Prezentowany tutaj jest protokół, który opisuje monitorowanie pełnego cyklu życia drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z podkładką agarozową i naczyniami do obrazowania komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bdellovibrio bacteriovorus to mała bakteria Gram-ujemna, która zabija inne bakterie Gram-ujemne, w tym szkodliwe patogeny. Dlatego jest uważany za żywy antybiotyk. Aby zastosować B. bacteriovorus jako żywy antybiotyk, konieczne jest najpierw zrozumienie głównych etapów jego złożonego cyklu życiowego, w szczególności jego namnażania się wewnątrz ofiary. Do tej pory wyzwaniem było monitorowanie kolejnych etapów cyklu życiowego drapieżnika w czasie rzeczywistym. Przedstawiono kompleksowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym pełnego cyklu życia B. bacteriovorus, zwłaszcza podczas jego wzrostu wewnątrz gospodarza. W tym celu stosuje się system składający się z podkładki agarozowej w połączeniu z szalkami do obrazowania komórek, w których komórki drapieżne mogą swobodnie poruszać się pod poduszką agarozową, podczas gdy unieruchomione komórki ofiary są w stanie tworzyć bdelloplasty. Zastosowanie szczepu wytwarzającego znakowaną fluorescencyjnie podjednostkę β polimerazy DNA III pozwala dodatkowo na monitorowanie replikacji chromosomów podczas fazy reprodukcji cyklu życiowego B. bacteriovorus.
Wprowadzenie
Bdellovibrio bacteriovorus to mała (0,3–0,5 µm na 0,5–1,4 µm) bakteria gram-ujemna, która poluje na inne bakterie gram-ujemne, w tym na szkodliwe patogeny, takie jak Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oraz Shigella flexneri1,2,3. Ponieważ B. bacteriovorus zabija patogeny, jest uważana za potencjalny żywy antybiotyk, który może być stosowany w walce z infekcjami bakteryjnymi, zwłaszcza tymi wywołanymi przez szczepy wielolekooporne.
B. bacteriovorus wykazuje specyficzny cykl życiowy składający się z dwóch faz: wolnożyjącej, niereplikacyjnej fazy ataku oraz wewnątrzkomórkowej fazy reprodukcyjnej (Rycina 1). W fazie wolnożyjącej ta wysoce ruchliwa bakteria, poruszająca się z prędkością do 160 µm/s, poszukuje swojej ofiary. Po przytwierdzeniu się do błony zewnętrznej ofiary, wnika ona do periplazmy4,5. Podczas reprodukcyjnej fazy w periplazmie B. bacteriovorus wykorzystuje liczne enzymy hydrolityczne do degradacji makrocząsteczek gospodarza i ponownego wykorzystania ich we własnym wzroście. Wkrótce po wniknięciu do periplazmy komórka gospodarza obumiera i pęcznieje, tworząc sferyczną strukturę zwaną bdelloplastem, wewnątrz którego komórka drapieżnika wydłuża się i replikuje swoje chromosomy. Proces replikacji rozpoczyna się w miejscu inicjacji replikacji (oriC)6 i trwa do momentu całkowitej syntezy kilku kopii chromosomu7. Co ciekawe, replikacji każdego chromosomu nie towarzyszy podział komórki. Zamiast tego drapieżnik wydłuża się, tworząc długą, wielonukleoidową komórkę nitkowatą. Po wyczerpaniu składników odżywczych filament przechodzi synchroniczne septowanie, a komórki potomne zostają uwolnione z bdelloplastu8.
Zanim B. bacteriovorus będzie mógł zostać wykorzystany jako żywy antybiotyk w walce z infekcjami bakteryjnymi, kluczowe jest zrozumienie głównych etapów jego cyklu życiowego, w szczególności tych związanych z proliferacją wewnątrz ofiary. Obrazowanie żywych komórek B. bacteriovorus było wyzwaniem ze względu na różnorodne formy morfologiczne drapieżnika i jego ofiary podczas złożonego cyklu życiowego. Do tej pory interakcje między B. bacteriovorus a komórką gospodarza były badane głównie za pomocą mikroskopii elektronowej i analizy statycznej2,9,10, z których obie mają ograniczenia, szczególnie gdy są wykorzystywane do monitorowania kolejnych etapów drapieżnego cyklu życiowego. Metody te zapewniają obrazy komórek B. bacteriovorus o wysokiej rozdzielczości i umożliwiają obserwację małego drapieżnika podczas fazy ataku lub wzrostu. Nie pozwalają one jednak na śledzenie pojedynczych komórek B. bacteriovorus przez obie fazy cyklu życiowego.
Przedstawiono tutaj kompleksowy protokół wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse (TLFM) do monitorowania pełnego cyklu życiowego B. bacteriovorus. Zastosowano system składający się z podkładki agarozowej w połączeniu ze szalką do obrazowania komórek, w której komórki drapieżne mogą swobodnie poruszać się pod podkładką agarozową, podczas gdy unieruchomione komórki ofiar mogą tworzyć bdeloplasty (Rysunek 2). Układ ten został przygotowany w oparciu o konkretne szczepy E. coli oraz B. bacteriovorus, jednak protokół można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do indywidualnych szczepów użytkownika (np. posiadających różne markery selekcyjne, białka połączone z różnymi fluoroforami itp.).
W tym przypadku, aby zwizualizować B. bacteriovorus podczas fazy ataku, skonstruowano specyficzny szczep (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry), który wykazuje ekspresję wersji białka cytoplazmatycznego PilZ z etykietą fluorescencyjną (dostępne w naszym laboratorium na zapytanie)7. Szczep ten dodatkowo produkuje DnaN (β-zacisk ślizgowy), podjednostkę holoenzymu polimerazy DNA III, połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Pozwala to na monitorowanie trwającej replikacji DNA wewnątrz komórek drapieżnych podczas ich wzrostu w bdelloplastach.
Chociaż opisany protokół oraz oprogramowanie wykorzystywane do akwizycji obrazów odnoszą się do mikroskopu odwróconego konkretnego producenta (patrz Tabela materiałów), technikę tę można dostosować do każdego mikroskopu odwróconego wyposażonego w komorę inkubacyjną lub inny zewnętrzny uchwyt grzewczy i umożliwiającego obrazowanie w trybie time-lapse. Do analizy danych użytkownicy mogą wybrać dowolne dostępne oprogramowanie kompatybilne z poszczególnymi formatami wyjściowymi.
Rycina 1: Cykl życiowy B. bacteriovorus w komórce gospodarza E. coli. W fazie ataku wolnopływająca komórka B. bacteriovorus poszukuje komórki gospodarza E. coli i przyczepia się do niej. Po inwazji komórka drapieżnika lokalizuje się w periplazmie ofiary, zmieniając kształt komórki gospodarza i tworząc bdelloplast. Faza reprodukcyjna rozpoczyna się wraz z formowaniem bdelloplastu. Komórka drapieżnika trawi komórkę ofiary i wykorzystuje proste związki do budowy własnych struktur. B. bacteriovorus rośnie w formie długiego, pojedynczego filamentu wewnątrz periplazmy gospodarza. Po wyczerpaniu zasobów komórki ofiary, filament B. bacteriovorus przechodzi synchroniczną septację i tworzy komórki potomne. Po wykształceniu wici przez komórki potomne, następuje liza bdelloplastu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie lizatu B. bacteriovorus do analizy mikroskopowej
- W kolbie o pojemności 250 mL przygotować kokulturę, łącząc 1 mL świeżej 24-godzinnej kultury B. bacteriovorus (np. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) i 3 mL nocnej kultury ofiary (np. E. coli S17-1 pZMR100) z 50 mL buforu Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) uzupełnionego w razie potrzeby o antybiotyki (tutaj: 50 µg/mL kanamycyny).
- Inkubować kokulturę przez 24 h w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm.
- Sprawdzić, czy komórki ofiary zostały całkowicie zlizowane, korzystając z mikroskopii fazowo-kontrastowej w preparacie mokrym. Na tym etapie powinny być obecne liczne ruchliwe komórki B. bacteriovorus w fazie ataku, a żadna komórka E. coli ani bdelloplast nie powinny być widoczne.
- Przefiltrować kulturę B. bacteriovorus przez filtr o rozmiarze porów 0,45 µm, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki gospodarza. Komórki drapieżne (0,3–0,5 µm x 0,5–1,4 µm) swobodnie przenikają przez pory 0,45 µm, podczas gdy komórki gospodarza są zatrzymywane na powierzchni filtra.
- Odwirować filtrat przez 20 min przy 2469 x g i 30 °C w stożkowej probówce 50 mL, aby zebrać komórki drapieżne. Resuspendować osad B. bacteriovorus w 3 mL buforu Ca-HEPES (do końcowej wartości OD600 wynoszącej około 0,2) i inkubować w temperaturze 30 °C przy 200 rpm przez 30 min.
2. Przygotowanie komórek gospodarza do inwazji B. bacteriovorus
- Pojedynczą kolonię szczepu gospodarza (E. coli S17-1 pZMR100 jest zalecany ze względu na różnorodność rozmiarów komórek, co prowadzi do powstania bdelloplastów o nierównych rozmiarach) wykorzystać do inokulacji 10 mL pożywki YT (0,8% Bacto tryptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,5% NaCl [pH = 7,5]), uzupełnionej w razie potrzeby o antybiotyki (w tym przypadku 50 µg/mL kanamycyny). Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C przy 180 rpm.
- Przenieść 2 mL nocnej hodowli E. coli (OD600 ok. 3,0) do probówki o pojemności 2 mL i odwirować w temperaturze pokojowej (RT) przy 2469 x g przez 5 min. Osad zawiesić w 200 µL buforu Ca-HEPES.
3. Konfiguracja mikroskopu (patrz Tabela materiałów)
- Przed użyciem podgrzej komorę mikroskopową z obiektywem imersyjnym 100x do 30 °C przez co najmniej 1 h. Krok ten jest niezbędny, aby uniknąć błędów w utrzymaniu ostrości podczas eksperymentu.
- Włącz mikroskop oraz system automatyzacji mikroskopowej. Uruchom oprogramowanie sterujące i wybierz odpowiednie filtry do pozyskiwania obrazów w świetle przechodzącym/DIC/fazowym oraz obrazów fluorescencyjnych, zgodnie z potrzebami (tutaj: obrazy BF, filtr polichromatyczny GFP/mCherry oraz emisja/pobudzenie dla mCherry i GFP).
4. Przygotowanie układów do mikroksopii fluorescencyjnej z rejestracją czasową (time-lapse)
- Wymieszać 200 mg agarozy klasy molekularnej o niskiej fluorescencji z 20 mL buforu Ca-HEPES (końcowe stężenie agarozy 1%) i rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej. Partia ta może być wykorzystana wielokrotnie po zastygnięciu, wystarczy zatem powtórzyć etap podgrzewania.
- Wlać 3 mL roztopionej agarozy do szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm (Tabela materiałów). Pozostawić agarozę do zastygnięcia.
- Za pomocą laboratoryjnej mikrołopatki ostrożnie wyjąć wkład agarozowy z szalki 35 mm, nie naruszając środkowego słupa wkładu. Odwrócić wkład spodem do góry i umieścić go w pokrywie szalki Petriego (Rysunek 2).
- Nanieść 5 µL zagęszczonej zawiesiny E. coli na wierzch odwróconego wkładu i rozprzestrzenić komórki w środkowym słupie za pomocą pętli do szczepienia. Dodać 5 µL zagęszczonej zawiesiny B. bacteriovorus (OD600 ok. 0,2) na powierzchnię pokrytą E. coli. Nie rozprzestrzeniać komórek.
- Szybko przenieść żel agarozowy z powrotem do szalki z szklanym dnem 35 mm (stroną wierzchnią do dołu), a następnie przykryć pokrywką. W razie potrzeby usunąć pęcherzyki powietrza, delikatnie dociskając agar do płytki.
Rysunek 2: Schematyczny opis przebiegu eksperymentu. Podkładkę agarozową wyjmuje się z szalki 35 mm i odwraca tak, aby strona dolna była skierowana do góry. Świeże zawiesiny komórek drapieżnych oraz nocna kultura komórek ofiar są nakładane na odwróconą podkładkę w celu pokrycia jej strony „dolnej”. Następnie podkładkę agarozową odwraca się do pierwotnej orientacji i umieszcza z powrotem w szalce 35 mm, którą montuje się na stoliku mikroskopu odwróconego w komorze mikroskopowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
5. Przeprowadzenie mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse
- Umieść szalkę 35 mm w uchwycie do szalek Petri w taki sposób, aby nie przemieszczała się ona w trakcie eksperymentu. Nanieś jedną kroplę olejku imersyjnego (współczynnik załamania światła 1,518) na obiektyw oraz na dno szalki 35 mm.
- Zamontuj uchwyt na stoliku mikroskopu odwróconego w komorze mikroskopu.
- Skonfiguruj opcje w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby zbierać wiele obrazów w wielu pozycjach stolika w czasie.
- Ustaw powiększenie (100x) i soczewkę polichromatyczną (GFP/mCherry). Korzystając z okularu i światła przechodzącego (BF), znajdź płaszczyznę ogniskowania i otwórz menedżera listy punktów.
- Wybierz co najmniej 10 interesujących pozycji, przesuwając stolik i zapisując współrzędne dla każdej pozycji w oprogramowaniu mikroskopu poprzez kliknięcie przycisku Mark point. Unikaj pozycji znajdujących się blisko siebie, aby zapobiec fotoblaknięciu i fototoksyczności. Przełącz zawór kamery z okularu na monitor i skalibruj każdy punkt, ustawiając płaszczyznę ogniskowania i klikając przycisk Replace point w menedżerze listy punktów.
- Otwórz projektant eksperymentu i ustaw wszystkie parametry eksperymentalne w każdej zakładce w następujący sposób:
- Odznacz pole Z-stacking.
- Wybierz kanały fluorescencyjne i ustaw optymalne parametry oświetlenia. W tym przypadku zastosowano następujące ustawienia: dla kanału mCherry zestaw filtrów mCherry (EX575/25; EM625/45), intensywność 50% i czas ekspozycji 200 ms; dla kanału GFP zestaw filtrów GFP (EX475/28; EM525/48), intensywność 50% i 80 ms; a dla obrazów BF kanał POL, intensywność 5% i 50 ms.
- Wybierz odstępy między akwizycjami obrazów oraz całkowity czas trwania eksperymentu. Tutaj zastosowano odstępy 5 min w ciągu 10 h trwania eksperymentu.
- Włącz utrzymywanie ostrości dla wybranych pozycji (w przypadku używanego tutaj systemu poprzez zaznaczenie pola Maintain focus with UltimateFocus).
- Wybierz folder danych, w którym pliki obrazów mają być automatycznie zapisywane.
- Ponownie sprawdź wszystkie ustawienia w sterowaniu oprogramowaniem mikroskopu, a następnie rozpocznij eksperyment time-lapse.
- Po pierwszej godzinie eksperymentu sprawdź, czy wszystkie pozycje stolika są nadal w ostrości. W razie potrzeby dostosuj ostrość w odstępach czasu między akwizycjami obrazów.
- Po zakończeniu eksperymentu time-lapse wyjmij szalkę Petri i zutylizuj szalkę 35 mm z podkładką agarową zgodnie z protokołem bezpieczeństwa biologicznego.
UWAGA: Wszystkie podkroki po punkcie 5.2 są specyficzne dla użytkowników systemu DeltaVision Elite. Badacze korzystający z innych systemów muszą dostosować ustawienia do konkretnych urządzeń.
6. Przetwarzanie obrazów time-lapse i generowanie filmów przy użyciu oprogramowania Fiji
- Przenieś dane eksperymentalne na komputer z zainstalowanym oprogramowaniem Fiji. Uruchom program Fiji i otwórz obraz za pomocą File | Open lub po prostu przeciągając i upuszczając plik obrazu do programu Fiji.
- W oknie Bio-Formats Import Options wybierz opcję View stack with Hyperstack w ustawieniach wyświetlania stosu, zaznacz Composite color mode w opcjach kolorów oraz zaznacz Autoscale.
- Przewijając stosy obrazów, oceń, czy komórki i bdelloplasty pozostały w ostrości w trakcie trwania eksperymentu. Sprawdź, czy zielone fluorescencyjne punkty DnaN-mNeonGreen są obecne w komórkach B. bacteriovorus wewnątrz bdelloplastów przez całą fazę wzrostu i upewnij się, że wszystkie etapy drapieżnego cyklu życiowego są widoczne.
- Aby przeanalizować konkretną komórkę B. bacteriovorus/bdelloplast, zaznacz ją za pomocą narzędzi zaznaczania w menu Fiji (Rectangle, Oval, Polygon lub Freehand). Powiel wybrany obszar, korzystając z Image | Duplicate lub skrótu Ctrl + Shift + D.
- Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału fluorescencji w następujący sposób:
- Aby wybrać pojedynczy kanał, otwórz Channel tools, klikając Image | Color | Channels tools lub Ctrl + Shift + Z, a następnie wybierz interesujący kanał (Channel 1: mCherry, Channel 2: mNeonGreen, Channel 3: jasne pole).
- Dostosuj jasność i kontrast obrazów w kanale fluorescencji, otwierając menu B&C w Image | Adjust | Brightness/Contrast lub klikając Ctrl + Shift + C.
- Dodaj pasek skali za pomocą Analyze | Tools | Scale bar. Dodaj znacznik czasu do obrazów, klikając Images | Stacks | Time Stamper.
- Aby zapisać zmodyfikowane obrazy, przejdź do File | Save As i wybierz TIFF, aby zapisać je jako sekwencję obrazów, AVI, aby stworzyć film, lub PNG, aby zapisać pojedynczy obraz bieżącej klatki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany system oparty na TLFM pozwala na śledzenie w czasie pojedynczych komórek . bacteriovorus (Rycina 3, Film 1) i dostarcza cennych informacji na temat każdego etapu złożonego, drapieżnego cyklu życiowego. Fuzja PilZ-mCherry umożliwia oznakowanie całej komórki drapieżnej w fazie ataku, a także we wczesnej fazie wzrostu (Rycina 3). Przejście z fazy ataku do fazy replikacyjnej zwizualizowano nie tylko poprzez tworzenie się bdelloplast...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na rosnące zainteresowanie wykorzystaniem B. bacteriovorus jako żywego antybiotyku, potrzebne są nowe narzędzia do obserwacji cyklu życiowego drapieżników, w szczególności interakcji drapieżnik-patogen. Prezentowany protokół służy do śledzenia całego cyklu życiowego B. bacteriovorus , zwłaszcza podczas jego wzrostu wewnątrz gospodarza, w czasie rzeczywistym. Co więcej, zastosowanie szczepu wytwarzającego znakowany fluorescencyjnie klamrę beta holoenzymu polimerazy III DNA umożliwiło monitorow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant Narodowego Centrum Nauki Opus 2018/29/B/NZ6/00539 dla J.Z.C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówka | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| Certyfikowana biologia molekularna Agaroza | BIO-RAD | 161-3100 | agaroza o niskiej fluorescencji do podkładki agarozowej |
| Fidżi | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Pakiet do przetwarzania obrazu Open Source |
| Naczynie szklane 35 mm | ibidi | 81218-200 | szkło |
| niepowlekaneMikroskop | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, moduł laserowy o najwyższej ostrości, kamera DV Elite CoolSnap HQ2, montaż SSSI FP DV, zestaw obj. Oly 100x olej 1.4 NA, pryzmat Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0,45 µ m | Sartorius | 16555----------K | Octan celulozy, sterylny, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Oprogramowanie do obrazowania dostarczone przez producenta |
Bibliografia
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898(2016).
- Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
