Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisana tutaj jest analiza wrodzonej fluorescencji pojedynczej komórki wspomagana mikroskopią refleksyjną (CRIF), minimalnie inwazyjna metoda rekonstrukcji wrodzonej sygnatury fluorescencji komórkowej z każdej pojedynczej żywej komórki w populacji rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej (3D). Wrodzona sygnatura fluorescencyjna komórki to zbiór sygnałów fluorescencyjnych emitowanych przez różne biomolekuły w komórce. Wcześniejsze badania wykazały, że wrodzone sygnatury fluorescencyjne odzwierciedlają różne właściwości komórkowe i różnice w stanie fizjologicznym oraz są bogatym źródłem informacji do charakterystyki i identyfikacji komórek. Wrodzone sygnatury fluorescencji były tradycyjnie analizowane na poziomie populacji, co wymagało hodowli klonalnej, ale nie na poziomie pojedynczej komórki. CRIF jest szczególnie przydatny do badań, które wymagają rozdzielczości 3D i/lub selektywnej ekstrakcji sygnałów fluorescencyjnych z pojedynczych komórek. Ponieważ sygnatura fluorescencyjna jest wrodzoną właściwością komórki, CRIF nadaje się również do bezznacznikowego przewidywania typu i/lub stanu fizjologicznego nienaruszonych i pojedynczych komórek. Metoda ta może być potężnym narzędziem do usprawnionej analizy komórek, w której fenotyp każdej pojedynczej komórki w heterogenicznej populacji może być bezpośrednio oceniany na podstawie jej sygnatury autofluorescencyjnej pod mikroskopem bez znakowania komórek.
Wprowadzenie
Różnorodne biomolekuły w komórce1 emitują sygnały autofluorescencji, a wrodzona sygnatura fluorescencji komórki składa się z połączenia tych sygnałów. Ta charakterystyczna fluorescencja odzwierciedla różne właściwości komórkowe, a także różnice w stanie fizjologicznym. Analiza fluorescencji wrodzonej jest minimalnie inwazyjna i może uzupełniać tradycyjne, bardziej inwazyjne sondy mikrobiologiczne, które pozostawiają szereg śladów od łagodnej modyfikacji metabolicznej do całkowitego zniszczenia komórek. Podczas gdy tradycyjne techniki, takie jak ekstrakcja DNA lub zawartości komórki2,3, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ4 oraz wprowadzenie fluorescencyjnych genów reporterowych do genomu są skuteczne w określaniu typu komórki lub stanu fizjologicznego, zwykle wymagają one albo manipulacji komórkami, albo inwazyjnego znakowania.
Badania wrodzonej fluorescencji różnych żywych i nienaruszonych kolonii drobnoustrojów, w tym zawiesin masowych kultur drobnoustrojów5,6, aktywne szlamy7, ssaki tkanki8,9 i komórki ssaków1,10wykazały, że analiza fluorescencji wrodzonej ułatwia analizę typów komórek i stanu fizjologicznego bez znaczników. Wrodzone sygnatury fluorescencji były tradycyjnie analizowane na poziomie populacji, a nie na poziomie pojedynczej komórki, a zatem wymagają hodowli klonalnej. W przeciwieństwie do tego, opisana tutaj technika analizy pojedynczej komórki wspomaganejmikroskopią reflekcyjną (CRIF)11 rekonstruuje i kataloguje wrodzoną sygnaturę fluorescencji komórkowej każdej pojedynczej żywej komórki drobnoustroju. Co więcej, CRIF może systematycznie zestawiać wrodzoną sygnaturę fluorescencyjną pojedynczej komórki drobnoustroju w populacji, która jest rozmieszczona w przestrzeni trójwymiarowej (3D).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Umieścić szklaną lamellkę z nałożoną uszczelką silikonową o grubości 1 mm z wgłębieniami.
- W wgłębieniu uszczelki silikonowej umieścić plaster agarozy 0,8% (w/v) o grubości 1 mm.
- Rozcieńczyć gęstość komórek dowolnej hodowli mikroorganizmów do gęstości optycznej przy 60 nm (OD660) = 1,0.
- Nanieść 5 µL zawiesiny komórkowej na plaster agarozy.
- Ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywką.
2. Konfiguracja mikroskopu
UWAGA: Technika CRIF łączy konfokalną mikroskopię odbiciową (CRM) z wielokanałową konfokalną mikrospektroskopią. CRM służy jako źródło informacji o morfologii komórkowej i lokalizacji przestrzennej, niezależnie od naturalnej fluorescencji komórek. Wielokanałowa konfokalna mikrospektroskopia dostarcza informacji widmowych dotyczących naturalnej fluorescencji komórkowej. W poniższym protokole każdy obraz uzyskany za pomocą CRM lub konfokalnej mikrospektroskopii fluorescencyjnej określany jest odpowiednio jako obraz CRM lub obraz z wielokanałowej konfokalnej mikrospektroskopii.
- Podłącz mikroskop konfokalny z odfiltrowanymi kanałami widmowymi do fotopowielacza (PMT) lub detektora GaAsP.
UWAGA: Takie konfiguracje są dostępne u kilku producentów. - Wyposaż mikroskop w obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i odpowiednim powiększeniu.
UWAGA: Do analizy komórek bakteryjnych zaleca się obiektyw 63x z NA > 1.4. - Wyposaż mikroskop w lustro półprzepuszczalne (np. NT 80/20), aby umożliwić stosowanie CRM, która opiera się na rozproszeniu światła padającego przez komórki w celu wizualizacji morfologii komórek.
- W przypadku wielokanałowej mikrospektroskopii konfokalnej wyposaż mikroskop w lustra dichroiczne. Na przykład użyj dzielników wiązki MBS InVis405, MBS458, MBS48, MBS458/514, MBS48/543 lub MBS 48/543/63 odpowiednio dla wzbudzenia przy 405, 458, 48, 514, 543 lub 63 nm.
- Dostosuj intensywność oświetlenia dla każdej długości fali wzbudzenia za pomocą miernika mocy lasera. Utrzymuj stałą moc wyjściową pod mikroskopem dla wszystkich długości fal wzbudzenia (np. stosując 50 µW przy obiektywie 63x).
3. Pozyskiwanie obrazów
- Ustaw rozmiar otworu (pinhole) na 1 AU za pomocą oprogramowania mikroskopu.
- Ustaw czas przebywania piksela (tj. prędkość skanowania) dla każdej długości fali wzbudzenia.
UWAGA: Nadmiernie długi czas przebywania piksela może uszkodzić komórki. Należy unikać zbyt długiego czasu przebywania piksela, aby zminimalizować fotouszkodzenia komórek. Dla próbek bakteryjnych czas przebywania piksela <55,6 µs/µm2 (przy natężeniu promieniowania pod mikroskopem ok. 17 µW/cm2) jest zazwyczaj odpowiedni, aby uniknąć zahamowania wzrostu. Parametr ten może się różnić w zależności od organizmów i konfiguracji doświadczalnej. - Ustaw rozdzielczość skanowania. W przypadku małych komórek, takich jak bakterie, należy zastosować obszar skanowania 1 024 x 1 024.
- Ustaw zakres skanowania w osi Z tak, aby objął obszar zainteresowania.
UWAGA: Dla próbek komórek bakteryjnych i drożdżowych rozmieszczonych na płytce agarowej zakres skanowania Z rzędu ~15 µm jest zazwyczaj wystarczający. - Ustaw detektor deskanowany tak, aby rejestrował widzialny zakres fal (np. 416−691 nm). Zastosuj okno spektralne 8−10 nm.
- Pozyskaj wielokanałowe obrazy mikrospektroskopii konfokalnej w sekwencji od najdłuższych do najkrótszych długości fal wzbudzenia, aby stworzyć stosy Z (Z-stacks) obrazów fluorescencyjnych.
- Pozyskaj obrazy CRM.
- Zapisz pozyskane obrazy jako 16-bitowe pliki tiff w katalogu. Nazwij pliki zgodnie z konwencją XXXcYYzZZ.tif, gdzie XXX to długość fali wzbudzenia, YY to numer kanału detektora, ZZ to numer przekroju Z, a „c” i „z” to prefiksy odpowiednio dla numeru detektora i numeru przekroju Z.
- Na przykład, jeśli wielokanałowy obraz mikrospektroskopii konfokalnej zostanie wykonany przy długości fali wzbudzenia 405 nm, przy użyciu 1.szego kanału macierzy detektorów i jest to 5.ty przekrój stosu Z, nazwij go „405c01z05.tif”. W przypadku obrazów CRM użyj ciągu „CRM” zamiast XXX (np. „CRMc01z05.tif”).
UWAGA: Zdecyduj, czy segmentacja 2D czy 3D jest bardziej odpowiednia dla danych obrazowych. Metody segmentacji 2D stosuj w sytuacjach, gdy małe komórki są ograniczone do płaszczyzny 2D (np. populacja bakterii przylegająca do powierzchni szkła). Metody segmentacji 3D stosuj w sytuacjach, gdy populacja komórek jest rozmieszczona w przestrzeni trójwymiarowej (np. biofilmy i próbki tkanek) lub gdy rozmiary komórek są większe niż grubość przekroju optycznego (np. komórki drożdży, komórki ssaków). W celu wykonania segmentacji 2D przejdź do sekcji 4; w celu wykonania segmentacji 3D przejdź do sekcji 5.
- Na przykład, jeśli wielokanałowy obraz mikrospektroskopii konfokalnej zostanie wykonany przy długości fali wzbudzenia 405 nm, przy użyciu 1.szego kanału macierzy detektorów i jest to 5.ty przekrój stosu Z, nazwij go „405c01z05.tif”. W przypadku obrazów CRM użyj ciągu „CRM” zamiast XXX (np. „CRMc01z05.tif”).
4. Analiza obrazów 2D
- Wyposażyć stanowisko pracy w oprogramowanie do analizy obrazu (np. MATLAB).
- Przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję sygnatur fluorescencji wrodzonej dla pojedynczych komórek.
- Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu.
- Dwukrotnie kliknąć i otworzyć jeden z dostarczonych skryptów „Script2D.m”.
- Przejść do karty Editor, a następnie kliknąć Run. Powinno pojawić się okno wyboru folderu.
- Wybrać katalog utworzony w kroku 3.8, a następnie kliknąć Open, aby kontynuować. Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametru segmentacji.
UWAGA: W celach testowych należy wybrać dostarczony zestaw danych („Sample_2D”). Przykładowy zestaw danych jest dostarczony jako plik skompresowany i powinien zostać wcześniej rozpakowany. - Wprowadzić parametry segmentacji: Threshold of Image Binarization (0−1) dla binaryzacji obrazu = 0.45, Upper Threshold For A Cell Region (in pixels) = 200, Lower Threshold for a Cell Region (in pixels) = 10 oraz The Number of Detectors = 32. Kliknąć OK, aby kontynuować.
UWAGA: Parametry te mogą wymagać dostrojenia w zależności od jakości obrazu. - Powinno pojawić się nowe okno obrazu prezentujące obraz CRM. Wybrać dowolny obszar tła (tj. obszar, w którym nie ma komórek), aby użyć go do odejmowania tła. Narysować prostokąt w obrazie CRM, przeciągając myszą. Dwukrotnie kliknąć w wybranym obszarze, aby zatwierdzić wybór.
- Znaleźć nowy katalog o nazwie Signature w tym samym katalogu, który wybrano w kroku 4.2.4.
UWAGA: Dostarczony kod automatycznie tworzy ten katalog. Katalog „Signature” przechowuje sygnatury fluorescencji wrodzonej każdej komórki drobnoustrojowej w populacji jako pliki .png, które są ponumerowane szeregowo po wspólnym prefiksie „Signature”.
5. Analiza obrazu 3D
- Wyposażyć stanowisko pracy w oprogramowanie do analizy obrazu (Tabela materiałów).
- Przeprowadzić segmentację komórek i rekonstrukcję sygnatur fluorescencji wrodzonej pojedynczych komórek.
- Uruchomić oprogramowanie do analizy obrazu.
- Dwukrotnie kliknąć i otworzyć dostarczony skrypt „Script3D.m”.
- Przejść do karty Editor, a następnie kliknąć Run. Powinno pojawić się okno wyboru folderu.
- Wybrać katalog utworzony w kroku 3.8, a następnie kliknąć Open, aby kontynuować. Automatycznie pojawi się okno dialogowe z prośbą o wprowadzenie parametrów segmentacji.
UWAGA: W celach testowych należy wybrać dostarczony zestaw danych („Sample_3D”). Przykładowy zestaw danych jest dostarczony jako plik skompresowany i powinien zostać wcześniej rozpakowany. - Wprowadzić parametry segmentacji: Threshold of Image Binarization (0–1) dla binaryzacji obrazu = 0.01, Upper Threshold for a Cell Volume (in pixels) = 1,0, Lower Threshold for a Cell Region (in pixels) = 20, X Pixel Size [μm/pixel] = 0.26, Y Pixel Size [μm/pixel] = 0.26, Z pixel Size [μm/pixel] = 0.42 oraz The Number of Detectors = 32. Kliknąć OK, aby kontynuować; pojawi się okno dialogowe z prośbą o podanie liczby długości fal wzbudzenia.
UWAGA: Parametry te mogą wymagać dostosowania w zależności od jakości obrazu. - Wprowadzić liczbę długości fal użytych do akwizycji obrazu (np. jeśli użyto 405, 48, 561, 630, wpisać 4 w oknie dialogowym). Kliknąć OK.
- Wprowadzić długości fal wzbudzenia w kolejności od najkrótszej (tj. nazwa pola: Excitation No. 1) do najdłuższej do okien dialogowych. Kliknąć OK, aby kontynuować; powinno wyskoczyć nowe okno obrazu prezentujące obraz CRM.
- Wybrać dowolny obszar tła (tj. obszar pozbawiony komórek), który zostanie użyty do odjęcia tła. Przeciągnąć myszą prostokąt w obrębie obrazu CRM. Dwukrotnie kliknąć wewnątrz wybranego obszaru, aby potwierdzić wybór.
- Znaleźć katalog o nazwie Signature w katalogu wybranym w kroku 5.2.4.
UWAGA: Dostarczony kod automatycznie tworzy ten katalog. Katalog „Signature” przechowuje sygnaturę fluorescencji wrodzonej każdej pojedynczej komórki mikrobiologicznej w populacji w formie plików .png, które są numerowane szeregowo po wspólnym prefiksie „Signature”.
6. Analiza statystyczna
UWAGA: Należy zastosować techniki redukcji wymiarowości (np. analizę głównych składowych [PCA]), aby zwizualizować rozkład hiperspektrów populacji komórkowych. Dostarczony skrypt (PCA.py) wykonuje PCA dla dwóch populacji komórek (tj. dwóch klas).
- Wyposażyć stanowisko robocze w język programowania oraz towarzyszące mu biblioteki i moduły (Tabela materiałów).
- Utwórz pusty katalog na dysku C (lub równoważnym) i nazwij go „Katalog nadrzędny” (tj. C:/ katalog nadrzędny).
- Zapisz sygnatury fluorescencyjne (np. pliki .png wygenerowane w kroku 4.2.7) dla każdej z dwóch populacji komórek w dwóch osobnych katalogach.
UWAGA: Oba katalogi powinny znajdować się w „Katalog nadrzędny”.
C:/Katalog_nadrzędny/
putidaKT240/
Podpis01.png
Podpis02.png
:
putidaKT242/
Podpis01.png
Podpis02.png
: - Pobierz PCA.py do „Katalog nadrzędny”.
- Otwórz wiersz poleceń stacji roboczej.
- Wpisz „python C:/Parent_directory/PCA.py„ w interfejsie wiersza poleceń.
- Wybierz „Katalog nadrzędnypo komunikacie „Wybierz katalog docelowyjest wyświetlane.
- W sekcji „C:/Katalog_nadrzędny”, znajdź “Analiza głównych składowych (PCA).png”, w którym znajduje się wynikowy wykres PCA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1A przedstawia typową sygnaturę fluorescencji pojedynczej komórki bakteryjnej w formie tradycyjnego wykresu widma (góra) oraz mapy ciepła (środek). Rysunek 1B pokazuje wynik dokładnej segmentacji komórek 2D nałożonej na oryginalny obraz CRM populacji bakterii glebowych (Pseudomonas putida KT2440)12. Uzyskane wrodzone sygnatury fluorescencji dla tej populacji przedstawiono jako mapę ciepła na Rysunku 1...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tej metodzie istnieją dwa krytyczne punkty, których należy ściśle przestrzegać, aby uzyskać powtarzalne wyniki: 1) utrzymanie stałej mocy wyjściowej lasera pod obiektywem mikroskopu poprzez długości fal wzbudzenia i eksperymenty oraz 2) przeprowadzenie dokładnej segmentacji komórek.
Pierwszy punkt jest szczególnie ważny przy porównywaniu wrodzonej sygnatury fluorescencji w różnych eksperymentach. Unikaj po prostu stosowania tych samych ustawień "procentu mocy" do długości fal wzbudzenia (tj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było częściowo wspierane przez dotację na badania naukowe od Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu i Technologii Japonii (18K04843) dla Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) dla N. Nomury.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Rozdzielacze wiązki | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 lub MBS 488/543/633 rozdzielacze wiązki (Carl Zeiss) | |
| Mikroskop konfokalny | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Szkiełka nakrywkowe | Matsunami Glass | C024601 | |
| Szkiełka | szklane Matsunami Szkło | S011120 | |
| Lustro półrefleksyjne | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laserowy miernik mocy | Thorlabs | PM400 (konsola miernika mocy) i S175C (czujnik) | |
| LB Bulion | Nacalai tesque | 20066-95 | Do hodowli bakterii |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | The MathWorks | MATLAB wersja 2019a lub nowsza, wymagany jest Image Processing Toolbox | |
| Obiektyw mikroskopu | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | np. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Oprogramowanie mikroskopowe | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Język | programowaniaPython i biblioteki, moduły (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) są wymagane do uruchomienia dostarczonego skryptu PCA. | ||
| Uszczelka silikonowa | Stacja | ||
| Zalecana jest stacja robocza o wysokiej wydajności z dyskretnymi procesorami graficznymi. | |||
| Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YPD) pożywka agarowa | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | Do hodowli drożdży |
| YPD podłoże | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
Bibliografia
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289(2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453(2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
