Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/61108

⸱

20 kwietnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Genetics and Biochemistry and Center for Human Genetics, Clemson University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster stanowi doskonały model do badania genetycznych podstaw wrażliwości na alkohol. W przeciwieństwie do badań na populacjach ludzkich, model Drosophila pozwala na ścisłą kontrolę tła genetycznego, a praktycznie nieograniczona liczba osobników o tym samym genotypie może być szybko hodowana w dobrze kontrolowanych warunkach środowiskowych bez ograniczeń regulacyjnych i przy stosunkowo niskich kosztach. Muchy wystawione na działanie etanolu przechodzą zmiany fizjologiczne i behawioralne, które przypominają zatrucie alkoholem u ludzi, w tym utratę kontroli postawy, uspokojenie i rozwój tolerancji. W tym miejscu opisujemy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Test opiera się na nagraniu wideo pojedynczych muszek wprowadzonych bez znieczulenia na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych w konfiguracji umożliwiającej synchroniczne rozpoczęcie ekspozycji na alkohol. System umożliwia jednej osobie zebranie indywidualnych danych dotyczących sedacji etanolem nawet od 2 000 much w ciągu 8 godzin pracy. Test może być w zasadzie rozszerzony w celu oceny skutków narażenia na jakąkolwiek substancję lotną i stosowany do pomiaru wpływu ostrej toksyczności substancji lotnych na inne owady, w tym inne gatunki much.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism informuje, że w 2015 roku nadmierne spożycie alkoholu, określane jako "zaburzenie związane z używaniem alkoholu", dotknęło około 16 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych. Nadużywanie alkoholu powoduje szeroki zakres niekorzystnych skutków fizjologicznych i jest główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. U ludzi zmniejszona wrażliwość lub niski poziom reakcji na alkohol ma silny komponent genetyczny i wiąże się z wyższym ryzykiem rozwoju zaburzeń związanych z używaniem alkoholu1,2,3,4. Badania ryzyka genetycznego na populacjach ludzkich są trudne ze względu na domieszkę populacji, zróżnicowaną historię rozwoju i narażenie środowiskowe oraz poleganie na kwestionariuszach zgłaszanych przez samych pacjentów w celu ilościowego określenia fenotypów związanych z alkoholem, które często są mylone z innymi schorzeniami neuropsychiatrycznymi.

Drosophila melanogaster stanowi doskonały model do badania genetycznych podstaw wrażliwości na alkohol5,6,7,8. Model Drosophila pozwala na ścisłą kontrolę nad pochodzeniem genetycznym, a praktycznie nieograniczona liczba osobników o tym samym genotypie może być szybko hodowana w dobrze kontrolowanych warunkach środowiskowych bez ograniczeń regulacyjnych i przy stosunkowo niskich kosztach. Oprócz publicznie dostępnych mutacji i linii RNAi, które celują w większość genów w genomie, dostępność Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), populacji 205 wsobnych linii pochodzenia dzikiego z pełnymi sekwencjami genomu, umożliwiła badania asocjacyjne całego genomu9,10. Takie badania zidentyfikowały sieci genetyczne związane z wpływem na czas rozwoju i żywotność po rozwojowym narażeniu na etanol11,12. Ewolucyjna ochrona podstawowych procesów biologicznych umożliwia wyciąganie wniosków translacyjnych poprzez nakładanie ludzkich ortologów na ich lotne odpowiedniki.

Muchy wystawione na działanie etanolu przechodzą fizjologiczne i behawioralne zmiany, które przypominają zatrucie alkoholem u ludzi, w tym utratę kontroli nad postawą8, sedacja i rozwój tolerancji13,14,15. Uspokojenie wywołane alkoholem u Drosophila można określić ilościowo za pomocą inebriometrów. Są to pionowe szklane kolumny o długości 122 cm z pochyłymi przegrodami z siatki, do których mogą przyczepiać się muchy16,17,18. Grupa co najmniej 50 much (płcie mogą być analizowane osobno) jest wprowadzana do górnej części kolumny i poddawana działaniu oparów etanolu. Muchy, które tracą kontrolę nad postawą, wpadają przez kolumnę i są zbierane w odstępach 1-minutowych. Średni czas elucji służy jako miara wrażliwości na zatrucie alkoholem. Kiedy muchy są wystawione na działanie alkoholu po raz drugi po wyzdrowieniu po pierwszym narażeniu, mogą rozwinąć tolerancję, co wynika z przesunięcia średniego czasu elucji13,15,19,20. Podczas gdy testy inebriometryczne doprowadziły do identyfikacji genów, sieci genetycznych i szlaków komórkowych związanych z wrażliwością na sedację alkoholową i rozwojem tolerancji12,13,14,21, test jest czasochłonny, o niskiej przepustowości i nieskuteczny w pomiarze wrażliwości na alkohol u pojedynczych much.

Alternatywne testy sedacji etanolem, które nie wymagają skomplikowanej konfiguracji inebriometru, pozwalają na wygodniejsze pomiary, ale nadal mają ograniczoną przepustowość i generalnie wymagają analiz grup much, a nie osobników21,22,23,24,25. Ocena pojedynczych much minimalizuje potencjalne efekty zakłócające wynikające z interakcji grupowych, takich jak te wynikające z zachowań społecznych. W tym miejscu przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa aparatury badawczej

  1. Utwórz kartonowy szablon wielkości 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, obrysowując płytkę na kartonie i wycinając wyznaczony obszar.
  2. Wytnij kawałek małej siatki przeciw owadom o rozmiarze płytki do hodowli komórkowej, korzystając z tekturowego szablonu z kroku 1.1.
  3. Przygotuj 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, umieszczając małą linię gorącego kleju na obwodzie górnej części płytki za pomocą pistoletu do klejenia na gorąco i przyklejając siatkę sitową na wierzchu otwartych studzienek.
  4. Przymocuj drewniany patyczek rzemieślniczy do każdej z trzech stron tej samej płytki do hodowli komórkowej z kroku 1.3 za pomocą gorącego pistoletu do klejenia. Zmodyfikowana płytka do hodowli komórkowej powinna teraz przypominać schemat płytki pokazany na Rysunek 1A oraz układ eksperymentalny pokazany na Rysunek 2.
    UWAGA: Przygotuj co najmniej tyle płytek do hodowli komórkowych, ile zmieści się w komorach filmowych (patrz poniżej).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat aparatury badawczej i komory filmowej. (a) Górne schematy. Pokazane są odpowiednio widok aparatury badawczej z góry, z boku i z przodu. Siatka sitowa leży płasko na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Drewniane kije rzemieślnicze, reprezentowane przez groty strzał, są przymocowane do trzech sąsiednich boków w celu zapewnienia stabilności i pomocy w ustawieniu, dwóch z boku płyty studzienkowej z sześcioma dołkami i jednego z boku płyty z czterema dołkami. Wszystkie nasadki są przyklejane na gorąco do aparatu. (b) Dolne schematy. Pokazane są odpowiednio widoki z góry, z boku i z przodu konfiguracji testu. Po prawej stronie pudełka wycina się szczelinę, od otworu na wieko do tyłu otworu, przy czym dolna część szczeliny znajduje się na poziomie wewnętrznej powierzchni. Otwór w górnej części pudełka, powierzchnia równoległa do podłoża, jest wyśrodkowany, aby zapewnić maksymalną ekspozycję wideo. Zacienione pole reprezentuje kamerę wideo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Zdjęcie systemu oznaczania. Kamera wideo jest umieszczona na górze komory polistyrenowej, z obiektywem włożonym w wycięty otwór, co ilustruje schematy Rysunek 1B. Dwa zestawy zmodyfikowanych 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych spoczywają na podkładce oświetleniowej, która jest umieszczona w szczelinie z boku komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Budowa komory filmowej

  1. Stwórz komorę filmową, wycinając otwór wielkości obiektywu kamery wideo z boku styropianowego pudełka. Wytnij dodatkową szczelinę na szerokość podkładki oświetleniowej po przeciwnej stronie styropianowego pudełka. Komora filmowa powinna przypominać komorę filmową pokazaną na Rysunek 1B i Rysunek 2.
  2. Przygotuj komorę filmowania do użycia, wkładając podkładkę oświetleniową do szczeliny i umieszczając kamerę w otworze obiektywu nad podkładką oświetleniową.
  3. Umieść wszystkie materiały i wykonuj wszystkie późniejsze testy w kontrolowanym środowisku, najlepiej w komorze behawioralnej o wilgotności około 30%, temperaturze 25 °C, równomiernym przepływie powietrza i poziomie hałasu poniżej 65 dB.

3. Przygotowanie aparatury testującej i muchy

  1. Odpipetować 1 ml 100% etanolu przez siatkę sita do każdej studzienki.
  2. Osusz siatkę sita kawałkiem gazy.
  3. Wytnij dwa kawałki gazy o wymiarach płytki do hodowli komórkowej, korzystając z tekturowego szablonu utworzonego w kroku 1.1. Umieścić je na suchej siatce zmodyfikowanej płytki do hodowli komórkowej zawierającej etanol z kroku 3.2.
  4. Utwórz mały kawałek cienkiej, elastycznej plastikowej deski do krojenia, obrysowując wokół kartonowego szablonu utworzonego w kroku 1.1 jako ogólny przewodnik i rozszerzając śledzony obszar o 1–2 cm na jednym z krótszych boków. Wytnij rozszerzony obszar śledzenia z cienkiej, elastycznej plastikowej deski do krojenia. Po przecięciu upewnij się, że plastik nadal mieści się między trzema drewnianymi patyczkami rzemieślniczymi na aparacie badawczym, ale zwisa z jednego końca na 1–2 cm.
  5. (Opcjonalnie) Jeśli konieczne jest utworzenie aspiratora, zmontuj aspirator taki jak ten pokazany na Rysunek 3, najpierw przecinając końcówkę pipety P1000 na pół. Włóż kawałek o większej średnicy do jednego końca ~30 cm kawałka elastycznej rurki, aby służył jako ustnik.

figure-protocol-3
Ryc. 3: Aspirator much, w którym zbiera się muchy, z wymiennym ustnikiem przymocowanym do elastycznej rurki i pipetą serologiczną o szerokim otworze z korkiem z bawełnianej gazy. Operator może zassać pojedynczą muchę do pipety w celu przeniesienia bez znieczulenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. (Opcjonalnie) Aby zakończyć montaż aspiratora, przykryj szeroki koniec 10-centymetrowego kawałka pipety serologicznej gazą, aby zapobiec przedostawaniu się much do rurki i włóż pipetę, najpierw gazą, do otwartego końca rurki, aby służyła jako komora na muchy. Aspirator powinien przypominać ten pokazany na Rysunek 3.
  2. Używając aspiratora (Rysunek 3, kroki 3.5 i 3.6), odessaj jedną muchę na studzienkę do oddzielnej 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Użyj elastycznego tworzywa sztucznego, aby przykryć wszelkie studzienki zawierające wcześniej zasysane muchy. Zapisać położenie studzienki i wszelkie istotne informacje o genotypie lub fenotypie każdej muchy.
  3. Trzymać elastyczny plastik równo z górną częścią płytki do hodowli komórkowej zawierającej muchy, aby zapobiec ich ucieczce, a następnie odwrócić płytkę na wierzch zmodyfikowanej płytki do hodowli komórkowej z etanolem. Arkusz elastycznego tworzywa sztucznego powinien spoczywać na arkuszach gazy. Wyrównaj odwróconą płytkę hodowli komórkowej zawierającą muchy za pomocą patyczków rzemieślniczych, aby upewnić się, że każda studzienka z etanolem jest wyrównana z każdą studzienką zawierającą muchę.
  4. Konfiguracja eksperymentalna powinna wyglądać podobnie Rysunek 2.

4. Testowanie much

  1. Upewnij się, że podkładka oświetleniowa jest oświetlona pełną jasnością, aby uzyskać maksymalny kontrast wizualny. Rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery wideo.
  2. Aby wystawić muchy na działanie etanolu, ostrożnie usuń plastik spomiędzy płytki studzienki i aparatury testowej, uważając, aby nie usunąć gazy.
  3. Zakończ nagrywanie wideo, gdy wszystkie muchy stracą kontrolę nad postawą. Gdy podejrzewa się, że wszystkie muchy utraciły kontrolę nad postawą, mocno postukaj w środek płytki, aby upewnić się, że wszystkie muchy całkowicie straciły kontrolę nad postawą. Jeśli wystąpi ruch, kontynuuj nagrywanie. Kontynuuj okresowe stukanie (co 1–2 minuty), aż nie pojawi się żaden ruch.
  4. (Opcjonalnie) Aby szybko odzyskać muchy, należy zdjąć tylko górną płytkę z aparatury badawczej, odsłaniając uspokojone muchy spoczywające na gazie. Odessać pojedyncze muchy do wybranych pojemników w celu odzyskania.
  5. Zastąp etanol na zmodyfikowanych płytkach do hodowli komórkowych 1 ml świeżego 100% etanolu co najmniej 1 raz na godzinę w celu kontroli parowania i nawilżania etanolu oraz utrzymania stałej ekspozycji na etanol przez cały czas trwania testu. Osusz siatkę sita gazą.
  6. Powtórz dla tylu próbek, ile chcesz.
    UWAGA: Aby uzyskać najwyższą przepustowość, zassaj następną rundę much do nowych płytek do hodowli komórkowych podczas nagrywania wideo. W tym miejscu protokół można wstrzymać, ponieważ nagranie wideo można później przejrzeć.

5. Wyznaczanie czasu sedacji muchy

  1. Nagraj czas sedacji dla każdej muchy z osobna, oglądając nagranie wideo. Czas sedacji definiuje się jako moment, w którym mucha traci pełną kontrolę postawy i zdolność lokomotoryczną. Zaleca się oglądanie filmu w odwrotnej kolejności i rejestrowanie czasu, w którym mucha zaczyna się poruszać, aby zapewnić dokładność.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwie 24-dołkowe płytki mikromiareczkowe mogą jednocześnie generować dane na temat 48 pojedynczych muszek w ciągu zaledwie 10 minut. Tabela 1 zawiera pomiary czasów sedacji etanolem dla 48 pojedynczych muszek, samców i samic osobno, dwóch linii DGRP o różnej wrażliwości na ekspozycję na alkohol na czas rozwoju i żywotność13. Muchy linii RAL_555 były mniej czułe niż linia RAL_177 (Rysunek 4, Tabela 2; p < 0,0001, ANOVA). Samce i samice z RAL_177 nie wykazywały efektu dymorficznego płciowo (Ryc. 4, Tabela 2; p > 0,1, ANOVA), podczas gdy samice linii RAL_555 były mniej wrażliwe na ekspozycję na etanol niż samce (Rysunek 4, Tabela 2; p < 0,006, ANOVA). Duża liczba much, które mogą być mierzone jednocześnie, oraz możliwość jednoczesnego pomiaru płci i różnych linii mogą zwiększyć dokładność poprzez zmniejszenie błędu wynikającego ze zmienności środowiska.

SZT. TGL TGL TGLI TGLI TGL szt. TGL TGL TGL SZT. szt. TGLI TGL TGL JEZDNE Rozdział szt. TGL Rozdział TGL TGL szt. szt. jezdnych TGL szt. TGL szt. TGL SZT. szt. TGL TGL SZT. TGL szt. TGL TGL TGL szt. TGLI TGL TGL TGL TGL TGL TGL szt. LAT TGL TGL TGL SZT. szt. SZT. TGL TGL TGL szt. TGL TGL szt. TGL Rozdział OSÓB Rozdział SZT. szt. szt. SZT. TGL TGL TGL szt. TGL TGL szt. szt. Rozdział TGL TGL TGL szt. SZT. szt. szt. SZT. TGL TGLI szt. LIPCA TGL szt. TGL szt. szt. TGL SZT. TGL szt. TGL TGL TGL TGL TGL TGLI szt. szt. TGL szt. TGL szt. szt. TGL TGL szt. TGL szt. TGL JEZDNE TGL TGL TGLI szt. TGL SZT. TGL SZT. SZT. szt. TGL TGL TGL
ZA.Czas sedacji etanolem (s)Ur.Czas sedacji etanolem (s)
KobietyMężczyźniKobietyMężczyźni
Z numerem 414365Z numerem 477Z numerem 423Okręg wyborczy 568Okręg wyborczy 309937742622460Okręg wyborczy 331Okręg wyborczy 498
Z numerem 201Rozdział 384Okręg wyborczy 498Z numerem 411Lokal mieszkalny 523626791619Rozdział 197Okręg wyborczy 467Okręg wyborczy 455562
Rozdział 228364Rozdział 333440Rejon 403267Okręg wyborczy 504744513570582Okręg wyborczy 506
440Z numerem 416Okręg wyborczy 404Z numerem 408Rozdział 422Rozdział 384970Okręg wyborczy 540369865Lokal mieszkalny 533Okręg wyborczy 492
Okręg wyborczy 888Rozdział 283Rozdział 285Rozdział 322369Rozdział 287Okręg wyborczy 595550Lokal 606Okręg wyborczy 392Okręg wyborczy 544345
1079Lokal mieszkalny 519Rozdział 315Okręg wyborczy 393Okręg wyborczy 376Rozdział 284Z numerem 418Okręg wyborczy 709Okręg wyborczy 553Rozdział 308Z numerem 477Okręg wyborczy 388
718Rozdział 287Z numerem 432Z dnia 275Rozdział 206Z numerem 411Rozdział 366Okręg wyborczy 564Okręg wyborczy 558Okręg wyborczy 385576377
Okręg wyborczy 598Okręg wyborczy 337Okręg wyborczy 398Rozdział 279631Rozdział 372Z numerem 437692Okręg wyborczy 578460Lokal mieszkalny 511Z numerem 412
Rozdział 241Okręg wyborczy 398364347374808665729484Okręg wyborczy 532Okręg wyborczy 425Okręg wyborczy 354
Rozdział 229Z numerem 423534Okręg wyborczy 386Okręg wyborczy 396628Rozdział 312576Rozdział 305Rozdział 334Okręg wyborczy 531Okręg wyborczy 506
Okręg wyborczy 388Z numerem 488Z numerem 451Lokal mieszkalny 523Rozdział 322Lokal mieszkalny 533682638420560548Okręg wyborczy 379
Z kolei 252529Okręg wyborczy 375Okręg wyborczy 427330Okręg wyborczy 5401045741Okręg wyborczy 708832Okręg wyborczy 509472
674Rejon 401Rozdział 303Rejon 401Lokal mieszkalny 307Rozdział 311Okręg wyborczy 394675Rozdział 381Z numerem 477Z numerem 449784
Rozdział 303Z numerem 453351Lokal mieszkalny 429525Rozdział 262Okręg wyborczy 540690520Okręg wyborczy 556Okręg wyborczy 495226
Rozdział 258Okręg wyborczy 483302Okręg wyborczy 389562Rozdział 319Okręg wyborczy 356Okręg wyborczy 615336Rejon 454Lokal mieszkalny 524590
Rozdział 346Okręg wyborczy 426Okręg wyborczy 385Z numerem 416Okręg wyborczy 596Rozdział 287626678840634677Okręg wyborczy 509

Tabela 1: Pomiary czasów sedacji etanolem (s) poszczególnych much linii (A) DGRP RAL_177 i (B) RAL_555 dla różnych płci (n = 48). Zobacz także Tabelę 2, Rysunek 4.

figure-results-1
Rysunek 4: Czasy sedacji alkoholowej linii DGRP RAL_177 i RAL_555. Słupki reprezentują średnie, a słupki błędów SEM (n = 48). Czas sedacji dla much RAL_177 był krótszy niż dla much RAL_55 (p < 0,0001, ANOVA). Poszczególne punkty danych przedstawiono w tabeli 1. Dodatkowe statystycznie istotne różnice między płciami i liniami wskazano w tekście oraz w tabeli 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

TGL pkt. TGL TGL TGL propozycji TGL
analizaŹródło zmiennościDfßWartość FWartość P
Pula pełnego modelulinia176962734 869<0,0001
płeć11050014,7570,0304
Linia x Płeć1Numer katalogowy: 860213,8970,0498
błądRozdział 1884149491
Zmniejszone modelki żeńskielinia1685126Godzina 23,58<0,0001
błąd94 Rozdział 942730718
Zredukowany model męskilinia1170522Rozdział 11.30,0011
błąd94 Rozdział 941418774
Zmniejszony model RAL_177płeć1Z numerem 4730,0230,8800
błąd94 Rozdział 941943741
Zredukowany model RAL_555płeć1190549Klasa 8.120,0054
błąd94 Rozdział 942205751

Tabela 2: Analizy wariancji czasu sedacji w zależności od płci i linii DGRP. Zastosowany model to Y = μ + L + S + LxS + ε, gdzie μ jest średnią ogólną, L jest stałym efektem linii DGRP (RAL_177, RAL_555), S jest ustalonym efektem płci (mężczyzna, kobieta), LxS jest składnikiem interakcji (stałym), a ε jest składnikiem błędu. Modele Y = μ + L + ε i Y = μ + S + ε zostały użyte dla modeli zredukowanych. Linia, płeć i termin interakcji linia x płeć były istotne w pełnym modelu na poziomie α < 0,05. Zmniejszone modele według płci i RAL_555 linii DGRP były również istotne i wyniosły α < 0,01. Zobacz także Tabelę 1, Rysunek 4. df = stopnie swobody, SS = sumy kwadratów typu I.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy prostą, niedrogą i wysokoprzepustową metodę oceny czasu sedacji z powodu ekspozycji na etanol u Drosophila melanogaster. W przeciwieństwie do wielu obecnych metod, które wymagają analiz grupowych, ten test umożliwia jednej osobie zebranie indywidualnych danych dotyczących czasu sedacji dla ~ 2,000 much w ciągu 8-godzinnego okresu pracy. Odkryliśmy, że jedna osoba może zdobyć 48 much na czas uspokojenia w około 5 minut. W tym tempie można ocenić 2 000 much w ciągu około 4 godzin, chociaż punktację można przeprowadzić później. W naszym teście zarejestrowany czas sedacji dla większości much waha się od 5 do 15 minut przy ekspozycji na 1 ml 100% etanolu. Niższe stężenia etanolu lub mniejsze objętości dostarczania spowodują dłuższy czas sedacji.

Obecne metody oceny czasu sedacji wymagają testowania dużej liczby much, ale nie umożliwiają pomiarów na pojedynczych osobnikach 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Wiele obecnych testów sedacji i czułości opiera się na ST50 22,23,24, punkcie czasowym, w którym 50% much jest uspokojonych w wyniku ekspozycji na etanol. Chociaż uzyskanie ST50 dla grup much nie było główną motywacją do opracowania tego testu, nagrania wideo wykazują większą użyteczność w porównaniu z obecnymi metodami, ponieważ nagrania mogą być wykorzystane do ustalenia ST50 dla grup indywidualnie badanych much i do pomiaru odsetka much, które spełniają dane kryterium (np. utrata kontroli nad postawą) w dowolnym momencie. Należy zauważyć, że takie analizy wideo wymagałyby dodatkowego czasu.

W przeciwieństwie do obecnych testów inebriometrycznych, opisana przez nas metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi do konfiguracji i może być wykonana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów. Stosując tę metodę, uzyskaliśmy wiarygodne i spójne czasy sedacji dla poszczególnych much. Test można w zasadzie rozszerzyć w celu oceny skutków narażenia na dowolną substancję lotną. Test może być również stosowany do pomiaru wpływu ostrej toksyczności substancji lotnych na inne owady, w tym inne gatunki much. Indywidualne dane dotyczące czasu sedacji można wykorzystać do oceny zakresu zmienności fenotypowej w populacji, takich jak DGRP.

Użyliśmy małej siatki przeciw owadom, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi z roztworem etanolu, jednocześnie umożliwiając dotarcie odpowiedniej ilości oparów etanolu do muchy. Warstwa białej gazy na wierzchu siatki ekranu zapewnia wizualny kontrast między muchą a powierzchnią poniżej i zapewnia, że muchy nie zostaną złapane w siatkę ekranu, co może prowadzić do niejednoznacznego określenia utraty kontroli postawy. Dostępne na rynku membrany, które są porowate dla wody i powietrza, dawały niespójne wyniki i były niewystarczająco przepuszczalne dla oparów etanolu. Celowo użyliśmy małej siatki przeciw owadom, ponieważ jest to jednolicie porowaty materiał, który minimalizuje zmiany w ekspozycji na etanol w wyniku pozycji muchy w studni. Modyfikacje tego protokołu mogą być wprowadzane w oparciu o dostępne materiały, chociaż zalecamy kontrolowaną komorę behawioralną, dostęp do 90%-100% etanolu w pobliżu muchy i równomierną ekspozycję na etanol.

Pozycja muchy na płytkach hodowli komórkowych powinna być losowo dobierana między powtórzeniami, aby uniknąć błędu pozycyjnego. W przypadku większych eksperymentów, które wymagają użycia tego testu przez wiele dni i w związku z tym podlegają zmianom środowiskowym, które mogą mieć wpływ na wyniki testu (np. zmiany ciśnienia atmosferycznego)27, zdecydowanie zalecamy, aby muchy były testowane o tej samej porze każdego dnia i randomizowane zarówno w ciągu dni, jak i między dniami, zwłaszcza jeśli różne linie i/lub płcie mają być porównywane ze sobą.

Opracowana przez nas metoda najlepiej nadaje się do pomiaru wpływu ostrej ekspozycji na alkohol, ale nie nadaje się do uzyskiwania danych dotyczących konsumpcji lub modelowania uzależnienia. Dane dotyczące wrażliwości na sedację alkoholową uzyskane z tego testu można jednak zintegrować z innymi pomiarami fenotypów związanych z alkoholem. Jednym z ograniczeń systemu jest to, że pionowa wysokość standardowych płytek do hodowli komórkowych pozwala na pionowy ruch much, którego nie można łatwo śledzić za pomocą wideo w celu szczegółowej oceny ogólnej aktywności lub lokomocji. Ograniczenie to nie ma jednak wpływu na dokładną ocenę czasu sedacji. W przypadku wykorzystania much o różnych genotypach (np. w populacjach niekrewniaczych pochodzących z DGRP28), test ten umożliwia również pobranie pojedynczych much w celu zebrania pul much o kontrastujących fenotypach do masowego sekwencjonowania DNA i ekstremalnego mapowania QTL 29,30. Ogólnie rzecz biorąc, test ten pozwala na szybkie i niedrogie zbieranie danych dotyczących sedacji alkoholowej na dużej liczbie pojedynczych much.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty DA041613 i GM128974 z National Institutes of Health dla TFCM i RRHA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorning3526Płaskodenne; będzie domem dla much w całym teście
Aspirator
GazaGenesee Scientific53-100Powszechnie dostępne.
EtanolDecon LabsV1001Szeroko dostępny.
Elastyczna plastikowa deska do krojenia (pokrywa talerza)Walmart550098612Każdy płaski plastik, który można łatwo przesunąć i całkowicie zakryć 24-dołkową płytkę. Dobrze sprawdza się elastyczna plastikowa deska do krojenia.
Gaza (do aspiratora)Honeywell North67622Powszechnie dostępna.
Podkładka oświetleniowaAmazon (AGPtek)ASIN B00YA9GP0GOdpowiednia jest każda podkładka świetlna zapewniająca kontrast.
Pałeczki Jumbo Craft Michaels10334892Odpowiedni jest każdy kij rzemieślniczy o długości co najmniej 7 cm.
Końcówka do pipety P1000 (do aspiratora)Genesee Scientific24-165RLKażda końcówka do pipety P1000 jest odpowiednia.
Pipeta serologiczna (do aspiratora)Genesee Scientific12-104
Mała siatka przeciw owadomLowe's (Saint-Gobain ADFORS)89322Każda mała siatka przeciw owadom jest odpowiednia.
KomoraWymiar przestrzeni wewnętrznej wystarczająco duży, aby objąć podkładkę świetlną. Może być wykonany z pudełka styropianowego.
Rurka Tygon (do aspiratora)Grainger9CUG7Szeroko dostępna.
Kamera wideoCanon1959C001AAKażda kamera wideo jest odpowiednia.
testowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).
  2. Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders. Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).
  3. Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).
  4. Schuckit, M. A., Smith, T. L. Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men. Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).
  5. Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. Genetics and genomics of alcohol sensitivity. Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).
  6. Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster. Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).
  7. Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'. Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7(2019).
  8. Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).
  9. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  10. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).
  11. Morozova, T. V., et al. A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development. G3. 8 (8), Bethesda, Md. 2643-2653 (2018).
  12. Morozova, T. V., et al. Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila. BMC Genomics. 16, 865(2015).
  13. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  14. Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).
  15. Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 7 (10), 95(2006).
  16. Weber, K. E. An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents. Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).
  17. Weber, K. E., Diggins, L. T. Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes. Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).
  18. Cohan, F. M., Graf, J. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).
  19. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).
  20. Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 8 (10), 231(2007).
  21. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics. Genetics. 83, 733-745 (2009).
  22. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).
  23. Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (98), e52676(2015).
  24. Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).
  25. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).
  26. Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines. Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).
  27. Pohl, J. B., et al. Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).
  28. Huang, W., et al. Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).
  29. Ehrenreich, I. M., et al. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants. Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).
  30. Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans. Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test sedacji alkoholemanaliza pojedynczej muchyekspozycja na etanolrejestracja wideop ytka 24 do kowapomiar czasu sedacjikontrola t a genetycznegobadanie substancji lotnych

Powiązane artykuły