Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Drosophila melanogaster stanowi doskonały model do badania genetycznych podstaw wrażliwości na alkohol. W przeciwieństwie do badań na populacjach ludzkich, model Drosophila pozwala na ścisłą kontrolę tła genetycznego, a praktycznie nieograniczona liczba osobników o tym samym genotypie może być szybko hodowana w dobrze kontrolowanych warunkach środowiskowych bez ograniczeń regulacyjnych i przy stosunkowo niskich kosztach. Muchy wystawione na działanie etanolu przechodzą zmiany fizjologiczne i behawioralne, które przypominają zatrucie alkoholem u ludzi, w tym utratę kontroli postawy, uspokojenie i rozwój tolerancji. W tym miejscu opisujemy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Test opiera się na nagraniu wideo pojedynczych muszek wprowadzonych bez znieczulenia na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych w konfiguracji umożliwiającej synchroniczne rozpoczęcie ekspozycji na alkohol. System umożliwia jednej osobie zebranie indywidualnych danych dotyczących sedacji etanolem nawet od 2 000 much w ciągu 8 godzin pracy. Test może być w zasadzie rozszerzony w celu oceny skutków narażenia na jakąkolwiek substancję lotną i stosowany do pomiaru wpływu ostrej toksyczności substancji lotnych na inne owady, w tym inne gatunki much.
Wprowadzenie
National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism informuje, że w 2015 roku nadmierne spożycie alkoholu, określane jako "zaburzenie związane z używaniem alkoholu", dotknęło około 16 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych. Nadużywanie alkoholu powoduje szeroki zakres niekorzystnych skutków fizjologicznych i jest główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. U ludzi zmniejszona wrażliwość lub niski poziom reakcji na alkohol ma silny komponent genetyczny i wiąże się z wyższym ryzykiem rozwoju zaburzeń związanych z używaniem alkoholu1,2,3,4. Badania ryzyka genetycznego na populacjach ludzkich są trudne ze względu na domieszkę populacji, zróżnicowaną historię rozwoju i narażenie środowiskowe oraz poleganie na kwestionariuszach zgłaszanych przez samych pacjentów w celu ilościowego określenia fenotypów związanych z alkoholem, które często są mylone z innymi schorzeniami neuropsychiatrycznymi.
Drosophila melanogaster stanowi doskonały model do badania genetycznych podstaw wrażliwości na alkohol5,6,7,8. Model Drosophila pozwala na ścisłą kontrolę nad pochodzeniem genetycznym, a praktycznie nieograniczona liczba osobników o tym samym genotypie może być szybko hodowana w dobrze kontrolowanych warunkach środowiskowych bez ograniczeń regulacyjnych i przy stosunkowo niskich kosztach. Oprócz publicznie dostępnych mutacji i linii RNAi, które celują w większość genów w genomie, dostępność Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), populacji 205 wsobnych linii pochodzenia dzikiego z pełnymi sekwencjami genomu, umożliwiła badania asocjacyjne całego genomu9,10. Takie badania zidentyfikowały sieci genetyczne związane z wpływem na czas rozwoju i żywotność po rozwojowym narażeniu na etanol11,12. Ewolucyjna ochrona podstawowych procesów biologicznych umożliwia wyciąganie wniosków translacyjnych poprzez nakładanie ludzkich ortologów na ich lotne odpowiedniki.
Muchy wystawione na działanie etanolu przechodzą fizjologiczne i behawioralne zmiany, które przypominają zatrucie alkoholem u ludzi, w tym utratę kontroli nad postawą8, sedacja i rozwój tolerancji13,14,15. Uspokojenie wywołane alkoholem u Drosophila można określić ilościowo za pomocą inebriometrów. Są to pionowe szklane kolumny o długości 122 cm z pochyłymi przegrodami z siatki, do których mogą przyczepiać się muchy16,17,18. Grupa co najmniej 50 much (płcie mogą być analizowane osobno) jest wprowadzana do górnej części kolumny i poddawana działaniu oparów etanolu. Muchy, które tracą kontrolę nad postawą, wpadają przez kolumnę i są zbierane w odstępach 1-minutowych. Średni czas elucji służy jako miara wrażliwości na zatrucie alkoholem. Kiedy muchy są wystawione na działanie alkoholu po raz drugi po wyzdrowieniu po pierwszym narażeniu, mogą rozwinąć tolerancję, co wynika z przesunięcia średniego czasu elucji13,15,19,20. Podczas gdy testy inebriometryczne doprowadziły do identyfikacji genów, sieci genetycznych i szlaków komórkowych związanych z wrażliwością na sedację alkoholową i rozwojem tolerancji12,13,14,21, test jest czasochłonny, o niskiej przepustowości i nieskuteczny w pomiarze wrażliwości na alkohol u pojedynczych much.
Alternatywne testy sedacji etanolem, które nie wymagają skomplikowanej konfiguracji inebriometru, pozwalają na wygodniejsze pomiary, ale nadal mają ograniczoną przepustowość i generalnie wymagają analiz grup much, a nie osobników21,22,23,24,25. Ocena pojedynczych much minimalizuje potencjalne efekty zakłócające wynikające z interakcji grupowych, takich jak te wynikające z zachowań społecznych. W tym miejscu przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much.
Protokół
1. Konstrukcja aparatury testowej
- Wyciąć z tektury szablon o rozmiarze 24-dołkowej płytki do hodowli komórek, odrysowując obrys płytki na tekturze i wycinając wyznaczony obszar.
- Wyciąć kawałek drobnej siatki przeciw owadom o rozmiarze płytki do hodowli komórek, korzystając z tekturowego szablonu z kroku 1.1.
- Przygotować 24-dołkową płytkę do hodowli komórek, nakładając za pomocą pistoletu z klejem na gorąco cienką linię kleju wokół górnego obrysu płytki, a następnie mocując siatkę na wierzchu otwartych dołków.
- Przymocować drewniany patyczek rzemieślniczy do trzech boków tej samej płytki do hodowli komórek z kroku 1.3 przy użyciu pistoletu z klejem na gorąco. Zmodyfikowana płytka do hodowli komórek powinna teraz odpowiadać schematowi płytki przedstawionemu na Ryc. 1A oraz konfiguracji eksperymentalnej pokazanej na Ryc. 2.
UWAGA: Przygotować co najmniej tyle płytek do hodowli komórek, ile zmieści się w komorach do filmowania (patrz poniżej).
Rycina 1: Schemat aparatury testowej i komory filmowej. (A) Górne schematy. Przedstawiono odpowiednio widok z góry, z boku i z przodu aparatury testowej. Siatka ekranowa leży płasko na górze 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Drewniane patyczki rzemieślnicze, oznaczone grotami strzałek, są przymocowane do trzech sąsiednich boków w celu zapewnienia stabilności i ułatwienia wyrównania: dwa po stronie płytki z sześcioma dołkami i jeden po stronie z czterema dołkami. Wszystkie elementy mocujące są przyklejone do aparatury za pomocą kleju na gorąco. (B) Dolne schematy. Przedstawiono odpowiednio widok z góry, z boku i z przodu układu testowego. Po prawej stronie pudełka wycięto szczelinę, od otworu na pokrywę do tylnej krawędzi otworu, przy czym dół szczeliny znajduje się na poziomie powierzchni wewnętrznej. Otwór na górze pudełka, na powierzchni równoległej do podłoża, jest wycentrowany w celu uzyskania maksymalnej ekspozycji wideo. Zacieniowane pudełko reprezentuje kamerę wideo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Fotografia systemu analitycznego. Kamera wideo została umieszczona na górze komory polistyrenowej, a obiektyw włożono w wycięty otwór, przedstawiony na schematach na Rycini 1B. Dwa zestawy zmodyfikowanych 24-dołkowych płytek do hodowli komórek spoczywają na podkładce oświetlającej, która została wsunięta w szczelinę w bocznej ścianie komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Konstrukcja komory filmowej
- Przygotuj komorę filmową, wycinając w boku pudełka polistyrenowego otwór o rozmiarze obiektywu kamery wideo. W przeciwległej ściance pudełka polistyrenowego wytnij dodatkowe nacięcie o szerokości panelu oświetleniowego. Komora filmowa powinna być podobna do komory pokazanej na ryc. 1B oraz ryc. 2.
- Przygotuj komorę filmową do użycia, wkładając panel oświetleniowy do nacięcia i ustawiając kamerę w otworze na obiektyw powyżej panelu oświetleniowego.
- Wszystkie materiały oraz wszystkie kolejne testy należy umieścić i przeprowadzić w kontrolowanym środowisku, najlepiej w komorze behawioralnej o wilgotności około 30%, temperaturze 25 °C, jednorodnym przepływie powietrza i poziomie hałasu poniżej 65 dB.
3. Przygotowanie aparatury testowej i much
- Pipetuj 1 mL 100% etanolu przez siatkę do każdego dołka.
- Osusz siatkę za pomocą kawałka gazy.
- Wytnij dwa kawałki gazy o wymiarach płytki do hodowli komórek, korzystając z szablonu tekturowego wykonanego w kroku 1.1. Umieść je na suchej siatce zmodyfikowanej płytki do hodowli komórek zawierającej etanol z kroku 3.2.
- Przygotuj niewielki kawałek cienkiej, elastycznej plastikowej deski do krojenia, odrysowując szablon tekturowy z kroku 1.1 jako ogólną wytyczną i poszerzając odrysowany obszar o 1–2 cm na jednym z krótszych boków. Wytnij powiększony obszar z plastikowej deski. Po wycięciu upewnij się, że plastik wciąż mieści się między trzema drewnianymi patyczkami w urządzeniu testowym, ale wystaje z jednego końca o 1–2 cm.
- (Opcjonalnie) Jeśli konieczne jest stworzenie aspiratora, zmontuj aspirator taki jak pokazano na Rysunku 3, najpierw przecinając na pół końcówkę pipety P1000. Włóż część o większej średnicy do jednego końca kawałka elastycznego wężyka o długości ~30 cm, aby służył on jako ustnik.
Rysunek 3: Aspirator do much, w którym muchy są zbierane za pomocą wymiennej końcówki przymocowanej do elastycznej rurki oraz szerokiej pipety serologicznej z korkiem z gazy bawełnianej. Operator może zassać pojedynczą muchę do pipety w celu jej przeniesienia bez konieczności stosowania anestezji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- (Opcjonalnie) Aby ukończyć montaż aspiratora, należy osłonić szeroki koniec 10 cm odcinka pipety serologicznej gazą, aby zapobiec przedostawaniu się much do rurki, a następnie włożyć pipetę, zaczynając od gazy, do otwartego końca rurki, tak aby służyła ona jako komora dla much. Aspirator powinien przypominać urządzenie przedstawione na Rysunku 3.
- Używając aspiratora (Rysunek 3, kroki 3.5 i 3.6), należy przenieść po jednej musze do poszczególnych studniek oddzielnej 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Użyj elastycznego tworzywa, aby przykryć studzienki zawierające wcześniej przeniesione muchy. Zapisz położenie studzienki oraz wszelkie istotne informacje o genotypie lub fenotypie każdej muchy.
- Przyłóż elastyczne tworzywo równo do górnej krawędzi płytki do hodowli komórek z muchami, aby zapobiec ich ucieczce, a następnie odwróć płytkę i połóż ją na wierzchu zmodyfikowanej płytki do hodowli komórek z etanolem. Arkusz elastycznego tworzywa powinien opierać się na arkuszach gazy. Wyrównaj odwróconą płytkę z muchami za pomocą patyczków do prac plastycznych, aby upewnić się, że każda studzienka z etanolem pokrywa się ze studzienką zawierającą muchę.
- Układ doświadczalny powinien przypominać Rysunek 2.
4. Testowanie much
- Upewnij się, że podkładka oświetleniowa świeci z pełną jasnością, aby uzyskać maksymalny kontrast wizualny. Rozpocznij nagrywanie kamerą wideo.
- Aby poddać muchy działaniu etanolu, ostrożnie usuń plastik znajdujący się pomiędzy płytką wielodołkową a aparaturą testową, uważając, aby nie przesunąć gazy.
- Zakończ nagrywanie wideo, gdy wszystkie muchy stracą kontrolę nad postawą. Gdy pojawi się przypuszczenie, że wszystkie muchy utraciły kontrolę nad postawą, mocno stuknij w środek płytki, aby upewnić się, że u wszystkich osobników występuje całkowita utrata kontroli nad postawą. Jeśli zaobserwowany zostanie ruch, kontynuuj nagrywanie. Stukaj okresowo (co 1–2 min), dopóki nie ustanie wszelki ruch.
- (Opcjonalnie) Aby szybko odzyskać muchy, zdejmij z aparatury testowej tylko górną płytkę, odsłaniając uspokojone muchy spoczywające na gazie. Przenieś pojedyncze muchy za pomocą aspiratora do wybranych pojemników w celu rekonwalescencji.
- Wymieniaj etanol w zmodyfikowanych płytkach do hodowli komórkowych na 1 mL świeżego 100% etanolu co najmniej raz na godzinę, aby kontrolować parowanie i uwodnienie etanolu oraz utrzymać stałą ekspozycję na etanol przez cały czas trwania testu. Osusz siatkę gazą.
- Powtórz procedurę dla tylu próbek, ile jest wymaganych.
UWAGA: Aby uzyskać najwyższą przepustowość, aspiruj kolejną partię much do nowych płytek do hodowli komórkowych w trakcie nagrywania wideo. Protokół można w tym miejscu przerwać, ponieważ nagranie wideo można przejrzeć później.
5. Wyznaczenie czasu sedacji much
- Odnotuj czas sedacji dla każdej pojedynczej muchy, analizując nagranie wideo. Czas sedacji definiuje się jako moment, w którym mucha całkowicie traci kontrolę nad postawą i zdolność lokomocyjną. W celu zapewnienia dokładności zaleca się oglądanie filmu od tyłu i odnotowanie czasu, w którym mucha zaczyna się poruszać.
Wyniki
Dwie 24-dołkowe płytki mikrotitracyjne mogły generować dane jednocześnie dla 48 poszczególnych much w czasie zaledwie 10 min. Tabela 1 zawiera pomiary czasu sedacji etanolem dla 48 poszczególnych much, z oddzielnym uwzględnieniem samców i samic, z dwóch linii DGRP o różnej wrażliwości na ekspozycję na alkohol w zakresie czasu rozwoju i żywotności13. Muchy linii RAL_555 były mniej wrażliwe niż linia RAL_177 (Rycina 4, Tabela 2; p < 0.0001, ANOVA). Samce i samice RAL_177 nie wykazywały efektu dymorfizmu płciowego (Rycina 4, Tabela 2; p > 0.1, ANOVA), podczas gdy samice linii RAL_555 były mniej wrażliwe na ekspozycję na etanol niż samce (Rycina 4, Tabela 2; p < 0.006, ANOVA). Duża liczba much, które mogą być mierzone jednocześnie, oraz możliwość równoczesnego badania obu płci i różnych linii mogą zwiększyć dokładność poprzez redukcję błędów wynikających ze zmienności środowiskowej.
| A. | Czas sedacji etanolem (s) | B. | Czas sedacji etanolem (s) | ||||||||||
| Samice | Samce | Samice | Samce | ||||||||||
| 414 | 365 | 477 | 423 | 568 | 309 | 937 | 742 | 622 | 460 | 331 | 498 | ||
| 201 | 384 | 498 | 411 | 523 | 626 | 791 | 619 | 197 | 467 | 455 | 562 | ||
| 228 | 364 | 333 | 440 | 403 | 267 | 504 | 744 | 513 | 570 | 582 | 506 | ||
| 440 | 416 | 404 | 408 | 422 | 384 | 970 | 540 | 369 | 865 | 533 | 492 | ||
| 888 | 283 | 285 | 322 | 369 | 287 | 595 | 550 | 606 | 392 | 544 | 345 | ||
| 1079 | 519 | 315 | 393 | 376 | 284 | 418 | 709 | 553 | 308 | 477 | 388 | ||
| 718 | 287 | 432 | 275 | 206 | 411 | 366 | 564 | 558 | 385 | 576 | 377 | ||
| 598 | 337 | 398 | 279 | 631 | 372 | 437 | 692 | 578 | 460 | 511 | 412 | ||
| 241 | 398 | 364 | 347 | 374 | 808 | 665 | 729 | 484 | 532 | 425 | 354 | ||
| 229 | 423 | 534 | 386 | 396 | 628 | 312 | 576 | 305 | 334 | 531 | 506 | ||
| 388 | 488 | 451 | 523 | 322 | 533 | 682 | 638 | 420 | 560 | 548 | 379 | ||
| 252 | 529 | 375 | 427 | 330 | 540 | 1045 | 741 | 708 | 832 | 509 | 472 | ||
| 674 | 401 | 303 | 401 | 307 | 311 | 394 | 675 | 381 | 477 | 449 | 784 | ||
| 303 | 453 | 351 | 429 | 525 | 262 | 540 | 690 | 520 | 556 | 495 | 226 | ||
| 258 | 483 | 302 | 389 | 562 | 319 | 356 | 615 | 336 | 454 | 524 | 590 | ||
| 346 | 426 | 385 | 416 | 596 | 287 | 626 | 678 | 840 | 634 | 677 | 509 | ||
Tabela 1: Pomiary czasu sedacji etanolem (s) poszczególnych much linii DGRP (A) RAL_177 oraz (B) RAL_555 z podziałem na płeć (n = 48). Patrz również Tabela 2, Rysunek 4.
Rysunek 4: Czasy sedacji alkoholowej linii DGRP RAL_177 i RAL_555. Słupki reprezentują średnie, a słupki błędów SEM (n = 48). Czasy sedacji dla muszek RAL_177 były krótsze niż dla linii RAL_55 (p < 0,0001, ANOVA). Poszczególne punkty danych przedstawiono w Tabeli 1. Dodatkowe istotne statystycznie różnice między płciami i liniami wskazano w tekście oraz w Tabeli 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Analiza | Źródło zmienności | df | SS | Wartość F | Wartość p |
| Pełny model zbiorczy | Linia | 1 | 769627 | 34.869 | <0.0001 |
| Płeć | 1 | 105001 | 4.757 | 0.0304 | |
| Linia x Płeć | 1 | 86021 | 3.897 | 0.0498 | |
| Błąd | 188 | 4149491 | |||
| Model zredukowany (samice) | Linia | 1 | 685126 | 23.58 | <0.0001 |
| Błąd | 94 | 2730718 | |||
| Model zredukowany (samce) | Linia | 1 | 170522 | 11.3 | 0.0011 |
| Błąd | 94 | 1418774 | |||
| Model zredukowany RAL_177 | Płeć | 1 | 473 | 0.023 | 0.8800 |
| Błąd | 94 | 1943741 | |||
| Model zredukowany RAL_555 | Płeć | 1 | 190549 | 8.12 | 0.0054 |
| Błąd | 94 | 2205751 | |||
Tabela 2: Analiza wariancji czasu sedacji w zależności od płci i linii DGRP. Zastosowany model to Y = µ + L + S + LxS + ε, gdzie µ oznacza średnią ogólną, L jest efektem stałym linii DGRP (RAL_177, RAL_555), S jest efektem stałym płci (samiec, samica), LxS to człon interakcji (stały), a ε to człon błędu. Modele Y = µ + L + ε oraz Y = µ + S + ε zostały użyte jako modele zredukowane. Linia, płeć oraz człon interakcji linia x płeć były istotne w pełnym modelu przy α < 0.05. Modele zredukowane według płci oraz linii DGRP RAL_555 były również istotne przy α < 0.01. Patrz również Tabela 1, Rycina 4. df = stopnie swobody, SS = suma kwadratów typu I.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy prostą, niedrogą i wysokoprzepustową metodę oceny czasu sedacji z powodu ekspozycji na etanol u Drosophila melanogaster. W przeciwieństwie do wielu obecnych metod, które wymagają analiz grupowych, ten test umożliwia jednej osobie zebranie indywidualnych danych dotyczących czasu sedacji dla ~ 2,000 much w ciągu 8-godzinnego okresu pracy. Odkryliśmy, że jedna osoba może zdobyć 48 much na czas uspokojenia w około 5 minut. W tym tempie można ocenić 2 000 much w ciągu około 4 godzin, chociaż punktację można przeprowadzić później. W naszym teście zarejestrowany czas sedacji dla większości much waha się od 5 do 15 minut przy ekspozycji na 1 ml 100% etanolu. Niższe stężenia etanolu lub mniejsze objętości dostarczania spowodują dłuższy czas sedacji.
Obecne metody oceny czasu sedacji wymagają testowania dużej liczby much, ale nie umożliwiają pomiarów na pojedynczych osobnikach 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Wiele obecnych testów sedacji i czułości opiera się na ST50 22,23,24, punkcie czasowym, w którym 50% much jest uspokojonych w wyniku ekspozycji na etanol. Chociaż uzyskanie ST50 dla grup much nie było główną motywacją do opracowania tego testu, nagrania wideo wykazują większą użyteczność w porównaniu z obecnymi metodami, ponieważ nagrania mogą być wykorzystane do ustalenia ST50 dla grup indywidualnie badanych much i do pomiaru odsetka much, które spełniają dane kryterium (np. utrata kontroli nad postawą) w dowolnym momencie. Należy zauważyć, że takie analizy wideo wymagałyby dodatkowego czasu.
W przeciwieństwie do obecnych testów inebriometrycznych, opisana przez nas metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi do konfiguracji i może być wykonana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów. Stosując tę metodę, uzyskaliśmy wiarygodne i spójne czasy sedacji dla poszczególnych much. Test można w zasadzie rozszerzyć w celu oceny skutków narażenia na dowolną substancję lotną. Test może być również stosowany do pomiaru wpływu ostrej toksyczności substancji lotnych na inne owady, w tym inne gatunki much. Indywidualne dane dotyczące czasu sedacji można wykorzystać do oceny zakresu zmienności fenotypowej w populacji, takich jak DGRP.
Użyliśmy małej siatki przeciw owadom, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi z roztworem etanolu, jednocześnie umożliwiając dotarcie odpowiedniej ilości oparów etanolu do muchy. Warstwa białej gazy na wierzchu siatki ekranu zapewnia wizualny kontrast między muchą a powierzchnią poniżej i zapewnia, że muchy nie zostaną złapane w siatkę ekranu, co może prowadzić do niejednoznacznego określenia utraty kontroli postawy. Dostępne na rynku membrany, które są porowate dla wody i powietrza, dawały niespójne wyniki i były niewystarczająco przepuszczalne dla oparów etanolu. Celowo użyliśmy małej siatki przeciw owadom, ponieważ jest to jednolicie porowaty materiał, który minimalizuje zmiany w ekspozycji na etanol w wyniku pozycji muchy w studni. Modyfikacje tego protokołu mogą być wprowadzane w oparciu o dostępne materiały, chociaż zalecamy kontrolowaną komorę behawioralną, dostęp do 90%-100% etanolu w pobliżu muchy i równomierną ekspozycję na etanol.
Pozycja muchy na płytkach hodowli komórkowych powinna być losowo dobierana między powtórzeniami, aby uniknąć błędu pozycyjnego. W przypadku większych eksperymentów, które wymagają użycia tego testu przez wiele dni i w związku z tym podlegają zmianom środowiskowym, które mogą mieć wpływ na wyniki testu (np. zmiany ciśnienia atmosferycznego)27, zdecydowanie zalecamy, aby muchy były testowane o tej samej porze każdego dnia i randomizowane zarówno w ciągu dni, jak i między dniami, zwłaszcza jeśli różne linie i/lub płcie mają być porównywane ze sobą.
Opracowana przez nas metoda najlepiej nadaje się do pomiaru wpływu ostrej ekspozycji na alkohol, ale nie nadaje się do uzyskiwania danych dotyczących konsumpcji lub modelowania uzależnienia. Dane dotyczące wrażliwości na sedację alkoholową uzyskane z tego testu można jednak zintegrować z innymi pomiarami fenotypów związanych z alkoholem. Jednym z ograniczeń systemu jest to, że pionowa wysokość standardowych płytek do hodowli komórkowych pozwala na pionowy ruch much, którego nie można łatwo śledzić za pomocą wideo w celu szczegółowej oceny ogólnej aktywności lub lokomocji. Ograniczenie to nie ma jednak wpływu na dokładną ocenę czasu sedacji. W przypadku wykorzystania much o różnych genotypach (np. w populacjach niekrewniaczych pochodzących z DGRP28), test ten umożliwia również pobranie pojedynczych much w celu zebrania pul much o kontrastujących fenotypach do masowego sekwencjonowania DNA i ekstremalnego mapowania QTL 29,30. Ogólnie rzecz biorąc, test ten pozwala na szybkie i niedrogie zbieranie danych dotyczących sedacji alkoholowej na dużej liczbie pojedynczych much.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty DA041613 i GM128974 z National Institutes of Health dla TFCM i RRHA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych | Corning | 3526 | Płaskodenne; będzie domem dla much w całym teście |
| Aspirator | |||
| Gaza | Genesee Scientific | 53-100 | Powszechnie dostępne. |
| Etanol | Decon Labs | V1001 | Szeroko dostępny. |
| Elastyczna plastikowa deska do krojenia (pokrywa talerza) | Walmart | 550098612 | Każdy płaski plastik, który można łatwo przesunąć i całkowicie zakryć 24-dołkową płytkę. Dobrze sprawdza się elastyczna plastikowa deska do krojenia. |
| Gaza (do aspiratora) | Honeywell North | 67622 | Powszechnie dostępna. |
| Podkładka oświetleniowa | Amazon (AGPtek) | ASIN B00YA9GP0G | Odpowiednia jest każda podkładka świetlna zapewniająca kontrast. |
| Pałeczki Jumbo Craft Michaels | 10334892 | Odpowiedni jest każdy kij rzemieślniczy o długości co najmniej 7 cm. | |
| Końcówka do pipety P1000 (do aspiratora) | Genesee Scientific | 24-165RL | Każda końcówka do pipety P1000 jest odpowiednia. |
| Pipeta serologiczna (do aspiratora) | Genesee Scientific | 12-104 | |
| Mała siatka przeciw owadom | Lowe's (Saint-Gobain ADFORS) | 89322 | Każda mała siatka przeciw owadom jest odpowiednia. |
| Komora | Wymiar przestrzeni wewnętrznej wystarczająco duży, aby objąć podkładkę świetlną. Może być wykonany z pudełka styropianowego. | ||
| Rurka Tygon (do aspiratora) | Grainger | 9CUG7 | Szeroko dostępna. |
| Kamera wideo | Canon | 1959C001AA | Każda kamera wideo jest odpowiednia. |
Bibliografia
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders. Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).
- Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men. Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).
- Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. Genetics and genomics of alcohol sensitivity. Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).
- Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster. Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).
- Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'. Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7(2019).
- Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).
- Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).
- Morozova, T. V., et al. A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development. G3. 8 (8), Bethesda, Md. 2643-2653 (2018).
- Morozova, T. V., et al. Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila. BMC Genomics. 16, 865(2015).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
- Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).
- Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 7 (10), 95(2006).
- Weber, K. E. An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents. Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).
- Weber, K. E., Diggins, L. T. Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes. Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).
- Cohan, F. M., Graf, J. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).
- Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster. Genome Biology. 8 (10), 231(2007).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics. Genetics. 83, 733-745 (2009).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).
- Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (98), e52676(2015).
- Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines. Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).
- Pohl, J. B., et al. Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).
- Huang, W., et al. Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).
- Ehrenreich, I. M., et al. Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants. Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).
- Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans. Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).
Przedruki i uprawnienia
