Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Protoplazmatyczne astrocyty (PrA) znajdujące się w korze mózgowej myszy są ściśle ze sobą zestawione, tworząc pozornie ciągłą trójwymiarową matrycę w dorosłym stadium. Jak dotąd, żadna strategia barwienia immunologicznego nie jest w stanie ich wyodrębnić i posegmentować ich morfologii u dojrzałych zwierząt i w trakcie kortykogenezy. Korowe PrA pochodzą od komórek progenitorowych zlokalizowanych w paliusiu grzbietowym i mogą być łatwo celowane za pomocą elektroporacji in utero wektorów integracyjnych. Przedstawiono tutaj protokół znakowania tych komórek za pomocą strategii wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC), która opiera się na transpozycji piggyBac/Tol2 i rekombinacji Cre/lox w celu stochastycznej ekspresji odrębnych białek fluorescencyjnych (niebieskich, cyjan, żółtych i czerwonych) skierowanych do określonych przedziałów subkomórkowych. Ta wielobarwna strategia mapowania losu umożliwia oznaczanie in situ pobliskich przodków kory mózgowej za pomocą kombinacji markerów kolorów przed rozpoczęciem glejogenezy i śledzenie ich potomstwa, w tym astrocytów, od etapów embrionalnych do dorosłych na poziomie poszczególnych komórek. Znakowanie półrzadkie osiągnięte poprzez dostosowanie stężenia wektorów elektroporowanych i kontrastów kolorów zapewnianych przez Multiadresowalne Markery Kolorów Integrujące Genom (MAGIC Markers lub MM) umożliwiają indywidualizację astrocytów i wyodrębnienie ich terytorium i złożonej morfologii pomimo ich gęstego układu anatomicznego. Przedstawiono kompleksowy przebieg eksperymentu, w tym szczegóły procedury elektroporacji, wielokanałową akwizycję stosów obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz wspomaganą komputerowo trójwymiarową segmentację, która umożliwi eksperymentatorowi ocenę indywidualnej objętości i morfologii PrA. Podsumowując, elektroporacja markerów MAGIC Markers to wygodna metoda indywidualnego znakowania wielu astrocytów i uzyskiwania dostępu do ich cech anatomicznych na różnych etapach rozwoju. Technika ta będzie przydatna do analizy właściwości morfologicznych astrocytów korowych w różnych modelach myszy bez uciekania się do skomplikowanych krzyżówek z transgenicznymi liniami reporterowymi.
Wprowadzenie
Astrocyty odgrywają wiele ważnych funkcji w rozwoju mózgu i fizjologii1. Oprócz swojej roli w barierze krew-mózg, gdzie regulują pobieranie składników odżywczych i przepływ krwi, aktywnie przyczyniają się do tworzenia i funkcjonowania synaps, wytwarzając jednocześnie neuromodulatory, które mogą zmieniać aktywność i zachowanie neuronów2. Ponadto dysfunkcja astrocytów przyczynia się do różnych zaburzeń neurologicznych3. Astrocyty zlokalizowane w korze mózgowej wykazują skomplikowaną morfologię, umożliwiającą rozległy kontakt z procesami neuronalnymi. Kontakty te, niezbędne do funkcjonowania obwodów, kontrolują również morfogenezę i synaptogenezę astrocytów poprzez białka adhezyjne komórek4. Neurobiolodzy potrzebują wygodnych i solidnych narzędzi do badania rozwoju i morfogenezy astrocytów w interesujących ich modelach neurologicznych. Jednak ze względu na bliskie przyporządkowanie astrocytów do ich sąsiadów i ich jednolite trójwymiarowe kafelkowanie, trudno jest wyodrębnić astrocyty korowe i kompleksowo ocenić ich morfologię za pomocą immunomarkerów.
Obecnie, dwie główne strategie inżynierii genetycznej umożliwiają znakowanie i indywidualizację astrocytów korowych in situ: rzadka aktywacja reporterowa w transgenicznych liniach myszy lub transgeneza somatyczna za pomocą elektroporacji plazmidów reporterowych. Pierwsza strategia opiera się na hodowli linii myszy reporterowej z myszami wykazującymi ekspresję indukowalnej formy rekombinazy Cre aktywowanej specyficznie w astrocytach po dostarczeniu tamoksyfenu (np. Aldh1l1-CreERT25). Z tą strategią wiąże się kilka wad. Po pierwsze, hodowla myszy transgenicznych wymaga dużej liczby zwierząt i zazwyczaj potrzebnych jest wiele testów w celu określenia właściwej dawki tamoksyfenu, aby zapewnić odpowiednio rzadkie znakowanie astrocytów korowych. Analiza fenotypów astrocytów korowych w genetycznym modelu myszy, który nas interesuje, będzie wymagała jeszcze większej hodowli i konsumpcji myszy. Ponadto wiadomo, że wstrzyknięcie tamoksyfenu in utero zakłóca poród, co utrudnia zastosowanie tej strategii do badania najwcześniejszych etapów rozwoju astrocytów. Elektroporacja DNA in vivo jest alternatywną strategią wolną od tamoksyfenu, która opiera się na minimalnej liczbie zwierząt6. Podejście to, wykonywane w stadium embrionalnym lub postnatalnym, polega na wstrzykiwaniu plazmidów reporterowych do bocznych komór gryzoni, a następnie impulsów elektrycznych, które tworzą pory w błonie komórkowej, umożliwiając w ten sposób DNA przedostanie się do komórek progenitorowych wyściełających komorę. Następnie transgeny reporterowe przenoszone przez elektroporowane plazmidy są przetwarzane przez docelową maszynerię komórkową i wyrażane 7. Dwie metody elektroporacji zostały wcześniej opisane w celu znakowania astrocytów korowych myszy: 1) Postnatal Astrocyte Labeling by Electroporation (PALE), który opiera się na elektroporacji 1-2 jednokolorowych episomalnych plazmidów reporterowych we wczesnych stadiach postnatalnych4; 2) Strategia StarTrack oparta na elektroporacji in utero (IUE) wielu jednokolorowych integracyjnych plazmidów reporterowych8,9,10. Chociaż te dwie techniki skutecznie oznaczają PrA w korze mózgowej, mają również pewne ograniczenia. W swojej początkowej wersji obie metody opierają się na promotorze kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) w celu stymulowania ekspresji w astrocytach, co może wpływać na znakowanie w kierunku promieniowego gleju, a także astrocytów pial i reaktywnych, które wyrażają GFAP silniej niż normalne spoczynkowe PrA11,12. Jeśli chodzi o PALE, inne wady to późny etap elektroporacji, który uniemożliwia znakowanie wcześnie urodzonych PrA (lub tych pochodzących z wczesnych rozwarstwiających się przodków) i analizę wczesnych etapów rozwoju astrogleju, a także stosowanie wektorów epizodycznych, które rozcieńczają się poprzez kolejne podziały podczas masowej proliferacji, której PrA ulega w pierwszym tygodniu po urodzeniu13, 14. W przeciwieństwie do PALE, StarTrack opiera się na embrionalnej elektroporacji integracyjnych plazmidów reporterowych, które umożliwiają śledzenie wkładu zarówno embrionalnych, jak i postnatalnych komórek progenitorowych w PrA. Zaktualizowany schemat StarTrack oparty na promotorze ubikwityny C (UbC-StarTrack) osiąga szerszą ekspresję reporterów fluorescencyjnych zarówno w neuronalnym, jak i glejowym zejściu (w tym astrocytach) progenitorów nerwowych15,16,17. Jednak w obecnej wersji implementacja tego podejścia jest złożona, ponieważ opiera się na równomolowej mieszaninie 12 odrębnych plazmidów wyrażających sześć białek fluorescencyjnych (FP) z częściowym wzbudzeniem i nakładaniem się widm emisyjnych.
Prezentowana tutaj jest prosta metoda wielokolorowego znakowania oparta na elektroporacji in utero, wykorzystująca integracyjne konstrukcje reporterowe napędzane przez silny i szeroko aktywny promotor w celu wyodrębnienia astrocytów korowych14. Ponadto dostępny jest łatwy potok analizy obrazu przy użyciu zarówno licencjonowanego (np. Imaris), jak i otwartego dostępu (Vaa3D18,19,20) oprogramowania do analizy obrazu, odpowiednio, do segmentacji objętości terytorialnej astrocytów i arboryzacji. W porównaniu z poprzednio opisanymi metodami, strategia ta opiera się wyłącznie na 1-2 wielokolorowych integracyjnych transgenach Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers lub MM21) skierowanych do cytoplazmatycznego i (opcjonalnie) jądrowego przedziału komórkowego, którego ekspresja jest sterowana przez syntetyczny promotor CAG składający się ze wzmacniacza wirusa cytomegalii, promotora β-aktyny kurczaka i akceptora akceptora splicingu królika β-globiny site22. Umożliwia to znakowanie i śledzenie astrocytów korowych, od stadium embrionalnego do późnego stadium posturodzeniowego, niezależnie od wyrażenia GFAP14,23. Każdy z tych transgenów ma następujące cztery odrębne FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP i tdTomato/mCherry, które wykazują minimalne nakładanie się widma, które można łatwo obejść za pomocą: 1) Sekwencyjnej akwizycji kanałów; 2) Zoptymalizowana moc wzbudzenia i wzmocnienie zbierania; oraz 3) Specjalne filtry dichroiczne do zbierania wąskich okien emisji FP. Strategia MM wykorzystuje rekombinację Cre/lox z samorozróżnioną rekombinazą Cre (seCre) w celu stymulowania stochastycznej ekspresji FP w populacji komórkowej. Pojedyncza kopia transgenu MM wyraża FP w sposób wzajemnie się wykluczający, podczas gdy wiele transgenów daje początek kombinacjom FP, tworząc dziesiątki odrębnych odcieni. Integracja genomowa transgenów jest napędzana przez system transpozycji piggyBac (PB) lub Tol224,25,26. W związku z tym, dzięki elektroporacji in utero, zestaw narzędzi MM i generowana przez niego wielokolorowa "mozaika" umożliwiają jednoczesne oznaczanie wielu sąsiadujących ze sobą komórek progenitorowych kory mózgowej i śledzenie ich glejowego zejścia, w tym astrocytów korowych, przez długi czas. Kontrasty kolorystyczne wynikające z ekspresji wyraźnego FP pozwalają na wyznaczenie konturu PrA, a następnie wydobycie kluczowych informacji o ich objętości terytorialnej (za pomocą IMARIS) i złożonej morfologii (za pomocą Vaa3D). Szczegółowo przedstawiona tutaj strategia wielokolorowa jest wygodną i solidną metodą, która zapewnia szybki i łatwy dostęp do powierzchni i morfologii astrocytów korowych u myszy typu dzikiego na różnych etapach rozwoju i jest łatwa do dostosowania do badania cech anatomicznych astrocytów w mysich modelach chorób neurologicznych bez użycia transgenicznych linii reporterowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Radę Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach im. Karola Darwina (CEEACD/N°5).
1. Przygotowanie plazmidów wolnych od endotoksyn dla MAGICZNYCH markerów w elektroporacji macicy
- Transformacja bakteryjna
- Na lodzie rozmrozić kompetentne komórki DH5 alfa przechowywane w temperaturze -70 °C.
- Rozgrzać płytki agarowe zawierające odpowiedni antybiotyk (100 μg/ml ampicyliny lub 50 μg/ml kanamycyny) w temperaturze 37 °C.
- Dodać 1 μl 5-50 ng plazmidowego DNA MAGIC Markers do 10 μl rozmrożonych komórek kompetentnych do DH5 alfa i inkubować na lodzie przez 10 minut bez mieszania.
- W celu przemiany szoku cieplnego należy umieścić podwielokrotność w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 45 s, a następnie natychmiast umieścić na lodzie i odczekać 3–5 minut.
- W sterylnych warunkach dodać 230 μl pożywki SOC i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Rozprowadzić zawartość podwielokrotności na płytce agarowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Hodowla plazmidów
- Następnego ranka, w sterylnych warunkach, podnieś kolonię z płytki agarowej i umieść ją w probówce o pojemności 14 ml zawierającej 2 ml pożywki LB z odpowiednim antybiotykiem. Pozostawić do inkubacji przez cały dzień w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obr./min.
- Na koniec dnia wysiać 300 ml LB z antybiotykiem, używając 2 ml kultury starterowej z kroku 1.2.1 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obr./min.
- Przygotowanie plazmidowego DNA
- Następnego ranka przystąp do oczyszczania plazmidowego DNA MAGIC Markers (tj. PB-CAG-Cytbow i Tol2-CAG-Nucbow, a także plazmidów sterowanych przez CAG z ekspresją transpozaz PB i Tol2 oraz rekombinazy Cre) przy użyciu zestawu maxiprep wolnego od endotoksyn zgodnie z protokołem producenta.
- Wypłukać DNA w 200 μl sterylnej wody i oszacować jego stężenie za pomocą spektrofotometru przed przechowywaniem w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie do MAGIC Markers in utero electroporation (MM IUE)
- Przygotowanie roztworu
- Ogrzej 30 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej i utrzymuj go w cieple przez cały czas trwania zabiegu.
- Przygotować mieszaninę plazmidów zawierającą PB-CAG-Cytbow i Tol2-CAG-Nucbow (stężenie końcowe, 0,8 μg/μL każda), transpozazy PB i Tol2 (stężenie końcowe, 0,4 μg/μL każda), CAG-seCre (stężenie końcowe, 0,16 μg/μL) i 0,01% barwnika Fast Green w PBS bez Ca2+ i Mg2+,
UWAGA: Do celów rekonstrukcji anatomicznej astrocytów można pominąć konstrukt Tol2-CAG-Nucbow. Jednak ten plazmid jest przydatny do rozróżniania dubletów blisko siebie zestawionych astrocytów i podczas używania MAGICZNYCH Markerów do badania relacji klonalnych między astrocytami14. - Przygotować roztwór znieczulający zawierający 100 μl ketaminy (100 mg/ml) i 100 μl ksylazyny (20 mg/ml) rozcieńczony w 2 ml roztworu soli fizjologicznej.
- Przygotować roztwór przeciwbólowy, rozcieńczając 0,3 mg/ml roztworu podstawowego buprenorfiny w stosunku 1:10 w roztworze soli fizjologicznej.
- Przygotowanie materiału zabiegowego
- Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (patrz tabela materiałów) w wysokiej temperaturze w sterylizatorze ze szklanych kulek lub jego odpowiedniku.
- Umieść kroplę żelu elektrodowego w naczyniu o średnicy 35 mm.
- Włóż mikropipetę do uchwytu mikrowstrzykiwacza, złamij końcówkę mikropipety i zasysaj roztwór DNA.
- Umieść 1 μl kropli roztworu Fast Green (0,01%) w pokrywce naczynia o średnicy 3 cm i używając jej jako odniesienia, wyreguluj średnicę końcówki mikropipety, łamiąc jej końcówkę drobnymi kleszkami. Dostosuj parametr ciśnienia tak, aby krople o równoważnej wielkości były wytwarzane przez mikrowstrzykiwacz, umożliwiając w ten sposób dostarczenie około 1 μl roztworu DNA na wstrzyknięcie.
- Przygotowanie ciężarnej samicy myszy
- Zważ ciężarną mysz RjOrl:SWISS.
- Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe w ilości 12,5 μl na gram masy ciała (m.c.) roztworu znieczulającego. Poczekaj 5 minut i sprawdź, czy mysz śpi, ściskając jej palec u nogi.
- Gdy zwierzę przestanie reagować na szczypanie, wstrzyknij mu podskórnie 1,6 μl/g m.c. roztworu przeciwbólowego.
- Dodaj kroplę żelu do oczu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji i umieść brzuch zwierzęcia do góry na podkładce rozgrzewającej.
- Delikatnie ogol jego brzuch, oczyść go wacikiem nasączonym jodem i zdezynfekuj ogolony obszar wacikiem nasączonym alkoholem.
- Zorganizuj pole operacyjne, umieszczając sterylne kompresy wokół ogolonego, oczyszczonego i odkażonego obszaru.
3. Elektroporacja in utero (IUE)
- Iniekcja dokomorowa
- Wytnij pionowe nacięcie o długości 2 cm wzdłuż linii środkowej, zaczynając w dolnej części brzucha, przez skórę, a następnie przez mięsień znajdujący się poniżej. Odsłoń rogi macicy, delikatnie manipulując torebkami embrionalnymi i oceń położenie szyjki macicy oraz liczbę torebek embrionalnych po obu stronach szyjki macicy.
- Zorientuj mózg zarodka E15.5 do elektroporacji, aby zobaczyć bregmę, łatwo rozpoznawalną, ponieważ jej lokalizacja pasuje do połączenia trzech głównych naczyń krwionośnych, które biegną wzdłuż szczelin mózgowych.
- Wyobraźmy sobie wirtualną linię między bregmą (widoczną przez czaszkę) a okiem; wprowadzić mikropipetę między wirtualną linię a szczelinę podłużną, a następnie nacisnąć pedał nożny wstrzykiwacza, aby dostarczyć 1 μl roztworu DNA do bocznej komory docelowej półkuli.
UWAGA: Po wstrzyknięciu we właściwe miejsce, wypełniona komora boczna staje się niebieska, co wskazuje, że została wypełniona roztworem DNA.
- Elektroporacja
- Nałożyć elektrody (patrz Tabela Materiałów), uprzednio zanurzone w żelu elektrodowym, po obu stronach wstrzykiwanego zarodka z anodą pokrywającą wstrzykniętą półkulę. Naciśnij pedał nożny elektroporatora, aby dostarczyć serię czterech impulsów 50 ms o napięciu 35 V, z których każdy jest oddzielony odstępem 950 ms.
- Zwilżyć zarodek podgrzanym roztworem soli fizjologicznej.
UWAGA: Zarodki powinny być utrzymywane w wilgoci przy użyciu podgrzanego roztworu soli fizjologicznej podczas całej operacji chirurgicznej, a macica nie powinna wysychać. - Powtórzyć kroki 3.1.2–3.2.2 dla każdego zarodka.
- Po elektroporacji wszystkich docelowych zarodków wymień rogi macicy w jamie brzusznej, delikatnie popychając je kleszczami z powrotem do ich pierwotnej pozycji. Wypełnij jamę brzuszną podgrzanym roztworem soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu macicy podczas zakładania szwów.
- Najpierw zamknij mięsień brzuszny ciągłym wchłanialnym szwem, a następnie skórę wieloma pojedynczymi szwami (~10) za pomocą szwu 4-0.
- Umieść zwierzę w czystej klatce, leżąc na boku na czystym ręczniku papierowym i obracaj zwierzę na drugą stronę co 5-10 minut, aż się obudzi i zacznie się samodzielnie poruszać.
- Oceń stan zwierzęcia następnego dnia, zwłaszcza jeśli zostało założone gniazdo.
UWAGA: Nie jest wymagane leczenie pooperacyjne. W przypadku braku gniazda, jakichkolwiek oznak bólu (np. pokłonu, kudłatego futra) i/lub obfitego krwawienia, zwierzę powinno zostać niezwłocznie poddane eutanazji.
4. Pobieranie i cięcie tkanek
- Pobieranie tkanek
- Wstrzyknąć fenobarbital (100 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo w celu znieczulenia końcowego w żądanym czasie zbioru. W tym przypadku czas zbiorów przypadł na dni pourodzeniowe (P) P4, P7 i P21.
- Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową przy użyciu zimnego, wstępnie przygotowanego roztworu na bazie paraformaldehydu.
- Wypreparować mózg i umieścić go na noc w temperaturze 4 °C w roztworze na bazie paraformaldehydu w celu późniejszego utrwalenia.
- histologia
- Następnego ranka płucz mózg 3x przez 10 minut za pomocą 1x PBS.
- Osadź mózg w 3% agarozie rozpuszczonej w 1x PBS.
- Ciąć odcinki o grubości 80 μm za pomocą mikrotomu z ostrzem wibracyjnym.
- Zebrać skrawki na 24-dołkowej płytce wstępnie wypełnionej 1x PBS.
- Zamontuj sekcje w medium montażowym (patrz Tabela materiałów) między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym. Utrzymuj zamontowane szkiełka w temperaturze -20 °C, aby zapewnić optymalną konserwację białek fluorescencyjnych i długotrwałe przechowywanie.
5. Wielokanałowe obrazowanie konfokalne
- Ustawienia mikroskopu
- Skonfiguruj mikroskop konfokalny, aby oddzielnie wzbudzić mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry za pomocą linii laserowych odpowiednio 440, 515 i 559 nm.
- Użyj obiektywu 20x 0,8 NA (lub wyższego NA) i dostosuj próbkowanie XY oraz rozmiar kroku Z zgodnie z kryteriami Nyquista.
UWAGA: Obrazy uzyskane z wyższą rozdzielczością (np. obiektyw olejowy 60x 1,4 NA) i algorytmami dekonwolucji umożliwią rekonstrukcję drobniejszych szczegółów altan astrocytów. Eksperymentator powinien jednak pamiętać, że najdrobniejsze procesy astrocytów mogą nie zostać rozwiązane przez konwencjonalne obrazowanie optyczne.
- Akwizycja obrazu
- Znajdź najjaśniejsze astrocyty w obszarze poddanym elektroporacji.
- Ponieważ oznaczone komórki znajdujące się blisko powierzchni mogą wydawać się jaśniejsze niż te znajdujące się głębiej w przekroju, dostosuj ustawienia akwizycji w komórkach powierzchni, aby uniknąć nasycenia obrazów.
- Dostosuj ustawienia akwizycji osobno dla każdego z trzech kanałów, upewniając się, że unikasz nasycenia pikseli za pomocą HiLo LUT, który wyświetla wartości zerowe jako niebieskie, a maksymalne wartości pikseli jako czerwone.
UWAGA: Odpowiednio zrównoważony obraz powinien wyświetlać tylko kilka niebieskich i prawie żadnych czerwonych pikseli. - Uzyskaj kafelkowe stosy Z o wymiarach 1,024 x 1,024 pikseli za pomocą zmotoryzowanego stolika mikroskopu, z 10% zachodzeniem na siebie sąsiednich stosów, aby następnie umożliwić mozaikową rekonstrukcję elektroporowanego obszaru lub strefy zainteresowania.
6. Segmentacja objętości terytorialnej astrocytów
UWAGA: To jest wykonywane za pomocą komercyjnego programu (np. IMARIS).
- Przygotowanie zbioru danych
- Przytnij oznakowane astrocyty w ramach rekonstrukcji 3D (250 x 250 pikseli), wybierając komórki całkowicie zamknięte w obrazowanej sekcji tkanki.
UWAGA: Możliwa jest również bezpośrednia praca na większych woluminach, jeśli używany komputer może je obsłużyć. - Kliknij przycisk Niebieska powierzchnia na pasku narzędzi Obiekt w widoku Surpass, aby utworzyć nową powierzchnię dla każdego astrocytu.
- Aby uzyskać lepszy kontrast wizualizacji, najpierw dostosuj minimalne i maksymalne wartości kontrastu kolorów, klikając Edytuj | Pokaż opcję dopasowania wyświetlacza i przeciągając oba uchwyty. W razie potrzeby zmień kolor kanału, klikając bezpośrednio na nazwę kanału w oknie Display Adjustment (Korekta wyświetlania), aby wybrać nowy kolor.
UWAGA: Preferencyjnie zawsze pracuj z tym samym kolorowym wyświetlaczem, aby zapobiec stronniczości wizualnej. - Kliknij Edytuj | Właściwości obrazu, aby ręcznie wskazać rozmiar woksela w mikrometrach. Jeśli rozmiar woksela nie jest dokładny, obliczenia głośności będą nieprawidłowe.
- Zapisz nowe ustawienia.
- Przytnij oznakowane astrocyty w ramach rekonstrukcji 3D (250 x 250 pikseli), wybierając komórki całkowicie zamknięte w obrazowanej sekcji tkanki.
- Segmentacja powierzchni
- Użyj niebieskiej ikony, aby wprowadzić powierzchnię. Ikona i pole Powierzchnia pojawią się na liście Scena. Pole Wolumin pozwala zobaczyć/ukryć zestaw danych.
- Wybierz linię powierzchni i kliknij Pomiń automatyczne tworzenie | Edytuj ręcznie.
- Kliknij Kontur | Widoczność i kliknij opcję Brak. Następnie przejdź do widoku Wybierz i kliknij przycisk Rysuj.
- Kliknij Tryb, aby wybrać tryb rysowania.
- Skorzystaj z szybkiego i wydajnego półautomatycznego narzędzia do rysowania Isoline. Zdefiniuj kontur komórki, przesuwając po niej wskaźnik myszy. Jeśli podgląd izolicznej nie pasuje do konturu astrocytów, dostosuj pozycję wskaźnika myszy. Aby sprawdzić poprawność podglądu, kliknij zaznaczenie lewym przyciskiem myszy. Aby poprawić potencjalne błędy, użyj okna Tablica, aby usunąć bieżący kontur płaszczyzny Z lub naciśnij Ctrl + Z.
- Korzystanie z plasterka | Pozycja, aby poruszać się po płaszczyznach Z, przejdź do następnej płaszczyzny, zmieniając numer płaszczyzny Z i rozpocznij nowy kontur. Preferencyjnie zacznij od środka komórki, a następnie przejdź do kończyn.
- Po narysowaniu konturów we wszystkich płaszczyznach Z zawierających astrocyt kliknij przycisk Utwórz powierzchnię. Przed utworzeniem powierzchni sprawdź, czy wszystkie komponenty są połączone. Jeśli nie, wybierz największe lub połącz odpowiednie przed wyeksportowaniem danych woluminu.
- Sprawdź dane ilościowe wyświetlane w Panelu danych i eksportuj statystyki w formacie arkusza kalkulacyjnego, zapisując wartość wolumenu i jednostkę.
- Zapisz powierzchnię pod nową nazwą, aby uzyskać do niej dostęp później.
7. Śledzenie arboryzacji astrocytów
UWAGA: Odbywa się to za pomocą otwartego oprogramowania Vaa3D.
- Przygotowanie zbioru danych
- Załaduj stos obrazów i wyszukaj izolowane astrocyty lub pobliskie astrocyty wyświetlające różne kolory.
UWAGA: Rozdzielczość rekonstrukcji można poprawić, zwiększając cel NA i próbkowanie. Ostatecznie jednak, ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopii konfokalnej, nie można dokładnie prześledzić najdrobniejszych procesów astrocytów. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernej segmentacji poza rozdzielczość uzyskanych obrazów. - Korzystając z Fidżi, przytnij obraz o wymiarach 250 x 250 pikseli wokół każdego astrocytu.
- Ponieważ śledzenie Vaa3D jest wykonywane tylko na jednym kolorze, wybierz jeden kanał i dezaktywuj pozostałe kanały.
- Przekonwertuj obraz na RGB i zapisz go w .tiff formacie.
- Załaduj stos obrazów i wyszukaj izolowane astrocyty lub pobliskie astrocyty wyświetlające różne kolory.
- Śledzenie trzpienia
- Otwórz obraz RGB w Vaa3D. Przejdź do obrazu | Dane | Geometria, a następnie ponowne próbkowanie obrazu i dostosowanie wartości rozmiaru woksela X/Y i Z.
UWAGA: Podczas rekonstrukcji altan astrocytów należy uważać, aby nie śledzić szczegółów drobniejszych niż rozdzielczość zapewniana przez obrazy. - Otwórz okno 3D, klikając Visualize | Przeglądarka 3D dla całego obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie 3D i wybierz 1 kliknięcie prawym przyciskiem myszy, aby zdefiniować znacznik. Wskaż kursorem środek astrocytu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby ustawić znacznik.
UWAGA: Kliknij Escape, aby ponownie uzyskać dostęp do widoku 3D. - Przejdź do Zaawansowane | Śledzenie 3D | Vaa3D-Neuron2-automatyczne śledzenie.
- W nowo otwartym oknie wybierz kanał, na którym chcesz zastosować wtyczkę.
- Wybierz próg tła (często od 30 do 90). W razie potrzeby dostosuj tę wartość dla każdego astrocytu.
- Usuń zaznaczenie opcji Promień od 2D i pozostaw zaznaczone opcje Automatycznie zmniejszaj próbkę i Automatyczne ponowne próbkowanie.
- Ustaw cnn_type na 3, length_thresh na 1, a SR_ratio na 0,1.
- Po kliknięciu ok upewnij się, że wtyczka automatycznie generuje dwa pliki na podstawie oryginalnej nazwy. Zostaną dodane sufiksy –ini.swc i -coordinateX–współrzędnaY-współrzędnaZ-app2.swc. Ręcznie dodaj wyróżniającą etykietę do tych plików nazw, aby nie nadpisywać ich podczas dalszego uruchamiania wtyczki.
- Otwórz Menedżera obiektów, przejdź do Neuron | Struktura linii, wybierz śledzony astrocyt, kliknij Tryb wyświetlania i wybierz Zawsze tryb linii.
- Wróć do okna 3D, w którym pojawia się szkielet astrocytu.
UWAGA: Jeśli segmentacja i sygnał nie są zgodne, powtórz kroki 7.2.3–7.2.10 i dostosuj próg, aż się spełnią. Upewnij się, że ponownie wprowadziłeś inne parametry, ponieważ są one resetowane po ponownym uruchomieniu wtyczki. - Kliknij prawym przyciskiem myszy na szkielet i wybierz pierwszy wybór neuron | linia#1...APP2_Tracing, aby uzyskać dostęp do pomiarów ilościowych, które pojawią się w nowym oknie Surface| Adnotacja obiektu.
UWAGA: Ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopii świetlnej, pomiary wyświetlane w wymienionych pozycjach Liczba rozgałęzień i Liczba rozwidleń dostarczają jedynie przybliżonego oszacowania złożoności trzpieni astrocytów.
- Otwórz obraz RGB w Vaa3D. Przejdź do obrazu | Dane | Geometria, a następnie ponowne próbkowanie obrazu i dostosowanie wartości rozmiaru woksela X/Y i Z.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Elektroporacja markerów MAGIC w embrionalnych progenitorach korowych umożliwia znakowanie astrocytów od wczesnych do późnych etapów rozwoju kory mózgu (Rysunek 1). Stwierdzono obecność tych astrocytów we wszystkich warstwach kory na różnych etapach postnatalnych (P4, P7, P21), ponieważ uległy one szerokiej dyspersji w całej korze mózgu. Zostały one ocenione za pomocą mozaikowych obrazów konfokalnych nabytych przy użyciu obiektywu 20x 0,8 NA (lub o wyższej aperturze NA) i zmontowanych w formi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Elektroporacja in utero (IUE) markerów MAGIC w przodkach kory (ryc. 1) umożliwiła znakowanie astrocytów w całej postnatalnej korze mózgowej na różnych etapach postnatalnych (P4-P7-P21, ryc. 2). Co ciekawe, stadium IUE nie jest krytyczne, ponieważ elektroporacja wykonana od E13.5 do E15.5 daje podobne wzorce znakowania dotyczące astrocytów korowych14. Jednak lokalizacja znakowanych neuronów piramidowych w miąższu kory mózgowej zmienia się ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy S. Fouquetowi oraz ośrodkom obrazowania i badań zwierzęcych Institut de la Vision i Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI i RAM) za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez stypendia z Région Ile-de-France i Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer dla S.C. oraz z Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) dla Los Angeles, dzięki finansowaniu przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-SG 336331, PI J. Valette) dla E.H., przez Agence Nationale de la Recherche na podstawie umów ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging), przez Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) oraz przez program ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1.1 Transformacja bakterii | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alfa kompetentne komórki | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Pojemnik na lód | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterylna szalka Petriego - 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Łaźnia wodna | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Hodowla plazmidów | |||
| 14 ml probówka hodowlana | Dutscher | 187262 | |
| Szkło erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Preparat plazmidowego DNA | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Przygotowanie roztworów | |||
| 26 G x 1/2 igły | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 igły | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Jednorazowa strzykawka polipropylenowa, 1 ml | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Przygotowanie zabiegu Materiał | |||
| Adson Kleszcze - DeBakey Pattern- 12,5 cm | FST | 11617-12 | |
| Kleszcze łukowe - 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Sterylizator do kulek szklanych Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Mikropipeta szklana 1 mm średnica | FHC | 10-10-L | |
| Kleszcze Graefe - Tytan 1 mm Końcówki Lekka Krzywizna - 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Kleszcze Graefe - Tytan 1 mm Końcówki proste - 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Nożyczki do tęczówki - Delikatne proste - 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Taśma laboratoryjna | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Mikrowtryskiwacz | INJECT+MATIC | Brak numeru katalogowego | |
| Olsen-Hegar Uchwyt igły - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Światłowód | VWR | 631-1806 | |
| Biały papier powlekany tworzywem sztucznym | Nieprzycięte | 700103 | |
| Żel elektrody Signagel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterylna szalka Petriego - 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterylizator, szklana sucha kulka, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Przygotowanie ciężarnej samicy myszy | |||
| Alcohol Pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0,3 mg/ml | |
| Kompres | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Żel do oczu | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS myszy | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% roztwór | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Podkładka rozgrzewająca | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Ksylazyna | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Elektroporacja | |||
| Szew wchłanialny Rozmiar 4-0 45 cm Szew 1-igłowy 19 mm Długość 3/8 koła Odwrócony | Novosyn | C0068220 | |
| Elektroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterylne pipety transferowe (pakowane pojedynczo) | Dutscher | 043202S | |
| Pęseta z platynowymi elektrodami krążkowymi 3 mm | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Pobieranie i cięcie tkanek | |||
| 24-dołkowa płytka | Falcon | 353047 | |
| Agaroza | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Szkiełko nakrywkowe | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), bez wapnia, bez magnezu | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Lakier do paznokci | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Wielokanałowe obrazowanie konfokalne | |||
| 20X olej NA 0,85 | Konfokalny | ||
| Zeiss | LSM880 | ||
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0,8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Segmentacja objętości terytorialnej astrocytów | |||
| IMARIS 8.3 i nowsze wersje | Bitplane | ||
| 7. Pakiet oprogramowania do analizy wspomaganej wizualizacją i wizualizacją | |||
| 3D (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus / Allen Institute for Brain Science |
Bibliografia
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
- García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
- Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039(2013).
- Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
- Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697(2017).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896(2016).
- Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87(2015).
- Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
- Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
- Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342(2014).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662(2019).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
- Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163(2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
