylacji lub zmianom temperatury ciała.

U pacjentów ludzkich, cewnikowanie serca jest wykonywane w konfiguracji zamkniętej klatki piersiowej, a dostęp naczyniowy uzyskuje się przez żyłę szyjną lub podobojczykową dla prawej komory i tętnicę promieniową lub udową dla lewej komory. Ze względu na mały rozmiar myszy podejście z zamkniętą klatką piersiową jest często trudne. W związku z tym badania prowadzone na myszach często przyjmują podejście z otwartą klatką piersiową. Technika ta polega na otwarciu klatki piersiowej, odsłaniając w ten sposób serce i ułatwiając wprowadzenie cewnika poprzez nakłucie wierzchołka lewej i/lub prawej komory³⁸. Chociaż podejście to jest technicznie mniej wymagające i dość powtarzalne, jego główne ograniczenia obejmują krwotok i inne powikłania związane z wierzchołkowym wprowadzaniem cewników oraz wyraźny spadek ciśnienia wewnątrzsercowego wynikający z otwarcia klatki piersiowej na ciśnienie atmosferyczne. Otwarcie klatki piersiowej u wentylowanego gryzonia powoduje spadek ciśnienia skurczowego w lewej komorze o 5–10 mm Hg i spadek ciśnienia w prawej komorze o 2–5 mm Hg³⁹. W związku z tym opracowano podejście z zamkniętą klatką piersiową, które jest mniej traumatyczne dla serca i daje bardziej fizjologicznie istotne pomiary, które łatwiej przełożyć na kliniczną ocenę czynności serca.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi i bezpieczeństwa biologicznego Queen's University (ROMEO/TRAQ#6016826). Przeprowadzone procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Jest to procedura terminalna. Ze względu na inwazyjność cewnikowania prawego i lewego, zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji natychmiast po pozyskaniu danych. Eutanazja powinna być przeprowadzana zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi badań na zwierzętach.

1. Przygotowanie i konfiguracja eksperymentu

1. Umieść cewnik w strzykawce o pojemności 10 ml z solą fizjologiczną/heparyną, w temperaturze pokojowej 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu (Rysunek 1A).
2. Po 30 minutach należy skalibrować cewnik (np. linię bazową i system akwizycji) zgodnie z zaleceniami producenta. System akwizycji wyświetla wysokie i niskie wartości kalibracji, które są używane do kalibracji systemu akwizycji przed rozpoczęciem eksperymentu. Wyświetl te wartości i upewnij się, że są zgodne.
   1. Użyj przycisku "Kontrola równowagi ciśnienia", "Zgrubny +/- " lub "Dokładny +/-", aby ustawić wartość ciśnienia bazowego na zero.
   2. Wykonaj dwupunktową kalibrację dla wysokiego i niskiego sygnału.
      1. Na konsoli sterowania naciśnij "Ustawienia systemu" w "Menu cewnika".
      2. Naciśnij "Wyślij sygnał kalibracji" w "Menu ustawień systemu", aby wysłać niski sygnał. Upewnij się, że ciśnienie, objętość, faza i wielkość wynoszą odpowiednio 0 mm Hg, 0 μl, 0° i 0 μs.
      3. Naciśnij "Enter", aby wysłać wysoki sygnał. Upewnij się, że ciśnienie, objętość, faza i wielkość wynoszą odpowiednio 100 mm Hg, 150 μl, 20° i 5,000 μs.
      4. Naciśnij "Enter", aby powrócić do "Menu ustawień systemowych".
      5. Naciśnij "6", aby powrócić do "Menu cewnika". Następnie naciśnij "Uzyskaj dane".
3. Zegnij igłę 30 G pod kątem około 90° (Rysunek 1B,C). Ta wygięta igła posłuży do nakłucia naczyń szyjnych i szyjnych.

2. Znieczulenie i kontrola temperatury ciała

1. Umieść mysz (28 g, C57BL/6 w tym protokole) w komorze anestezjologicznej zawierającej gaz znieczulający (tj. tlen 100%, izofluran 3–4% do indukcji).
2. Gdy zwierzę jest znieczulone, nie reagując na szczypanie łapy lub ogona, połóż mysz na wznak na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C.
3. Podłącz mysz do respiratora przez stożek nosowy dostarczający mieszaninę 100% tlenu i 2% izofluranu. Aby automatycznie obliczyć zalecane ustawienia wentylacji, wprowadź wagę zwierzęcia do zastrzeżonego oprogramowania respiratora za pomocą ekranu dotykowego. W obliczeniach stosuje się następujący wzór:
   Objętość oddechowa = 6.2 x masa zwierzęcia^1.01 (kg),
   Częstość oddechów = 53,5 x masa ^{zwierzęcia-0,26} (kg).
4. Włącz linię znieczulenia od komory anestezjologicznej do stożka nosowego.
5. Włóż sondę sprzężenia zwrotnego temperatury do odbytnicy, a sondę podkładkową między podkładkę a grzbiet myszy, ustawiając żądaną temperaturę ciała na 37 °C–37.5 °C. Kontroluj temperaturę zwierzęcia na ekranie monitora (Rysunek 2A,B).
6. Przyklej przednie łapy i jedną dystalną łapę myszy do koca grzewczego za pomocą taśmy chirurgicznej, pozostawiając jedną tylną łapę wolną, aby monitorować głębokość znieczulenia.

3. Dostęp do miejsca operacji

1. Wykonaj 2-centymetrowe brzuszne nacięcie linii środkowej szyjki macicy w kształcie litery H od manubrii do poziomu kości gnykowej.
   1. Odbij skórę z dala od leżących pod nią mięśni. W razie potrzeby mięśnie te można wyciąć dla lepszej wizualizacji.
   2. Delikatnie odsuń gruczoł podżuchwowy na bok.
   3. Wypreparować tkankę miękką szyjki macicy i odsłonić mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i mięsień mostkowo-gnykowy za pomocą kleszczy metodą rozwarstwienia.
   4. Podziel powięź pośrodku, nakładając się na sparowaną mostek gnykowo-gnykowy. Pozwól, aby sparowany mostek gnykowo-gnykowy cofnął się na boki, aby odsłonić tchawicę. Uważaj, aby nie uszkodzić tętnic szyjnych i nerwów błędnych, które biegną wzdłuż tchawicy.
2. Przełóż kleszcze pod tchawicą, aby ją podnieść. Następnie przełóż jedwabny szew chirurgiczny 4.0 pod tchawicą i wykonaj potencjalny węzeł w środku szwu, który później zostanie zaciśnięty, aby zabezpieczyć rurkę dotchawiczą (Rysunek 3A).
3. Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie między pierścieniami chrząstki tchawicy poniżej poziomu krtani. Włóż rurkę dotchawiczą (Rysunek 3B).
4. Podłącz rurkę tracheostomijną do respiratora i rozpocznij wentylację 100% tlenem i 2% izofluranem. Zaciśnij węzeł wokół tchawicy, aby zabezpieczyć rurkę dotchawiczą i przyklej rurkę respiratora do stołu operacyjnego. Upewnij się, że tchawica nie jest zatkana ani zapadnięta (Rysunek 3C).

4. Izolacja prawej szyi i prawej tętnicy szyjnej

1. Izolacja prawej tętnicy szyjnej
   1. Za pomocą rozwarstwienia przemieszcz mięsień mostkowo-gnykowy na boki, aby odsłonić i odizolować prawą tętnicę szyjną.
   2. Odizoluj tętnicę szyjną od nerwu błędnego przez rozwarstwienie za pomocą kleszczy.
   3. Przełóż trzy szwy chirurgiczne (4,0) pod tętnicą szyjną, z wyłączeniem nerwu błędnego.
2. Izolacja prawej żyły szyjnej
   1. Przemieszcz podżuchwową i śliniankę przyuszną na boki, aby uwidocznić prawą żyłę szyjną. Tępo wypreparuj i odsłoń prawą żyłę szyjną za pomocą kleszczy. Ostrożnie wypreparuj żyłę i usuń otaczającą powięź.
   2. Przełóż kleszcze pod żyłą szyjną.
   3. Przełóż jeden szew chirurgiczny pod żyłą szyjną, a następnie zawiąż go po stronie czaszki żyły. Zastosuj delikatną trakcję na tym szwie w kierunku głowy za pomocą zacisku hemostatycznego.
   4. Przełóż dwa dodatkowe szwy pod żyłą szyjną. Delikatnie pociągnij najbardziej dystalny szew w kierunku ogonowym za pomocą zacisku hemostatycznego. Zrób luźny, potencjalny węzeł w środkowym szwie.
   5. Umieść kilka kropli podgrzanej, fizjologicznej soli fizjologicznej na naczyniu w miejscu przewidywanej janotomii.

5. Zabiegi chirurgiczne cewnikowania prawej i lewej komory

1. Cewnikowanie prawej komory (Rysunek 4 A–D).
   1. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj żyłę szyjną.
   2. Delikatnie zastosuj doskonałą trakcję na żyle. Wykonaj janotomię, wprowadzając zakrzywioną igłę o wadze 30 G między szew czaszkowy a szew środkowy. Wbić igłę pod kątem 140° w stosunku do żyły, aby upewnić się, że wchodzi w sposób współosiowy.
   3. Po wprowadzeniu należy rozszerzyć janotomię, przesuwając igłę. Wprowadzić końcówkę cewnika do wenotomii, pod igłę. Następnie delikatnie zawiąż środkowy szew, zabezpieczając cewnik.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie wiązać szwu zbyt mocno, ponieważ nadmierna siła może uszkodzić cewnik.
   4. Zwolnij szew ogonowy i wsuń cewnik do prawej komory, wykrywając klasyczny przebieg ciśnienia w prawej komorze na ciągłym monitorze.
   5. Ustabilizuj ciśnienie w prawej komorze. Upewnij się, że cewnik jest prawidłowo umieszczony w prawej komorze, aby wygenerować optymalną pętlę PV.
      1. Ustabilizuj wielkość, która odbija krew i mięśnie, aby wygenerować pętle ciśnienie-wielkość (tj. ciśnienie w osi Y, wielkość w osi X). W razie potrzeby delikatnie obrócić trzon cewnika, aby uzyskać optymalne ułożenie cewnika wzdłuż osi prawej komory.
         UWAGA: Maksymalna wartość fazy, która odbija mięsień, powinna wynosić poniżej 7°.
   6. Gdy sygnał pętli ciśnienie-wielkość jest optymalny, naciśnij "Enter" na konsoli podczas akwizycji, aby wykonać skanowanie linii bazowej. Upewnij się, że tętno zgłaszane na ekranie monitora w uderzeniach na minutę (bpm) mieści się w zakresie fizjologicznym (tj. 400–600 bpm).
   7. Wygeneruj pętle fotowoltaiczne. Zmień "Wielkość" na "Objętość" jako parametr dla osi X i utrzymuj ciśnienie jako oś Y. Gdy sygnał pętli fotowoltaicznych jest optymalny, nagrywaj przez 30 sekund.
   8. Zatrzymaj nagrywanie. Odciągnij cewnik i delikatnie przetrzyj gazą. Umieść cewnik w roztworze heparyny/chlorku sodu i zawiąż szew ogonowy, aby zatrzymać krwawienie z żyły szyjnej.
2. Cewnikowanie lewej komory (Rysunek 5 A–D).
   1. Delikatnie podnieś prawą tętnicę szyjną, która została wcześniej odizolowana (5A), wsuwając zakrzywione kleszcze pod tętnicę.
   2. Zawiąż poprzedni szew, zamykając w ten sposób tętnicę. Następnie delikatnie zastosuj trakcję ukierunkowaną czaszkowo za pomocą zacisku hemostatycznego.
   3. Pociągnij najbardziej dystalny szew w kierunku ogonowym za pomocą zacisku hemostatycznego. Zrób luźny potencjalny węzeł na środkowym szwie.
   4. Umieść kilka kropli podgrzanej, fizjologicznej soli fizjologicznej na naczyniu w miejscu przewidywanej arterionomii. Skoncentruj się na odcinku czaszki, między szwem ogonowym a środkowym, za pomocą mikroskopu stereotaktycznego.
   5. Delikatnie zastosuj lepszą przyczepność na tętnicy. Wykonaj arteriotomię, wprowadzając zakrzywioną igłę o wadze 30 G między szew czaszkowy a szew środkowy. Włóż igłę pod kątem 140° w stosunku do tętnicy, aby upewnić się, że wchodzi w sposób współosiowy.
   6. Włóż końcówkę cewnika do arteriotomii, a następnie dokręć środkowy szew, aby zabezpieczyć cewnik. W tym samym czasie zwolnij szew dystalny i wsuń cewnik do aorty, aby rozpocząć nagrywanie. Upewnij się, że kanał ciśnieniowy pokazuje typowy ślad aorty.
   7. Przesuń cewnik wstecz przez zastawkę aortalną do lewej komory. Wejście do lewej komory będzie widoczne po nagłym wyraźnym spadku ciśnienia rozkurczowego z aorty.
   8. Ustabilizuj ciśnienie w lewej komorze serca. Upewnij się, że cewnik jest prawidłowo umieszczony w lewej komorze, aby wygenerować optymalną pętlę PV.
      1. Ustabilizuj wielkość, która odbija krew i mięśnie, aby wygenerować pętle ciśnienie-wielkość (tj. ciśnienie w osi Y, wielkość w osi X). W razie potrzeby delikatnie obrócić trzon cewnika, aby uzyskać optymalne ułożenie cewnika wzdłuż osi lewej komory.
         UWAGA: Maksymalna wartość fazy, która odbija mięsień, powinna wynosić poniżej 7°.
   9. Zatrzymaj nagrywanie. Odciągnąć cewnik i umieścić go w roztworze heparyny/chlorku sodu. Następnie zawiąż szew ogonowy.
   10. Oczyść cewnik detergentem enzymatycznym (np. endozimem).
       UWAGA: Po operacji poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi badań na zwierzętach. 

6. Analiza danych

1. Przeprowadzić analizę pętli fotowoltaicznej zgodnie z ustalonymi zaleceniami.
   1. Wybierz optymalny ślad ciśnienia i objętości (najlepiej cały, stabilny zapis 30 s). W oprogramowaniu kliknij "Zaawansowane", kliknij "Pętle", a następnie kliknij "Obliczenia offline".
   2. Wybierz objętość jako kanał objętościowy, a ciśnienie jako kanał ciśnienia.
   3. Aby uzyskać spójne wyniki, konieczne jest co najmniej 20 pętli.

Wyniki

Cewnik został umieszczony w strzykawce o pojemności 10 ml zawierającej roztwór heparynizowanej soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej 30 minut przed cewnikowaniem (Rysunek 1A). Igła o średnicy 30 G została wygięta pod kątem ~90° (Ryc. 1B, C), oraz przygotowano kaniulę tracheotomijną o średnicy 1,45 mm (Rysunek 1C).

Utrzymanie fizjologicznej temperatury ciała jest kluczowe. Mysz została przyklejona taśmą i podłączona do respiratora za pomocą stożka nosowego. Sonda sprzężenia zwrotnego została umieszczona między podkładką a tyłem myszy. Założono sondę doodbytniczą w celu monitorowania temperatury ciała zwierzęcia (Ryc. 2A). Monitorowano temperaturę ciała (37,1 °C) i temperaturę poduszki (40,7 °C) (Rysunek 2B).

Zdjęcia krytycznych etapów procedury intubacji są wyświetlane w Rysunek 3A–C. Udana i niezakłócona intubacja skutkowała regularnym częstym oddechem ze stabilnym ciśnieniem szczytowym (Ryc. 2B).

Zdjęcia krytycznych etapów cewnikowania prawego serca, od izolacji żyły szyjnej (Rysunek 4A–C) do wprowadzenia cewnika do żyły szyjnej są pokazane w Rysunek 4D. Rysunek 5 pokazuje kluczowe etapy cewnikowania lewego serca, w tym izolację prawej tętnicy szyjnej (Rysunek 5 A,B) i wprowadzenie cewnika (Rysunek 5 C,D)

Cewnik został wprowadzony do żyły szyjnej i wprowadzony do prawej komory. Następnie ustabilizowano ciśnienie w prawej komorze i zweryfikowano prawidłowe ułożenie. Wszystkie elektrody cewnika (o długości osi 6 mm) musiały znajdować się w prawej komorze komory i nie stykać się ze ścianami komory. Optymalne ustawienie cewnika, jak schematycznie przedstawiono w Rysunek 6A wygenerował optymalne pętle PV (tj. trójkątne, regularne). Niewłaściwe ustawienie, jak schematycznie przedstawiono w Rysunek 6B (tj. kontakt ze ścianą komory) spowoduje wadliwe pętle PV (tj. zapadnięte i nieregularne pętle).

Cewnik został wprowadzony do tętnicy szyjnej, następnie przesunięty do aorty, a następnie posunął się wstecz przez zastawkę aortalną do lewej komory. Ciśnienie w lewej komorze zostało ustabilizowane, a prawe ustawienie zweryfikowane. Wszystkie elektrody cewnika (o długości osi 6 mm) powinny znajdować się w komorach lewej komory i nie stykać się ze ścianami komory. Optymalne ustawienie cewnika, jak schematycznie przedstawiono w Rysunek 6C wygenerował optymalne pętle PV (tj. prostokątne, regularne). Niewłaściwe ustawienie, jak schematycznie przedstawiono w Rysunek 6D (tj. kontakt ze ścianą komory) skutkowało wadliwymi pętlami PV (tj. zapadniętymi, nieprostokątnymi i nieregularnymi pętlami).

Reprezentatywne badania hemodynamiczne generowane przez lewą i prawą pętlę PV wykazały częstość akcji serca 410 uderzeń na minutę, pojemność minutową serca 9,107 μL/min i objętość wyrzutową 24,5 μL. Specyficzne parametry prawej komory wykazały ciśnienie skurczowe prawej komory 21,9 mm Hg, ciśnienie rozkurczowe końca prawej komory 1,049 mm Hg, frakcję wyrzutową 56,1%, dp/dt max 1 469 mm Hg/s, dp/dt max -1 504 mm Hg/s, końcowa objętość rozkurczowa 38,4 μL, praca udarowa 0,068 mJ, obszar ciśnienia i objętości 0,089 mJ, elastancja tętnicza płuc (Ea) 0,83 mm Hg/μL i współczynnik Tau 12,8 ms. Specyficzne parametry lewej komory wykazywały: ciśnienie skurczowe lewej komory 77,1 mm Hg, ciśnienie rozkurczowe końcowe lewej komory 2,33 mm Hg, frakcja wyrzutowa 59,1%, dp/dt max 4,695 mm Hg/s, dp/dt max -3,553 mm Hg/s, końcowa objętość rozkurczowa 36,9 μL, praca wyrzutowa 0,14 mJ, powierzchnia ciśnieniowo-objętościowa 0,22 mJ, elastyczność tętnicza (Ea) 5,37 mm Hg/μL i współczynnik Tau 15,1 ms (tabela 1).

Parametry hemodynamiczne
Dział kadr (BPM)	410,6 ± 23,3
CO (μL/min)	9107 ± 1016
SV (μL)	24,5 ± 2,3
Funkcja RV
RVSP (mmHg)	21,9 ± 2,15
RVEDP (mmHg)	1,042 ± 0,12
EF (%)	56,1 ± 4,4
dP/dt max (mmHg/s)	1469 ± 170
dP/dt max (- mmHg/s)	1504 ± 215
EDV (μL)	38,4 ± 3,7
SW (mdżule)	0,068 ± 0,008
PVA (mdżule)	0,084 ± 0,009
Ea (mmHg/μL)	0,83 ± 0,09
Współczynnik tau (ms)	12,8 ± 0,8
Funkcja LV
LVSP (mmHg)	77,1 ± 2,4
LVEDP (mmHg)	2,33 ± 0,17
EF (%)	59,1 ± 3,6
dP/dt max (mmHg/s)	4695 ± 355
dP/dt max (- mmHg/s)	3553 ± 373
EDV (μL)	36,9 ± 4,8
SW (mdżule)	0,14 ± 0,013
PVA (mdżule)	0,22 ± 0,03
Ea (mmHg/μL)	5,37 ± 0,9
Współczynnik tau (ms)	15.07 ± 1.7
CO, rzut serca; Ea, elastancja tętnicza; EDV, końcowa objętość rozkurczowa; Tętno, tętno; LVEDP, objętość rozkurczowa końca lewej komory; LVSP, ciśnienie skurczowe lewej komory; PVA, obszar objętości ciśnienia; RVEDP, ciśnienie rozkurczowe końca komory prawej komory; RVSP, ciśnienie skurczowe prawej komory; SV, objętość wyrzutowa; SW, praca z udarem; Czynnik Tau, Tau Mirsky. N = 6 myszy. Wartości są wyrażane ± SEM

Tabela 1: Tabela parametrów hemodynamicznych. Parametr hemodynamiczny lewej i prawej komory mierzony u sześciu myszy.

Rysunek 1: Przygotowanie i konfiguracja eksperymentalna. (A) Cewnik w strzykawce o pojemności 10 ml z solą fizjologiczną/heparyną, (B), (C) igła 30 G zgięta pod kątem około 90°, (D) kaniula tracheotomijna o średnicy 1,45 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Znieczulenie, kontrola temperatury ciała. (A) Mysz z trzema łapami zaklejonymi taśmą, podłączona do respiratora przez stożek nosowy, z włożonym sprzężeniem zwrotnym i sondami doodbytniczymi. Zwróć uwagę, że podkładka rozgrzewająca znajduje się pod kocem chirurgicznym. (B) Kontrola monitora temperatury pokazująca temperaturę ciała (odbytnicy) i poduszki (sprzężenie zwrotne) oraz parametry wentylacji: częstość oddechów (ustawiona RR), średnia objętość oddechowa (Meas TV), ciśnienie szczytowe (PeakPress) i wentylacja minutowa (MinVol). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Procedura intubacji. (A) Skóra została oderwana i przecięta. Gruczoł podżuchwowy został delikatnie odsunięty na bok. Mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i mięsień mostkowo-gnykowy rozdzielono gołębek, a następnie włożono kleszcze pod tchawicę, stosując delikatną, sekcję. (B) Jedwab chirurgiczny (4.0) został przepuszczony pod tchawicę i wykonano małe nacięcie z przodu między dwoma pierścieniami chrząstki tchawicy. Tracheostomia została wprowadzona i zawiązana. (C) Rurka tracheostomijna została podłączona do respiratora, a szew został zawiązany wokół rurki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Cewnikowanie prawej komory. (A), (B), (C) Prawą żyłę szyjną izolowano, następnie wprowadzano pod nią jeden szew chirurgiczny i wiązano go po stronie czaszki. Na tym szewie zastosowano delikatną trakcję w kierunku głowy za pomocą klamry hemostatycznej. Dwa dodatkowe szwy przeprowadzono dystalnie, pod żyłą szyjną. Najbardziej dystalny szew został delikatnie naciągnięty w kierunku ogonowym za pomocą klamry hemostatycznej. W środkowym szwie wykonano luźny, potencjalny węzeł. (D) Cewnik został wprowadzony do żyły szyjnej, szew środkowy był przywiązany do cewnika. Obrazy w (C) i (D) są powiększane przez mikroskop stereoskopowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Cewnikowanie lewej komory. (A), (B) Prawą tętnicę szyjną izolowano, a następnie jeden szew chirurgiczny wprowadzano pod żyłę szyjną i wiązano po stronie czaszki żyły. Na tym szewie zastosowano delikatną trakcję w kierunku głowy za pomocą klamry hemostatycznej. Dwa dodatkowe szwy zostały wprowadzone pod tętnicą szyjną. Najbardziej dystalny szew został delikatnie naciągnięty w kierunku doogonowym za pomocą klamry hemostatycznej. Wykonano luźny, potencjalny węzeł w środkowym szwie. (C) Końcówka cewnika została wprowadzona do tętnicy szyjnej, a następnie środkowy szew przywiązał się do cewnika, aby go zabezpieczyć. (D) Cewnik był delikatnie wysunięty wstecz w dół tętnicy szyjnej w kierunku aorty. Obrazy w (B), (C), (D) są powiększane przez mikroskop stereoskopowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schematyczne przedstawienie położenia cewnika i wynikowych pętli fotowoltaicznych. (A) Optymalne umiejscowienie cewnika w prawej komorze. Końcówka cewnika znajduje się pośrodku komory, odizolowana od ścian komory. Reprezentatywne pętle PV wynikające z optymalnego ułożenia cewnika w prawej komorze (tj. stabilnej, trójkątnej). (B) Nieprawidłowe ułożenie cewnika w prawej komorze. Końcówka cewnika styka się ze ścianami komory. Reprezentatywny szum pętli PV wynikający z nieoptymalnego ułożenia cewnika w prawej komorze (tj. zapadnięty, nieregularny). (C) Optymalne ułożenie cewnika w lewej komorze. Końcówka cewnika znajduje się pośrodku komory, odizolowana od ścian komory. Reprezentatywne pętle PV wynikające z optymalnego ułożenia cewnika w lewej komorze (tj. stabilnej, prostokątnej). (D) Nieprawidłowe ułożenie cewnika w lewej komorze. Końcówka cewnika styka się ze ścianami komory. Reprezentatywne pętle PV wynikające z nieoptymalnego ułożenia cewnika w lewej komorze (tj. zapadnięte, nieregularne). Do wygenerowania pętli fotowoltaicznych zastosowano filtr szumów FIR 50 Hz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ocena czynności serca jest kluczowym krokiem w przedklinicznych badaniach sercowo-naczyniowych i płucno-naczyniowych. W tej pracy zaproponowaliśmy protokół zamkniętej dwukomorowej oceny czynności serca w klatce piersiowej u myszy. Dzięki takiemu podejściu można wygenerować pętle PV prawej i lewej komory w tej samej myszy. Takie podejście zapewnia solidną i kompletną ocenę czynności serca, umożliwiając pomiar funkcji skurczowej i rozkurczowej, a także objętości wyrzutowej i pojemności minutowej serca. W przeciwieństwie do podejścia z otwartą klatką piersiową, klasycznie stosowanego do cewnikowania gryzoni, ta technika zamkniętej klatki piersiowej skutkuje bardziej stabilną fizjologią i bardziej fizjologicznie istotnymi danymi. Chociaż jest to technicznie trudniejsze i zależne od umiejętności operatora, aby skutecznie ustawić cewnik w prawej i lewej komorze, podejście z zamkniętą klatką piersiową ogranicza uraz i krwotok związane z operacją otwartej klatki piersiowej i zmniejsza drastyczne zmiany ciśnienia związane z wystawieniem płuc na ciśnienie atmosferyczne. Podejście z zamkniętą klatką piersiową również lepiej naśladuje procedurę cewnikowania serca wykonywaną u pacjentów, co zwiększa znaczenie stosowania tej techniki w badaniach przedklinicznych.

Zabieg chirurgiczny jest krytycznym etapem protokołu. Nawet w przypadku korzystania z mikroskopu chirurgicznego do wprowadzania cewnika do żyły szyjnej lub tętnicy szyjnej, co jest zalecane, procedura ta wymaga praktyki i umiejętności technicznych. Staranne wypreparowanie naczyń krwionośnych z otaczającej powięzi za pomocą delikatnego, rozwarstwienia zwiększy powodzenie kaniulacji, jednocześnie minimalizując ryzyko krwotoku. Aby zminimalizować utratę krwi, ważne jest, aby kaniulować tętnicę szyjną w następujących po sobie krokach: 1) wprowadzić końcówkę cewnika do tętnicy szyjnej; 2) delikatnie zawiąż szew wokół części tętnicy, w której znajduje się cewnik; 3) Zwolnij bezpieczny szew, umożliwiając ruch cewnika, zachowując delikatną przyczepność w górę, aby zminimalizować krwawienie; i 4) przesunąć cewnik do aorty. Umieszczenie cewnika w komorze, określone przez monitorowanie kształtu fali w czasie rzeczywistym, jest najtrudniejszą częścią tego protokołu. Wszystkie elektrody cewnika powinny znajdować się w jamie komory i żadna nie powinna dotykać ściany. Każde niewłaściwe ustawienie cewnika spowoduje nieregularne pętle PV i niekorzystnie wpłynie lub uniemożliwi pozyskiwanie danych. Rozpoznanie charakterystycznego kształtu fali ciśnieniowo-objętościowej, który wynika z posiadania wszystkich elektrod w komorze, pozwala mieć pewność co do odpowiedniego położenia cewnika. Bardzo ważne jest uzyskanie stabilnego kształtu fali ciśnienia w komorze i stabilnych pętli ciśnienia i wielkości przed przejściem do trybu PV i akwizycji objętości. Właściwa znajomość fizjologii i anatomii serca jest niezbędna dla powodzenia tej procedury. Odczyt online śladów PV z przedsionka, obszaru zastawki trójdzielnej i prawej komory, pokaże postęp cewnika i pomoże osiągnąć prawidłowe umiejscowienie. Bardzo ważne jest, aby znać normalne tętno (400–600 uderzeń na minutę) oraz oczekiwane przebiegi i ciśnienie (np. ciśnienie skurczowe prawej komory, 18–25 mm Hg, ciśnienie rozkurczowe <5 mm Hg; ciśnienie skurczowe lewej komory 60–120 mm Hg⁴⁰, ciśnienie rozkurczowe <8 mmHg) u myszy, aby umożliwić operatorowi ocenę prawdziwości obserwowanych danych.

Jakość i powtarzalność danych będzie zależała od szybkości procedury oraz utraty krwi lub krwotoku. Procedura od znieczulenia do zakończenia zbierania danych trwa średnio ~30-40 min/mysz. Cewnikowanie prawego serca od wprowadzenia cewnika do pozyskania danych trwa 5–10 minut, cewnikowanie lewego serca od wprowadzenia cewnika do akwizycji danych trwa kolejne 10–15 minut. Dane o jakości publikacji uzyskuje się w ~75% przypadków. Kolejność etapów cewnikowania serca powinna być stała między zwierzętami. W tej procedurze myszy są najpierw intubowane, następnie cewnikowanie prawej komory, a na końcu cewnikowanie lewej komory. Decyzja o postępowaniu w tej kolejności opiera się na większej trudności i ryzyku krwawienia w przypadku cewnikowania lewego serca w porównaniu z prawym sercem. Można zaobserwować niespecyficzny artefakt nagrywania szumów 50 Hz. Szum ten można zmniejszyć za pomocą filtra FIR z wysokim odcięciem przy 50 Hz i niskim odcięciem 0 w oprogramowaniu. Dla kanału woluminu utwórz nowy kanał/filtr/filtr FIR. Podczas akwizycji danych można również zastosować filtr wycinający 50 Hz w celu wyeliminowania szumów sieciowych i usunięcia wszelkich zakłóceń o częstotliwości radiowej.

Im szybciej zostanie wykonane cewnikowanie, tym lepsza jakość danych. Na podstawie wcześniejszych doświadczeń zaleca się pozyskanie danych w ciągu 15 minut. Wydłużony czas cewnikowania zwiększa stres fizjologiczny zwierzęcia i zwiększa ryzyko arytmii z powodu obecności cewnika w jamie. Siły te mogą zmniejszyć objętość wyrzutową i pogorszyć odtwarzalność i interpretowalność przebiegów. Ponadto końcówka cewnika jest ostra i może uszkodzić lub przebić komorę. Jest to szczególnie ważne w przypadku prawej komory, która stanowi ~ 1/3 grubości lewej komory.

Inwazyjna tracheostomia i wentylacja mechaniczna z dodatnim ciśnieniem skutkują stabilnym i kontrolowanym oddychaniem myszy oraz zmniejszają zmienność akwizycji pętli PV. Jednak dodatnie końcowe ciśnienie wydechowe (PEEP) stanowi wyraźny kontrast z normalną wentylacją, która jest zjawiskiem podciśnienia. Wentylacja nadciśnieniowa i PEEP razem obniżają pojemność minutową serca i obniżają ciśnienie w prawym sercu. Tak więc, chociaż jest to wymagane do uzyskania stabilnych danych, wentylacja mechaniczna, a także kardiodepresyjne działanie znieczulenia będą miały wpływ na pętle PV i powinny być traktowane jako ograniczenie. Tymczasowe zatrzymanie wentylacji mechanicznej podczas krótkiego zapisu pętli fotowoltaicznych służy do wyeliminowania tego potencjalnego źródła artefaktów. Należy pamiętać, że skuteczność wentylacji można potwierdzić za pomocą kapnograficznego monitorowania dwutlenku węgla.

Umiejętności techniczne wymagane przy podejściu z zamkniętą klatką piersiową mogą być ograniczeniem tej techniki. Podobnie trudno jest uzyskać prawidłowe, stabilne ułożenie cewnika w komorze. Szanse na sukces rosną wraz z doświadczeniem operatora oraz wielkością i wagą myszy. Cewnikowanie myszy o wadze poniżej 20 g jest niezwykle trudne. Unikalna geometria komory prawej komory może mieć wpływ na pomiar objętości i powinna być brana pod uwagę. Zastosowany środek znieczulający, tętno, temperatura i obciążenie zwierząt mogą wpływać na parametry hemodynamiczne i powinny być dokładnie zgłaszane i monitorowane.

Podsumowując, w tym protokole zarówno cewnikowanie prawej, jak i lewej komory jest wykonywane u tej samej myszy. W zależności od konkretnych celów naukowca, cewnikowanie lewej lub prawej komory może być wykonane niezależnie, przy użyciu odpowiedniej części procedury dwukomorowej. Jednak przedstawione podejście jest optymalne do pełnej oceny czynności serca.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ADVantage System ciśnieniowo-objętościowy (ADV500)	Transonic	FY097B
Endozime AW triple plus	Ruhof	34521
Światłowód podwójny Gęsia szyja	Volpi Intralux	# 6000-1
Kleszcze	FST	11052-10
Kleszcze	FST	11251-20
Gąbki z gazy	Dermacea	441400
Zacisk hemostatyczny	FST	13003-10
Zacisk hemostatyczny	FST	13018-14
Heparyna sodowa	Sandoz	023-3086	100 U/L
Cewnik o wysokiej wierności	Scisence; Transonic	FTH-1212B-3518
Izofluoran	Baxter	CA2L9108
oprogramowanie labScribe v4	iworx	LS-30PVL
Igła (30 gauge)	BD	305106
chlorek sodu do wstrzykiwań	Baxter	JB1309M	0,9%(wt/vol)
Mikroskop stereoskopowy	Cole-Parmer	OF-48920-10
Szew chirurgiczny	SERAFLEX	ID158000	pleciony jedwab, 4.0
Taśma chirurgiczna	3M, Transpore	SN770
Stołowe systemy anestezjologiczne dla pojedynczych zwierząt	Aparat Harvard	72-6468
Kaniula tracheotomijna o średnicy 1,45 mm	Aparat Harvard	72-1410
Respirator dalekiej podczerwieni podkładka grzewcza dla myszy i szczurów PhysioSuite	Kent korporacja naukowa	# PS-02