Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61113

⸱

13 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami mogą otworzyć barierę krew-mózg punktowo i przejściowo. Technika ta została wykorzystana do dostarczania szerokiej gamy środków przez barierę krew-mózg. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół miejscowego dostarczania do mózgu gryzonia z lub bez wskazówek MRI.

Streszczenie

Chirurgia stereotaktyczna jest złotym standardem w dostarczaniu leków i genów do mózgu gryzoni. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z dostarczaniem ogólnoustrojowym, w tym precyzyjną lokalizację w docelowym regionie mózgu i redukcję skutków ubocznych poza celem. Jednak chirurgia stereotaktyczna jest wysoce inwazyjna, co ogranicza jej skuteczność translacyjną, wymaga długiego czasu rekonwalescencji i stanowi wyzwanie w przypadku celowania w wiele obszarów mózgu. Skoncentrowane ultradźwięki (FUS) mogą być stosowane w połączeniu z krążącymi mikropęcherzykami w celu przejściowego otwarcia bariery krew-mózg (BBB) w obszarach o wielkości milimetra. Pozwala to na wewnątrzczaszkową lokalizację czynników dostarczanych ogólnoustrojowo, które normalnie nie mogą przekroczyć bariery krew-mózg. Technika ta stanowi nieinwazyjną alternatywę dla chirurgii stereotaktycznej. Jednak do tej pory technika ta nie została jeszcze powszechnie przyjęta w laboratoriach neurobiologicznych ze względu na ograniczony dostęp do sprzętu i ustandaryzowanych metod. Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie laboratoryjnego podejścia do otwierania FUS BBB (BBBO), które jest przystępne cenowo i powtarzalne, a zatem może być łatwo przyjęte przez każde laboratorium.

Wprowadzenie

Pomimo wielu odkryć w dziedzinie neurobiologii, liczba pojawiających się metod leczenia zaburzeń neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych pozostaje stosunkowo ograniczona1,2. Głębsze zrozumienie genów, molekuł i obwodów komórkowych zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne zasugerowało, że obiecujące terapie są niemożliwe do zrealizowania u ludzi przy użyciu obecnych technik3. Skuteczne metody leczenia są często ograniczone ze względu na konieczność penetracji mózgu i specyficzne dla danego miejsca4,5,6,7,8. Jednak istniejące metody miejscowego dostarczania leku do określonych obszarów mózgu (np. dostarczanie za pomocą iniekcji lub kaniuli) są inwazyjne i wymagają wykonania otworu w skull9. Inwazyjność tej operacji zapobiega rutynowemu stosowaniu miejscowego dostarczania do ludzkiego mózgu. Dodatkowo, uszkodzenie tkanek i wynikające z nich reakcje zapalne są wszechobecnymi zakłóceniami w badaniach podstawowych i przedklinicznych, które opierają się na iniekcji domózgowej10. Zdolność do nieinwazyjnego dostarczania środków przez barierę krew-mózg (BBB) i kierowania ich do określonych regionów mózgu może mieć ogromny wpływ na leczenie zaburzeń neurologicznych, zapewniając jednocześnie potężne narzędzie badawcze do badań przedklinicznych.

Jedną z metod ukierunkowanego transportu przez BBB przy minimalnym uszkodzeniu tkanek jest przezczaszkowe skoncentrowane ultradźwięki (FUS) wraz z mikropęcherzykami w celu ogniskowego i przejściowego otwarcia BBB11,12,13,14,15,16. Otwarcie FUS BBB zyskało ostatnio uwagę w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, udaru mózgu i glejaka poprzez lokalizację środków terapeutycznych w docelowych regionach mózgu, takich jak czynniki neurotroficzne17,18,19, terapie genowe20,21,22, przeciwciała23, neuroprzekaźniki24, oraz nanocząstki25,26,27,28,29. Dzięki szerokiemu zakresowi zastosowań i nieinwazyjnemu charakterowi30,31, otwarcie FUS BBB jest idealną alternatywą dla rutynowych stereotaktycznych iniekcji wewnątrzczaszkowych. Ponadto, ze względu na jej obecne zastosowanie u ludzi30,32, badania przedkliniczne z wykorzystaniem tej techniki można uznać za wysoce translacyjne. Jednak otwieranie FUS BBB nie jest jeszcze powszechnie uznaną techniką w naukach podstawowych i badaniach przedklinicznych ze względu na brak dostępności. W związku z tym przedstawiamy szczegółowy protokół podejścia laboratoryjnego do otwierania FUS BBB jako punkt wyjścia dla laboratoriów zainteresowanych ustaleniem tej techniki.

Te badania zostały przeprowadzone za pomocą przetwornika ultradźwiękowego FUS o dużej mocy, wspomaganego powietrzem, lub ultradźwiękowego przetwornika zanurzeniowego o niskiej mocy, tłumionego. Przetworniki były napędzane przez wzmacniacz mocy RF przeznaczony do obciążeń biernych oraz standardowy laboratoryjny generator funkcyjny. Szczegóły dotyczące tych elementów można znaleźć w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Konfiguracja sprzętu do jazdy za pomocą ultradźwięków

  1. Użyj koncentrycznych BNC 50 Ohm, aby podłączyć (1) wejście przetwornika ultradźwiękowego do wyjścia wzmacniacza RF i (2) wejście wzmacniacza RF do wyjścia generatora funkcyjnego.
  2. Ustaw tryb generatora funkcyjnego na sinusoidę raz na sekundę z 1% cyklem pracy.
    1. W przypadku tłumionego przetwornika zanurzeniowego małej mocy 1 MHz o ogniskowej 0.8 cala używanego ze wzmacniaczem RF 50 dB, ustaw ustawienia początkowe na: fala sinusoidalna 1 MHz, 1 V szczyt do szczytu, cykl 10 k, interwał (lub okres) 1 s.
    2. W przypadku przetwornika o dużej mocy 1,1 MHz z napędem powietrznym ustaw ustawienia początkowe na: fala sinusoidalna 1,1 MHz, 50 mV od szczytu do szczytu, 11 tys. cykli, interwał 1 s.
      UWAGA: Nie używaj przetworników, jeśli nie są zanurzone. Nie umieszczaj dłoni ani innej części ciała w ognisku ultrasonograficznym ani nie dotykaj powierzchni głowicy podczas jej pracy.

2. Konfiguracja stacjonarna z fokusem ultradźwiękowym

  1. Drukuj w 3D ramkę stereotaktyczną i uchwyt ramy stereotaktycznej.
  2. Podłącz przetwornik do pozycjonera XYZ za pomocą zacisku przytrzymującego rurkę PVC (Rysunek 1a). Przykręć zacisk do prowadnicy osi X i zablokuj nakrętką motylkową.
    1. Jeśli używasz przetwornika ultradźwiękowego o dużej mocy, przymocuj go do rury PVC za pomocą dopasowanej pary magnesów. Upewnij się, że jeden magnes ma otwór, a drugi pasujący występ. Zakryj dolną część rury PVC i przymocuj do niej jeden z magnesów za pomocą żywicy epoksydowej (patrz Rysunek 1b).
    2. Przymocuj drugi magnes do górnej środkowej części przetwornika ultradźwiękowego o dużej mocy za pomocą żywicy epoksydowej. Upewnij się, że znajduje się na samym środku przetwornika (Rysunek 1c).
  3. Jeśli używasz przetwornika ultradźwiękowego o dużej mocy, utwórz wskaźnik do zerowania pozycjonera XYZ. Końcówka tego wskaźnika wskazuje położenie w przestrzeni środka ostrości przetwornika, gdy przetwornik ultradźwiękowy jest podłączony do pozycjonera XYZ. Zrób wskazówkę z nacięcia na igłę 18 G tak, aby była długością odległości ogniskowej przetwornika plus grubość przetwornika (Rysunek 1d).
    1. Nałóż żywicę epoksydową na trzeci magnes (ten magnes również łączy się z magnesem z nasadką z PVC) i przymocuj go do górnej części wskaźnika. Wskaźnik będzie wtedy mógł przymocować się do magnesu na rurze PVC w celu zerowania XYZ (Rysunek 1d).
  4. Jeśli używasz przetwornika zanurzeniowego o małej mocy, wydrukuj w 3D plik wskaźnika i klipsa montażowego.
    1. Przymocuj przetwornik zanurzeniowy małej mocy do rury PVC, przypinając zacisk montażowy do rury PVC i włóż przetwornik do pierścienia (Rysunek 1f).
  5. Zrób kąpiel wodną, sklejając ze sobą kawałki wycięte z arkusza akrylu, które będą mogły spoczywać na głowie zwierzęcia nad ramą stereotaktyczną (Rysunek 1e).
    1. Wytnij otwór w dnie wanny, który jest mniej więcej wielkości głowy zwierzęcia. Zakryj otwór w łaźni wodnej taśmą poliimidową.
      UWAGA: Należy uważać, aby woda nie przeciekała wokół taśmy poliimidowej, ponieważ może ona zmoczyć sierść szczura i spowodować hipotermię.
  6. Wykonaj rezonans magnetyczny, wypełniając plastikową lub szklaną kulę o cienkiej skorupie o średnicy 4 mm widocznym płynem MRI (np. olejem z witaminą E) i uszczelnij ją. Umieść go w uchwycie referencyjnym MRI po prawej stronie wydrukowanej w 3D stereotaktycznej ramy (Rysunek 2a).
  7. Mocno przymocuj wydrukowany w 3D uchwyt ramy do pozycjonera XYZ w dobrym miejscu do pozycjonowania zwierząt. Wsuń wypustkę na obrotowym końcu uchwytu ramy do pasującego kanału na szynie osi Y i zabezpiecz ustalającymi (Rysunek 1h, czerwone strzałki).
  8. Aby sterować pozycjonerem XYZ, zainstaluj konwerter USB na port szeregowy w komputerze, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta i podłącz konwerter. Zainstaluj środowisko wykonawcze i oprogramowanie sterownika silnika na komputerze.
    1. Upewnij się, że w oprogramowaniu wybrano właściwy port szeregowy, wybierając konwerter USB na port szeregowy w kontrolce wyboru portu z listy rozwijanej na panelu przednim oprogramowania kontrolera. Podłącz konwerter USB na szeregowy do skrzynki sterownika silnika krokowego za pomocą 9-pinowego szeregowego z przeplotem (np. modemu RS232 null).
    2. Uruchom oprogramowanie sterownika, aby sprawdzić, czy silniki krokowe mogą być sterowane pod kontrolą oprogramowania. Ten krok może wymagać pomocy lokalnego wsparcia IT.

3. Procedura celowania wewnątrzczaszkowego

UWAGA: Samce szczurów Sprague Dawley o wadze 250-350 g zostały użyte do tych eksperymentów. Zwierzęta miały swobodny dostęp do wody i karmy dla szczurów i były utrzymywane w cyklu światła i ciemności o godzinie 12:12.

  1. Umieść zwierzę w znieczuleniu (3% izofluranu z tlenem) i sprawdź, czy nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie włóż cewnik zgodnie z poniższym opisem.
    1. Ogrzej ogon lampą, aby łatwiej było trafić w żyłę. Uważaj, aby nie przegrzać zwierzęcia ani nie spalić ogona.
    2. Gdy zwierzę zaśnie (nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi), włóż cewnik do żył ogonowych 24 G, który będzie używany do dostarczania mikropęcherzyków, niebieskiego barwnika Evansa (EBD), kontrastu MRI gadobutrolu w przypadku korzystania z MRI oraz czynnika eksperymentalnego będącego przedmiotem zainteresowania. Gdy żyła zostanie uderzona, krew wypełni osłonkę, powoli wyjmij wewnętrzną igłę, jednocześnie wpychając osłonkę głębiej do żyły.
      UWAGA: Zobacz przewodnik taki jak Stuart and Schroeder33, jeśli wykonujesz zastrzyki do żyły ogona szczura po raz pierwszy.
    3. Jeśli nie ma przepływu krwi, powoli wysuń osłonkę cewnika z żyły, aby sprawdzić, czy igła mogła przebić się przez żyłę. Jeśli krew płynie, gdy cewnik jest lekko odciągnięty, pierwsze szturchnięcie przeszło przez żyłę, a umieszczenie cewnika będzie musiało zostać wznowione w innym miejscu na ogonie, które jest rostralne do poprzedniej lokalizacji.
  2. Napełnij zatyczkę cewnika solą fizjologiczną i wkręć zatyczkę cewnika w koniec portu cewnika, gdy tylko port wypełni się krwią. Ostrożnie owiń taśmę laboratoryjną wokół cewnika i ogonka, aby utrzymać go na miejscu. Zacznij od małego kawałka u góry i pracuj w kierunku ogonowym, pozostawiając odsłonięty sam koniec zatyczki cewnika.
  3. Podłącz linię anestezjologiczną do złącza anestezjologicznego na ramie stereotaktycznej (Rysunek 2a) i przymocuj głowę zwierzęcia do ramy, umieszczając usta na belce zgryzowej i prowadząc pręty douszne do obu kanałów słuchowych, a następnie dokręć dociskowe. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest bezpieczna i wypoziomowana.
  4. Przenieś zwierzę do łóżka do rezonansu magnetycznego i podłącz linię anestezjologiczną do stożka nosowego. W tym protokole wykorzystano rezonans magnetyczny zwierzęcia o masie 9,4 T.
  5. Zbierz koronalne i osiowe obrazy T2-zależne, które obejmują cały mózg, a także referencyjny rezonans magnetyczny (Rysunek 2b) do pomiarów współrzędnych. Podaj lokalnemu fizykowi lub technikowi MRI następujące informacje, aby mogli opracować protokół MRI.
    1. Dla obrazów koronalnych (Rysunek 2b na górze) użyj następujących parametrów: liczba obrazów: 27, szerokość: 62,2 mm, wysokość: 62,2 mm, głębokość: 37,97 mm, rozmiar woksela: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
    2. W przypadku obrazów osiowych (Rysunek 2b na dole) użyj następujących parametrów: liczba obrazów: 13, Szerokość: 61,47 mm, Wysokość: 53,81 mm, Głębokość: 16,7 mm, Rozmiar woksela: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3,
      UWAGA: Nie jest konieczne posiadanie tych dokładnych parametrów, o ile rozdzielczość koronalna w płaszczyźnie jest bliska 0,25 mm, a obrazy obejmują cały mózg i są referencyjne.
  6. Zbierz pomiary współrzędnych z powyższych obrazów, rejestrując odległość od punktu odniesienia MRI do obszaru mózgu, który będzie celem FUS.
    1. W skanerze, na obrazach koronalnych zebranych w kroku 3.5, znajdź obraz, na którym powiernik jest największy, wskazując środek odniesienia. Zapisz odległość od górnej części obszaru odniesienia do mózgu będącego przedmiotem zainteresowania w mm (oprogramowanie MRI będzie wyposażone w skalę lub narzędzie do pomiaru punktu, skonsultuj się z lokalnym technikiem MRI lub fizykiem, aby dowiedzieć się, jak to zrobić) zarówno w kierunku przyśrodkowym/bocznym, jak i w kierunku grzbietowo-brzusznym (Rysunek 2b, góra).
    2. W skanerze, na obrazach osiowych zebranych w kroku 3.5, znajdź obraz, który pokazuje samą górę otworu odniesienia i zmierz odległość od środka powiernika do docelowego obszaru mózgu zarówno w kierunku grzbietowym/brzusznym, jak i w kierunku przyśrodkowym/bocznym (Rysunek 2b, na dole).
    3. Porównaj dwa pomiary przyśrodkowe/boczne, a jeśli się różnią, użyj średniej. Te pomiary współrzędnych zostaną wykorzystane w dalszej części kroku 4.3 do naprowadzenia punktu ogniskowego FUS do docelowego obszaru mózgu za pomocą pozycjonera XYZ.
  7. Zbierz obrazy skanowania wstępnego MRI. Porównaj te obrazy z obrazami zebranymi po otwarciu FUS BBB (Rysunek 4). Obrazy zależne T1 zostaną później wykorzystane do wizualizacji otwarcia BBB, obrazy zależne od T2 zostaną później wykorzystane do upewnienia się, że po leczeniu FUS nie doszło do uszkodzenia tkanki34.
    1. W przypadku obrazów osiowych ważonych T1 należy użyć następujących parametrów: szerokość: 30 mm, wysokość: 51,2 mm, głębokość: 3,0 mm, rozmiar woksela: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, liczba obrazów: 13.
    2. W przypadku obrazów osiowych ważonych T2 należy użyć następujących parametrów: szerokość: 30 mm, wysokość: 51,2 mm, głębokość: 2,6 mm, rozmiar woksela: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, liczba obrazów: 13.
    3. W przypadku obrazów koronalnych T1-zależnych należy użyć następujących parametrów: szerokość: 30 mm, wysokość: 30 mm, głębokość: 27 mm, rozmiar woksela: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, liczba obrazów: 27.
    4. W przypadku obrazów koronalnych T2-zależnych należy użyć następujących parametrów: szerokość: 30 mm, wysokość: 30 mm, głębokość: 27 mm, rozmiar woksela: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, liczba obrazów: 27,
      UWAGA: Podobnie jak w kroku 3.5, te parametry obrazowania nie muszą być dokładnie takie same, jak podane. Obrazy te mają mniejsze pole widzenia i wyższą rozdzielczość niż te zebrane w kroku 3.5.
  8. Utrzymując zwierzę w ramie stereotaktycznej, szybko przetransportuj zwierzę z łóżka do rezonansu magnetycznego do stacjonarnego zestawu FUS. Upewnij się, że zwierzę pozostaje w stanie snu do przeniesienia pod wpływem znieczulenia.
  9. W przypadku dłuższych czasów przenoszenia użyj pudełka do przenoszenia, które jest wystarczająco duże, aby zmieścić zwierzę i ramę. Trzymając zatyczkę do znieczulenia, umieść zwierzę i ramkę w pudełku i pozwól, aby nadmiar izofluranu wypełnił pudełko przez kilka minut. Odłącz przewód anestezjologiczny i szybko przenieś.

4. Zogniskowana procedura ultradźwiękowa

  1. Po przybyciu do zestawu laboratoryjnego FUS natychmiast podłącz linię anestezjologiczną do stożka nosowego i kontynuuj podawanie 1,5-3% izofluranu z tlenem. Zrób to tak szybko, jak to możliwe, aby zwierzę się nie obudziło.
  2. Wsuń ramę do uchwytu ramy i mocno ją zatrzaśnij. Użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić głowę zwierzęcia. Zetrzyj nadmiar włosów i nałóż krem do depilacji na skórę głowy. Odstaw na 3 minuty i wytrzyj wodą i gazą.
  3. Jeśli rezonans magnetyczny nie jest dostępny do celowania, użyj standardowej (nie wydrukowanej w 3D) ramki stereotaktycznej, aby wyzerować pozycję wskaźnika do bregma, dotykając końcówki wskaźnika do bregma (do tego potrzebne będzie nacięcie skóry głowy) i zerując oprogramowanie lub zapisując współrzędne. Przesuń karetkę XYZ w górę o 50 mm, klikając przycisk w górę o 50 mm w oprogramowaniu i zamieniając wskazówkę na przetwornik. Opierając się na atlasie mózgu szczura, jak opisano wcześniej35, przejdź do żądanych współrzędnych mózgu za pomocą przycisków krokowych w oprogramowaniu. W przypadku stosowania tej metody zamiast rezonansu magnetycznego należy przejść do sekcji 4.6.
  4. Jeśli korzystasz z nawigacji MRI, przymocuj wskaźnik i przesuń wskaźnik do miejsca, w którym znajduje się punkt odniesienia MRI (Rysunek 1d,g). Umieść wskaźnik na samej górze i pośrodku otworu odniesienia MRI (mały otwór w górnej części uchwytu referencyjnego służy do wskazywania). Kliknij przycisk pozycji zerowej, który jest punktem, od którego zostały obliczone wszystkie odległości na obrazie MRI.
  5. Usuń wskaźnik i przesuń pozycjoner do współrzędnych środkowych/bocznych oraz współrzędnych rostralnych/ogonowych. Podnieś pozycjoner do góry, naciskając przycisk up 50, aby umożliwić umieszczenie kąpieli wodnej i żelu ultradźwiękowego. Jeśli zostanie osiągnięta górna część przesuwu osi Z, lokalizacja zerowania zostanie unieważniona. Współrzędna grzbietowa/brzuszna zostanie ustawiona po dodaniu przetwornika.
  6. Nałóż żel ultradźwiękowy na skórę głowy zwierzęcia i umieść kąpiel wodną na zwierzęciu z okienkiem z taśmy poliamidowej dociśniętym do żelu. Upewnij się, że w żelu do ultradźwięków nie ma pęcherzyków powietrza.
  7. Napełnij łaźnię wodną odgazowaną wodą.
  8. Jeśli używasz przetwornika o dużej mocy, opuść pozycjoner tak, aby magnes znajdował się tuż nad wodą. Przymocuj przetwornik do pozycjonera, ostrożnie opuszczając przetwornik do wody pod kątem, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza pod powierzchnią i podłącz magnesy.
  9. Jeśli używasz przetwornika zanurzeniowego o małej mocy, opuść pozycjoner do wody tuż nad zaciskiem przetwornika. Następnie przypnij przetwornik na miejscu, powoli opuszczając go do wody pod kątem, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza pod twarzą.
    UWAGA: Przezroczysta kąpiel jest pomocna, gdy zaglądasz pod powierzchnię przetwornika w poszukiwaniu pęcherzyków.
  10. Opuść pozycjoner do współrzędnej grzbietowej/brzusznej.
  11. Włącz moc RF amp.
  12. Wstrzyknąć 1 ml/kg 3% niebieskiego barwnika Evansa (EBD), wbijając końcówkę igły w zatyczkę cewnika i wstrzykując. Pozwól mu krążyć przez 5 minut.
  13. Aktywuj mikropęcherzyki, potrząsając nimi gwałtownie za pomocą wytrząsarki bąbelkowej.
    1. Przygotuj 5 razy większą dawkę 30 μl/kg mikropęcherzyków (stężenie pęcherzyków 1,2 x10 10/ml) w 0,2 ml soli fizjologicznej, aby uwzględnić 2 zabiegi FUS i rurkę w zestawie do infuzji 18 G ze skrzydełkami. Na przykład, jeśli szczur waży 200 g, napełnij strzykawkę zawierającą końcówkę igły 18 G 30 μl mikropęcherzyków w 1 ml soli fizjologicznej.
      UWAGA: Należy upewnić się, że używasz końcówek igieł 18 G zarówno do przyjmowania w górę, jak i wstrzykiwania za pomocą zestawu do infuzji ze skrzydełkami.
    2. Odwrócić strzykawkę kilka razy, aby uzyskać równomierny rozkład mikropęcherzyków. Następnie załóż i napełnij skrzydlaty zestaw infuzyjny. Umieścić strzykawkę na pompie infuzyjnej i ustawić pompę infuzyjną tak, aby podawała 0,2 ml z szybkością 6 ml/h. Zapewni to powolną infuzję mikropęcherzyków w ciągu 2-minutowej ekspozycji na FUS.
    3. Wprowadzić igłę ze skrzydełkami do zatyczki cewnika.
  14. Najpierw uruchom pompę infuzyjną, odczekaj 3 sekundy i rozpocznij leczenie FUS, naciskając przycisk włączania wyjścia na generatorze funkcyjnym (oznaczony jako "on" na generatorze funkcyjnym w Tabeli materiałów). Powtórz to dwa razy na region z 5-minutową przerwą, aby mikropęcherzyki mogły się oczyścić.
    1. Nacisnąć ponownie przycisk włączania na generatorze funkcyjnym, aby zatrzymać leczenie FUS, gdy pompa infuzyjna zatrzyma się po 2 minutach.
    2. Odczekaj 5 minut, aż mikropęcherzyki się znikną. Następnie rozpocznij infuzję i drugi zabieg FUS.
    3. Natychmiast po drugim zabiegu FUS wstrzyknąć kontrast gadobutrolu (w przypadku korzystania z rezonansu magnetycznego) i czynnik będący przedmiotem zainteresowania, na przykład cząsteczki wirusa. Łączna objętość wszystkich dostarczonych środków nie powinna przekraczać 5 ml/kg.
      UWAGA: Czas podania (np. przed lub po otwarciu FUS BBB) interesującego nas środka może się różnić w zależności od użytego środka.
  15. Wyłącz wzmacniacz mocy RF i natychmiast przetransportuj zwierzę z powrotem do rezonansu magnetycznego.

5. Potwierdzenie MRI otwarcia BBB

  1. Jeśli rezonans magnetyczny nie jest dostępny, przejdź do sekcji 6 i użyj wyrażenia EBD w celu potwierdzenia otwarcia BBB.
  2. Umieść zwierzę z powrotem na łóżku do rezonansu magnetycznego dokładnie w tym samym miejscu, co w kroku 3.7 i podłącz linię anestezjologiczną.
  3. Zbierz skany MRI po skanach z tymi samymi parametrami obrazowania, które zostały użyte w kroku 3.7, aby zobrazować poprawę MRI gadobutrolu w obszarze otwarcia BBB (Rysunek 3b,e).

6. Perfuzja i pobieranie tkanek

  1. Perfuzję zwierzęcia zimną 4% formaliną, aż krew będzie całkowicie czysta.
  2. Wyjąć mózg i umieścić na noc w 4% formalinie lub PFA w temperaturze 4 °C. Następnie umieść mózg w 30% roztworze sacharozy, aż mózg zatonie (około 2-3 dni). Na koniec błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie lub na suchym lodzie i przechowywanie w temperaturze -80°C do czasu kriosekcji.
  3. Zamroź mózg w OCT i wykonaj kriosekcję.
  4. Skrawki fix i szkiełko nakrywkowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Szczyty wzbudzenia EBD przypadają na długości fali 470 i 540 nm, a piki emisji na długości fali 680 nm. Szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym DAPI w celu wizualizacji ogólnej morfologii komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu pokazano, że skoncentrowane ultradźwięki w połączeniu z mikropęcherzykami mogą wywołać lokalne otwarcie BHE przy zastosowaniu powyżej określonych parametrów zarówno za pomocą niskomocowego przetwornika zanurzeniowego (Ryc. 3), jak i przetwornika FUS (Ryc. 4). Wstępne eksperymenty polegały na skierowaniu niskomocowego przetwornika zanurzeniowego na jedną półkulę mózgową – położoną z przodu (Ryc. 3b) lub w części ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy podejście laboratoryjne do otwierania bariery krew-mózg za pomocą mikropęcherzyków z alternatywnymi podejściami, w tym dwoma różnymi przetwornikami i metodami celowania wewnątrzczaszkowego z kontrolą MRI i bez niej. Obecnie, aby wprowadzić do laboratorium otwieranie FUS BBB pod kontrolą MRI, istnieje możliwość zakupu doskonałych, gotowych do użycia urządzeń, które zapewniają wysoce ustandaryzowane i powtarzalne wyniki z przyjaznymi dla użytkownika interfejsami. Jednak wiele laboratoriów nie jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez grant NSF EPSCoR Research Infrastructure dla Clemson University (1632881). Ponadto badania te były częściowo wspierane przez Międzynarodowe Centrum Badawcze Civitan w Birmingham. Autorzy wyrażają wdzięczność za korzystanie z usług i udogodnień University of Alabama at Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Autorzy dziękują Rajivowi Choprze za jego wsparcie i wskazówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wytrząsarka bąbelkowaLantheus Medical ImagingVMIXVIALMIX, urządzenie aktywujące służące do aktywacji mikropęcherzyków Definity
Zatyczka cewnika / Nasadka iniekcyjnaTechnologie infuzji SAINumer części: ICZatyczka cewnika / Nasadka do wstrzykiwań
Niebieski barwnik EvansSigmaE2129-10GNiebieski barwnik Evans
Generator funkcjiTektronixAFG3022BDwukanałowy, Przetwornik FUS 250MS/s
, 1,1MHzFUS InstrumentsTX-1101 MHz Przetwornik ultradźwiękowy z hydrofonem kompatybilny z rezonansem magnetycznym 1 MHz
Poduszka grzewcza dla myszy i szczurów Podkładka grzewczaKent ScientificPS-03- PhysioSuite dla myszy i szczurów
Pompa infuzyjnaKD Scientific780100KDS 100 Legacy Pojedyncza strzykawka Pompa infuzyjna
Taśma kaptonowaGizmo Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		Gizmo Dorks Taśma kaptonowa (poliimid) do drukarek 3D i drukowania, 8 x 8 cali, 10 arkuszy w opakowaniu
Przetwornik zanurzeniowy małej mocy, przetwornikOlympusV303-SU1MHz, 1 MHz, 0.50 in. Średnica elementu, standardowy styl obudowy, proste złącze UHF, F=0.80IN PTF
Zestawy magnesówWINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15mm Wszyj magnetyczne zapięcia do toreb do szycia scrapbookingu - 10 zestawów
Wzmacniacz RFE& IA07575W
Cewnik do żył ogonowychBD382512/ Fisher Pozycja: NC122851324g Osłonięte cewniki dożylne BD Insyte Autoguard (bez skrzydeł)
Mikropęcherzyki kontrastu ultradźwiękowegoLantheus Medical ImagingDE4, DE16DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Żel ultradźwiękowyAquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		Żel ultradźwiękowy Aquasonic 100 Transmission 1 litr Butelka do wyciskania
Zestawy do infuzji ze skrzydłami, 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Winged Infusion Sets
oprogramowanie sterownika silnikaN/AN/A Niestandardoweoprogramowanie napisane w LabView do sterowania środowiskiem pracy sterownika silnika Velmex
dla oprogramowania sterownika silnikaNational InstrumentsLabView w wersji 2017 lub nowszejhttps://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3-osiowy siłownik stolika liniowego (pozycjoner XYZ)Velmex
MB-1BiSlide 1/4-20x3/4" Śruba z walcowym (10 szt.), Sterownik silnika Ilość: 3
Sterowanie VelmexVXM-3, 3-osiowe programowalne sterowanie silnikiem krokowym, Knagi
montażoweIlość: 1VelmexMC-2Knaga, 2 otwory BiSlide,
Knagi montażoweVelmexMC-2Knagi, 2 otwory BiSlide, Konwerter
USB na port szeregowyVelmexVXM-USB-RS232komunikacji szeregowej USB na RS232 10 stóp, Ilość: 1
stopień liniowy osi xVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, przesuw=10 cali, 2 mm/obr, limity, NEMA 23, Ilość:1
silnik krokowy osi xVelmexPK266-03A-P1Vexta Typ 23T2, Silnik krokowy z pojedynczym wałem, Ilość:1
stopień liniowy osi yVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, przesuw=10 cali, 2 mm/obr, limity, NEMA 23, Ilość: 1
silnik krokowy osi yVelmexPK266-03A-P1Vexta Typ 23T2, Silnik krokowy z pojedynczym wałem, Przepustnica osi Z Ilość: 1
AmortyzatorVelmexD6CL-6.3FD6CL do silnika krokowego z podwójnym wałem typu 23 Silnik, Ilość:1
stopień liniowy osi zVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, przesuw=10 cali, 2 mm/obr, limity, NEMA 23, Ilość:1
silnik krokowy osi zVelmexPK266-03B-P2Vexta Type 23T2, Silnik krokowy z podwójnym wałem, Ilość: 1
Pliki
Mocowanie przetwornika zanurzeniowego i wskaźnikhttps://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Ramkahttps://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaktyczny uchwyt
https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX 9.4T rezonans magnetyczny zwierząt małych otworówBruker BrukerBioSpec 94/20ParaVision wersja 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
Kremowy środek do usuwania włosówChurch & DwightNair krem
gadobutrol MRI środek kontrastowyBayerGadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Ramka stereotaktycznaStoelting#51500nie kompatybilne z MRI
urządzenie do dostarczania FUS pod klucz FUSInstrumenty FUSRK-300gotowe do użycia FUS kompatybilne z MRI dla gryzoni
zanurzeniowy Śruba Velmex do druku 3D stereotaktyczna ramy

Bibliografia

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197(2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15(2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986(2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86(2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

infuzja mikrop cherzyk wbarwnik Evans Bluekontrast gadobutrolnaprowadzanie MRIrama stereotaktycznacewnik y y ogonowejel ultrad wi kowya nia wodna
Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.