Artykuł metodologiczny

Model choroby niedokrwiennej serca i porównanie wideo skurczu kardiomiocytów przy użyciu kardiomiocytów pochodzących z hiPSC

DOI:

10.3791/61104

⸱

5 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy model choroby niedokrwiennej serca za pomocą kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, wraz z metodą ilościowej oceny uszkodzeń tkanek spowodowanych niedokrwieniem. Model ten może stanowić użyteczną platformę do badań przesiewowych leków i dalszych badań nad chorobą niedokrwienną serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. W związku z tym był przedmiotem ogromnej liczby badań, często na modelach małych zwierząt, takich jak gryzonie. Jednak fizjologia ludzkiego serca znacznie różni się od fizjologii serca gryzoni, co podkreśla potrzebę klinicznie istotnych modeli do badania chorób serca. W tym miejscu przedstawiamy protokół modelowania choroby niedokrwiennej serca przy użyciu kardiomiocytów zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS-CM) oraz ilościowego określenia uszkodzeń i upośledzenia funkcjonalnego niedokrwionych kardiomiocytów. Narażenie na 2% tlenu bez glukozy i surowicy zwiększa odsetek uszkodzonych komórek, na co wskazuje zabarwienie jądra jodkiem propidyny i zmniejsza żywotność komórek. Warunki te zmniejszają również kurczliwość hiPS-CM, co potwierdza analiza pola wektora przemieszczenia mikroskopowych obrazów wideo. Protokół ten może ponadto stanowić wygodną metodę spersonalizowanych badań przesiewowych leków, ułatwiając wykorzystanie komórek hiPS od poszczególnych pacjentów. Dlatego ten model choroby niedokrwiennej serca, oparty na iPS-CM pochodzenia ludzkiego, może stanowić użyteczną platformę do badań przesiewowych leków i dalszych badań nad chorobą niedokrwienną serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca (IHD) jest uznawana na całym świecie za główną przyczynę zgonów i oszacowano, że jest odpowiedzialna za ponad dziewięć milionów zgonów w 2016 roku1. Częstość występowania chorób sercowo-naczyniowych stale rośnie, a globalizacja wydaje się przyczyniać do występowania czynników ryzyka chorób serca w krajach rozwijających się. W związku z tym badania nad IHD stają się coraz pilniejsze2.

Eksperymentalne modele chorób sercowo-naczyniowych są kluczowe dla badania mechanizmów choroby, dokładności diagnozy i rozwoju nowych terapii. Wiele laboratoriów zaproponowało kilka modeli eksperymentalnych. Niezwykle ważne jest, aby wybrać model o znaczących zaletach; Wykonalność, powtarzalność i podobieństwo do chorób ludzkich są kluczowymi czynnikami przy wyborze modeli chorób sercowo-naczyniowych3. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) niosące specyficzne mutacje związane z kardiomiopatią są obiecującą alternatywą dla modeli zwierzęcych4. Chociaż opisano wiele strategii indukowania kardiomiocytów za pomocą iPSCs5,6,7,8,9, tutaj przedstawiamy prostą metodę tworzenia modelu IHD przy użyciu kardiomiocytów zróżnicowanych od hiPSC, w której nie stosuje się pracochłonnej selekcji kardiomiocytów za pomocą markerów. W tej metodzie kardiomiocyty są selekcjonowane funkcjonalnie poprzez analizę spontanicznego skurczu.

Indukcja kardiomiocytów za pomocą hiPSC pozwala uniknąć składania ofiar ze zwierząt i technicznie trudnych operacji. Tworzenie modeli zwierzęcych IHD wymaga wymagających technik chirurgicznych10. Doskonała symulacja różnych patofizjologicznych aspektów chorób serca u ludzi, takich jak tętno i potencjały czynnościowe z fizjologii gryzoni, jest prawie niemożliwa. W połączeniu z moralnością i etyką korzystania z modeli zwierzęcych, konieczne jest opracowanie nowych modeli eksperymentalnych innych niż modele zwierzęce. Kardiomiocyty zróżnicowane z ludzkich komórek iPS lepiej naśladują fizjologiczny stan ludzkiego serca. W tym protokole ustalamy model IHD przy użyciu kardiomiocytów pochodzących z komórek hiPS (hiPS-CMs). W naszym modelu brak tlenu i glukozy prowadzi do zmniejszenia siły skurczu i żywotności hiPS-CM. Nasza metoda zapewnia nowe podejście do modelowania IHD i demonstruje nową platformę do badania tej choroby.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. kultura utrzymania hiPSC

  1. Pokryj sześciodołkową płytkę hodowlaną lamininą (tabela materiałów).
    1. Rozcieńczyć lamininę do 0,5 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    2. Dodać rozcieńczoną lamininę do sześciodołkowej płytki o objętości 2,0 ml/dołek.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Usuń roztwór lamininy z dołków.
  3. Wysiewać hiPSC w 2 ml pożywki konserwacyjnej iPSC (tabela materiałów) do powlekanych studzienek o gęstości 3 × 104 komórek/studzienkę bez suszenia powierzchni.
  4. Subkultura hiPSC.
    1. Przygotować 0,5× roztwór enzymów dysocjacji komórek (tabela materiałów).
      1. Wymieszaj 10 μl 0,5 M etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) i 10 ml PBS, aby uzyskać 0,5 mM EDTA/PBS.
      2. Rozcieńczyć 10 ml enzymów dysocjacji komórek 1× do 0,5×, dodając 10 ml 0,5 mM EDTA/PBS.
    2. Odessać zużyte podłoże ze studzienek.
    3. Dodaj 2 ml / studzienkę PBS, aby umyć komórki, a następnie wyrzuć PBS.
    4. Dodać 800 μl 0,5× enzymów dysocjacji komórek i inkubować komórki przez 7 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2,
      UWAGA: 0,05% trypsyny-EDTA może być używane do dysocjacji komórek.
    5. Delikatnie usuń 0,5× roztwór enzymów dysocjacji komórek.
    6. Umyj komórki 2 ml PBS, a następnie wyrzuć PBS.
      UWAGA: Bądź delikatny, ponieważ komórki łatwo odłączają się po dodaniu roztworu enzymów dysocjujących komórki.
    7. Dodać 1 ml pożywki konserwacyjnej iPS (tabela materiałów) zawierającej 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Dodanie Y-27632 zwiększa przeżywalność hiPSC.
    8. Usuń komórki za pomocą skrobaka do komórek i zbierz je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    9. Policz liczbę komórek. Dostosuj gęstość komórek do 1,5 × 104 komórek/ml, dodając pożywkę konserwacyjną iPS zawierającą 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Nie używaj wirowania, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.
    10. Wysiewać 2 ml mieszaniny komórek na pokrytej lamininą płytce sześciodołkowej (gęstość końcowa: 3 × 104 komórki/basenik).
    11. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
    12. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką podtrzymującą iPS bez Y-27632 w dniach 1, 4, 5 i 6.
  5. Subhodowla komórek w dniu 7.
    UWAGA: Subkultura komórek do 7 dnia w celu zahamowania losowego różnicowania hiPSC.

2. Indukcja różnicowania sercowego hiPSC

  1. Pokryj 96-dołkową płytkę hodowlaną lamininą (tabela materiałów).
    1. Rozcieńczyć lamininę do 1,675 μg/ml za pomocą PBS.
    2. Dodać rozcieńczony roztwór lamininy do 96-dołkowej płytki o objętości 0,1 ml/dołek.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  2. Wysiewać hiPSC na 96-dołkową płytkę o gęstości 3 × 104 komórek/dołek.
  3. Rozprzestrzenianie hiPSC w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
    1. Dzień później zastąp pożywkę pożywką o stężeniu 200 μl/studzienkę iPS (tabela materiałów).
    2. Zmieniaj pożywkę codziennie przez dodatkowe 2-3 dni, aż komórki osiągną 70%-80% konfluencji.
  4. Zastosuj pożywkę różnicującą.
    1. Odessać zużytą pożywkę i powoli zastąpić ją 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego A (tabela materiałów).
    2. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
    3. Po 48 godzinach odessać pożywkę i powoli zastąpić ją 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego B (tabela materiałów).
    4. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2,
      UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby podłoża różnicujące były świeże. Stopniowo tracą efekt różnicowania, zwykle w ciągu dwóch tygodni. W razie potrzeby podwielokrotnić świeżą pożywkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Zastosować pożywkę do konserwacji kardiomiocytów.
    1. Po 48 godzinach odessać pożywkę i powoli zastąpić ją 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanej pożywki podtrzymującej kardiomiocyty (tabela materiałów).
    2. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .
    3. Pożywkę różnicującą kardiomiocyty należy wymieniać co drugi dzień do 30,< dnia /> UWAGA: Ważne jest, aby czas stosowania pożywek różnicujących A i B był dokładnie ustawiony na 48 godzin, aby zapewnić precyzyjną sekwencję ekspresji genów wymaganych do różnicowania.

3. Narażenie na niedokrwienie

  1. Pozbawić pożywkę hodowlaną składników odżywczych i tlenu.
    1. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco bez glukozy i surowicy.
    2. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków 96-dołkowej płytki zawierającej hiPS-CMs.
    3. Dodać pożywkę pozbawioną składników odżywczych do studzienek w objętości 200 μl/studzienkę.
  2. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze do hipoksyi (tabela materiałów).
  3. Wlej gazowy azot i utrzymuj wewnętrzne stężenie tlenu na poziomie 2% i stężenie CO2 na poziomie 5% przez 24 godziny.
  4. Przejdź do pożądanych analiz: np. testu żywotności, oceny kurczliwości lub oceny uszkodzenia komórek.

4. Ocena żywotności komórek za pomocą testu MTT

  1. Użyj zestawu testowego MTT (tabela materiałów), aby ilościowo ocenić żywotność komórek.
    UWAGA: Narażenie na 1 mM nadtlenku wodoru w DMEM przez 1 godzinę może być wykorzystane do uszkodzenia komórek (kontrola pozytywna). Narażenie na 0 mM nadtlenku wodoru w DMEM można zastosować do kontroli ujemnej.
    1. Dodać 10 μl odczynnika MTT do komórek za pomocą powtarzalnego pipetora.
    2. Mieszaj delikatnie przez minutę na wytrząsarce orbitalnej.
    3. Inkubować komórki przez 3–4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Po inkubacji formazan wytwarzany w komórkach pojawi się jako ciemne kryształy na dnie studzienek.
    4. Po usunięciu supernatantu rozpuścić nierozpuszczalne kryształy formazanu w 100 μl roztworu dimetylosulfotlenku (DMSO). Ten roztwór rozpuści kryształy formazanu, tworząc fioletowy roztwór.
      UWAGA: DMSO może podrażniać oczy, układ oddechowy i skórę. Nosić odpowiednie rękawice i ochronę oczu/twarzy.
    5. Zmierzyć absorbancję każdej próbki za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 570 nm.

5. Ocena kurczliwości iPS-CM

  1. Jeśli nie jest zainstalowany, pobierz wtyczkę Particle Image Velocimetry ImageJ11 pod adresem https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv i zainstaluj.
  2. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym rejestruj obrazy wideo hiPS-CM za pomocą obiektywu 4× z prędkością ~20 klatek na sekundę przez ~10 s i zapisz jako "analyze.avi". W celu porównania kurczliwości między przed i po niedokrwieniu, upewnij się, że zarejestrowano interesujące Cię miejsce.
    UWAGA: Mikroskop ze zautomatyzowanym stolikiem jest przydatny do celowania w interesujące Cię miejsce. Plik filmowy powinien być w formacie .avi do późniejszej analizy. Jeśli nie, przekonwertuj film na .avi.
  3. Utwórz strukturę folderów, jak pokazano w Rysunek 1. Przykład "joblist.txt" jest wskazany w pliku uzupełniającym.
  4. Analizuj dyskretne dwuwymiarowe pola wektorowe przemieszczeń komórkowych.
    1. Uruchom oprogramowanie Fiji (ImageJ) 12, przejdź do Wtyczki > Makra > Edytuj i otwórz "vector_analysis.ijm" (Dodatkowy plik kodowania).
    2. Kliknij przycisk Uruchom. Analiza zostanie przeprowadzona automatycznie.
      UWAGA: Wektory przemieszczenia D(x,y) są obliczane dla każdych 16 × 16 pikseli między klatką odniesienia (pierwszą klatką) a wszystkimi kolejnymi klatkami (klatki 1 a 2, 1 vs 3, 1 vs 4 itd.). Wynik jest obliczany dla każdej klatki i zapisywany jako "vec_x.txt" (x to numer klatki). Wektor maksymalnego przemieszczenia, M(x, y), jest zdefiniowany dla każdej pary (x, y) w następujący sposób:
      figure-protocol-1
      gdzie k oznacza numer klatki, przy którym |Dk (x,y)| = max [|D2 (x,y)|, |D3 (x,y)|, ..., |Dn (x,y)|] a n oznacza ostatnią klatkę. Wynik jest zapisywany jako "Max_vector.txt". |M(x, y)| reprezentuje maksymalne przemieszczenie spowodowane skurczem kardiomiocytów w punkcie analizy (x, y). Wartość kurczliwości C w dowolnych jednostkach oblicza się w następujący sposób:
      figure-protocol-2
      Wartość ta jest zapisywana w kolumnie 7, wierszu 1 w polu "Max_vector.txt". C oznacza sumę przemieszczeń dla wszystkich (x, y). Im większa część, w której przemieszczenie spowodowane skurczem mięśnia sercowego jest duże, tym większa wartość C. Pole wektorowe maksymalnego przemieszczenia, M(x, y), jest nakładane na obraz kontrastu fazowego pierwszej klatki ("Phase_contrast.png") i zapisywane jako "Overlaid.png". Ponieważ wielkość wektora przemieszczenia jest obliczana na podstawie pierwszej klatki wideo, zaleca się, aby hiPS-CM znajdowały się w spoczynkowym okresie rozkurczowym w pierwszej klatce.

6. Ocena uszkodzeń komórek za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Rozcieńczyć roztwór jodku propidyny w proporcji 1:1 000 w PBS.
  2. Zabarwić oderwane komórki jodkiem propidyny.
    1. Odessać pożywkę i umieścić ją w probówce wirówkowej o odpowiedniej wielkości.
    2. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 × g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant, aby nie stracić osadzonych komórek.
    3. Inkubować komórki z rozcieńczonym roztworem jodku propidyny w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 × g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant, aby nie stracić osadzonych komórek.
    5. Rozpuść komórki w ~1 ml PBS.
      UWAGA: Ważne jest, aby zebrać oderwane pływające komórki z pożywki, aby dokładnie określić ilościowo uszkodzenia komórek.
  3. Zabarwić przyczepione komórki jodkiem propidyny.
    1. Delikatnie umyj przyczepione komórki dwukrotnie PBS, a następnie wyrzuć PBS.
    2. Inkubować komórki z rozcieńczonym roztworem jodku propidyny przez 15 minut w ciemności.
    3. Odessać roztwór jodku propidyny.
    4. Odłącz komórki za pomocą 0,25% trypsyny. Przenieś roztwór komórkowy do probówki wirówkowej.
    5. Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 × g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant, aby nie stracić osadzonych komórek.
    6. Rozpuść komórki w ~1 ml PBS.
  4. Wymieszaj pływające i przyłączone komórki do analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
  5. Przepuść roztwór komórkowy przez filtr 30 μm.
    UWAGA: Przekazanie komórek do filtra jest bardzo ważne dla dokładnego pomiaru FACS.
  6. Analizuj próbki za pomocą systemu FACS.

7. Barwienie immunologiczne

  1. Napraw próbkę komórki.
    1. Odessać pożywkę hodowlaną.
    2. Dodaj 4% paraformaldehydu do PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj komórki trzykrotnie za pomocą PBS.
      UWAGA: Świeży roztwór paraformaldehydu jest zalecany w celu optymalnego utrwalenia.
  2. Przepuszczalność komórek 0,2% Triton X-100 przez 15 minut, a następnie wyrzucić odczynnik.
  3. Dodaj 3% albuminy surowicy bydlęcej, aby zablokować komórki na 30 minut.
  4. Zastosuj przeciwciało pierwszorzędowe.
    1. Odrzucić roztwór albuminy surowicy bydlęcej z płytki hodowlanej.
    2. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć roztwór przeciwciał.
    4. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
  5. Zastosuj przeciwciało wtórne.
    1. Wyrzucić roztwór PBS z płytki hodowlanej.
    2. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Pierwotne mysie przeciwciało monoklonalne przeciw sercowej troponinie T (TNNT2) stosuje się w rozcieńczeniu 1:750 w 3% BSA. Sprzężone z Alexa Fluor 488 wtórne przeciwciało anty-mysie przeciwko kozom rozcieńcza się do 1:1,000 w 3% BSA.
  6. Dodatkowe barwienie włókien jądra i aktyny.
    1. Usunąć roztwór przeciwciał.
    2. Inkubować komórki w odczynniku do barwienia jądra (tabela materiałów) i odczynniku do barwienia aktyny (tabela materiałów) w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Do barwienia jądrowego można użyć 4', 6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) lub Hoechst 33342.
    3. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
  7. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślnie zróżnicowane komórki wykazują spontaniczne skurcze pod mikroskopem (Wideo 1). Zazwyczaj 50% studzienek wykazuje spontaniczny skurcz w ciągu <20 dni (rysunek uzupełniający 1). Białko markerowe serca (np. cTnT) może być użyte do potwierdzenia pomyślnego różnicowania (Ryc. 2).

Zazwyczaj komórki z grupy niedokrwiennej wykazują niższą żywotność w testach MTT (Rysunek 3A) i kurczliwość (Rysunek 3E,F, Rysunek uzupełniający 2) niż te z normoksycznej grupy kontrolnej. Ponadto stosunek komórek dodatnich z jodkiem propidyny jest wyższy w grupie niedokrwiennej niż w grupie kontrolnej (Rysunek 3B-D), co wskazuje na większe uszkodzenie komórek.

figure-results-1
Rysunek 1: Struktura folderów do analizy wektorów przemieszczeń przy użyciu imageJ.
"joblist.txt" opisuje ścieżkę do plików filmowych w każdym wierszu. Jeśli do przeanalizowania są trzy pliki, będą trzy foldery (film1, film2 i film3), w których należy umieścić "analyze.avi" (interesujący nas film). Po przeprowadzeniu analizy za pomocą kodu "vector_analysis.ijm" zostaną wygenerowane pliki (oznaczone kolorem niebieskim) w każdym folderze z filmem. Informacje przechowywane w każdym pliku są szczegółowo wyjaśnione w tekście głównym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywny obraz barwienia markerów sercowych.
Ekspresja białka markera sercowego troponiny sercowej T (cTnT). Niebieski: 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), czerwony: aktyna, zielony: cTnT. Wstawka: prążkowane wyrażenie cTnT, które odpowiada strukturze sarkomeru. Podziałka, 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Wei et al.13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy testu żywotności komórek, oceny uszkodzenia komórek i kurczliwości.
(A) Porównanie żywotności komórkowej (test MTT). Wyższa absorbancja wskazuje na wyższą żywotność. n = 5 dla każdego warunku. (B, C oraz D) Analiza cytometrii przepływowej komórek barwionych jodkiem propidyny (PI). Komórki niedokrwienne wykazują zmniejszoną intensywność rozpraszania do przodu i zwiększoną fluorescencję PI w porównaniu z kontrolą. (D) Procent komórek barwionych PI w analizie cytometrii przepływowej. n = 3 dla każdego warunku. (E) Analiza kurczliwości iPS-CMs przy użyciu oprogramowania ImageJ. Wektory czerwony i niebieski wskazują odpowiednio największe i najmniejsze skurcze. Podziałka, 100 μm. (F) Analiza ilościowa kurczliwości iPS-CM za pomocą kodu. n = 3 dla kontroli i n = 8 dla stanu niedokrwiennego. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. Do analizy statystycznej przeprowadzono niesparowany dwustronny test t-Studenta. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0,0001. Ten rysunek jest cytowany z Wei et al.13 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Zróżnicowane komórki wykazują spontaniczne skurcze pod mikroskopem. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek uzupełniający 1: Analiza Kaplana-Meiera procentu próbek bez spontanicznego skurczu. 50% próbek iPS-CM wykazało skurcz w 20 dniu. W 30 dniu 64,4% próbek wykazało skurcz. n = 83. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2: Ocena kurczliwości serca. Skalowaną kurczliwość uzyskaną przez podzielenie kurczliwości C przez liczbę punktów analizy (x, y) wykreślono dla grup kontrolnych i niedokrwiennych przed i po ekspozycji na 24-godzinne niedotlenienie. n = 3 dla kontroli i n = 8 dla stanu niedokrwiennego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 3: Ocena zawartości kardiomiocytów. Barwienie immunologiczne białka markera sercowego na płytce 96-dołkowej. Zielony: cTnT, niebieski: DAPI. Częstość różnicowania komórek obliczono na 20,7 ± 9,6%, dzieląc obszar regionu barwionego cTnT przez obszar obszaru barwionego DAPI. Podziałka liniowa = 1 mm. n = 4 dla warunków kontrolnych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dodatkowy plik kodowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naukowcy często wykorzystują laboratoryjne modele małych zwierząt do przeprowadzania eksperymentów z IHD. W tym miejscu opracowaliśmy model hodowli komórkowej ludzkiego IHD w celu przeprowadzenia takich eksperymentów.

Głównym problemem, z jakim może się spotkać użytkownik tego protokołu, jest niski wskaźnik zróżnicowanych kardiomiocytów. Należy podjąć kilka kroków z dużą ostrożnością, aby poprawić szybkość pomyślnego różnicowania: (a) należy zachować ostrożność podczas pipetowania, ponieważ komórki łatwo odłączają się po dodaniu odczynnika enzymów dysocjacji komórek, (b) dodanie Y-27632 zwiększa przeżywalność komórek iPS podczas odłączania, oraz (c) czas zmian pożywki na początku różnicowania powinien wynosić dokładnie 48 godzin od siebie, aby zapewnić kontrolowaną ekspresję genów zaangażowanych w różnicowanie.

Jeśli chodzi o białka macierzy zewnątrzkomórkowej używane do powlekania powierzchni płytki hodowlanej, można użyć innych materiałów niż laminina, których użyliśmy w tym protokole. Na przykład Matrigel14,15 i żelatyna16,17 są używane do hodowli hiPSC bez podawania. Według Haraguchi i wsp., hiPSC wysiane na Matrigel zostały z powodzeniem zróżnicowane w arkusz komórek serca18.

Istnieje szereg wcześniejszych badań dotyczących modeli hodowlanych do modelowania chorób z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z hiPSC. Jeśli chodzi o modelowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego, wprowadzono manipulacje środowiskiem komórkowym, takie jak hiperkaliemia, kwasica i akumulacja mleczanu19. Inne metody obejmują granulowanie komórek w celu utrudnienia dyfuzji tlenu20 i hamowanie metabolizmu za pomocą cyjanku21. W obecnym protokole uszkodzenie komórek zostało osiągnięte za pomocą stosunkowo prostej metody, a mianowicie 24-godzinnego pozbawienia tlenu i składników odżywczych. Należy jednak zwrócić uwagę na dokładne procesy patofizjologiczne choroby niedokrwiennej serca, ponieważ rzeczywiście istnieją różnice między chorobą in vivo a modelem choroby obecnego protokołu, takie jak obecność lub brak trójwymiarowego środowiska komórkowego i krwi.

Jeśli chodzi o technologiczny aspekt oceny funkcji kardiomiocytów, Toepfer i wsp. opisali algorytm oparty na MatLab do określania skurczu i relaksacji sarkomeru w hiPS-CMs22. Smith i wsp. opisali zaawansowaną metodę wysokoprzepustowej analizy elektrofizjologicznej pobudliwych komórek pochodzących z hiPS-CMs, przy użyciu wyrafinowanych nanotopograficznych układów wieloelektrodowych23,24. Zaletą naszego protokołu jest to, że wymaga on jedynie konwencjonalnego oprogramowania i materiałów eksploatacyjnych, takich jak oprogramowanie imageJ i płytki 96-dołkowe.

Jeśli chodzi o poziom tlenu w sercu, uważa się, że ciśnienie tlenu w żyłach docierających do serca wynosi 40 mmHg25. Według McDougala i wsp. szacuje się, że zewnątrzkomórkowe ciśnienie tlenu w niedotlenieniu wynosi <12,8 mmHg26. Stosując metodę Rounds i wsp.27, ciśnienie tlenu w pożywce hodowlanej (zasolenie: 35‰) w stanie niedotlenienia (2% tlenu) w temperaturze 37 °C poddanej działaniu obecnego protokołu oblicza się na 14,9 mmHg, czyli więcej niż oszacowano powyżej. Co ciekawe, Al-Ani i in. stwierdzili, że w pożywce hodowlanej występuje gradient ciśnienia tlenu, a na ciśnienie tlenu ma wpływ typ komórki, gęstość wysiewu i objętość pożywki28. Zazwyczaj stężenie tlenu na dnie płytki hodowlanej, na której znajdują się komórki, jest najniższe. W związku z tym wpływ głębokości w pożywce hodowlanej jeszcze bardziej obniżyłby efektywne ciśnienie tlenu w pobliżu hiPS-CM. W celu wywołania wystarczającego uszkodzenia hiPS-CM w warunkach niedotlenienia, należy zwrócić szczególną uwagę na głębokość pożywki i gęstość komórek.

Nasz model hiPS-CM, który jest bardzo zbliżony do warunków fizjologicznych ludzkich miocytów serca, korzystnie naśladuje ludzką IHD. Podejścia oparte na modelach zwierzęcych obejmują kwestie etyczne, techniczne i akademickie. W szczególności modele in vivo wymagają zaawansowanej techniki mikrochirurgii w celu uzyskania powtarzalnych danych: np. niedrożność przedniej gałęzi zstępującej lewej tętnicy wieńcowej u gryzoni3. Opisany w niniejszym dokumencie model hiPS-CM pokonuje te krytyczne bariery i stanowi użyteczną, istotną i powtarzalną platformę dla chorób sercowo-naczyniowych.

Należy jednak zwrócić uwagę na pewne ograniczenia. Oczywistą różnicą między kardiomiocytami indukowanymi przez iPS a normalnymi kardiomiocytami jest brak kanalików T29, a w naszym badaniu nie uwzględniliśmy czynników humoralnych, takich jak uszkodzenie tkanek wywołane przez leukocyty i aktywacja układu dopełniacza. Ponadto należy poprawić odsetek zróżnicowanych kardiomiocytów w tym modelu (20,7 ± 9,6%, rysunek uzupełniający 3). Niedawna publikacja Halloina i wsp. opisuje skalowalną, chemicznie zdefiniowaną metodę indukowania czystości hiPS-CM na poziomie >95% za pomocą chemicznych modulatorów szlaku WNT bez konieczności selekcji za pomocą markerów30. Niemniej jednak nasz model ludzkiego IHD jest stosunkowo prosty i ma zastosowanie kliniczne (np. badania przesiewowe leków z wykorzystaniem komórek iPS pochodzących od pacjenta). Nasz model jest również unikalną platformą do dalszego wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw IHD.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez JSPS KAKENHI, Fundusz na rzecz Promocji Wspólnych Międzynarodowych Badań (Wspieranie Wspólnych Międzynarodowych Badań), 17KK0168. Autorzy dziękują Centralnemu Laboratorium Badawczemu, Okayama University Medical School za pomoc FACS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik do barwienia aktyny (odczynnik ActinRed 555 ReadyPromes)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37112
Przeciwciało przeciw troponinie sercowej TThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAMA5-12960
Pożywka podtrzymująca kardiomiocyty (zestaw do różnicowania kardiomiocytów PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Enzymy dysocjacji komórek (TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone12563011
Pożywka różnicująca A (zestaw do różnicowania kardiomiocytów PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Pożywka różnicująca B (zestaw do różnicowania kardiomiocytów PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, StanyZjednoczone A2921201
SystemFACS Aria IIIBD Biosciences, San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone
Mikroskop fluorescencyjnyKEYENCE, Osaka, JaponiaBZ-X710
Kozie przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA28175
Ludzkie komórki iPSRIKEN, Tsukuba, Japonia201B7
Inkubator hipoksyjnySANYO, Osaka, JaponiaMCO-175M
Pożywka wzrostowa iPSC (Essential 8 Medium)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA1517001
pożywka do konserwacji iPSC (StemFit AK02N)Ajinomoto, Tokio, JaponiaRCAK02N
Laminin (iMatrix-511)Nippi, Tokio, JaponiaiMatrix-511
(zestaw do oznaczania proliferacji komórek MTT)Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA10009365
Odczynnik do barwienia jąder (odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, Kioto, Japonia35501-02
Zestaw do oznaczania MTT

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94(2019).
  2. Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375(2019).
  3. Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
  4. Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
  5. Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
  6. Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
  7. Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
  8. Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590(2017).
  9. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  10. Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
  11. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
  14. Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
  15. Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
  16. Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
  17. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
  18. Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
  19. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  20. Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
  21. Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666(2010).
  22. Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
  23. Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
  24. Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
  25. Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
  26. McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
  27. Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
  28. Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269(2018).
  29. Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
  30. Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kardiomiocyty hiPSCludzkie indukowane pluripotencjalne kom rki macierzyster nicowanie kardiomiocyt wkomora hipoksycznaprzesiew lek wbarwienie jodkiem propidynywektorem pr dko ci obrazu cz stekbia ko markerowe serca

Powiązane artykuły