Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Podsumowanie

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Streszczenie

Magnetyczne nanocząstki, zbudowane z tlenku żelaza, są szczególnie interesujące dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, do których często są internalizowane w komórkach, a następnie pozostawiane w nich. Jednym z wyzwań jest ocena ich losu w środowisku wewnątrzkomórkowym za pomocą wiarygodnych i precyzyjnych metodologii. W niniejszym artykule przedstawiamy zastosowanie magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM) do precyzyjnego ilościowego określenia integralności nanocząstek magnetycznych w komórkach poprzez pomiar ich momentu magnetycznego. Komórki macierzyste są najpierw znakowane dwoma rodzajami nanocząstek magnetycznych; Nanocząstki mają ten sam rdzeń wytwarzany w wyniku szybkiej i wydajnej syntezy żelu niewodnego na bazie mikrofal i różnią się powłoką: powszechnie stosowana cząsteczka kwasu cytrynowego jest porównywana do kwasu poliakrylowego. Tworzenie sferoid komórkowych 3D odbywa się następnie poprzez wirowanie, a moment magnetyczny tych sferoid jest mierzony w różnych momentach za pomocą VSM. Uzyskany moment jest bezpośrednim odciskiem palca integralności nanocząstek, przy czym malejące wartości wskazują na degradację nanocząstek. W przypadku obu nanocząstek moment magnetyczny zmniejsza się w czasie hodowli, ujawniając ich biodegradację. Wykazano również działanie ochronne powłoki z kwasu poliakrylowego w porównaniu z kwasem cytrynowym.

Wprowadzenie

Wzrasta zainteresowanie magnetycznymi cechami nanocząsteczek tlenku żelaza dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych. Ich reakcja na rezonans magnetyczny sprawia, że są niezawodnymi środkami kontrastowymi do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), co jest zaletą w medycynie regeneracyjnej, gdzie komórki znakowane nanocząstkami magnetycznymi mogą być śledzone in vivo po implantacji¹. Za pomocą pól magnetycznych komórki mogą być również kierowane na odległość; W ten sposób sferoidy komórkowe^2,3, rings⁴, lub sheets⁵ mogą być konstruowane magnetycznie, a także zdalnie stymulowane⁶, co jest atutem w rozwoju tkanek wolnych od rusztowań. Zakres możliwości dla tych nanocząstek obejmuje również systemy dostarczania leków^7,8 oraz magnetyczne i fotoindukowane leczenie hipertermiczne w celu zabijania komórek rakowych^9,10,11. We wszystkich tych zastosowaniach nanocząstki są integrowane ze środowiskiem biologicznym albo przez wstrzyknięcie dożylne, albo poprzez bezpośrednią internalizację w komórkach, a następnie pozostają w środku, co stawia pod znakiem zapytania ich los wewnątrzkomórkowy.

Analizy in vivo dostarczyły ogólnego zrozumienia losu nanocząsteczek w organizmie: po wstrzyknięciu do krwiobiegu, są one najpierw wychwytywane głównie przez makrofagi wątroby (komórki Kupffera), śledziony i szpiku kostnego, ulegają postępującej degradacji i dołączają do puli żelaza w organizmie^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Obserwacje jakościowe są możliwe tylko dzięki cyrkulacji nanocząstek w całym organizmie. Zazwyczaj transmisyjna mikroskopia elektroniczna (TEM) może być używana do bezpośredniej obserwacji nanocząstek, a obecność żelaza w narządach można określić za pomocą dawkowania. Ostatnio ich los został oceniony bezpośrednio na puli komórek, co oznacza, że znajdują się w zamkniętym obwodzie bez ucieczki żelaza, co pozwala na ilościowy pomiar ich biotransformacji na poziomie komórki^20,21,22. Takie pomiary są możliwe dzięki analizie właściwości magnetycznych nanocząstek, które są ściśle związane z ich integralnością strukturalną. Magnetometria próbek wibracyjnych (VSM) to technika, w której próbka jest okresowo wibrowana, tak że pomiar cewki indukowanego strumienia zapewnia moment magnetyczny próbki przy przyłożonym polu magnetycznym. Taka detekcja synchroniczna pozwala na szybki pomiar, co jest atutem w określaniu momentów magnetycznych dużej liczby próbek^20,21,22,23. Makroskopowa sygnatura magnetyczna uzyskana przez VSM daje następnie ilościowy przegląd całej próbki biologicznej bezpośrednio skorelowanej z rozmiarem i strukturą nanocząstek. W szczególności zapewnia moment magnetyczny przy nasyceniu (wyrażony w emu) próbek, który jest bezpośrednim określeniem ilościowym liczby nanocząstek magnetycznych obecnych w próbce, odpowiednio do ich określonych właściwości magnetycznych.

Wykazano, że wewnątrzkomórkowe przetwarzanie nanocząstek magnetycznych jest ściśle związane z ich cechami strukturalnymi²⁰. Cechy te mogą być kontrolowane za pomocą optymalnych protokołów syntezy. Każdy protokół ma swoje zalety i ograniczenia. Nanocząstki tlenku żelaza są powszechnie syntetyzowane w roztworach wodnych poprzez współstrącanie jonów żelaza²⁴. Aby przezwyciężyć ograniczenia polidyspersyjności wielkości nanocząstek, opracowano inne metody syntezy, takie jak metody zol-żel za pośrednictwem polioli²⁵. Niewodne podejścia do rozkładu termicznego prowadzą do produkcji bardzo dobrze skalibrowanych nanocząstek tlenku żelaza²⁶. Jednak stosowanie ogromnych ilości środków powierzchniowo czynnych, takich jak oleiloamina czy kwas oleinowy, komplikuje ich funkcjonalizację i transfer wody do zastosowań biomedycznych. Z tego powodu syntetyzujemy takie magnetyczne nanocząstki za pomocą niewodnego szlaku zol-żel, co prowadzi do wysokiej krystaliczności, czystości i odtwarzalności²⁷. Protokół ten wytwarza nanocząstki o dobrze kontrolowanym rozmiarze, które można dostroić poprzez zmiany temperatury²⁸. Niemniej jednak wspomagana mikrofalami niewodna droga zol-żel ma górną granicę wielkości otrzymanych nanocząstek wynoszącą około 12 nm. Procedura ta nie byłaby dostosowana do zastosowań wykorzystujących cząstki ferromagnetyczne w temperaturze pokojowej. Oprócz syntezy rdzenia, kolejną główną cechą, którą należy wziąć pod uwagę, jest powłoka. Leżąc na powierzchni nanocząstki, powłoka działa jak cząsteczka kotwicząca, pomagając w ukierunkowanej internalizacji nanocząstek lub może chronić nanocząstkę przed degradacją. Ponieważ alkohol benzylowy działa jednocześnie jako źródło tlenu i ligand, gołe nanocząstki są wytwarzane bez potrzeby stosowania dodatkowych środków powierzchniowo czynnych lub ligandów. Nanocząstki są następnie łatwo funkcjonalizowane powierzchniowo po syntezie bez procesu wymiany środków powierzchniowo czynnych.

Tutaj oceniane są dwa rodzaje nanocząstek, które mają ten sam rdzeń i różnią się powłoką. Rdzeń jest syntetyzowany przy użyciu szybkiej i bardzo wydajnej techniki opartej na mikrofalach. Dwie porównywane powłoki składają się z kwasu cytrynowego, jednego z najczęściej używanych jako środek powlekający w zastosowaniach biomedycznych^29,30, oraz kwasu poliakrylowego (PAA), powłoki polimerowej o dużej liczbie funkcji chelatujących. Pomiary magnetometryczne VSM są następnie wykorzystywane najpierw do ilościowego określenia wychwytu nanocząstek przez komórki, a następnie jako bezpośrednia ocena integralności strukturalnej nanocząstek po internalizacji w komórkach macierzystych. Wyniki pokazują, że stężenie w inkubacji wpływa na absorpcję nanocząstek, a powłoka wpływa na ich degradację, przy czym duża liczba cząsteczek zakotwiczających PAA chroni rdzeń przed degradacją.

Protokół

1. Synteza nanocząstek magnetycznych

1. Synteza rdzenia – wspomagana mikrofalami
   1. Rozpuścić 400 mg acetyloacetonianu żelaza(III) (>99,9%) w 10 ml alkoholu benzylowego (BA, 99,8%) w szklanej fiolce o pojemności 30 ml.
   2. Zwiększyć temperaturę zawiesiny z 25 do 250 °C w ciągu 20 minut (z szybkością 11,25 °C/min) i utrzymywać ją na poziomie 250 °C przez 30 minut za pomocą reaktora mikrofalowego.
   3. Powstałe nanocząstki zawieszone w alkoholu benzylowym przenieść do szklanej fiolki i oddzielić nanocząstki za pomocą magnesu neodymowego na 30 minut.
   4. Przemyć osad w poprzedniej szklanej fiolce o pojemności 100 ml 10 ml 10 ml dichlorometanu, 1 M wodorotlenku sodu, etanolu, wody o pH 7 (trzy razy) za pomocą magnesu neodymowego przez 5 minut każdego kroku w celu granulacji nanocząstek i usunięcia supernatantu.
   5. Doprowadzić zawiesinę nanocząstek w wodzie do pH 2 za pomocą 1 M kwasu solnego, a następnie odwirować w ultraodśrodkowych filtrach o mocy 100 kDa przy 2 200 x g przez 10 minut.
   6. Usunąć filtrat, dodać 12 ml ^10-2 M kwasu solnego do roztworu nanocząstek i odwirować w ultraodśrodkowych filtrach 100 kDa przy 2 200 x g przez 10 minut (trzy razy). Następnie rozcieńczyć roztwór nanocząstek w 10 ml ^10-2 M kwasu solnego przed powlekaniem.
2. powłoka
   1. Rozcieńczyć 175 mg kwasu cytrynowego i kwasu poliakrylowego w wodzie o pH 2 w szklanej fiolce o pojemności 100 ml i dostosować pH do 2 za pomocą 1 M roztworu kwasu solnego.
   2. Dodać 10 ml wodnych nanocząstek dyspersji do roztworu cząsteczki powlekającej, co odpowiada stosunkowi masowemu 5 między cząsteczką powłoki a nanocząstkami. Mieszać przez 2 godziny przy mieszaniu magnetycznym w temperaturze pokojowej.
   3. Po reakcji dostosować pH do 7 za pomocą 1 M wodorotlenku sodu.
   4. Odwirować roztwór nanocząstek 3 razy wodą dejonizowaną (DI) w ultrafiltrach ultraodśrodkowych o stężeniu 100 kDa przy 2 200 x g przez 10 minut; usunąć filtrat i rozcieńczyć roztwór nanocząstek w 12 ml wody demineralizowanej.

2. Hodowla i magnetyczne znakowanie komórek macierzystych

1. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kompletnym pożywce do wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCGM) w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, dodaj 10 ml trypsyny-EDTA wstępnie podgrzanej w temperaturze 37°C na kolbę 150 cm² i pozostaw na 2-3 minuty w celu odłączenia komórek.
   1. Aby wiedzieć, kiedy komórki są odłączone, obserwuj je pod mikroskopem jasnego pola. Ponownie zawiesić oderwane komórki w MSCGM i podzielić je na cztery kolby o powierzchni 150 cm². Amplifikuj komórki w ten sposób, aż do przejścia od 4 do 5.
2. Przygotuj roztwór nanocząstek magnetycznych do znakowania komórek: zdysperguj wybrane stężenie nanocząstek tlenku żelaza w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RMPI-1640) bez glutaminy. RPMI jest używany do inkubacji nanocząstek (i powiązanych etapów płukania), ponieważ ma niższą siłę jonową niż DMEM i lepiej zapobiega agregacji nanocząstek.
3. Gdy komórki znajdują się w pasażu 4 lub 5 i 90% zlewają się, usuń pożywkę MSCGM, przepłucz komórki surowicą wolną od surowicy RPMI (bez glutaminy) i dodaj 10 ml roztworu nanocząstek tlenku żelaza na 150 cm² kolbę hodowlaną, co jest minimalną objętością wymaganą do pokrycia wszystkich komórek.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 minut, a następnie wyrzucić roztwór nanocząstek. Przemyć raz surowicą wolną od surowicy RPMI-1640 (bez glutaminy) i inkubować ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (25 ml na 150 cm² kolba) przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ , aby umożliwić pełną internalizację nanocząstek.

3. Powstawanie sferoid komórek macierzystych

1. Świeżo przygotowana pożywka do hodowli sferoidów komórkowych składająca się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą uzupełnioną 50 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 0,1 μM deksametazonu, 1 mM pirogronianu sodu, 0,35 mM L-proliny i 1% uniwersalnego suplementu hodowlanego zawierającego insulinę, ludzką transferynę i kwas selenowy (ITS-Premix).
2. Odłączyć magnetyczne MSC, dodając 10 ml 0,05% trypsyny-EDTA wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C na 150 cm² kolbę przez 2-3 minuty. Po odłączeniu komórek natychmiast dezaktywuj trypsynę, dodając 1/3 objętości DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C.
3. Odwirować zdysocjowane komórki przy 260 x g przez 5 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w małej objętości (mniej niż 1 ml na kolbę 150 cm²) pożywki do hodowli sferoidalnej, takiej jak 200 000 komórek w około 50 μl pożywki. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i w razie potrzeby dostosuj głośność.
4. Dodać 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do hodowli sferoidalnych komórek do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać objętość ponownie zawieszonego roztworu odpowiadającą 200 000 komórek.
5. Odwiruj te magnetycznie znakowane komórki przy 180 x g przez 3 minuty, tworząc osad komórkowy na dnie probówki i zachowaj supernatant, który jest pożywką do hodowli komórkowych.
6. Lekko otworzyć probówki, aby umożliwić wymianę powietrza i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez okres do 21 dni, czas hodowli, wzdłuż którego komórki tworzą spójną strukturę 3D, w wyniku której powstaje w pełni uformowana sferoida. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu.
7. W wyznaczonych dniach należy dwukrotnie przepłukać sferoidy buforem kakodylowym złożonym z 0,2 M kakodylanu rozcieńczonego w wodzie zdemineralizowanej i utrwalić je za pomocą 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym rozcieńczonym w wodzie destylowanej przez 30 min w temperaturze pokojowej. Przechowuj stałe sferoidy w PBS do czasu użycia do pomiaru VSM lub obrazowania TEM. Ten etap fiksacji zatrzymuje wszystkie procesy biologiczne i pozwala na długotrwałą ochronę.

4. Kwantyfikacja nanocząstek magnetycznych w roztworze i w celulonie za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM)

1. Umieścić określoną objętość roztworu nanocząstek magnetycznych (maksymalnie 10 μl) lub sferoidę pojedynczej komórki w uchwycie na próbkę specjalnie zaprojektowanym tak, aby pasował do VSM.
2. Włóż próbkę do VSM i zeskanuj w poszukiwaniu przesunięcia próbki. Umieścić próbkę w pozycji odpowiadającej maksimum namagnesowania.
3. Wykonaj pierwszy pomiar przy niskim polu magnetycznym (od -1500 Oe do +1500 Oe) z szybkością 20 Oe/s.
4. Wykonaj drugi pomiar przy silnym polu magnetycznym (od -30 000 Oe do +30 000 Oe) z szybkością 200 Oe/s.

5. Analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

1. W przypadku roztworów nanocząstek należy umieścić 10 μl roztworu wodnego na siatce miedzianej pokrytej węglem i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
2. W przypadku nanocząstek zinternalizowanych w komórkach należy skontrastować utrwalone sferoidy komórkowe z ekstraktem z herbaty Oolong (OTE) w stężeniu 0,5% rozcieńczonym w 0,1 M buforze kakodylowym, po utrwaleniu 1% tetratlenkiem osmu zawierającym 1,5% cyjanożelazianu potasu, a następnie odwodnić w stopniowanych kąpielach etanolowych, zawartych w Eponie. Pokrój ultrasekcje o długości fali 70 nm i umieść je na siatkach miedzianych.
3. Wykonuj zdjęcia za pomocą mikroskopu elektronowego o napięciu 80 kV z powiększeniem od 1k do obserwacji całych komórek do 40k do obserwacji kompartmentów endosomalnych.

Wyniki

Z wykorzystaniem syntezy wspomaganej mikrofalowo otrzymuje się nanocząstki magnetyczne o monodyspersyjnej wielkości rdzenia 8.8 ± 2.5 nm, które następnie pokrywa się cytratem lub PAA (Rysunek 1A). Komórki macierzyste inkubuje się następnie przez 30 minut z tymi nanocząstkami zdyspergowanymi w pożywce hodowlanej w określonym stężeniu, co prowadzi do ich endocytozy i zamknięcia w endosomach komórkowych (Rysunek 1B). Magnetyczne komórki macierzyste zawiesza się w p...

Dyskusja

Korzystając z szybkiej i wydajnej syntezy mikrofalowej, nanocząstki magnetyczne mogą być łatwo syntetyzowane, o kontrolowanym rozmiarze, a następnie powlekane danymi cząsteczkami. Krytycznym krokiem jest przechowywanie soli żelaza i alkoholu benzylowego w próżni, aby zachować niewielką dyspersję. Alkohol benzylowy działa jednocześnie jako rozpuszczalnik i ligand, umożliwiając bezpośrednie otrzymanie skalibrowanego gołego tlenku żelaza bez konieczności stosowania dodatkowych ligandów. Po przeniesieniu nanocząstek do wody,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Alkohol benzylowy do syntezy	Sigma Aldrich	8.22259
Deksametazon	Sigma	D4902	Przygotować 1 mM roztwór podstawowy rozcieńczony w etanolu 100% i przechowywać w temperaturze -20° C
Dichlorometan ≥ Stabilizowany w 99%, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM z Glutamax I	Life Technologies	31966-021	Bez pirogronianu sodu, bez HEPES
Absolutny etanol	VWR	20821.310
Surowica bydlęca	Technologies	10270-106
Roztwór formaliny 10% neutralny buforowany	Sigma	HT5012
Kwas solny, 1,0N Roztwór standaryzowany	Alfa Aesar	35640
acetyloacetonian żelaza(III) (> 99,9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Uniwersalny suplement do hodowli (20x)	Corning	354352
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan	Sigma	A8960	Przygotować świeży stężony roztwór (25 mM) rozcieńczony w wodzie destylowanej
L-Prolina	Sigma	P5607	Przygotować 175 mM roztwór podstawowy rozcieńczony w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze 4° C
Mezenchymalna komórka macierzysta (MSC)	Lonza	PT-2501
Fiolka ze szkła monofalowego	Anton Paar	82723_us
Reaktor mikrofalowy	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	Aby uzyskać kompletną pożywkę, dodaj dostarczony zestaw BulletKit (zawierający surowicę, glutaminę i antybiotyki) do pożywki MSCGM
PBS bez CaCl2 w/ o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicylina (10.000U/ml)/Streptomycyna (10.000&mikro; g / mL)	Life Technologies	15140-122
Poli(kwas akrylowy, sól sodowa)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, bez glutaminy	Life Technologies	31870-025	Bez pirogronianu sodu, bez HEPES
Wodorotlenek sodu, 1,0N Standaryzowany roztwór	Alfa Aesar	35629
Roztwór pirogronianu sodu 100mM	Sigma	S8636
Sterylna stożkowa probówka wirówkowa	Falcon	352097	15 ml
probówki Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermo Fisher Scientific	25300054
Cytrynian trisodowy	VWR	33615.268	Przygotować 1 M roztwór podstawowy rozcieńczony w wodzie destylowanej i przechowywać w temperaturze 4° C
Cytrynian trójsodowy dwuwodny, certyfikowany AR do analizy	Sigma Aldrich	10396430
Ultra filtr odśrodkowy	Amicon	AC S510024

płodu Life