Prezentowany tutaj jest protokół, który opisuje monitorowanie pełnego cyklu życia drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z podkładką agarozową i naczyniami do obrazowania komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bdellovibrio bacteriovorus to mała bakteria Gram-ujemna, która zabija inne bakterie Gram-ujemne, w tym szkodliwe patogeny. Dlatego jest uważany za żywy antybiotyk. Aby zastosować B. bacteriovorus jako żywy antybiotyk, konieczne jest najpierw zrozumienie głównych etapów jego złożonego cyklu życiowego, w szczególności jego namnażania się wewnątrz ofiary. Do tej pory wyzwaniem było monitorowanie kolejnych etapów cyklu życiowego drapieżnika w czasie rzeczywistym. Przedstawiono kompleksowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym pełnego cyklu życia B. bacteriovorus, zwłaszcza podczas jego wzrostu wewnątrz gospodarza. W tym celu stosuje się system składający się z podkładki agarozowej w połączeniu z szalkami do obrazowania komórek, w których komórki drapieżne mogą swobodnie poruszać się pod poduszką agarozową, podczas gdy unieruchomione komórki ofiary są w stanie tworzyć bdelloplasty. Zastosowanie szczepu wytwarzającego znakowaną fluorescencyjnie podjednostkę β polimerazy DNA III pozwala dodatkowo na monitorowanie replikacji chromosomów podczas fazy reprodukcji cyklu życiowego B. bacteriovorus.
Wprowadzenie
Bdellovibrio bacteriovorus to mała (0,3–0,5 µm na 0,5–1,4 µm) bakteria gram-ujemna, która poluje na inne bakterie gram-ujemne, w tym na szkodliwe patogeny, takie jak Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oraz Shigella flexneri1,2,3. Ponieważ B. bacteriovorus zabija patogeny, jest uważana za potencjalny żywy antybiotyk, który może być stosowany w walce z infekcjami bakteryjnymi, zwłaszcza tymi wywołanymi przez szczepy wielolekooporne.
B. bacteriovorus wykazuje specyficzny cykl życiowy składający s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie lizatu B. bacteriovorus do analizy mikroskopowej
- W kolbie o pojemności 250 mL przygotować kokulturę, łącząc 1 mL świeżej 24-godzinnej kultury B. bacteriovorus (np. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) i 3 mL nocnej kultury ofiary (np. E. coli S17-1 pZMR100) z 50 mL buforu Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) uzupełnionego w razie potrzeby o antybiotyki (tutaj: 50 µg/mL kanamycyny).
- Inkubować kokulturę przez 24 h w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm.
- Sprawdzić, czy komórki ofiary zostały całkowicie zlizowane, korzystając z mikroskopii fazowo-kontrastowej....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany system oparty na TLFM pozwala na śledzenie w czasie pojedynczych komórek . bacteriovorus (Rycina 3, Film 1) i dostarcza cennych informacji na temat każdego etapu złożonego, drapieżnego cyklu życiowego. Fuzja PilZ-mCherry umożliwia oznakowanie całej komórki drapieżnej w fazie ataku, a także we wczesnej fazie wzrostu (Rycina 3). Przejście z fazy ataku do fazy replikacyjnej zwizualizowano nie tylko poprzez tworzenie się bdelloplast.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na rosnące zainteresowanie wykorzystaniem B. bacteriovorus jako żywego antybiotyku, potrzebne są nowe narzędzia do obserwacji cyklu życiowego drapieżników, w szczególności interakcji drapieżnik-patogen. Prezentowany protokół służy do śledzenia całego cyklu życiowego B. bacteriovorus , zwłaszcza podczas jego wzrostu wewnątrz gospodarza, w czasie rzeczywistym. Co więcej, zastosowanie szczepu wytwarzającego znakowany fluorescencyjnie klamrę beta holoenzymu polimerazy III DNA umożliwiło monitorow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant Narodowego Centrum Nauki Opus 2018/29/B/NZ6/00539 dla J.Z.C.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówka | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| Certyfikowana biologia molekularna Agaroza | BIO-RAD | 161-3100 | agaroza o niskiej fluorescencji do podkładki agarozowej |
| Fidżi | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Pakiet do przetwarzania obrazu Open Source |
| Naczynie szklane 35 mm | ibidi | 81218-200 | szkło |
| niepowlekaneMikroskop | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, moduł laserowy o najwyższej ostrości, kamera DV Elite CoolSnap HQ2, montaż SSSI FP DV, zestaw obj. Oly 100x olej 1.4 NA, pryzmat Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0,45 µ m | Sartorius | 16555----------K | Octan celulozy, sterylny, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Oprogramowanie do obrazowania dostarczone przez producenta |
Bibliografia
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Stap....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
