Artykuł metodologiczny

Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego

DOI:

10.3791/61122

⸱

12 maja 2020

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego jest ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych poprzez pomiar produkcji produktów peroksydacji lipidów, głównie dialdehydu malonowego, przy użyciu spektrofotometrii o długości fali widzialnej przy długości fali 532 nm. Opisana tutaj metoda może być stosowana do ludzkiej surowicy, lizatów komórkowych i lipoprotein o niskiej gęstości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo ograniczonej specyfiki analitycznej i wytrzymałości, test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) jest szeroko stosowany jako ogólny wskaźnik peroksydacji lipidów w płynach biologicznych. Często uważa się, że jest dobrym wskaźnikiem poziomu stresu oksydacyjnego w próbce biologicznej, pod warunkiem, że próbka była odpowiednio obsługiwana i przechowywana. Test polega na reakcji produktów peroksydacji lipidów, przede wszystkim dialdehydu malonowego (MDA), z kwasem tiobarbiturowym (TBA), co prowadzi do powstania adduktówMDA-TBA2 zwanych TBARS. TBARS daje czerwono-różowy kolor, który można zmierzyć spektrofotometrycznie przy 532 nm. Test TBARS przeprowadza się w warunkach kwaśnych (pH = 4) i w temperaturze 95 °C. Czysty MDA jest niestabilny, ale warunki te pozwalają na uwolnienie MDA z MDA bis(octan dimetylu), który jest stosowany jako wzorzec analityczny w tej metodzie. Test TBARS jest prostą metodą, którą można wykonać w ciągu około 2 godzin. Przygotowanie odczynników do oznaczania jest szczegółowo opisane tutaj. Badacze dbający o budżet mogą używać tych odczynników do wielu eksperymentów przy niskich kosztach, zamiast kupować drogi zestaw testowy TBARS, który pozwala na skonstruowanie tylko jednej krzywej wzorcowej (a zatem może być użyty tylko w jednym eksperymencie). Zastosowanie tego testu TBARS wykazano w surowicy ludzkiej, lipoproteinach o niskiej gęstości i lizatach komórkowych. Test jest spójny i powtarzalny, a granice wykrywalności mogą zostać osiągnięte na poziomie 1,1 μM. Podano zalecenia dotyczące stosowania i interpretacji spektrofotometrycznego testu TBARS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksydacja lipidów to proces, w którym wolne rodniki, takie jak reaktywne formy tlenu i reaktywne formy azotu, atakują podwójne wiązania węgiel-węgiel w lipidach, proces, który polega na abstrahowaniu wodoru z węgla i wstawieniu cząsteczki tlenu. Proces ten prowadzi do powstania mieszaniny złożonych produktów, w tym nadtlenków lipidowych i wodoronadtlenków jako produktów pierwotnych, a także dialdehydu malonowego (MDA) i 4-hydroksynonenalu jako dominujących produktów wtórnych1.

MDA jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych jako marker peroksydacji lipidów ze względu na łatwą reakcję z kwasem tiobarbiturowym (TBA). Reakcja prowadzi do powstania MDA-TBA2, koniugatu, który absorbuje w widmie widzialnym przy 532 nm i wytwarza czerwono-różowy kolor2. Inne cząsteczki pochodzące z peroksydacji lipidów oprócz MDA mogą również reagować z TBA i absorbować światło o długości fali 532 nm, przyczyniając się do ogólnego pomiaru sygnału absorpcji. Podobnie, MDA może reagować z większością innych głównych klas biomolekuł, potencjalnie ograniczając jego dostępność do reakcji z TBA3,4. W związku z tym ten tradycyjny test jest po prostu uważany za mierzący "substancje reagujące z kwasem tiobarbiturowym" lub TBARS5.

Przy prawidłowym zastosowaniu i interpretacji, test TBARS jest ogólnie uważany za dobry wskaźnik ogólnego poziomu stresu oksydacyjnego w próbce biologicznej6. Niestety, jak udokumentowali Khoubnasabjafari i inni, test TBARS jest często przeprowadzany i interpretowany w sposób, który ułatwia wątpliwe wnioski3,4,7,8,9,10,11. Przyczyny tego stanu rzeczy są przede wszystkim zakorzenione w zmiennych przedanalitycznych związanych z próbką oraz braku odporności testu, która uniemożliwia pozornie niewielkie zmiany w protokole testu bez istotnych zmian w wynikach testu1,7,12,13.

Zmienne przedanalityczne związane z obsługą i przechowywaniem próbek biologicznych (np. osocze krwi przechowywane tymczasowo w temperaturze -20 °C)14,15 mogą mieć duży wpływ na wyniki testów TBARS class16,17; do tego stopnia, że wyniki testów TBARS nie powinny być porównywane między różnymi laboratoriami, chyba że jest to uzasadnione wyraźnymi międzylaboratoryjnymi danymi analitycznymi. To zalecenie jest podobne do tego, jak western blot jest powszechnie używany i interpretowany. Porównania gęstości prążków są ważne dla badań wewnątrz-plamowych i być może wewnątrzlaboratoryjnych, ale porównywanie gęstości prążków między laboratoriami jest ogólnie uważane za nieprawidłową praktykę.

Niektórzy badacze sugerowali, że MDA mierzone za pomocą testu TBARS po prostu nie spełnia kryteriów analitycznych lub klinicznych wymaganych od akceptowalnego biomarkera3,9,10,18,19. Rzeczywiście, gdyby test nie został opracowany ponad 50 lat temu, prawdopodobnie nie zyskałby tak powszechnego zastosowania i milczącej akceptacji, jak ma dzisiaj. Chociaż istnieją inne testy o większej czułości analitycznej, swoistości i odporności stosowane do określania stresu oksydacyjnego, test TBARS oparty na absorbancji przy 532 nm pozostaje zdecydowanie jednym z najczęściej stosowanych testów do oznaczania peroksydacji lipidów20, a tym samym oceny stresu oksydacyjnego.

Test TBARS można znaleźć tylko jako drogi zestaw (ponad 400 dolarów amerykańskich), w którym instrukcje nie zawierają szczegółowych informacji na temat większości stężeń używanych odczynników. Dodatkowo dostarczone odczynniki mogą być użyte tylko do jednego eksperymentu, ponieważ w jednym zestawie można wykonać tylko jedną kolorymetryczną krzywą wzorcową. Może to być problematyczne dla badaczy, którzy zamierzają określić poziomy utlenienia w kilku próbkach w różnych punktach czasowych, ponieważ ta sama krzywa standardowa nie może być używana w wielu momentach. W związku z tym należy zakupić wiele zestawów do wielu eksperymentów. Obecnie, o ile nie zostanie zakupiony drogi zestaw, nie ma szczegółowego protokołu dotyczącego wykonywania testu TBARS. Niektórzy badacze w przeszłości niejasno opisywali, jak przeprowadzić test TBARS21,22, ale w literaturze nie jest dostępny ani w pełni szczegółowy protokół, ani obszerny film na temat przeprowadzania testu TBARS bez drogiego zestawu.

Tutaj przedstawiamy szczegółową, analitycznie zweryfikowaną metodologię dotyczącą tego, jak przeprowadzić test TBARS w prosty, powtarzalny i tani sposób. Zmiany w peroksydacji lipidów ludzkiej surowicy, lizatów HepG2 i lipoprotein o niskiej gęstości po leczeniu jonami Cu(II) przedstawiono jako ilustracyjne zastosowania do testu TBAR. Wyniki pokazują, że ten test TBARS jest spójny i powtarzalny na co dzień.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki ludzkiej surowicy zostały pobrane od ochotników, którzy wyrazili zgodę na to za zgodą IRB i zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Próbki zostały zakodowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed przekazaniem do laboratorium analitycznego.

1. Przygotowanie próbki

  1. Lizaty komórek HepG2
    1. Wysiewać około 10 x 106 komórek HepG2 na kolbę w 16 kolbach T75 z 14 ml pożywki EMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i rosnąć komórki przez 2 dni.
    2. Przygotuj bufor RIPA: do probówki o pojemności 50 ml dodaj 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μl odczynnika NP-40, a następnie doprowadź końcową objętość do 50 ml wodą DI.
    3. Przygotuj bufor do lizy: podajcie 20 ml buforu RIPA do probówki o pojemności 50 ml i dodajcie 200 μl 100-krotnego roztworu inhibitora proteazy, aby zahamować degradację białek i lipidów. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Bufor do lizy jest kompatybilny z odczynnikami TBARS i nie zakłóca absorbancji przy 532 nm. Jeżeli planowane jest użycie innego buforu do lizy lub dodanie dodatkowych składników do buforu do lizy, należy przeprowadzić wstępne badania walidacyjne w celu sprawdzenia, czy składniki buforu do lizy są kompatybilne z testem TBARS.
    4. Usuń pożywkę zawierającą 10% FBS i umyj komórki 2x 5 ml zimnego, sterylnego 1x PBS.
    5. Dodać 1 ml buforu do lizy do kolb T75 zawierających komórki i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) z ciągłym wirowaniem, aby zapewnić dobre rozprowadzenie buforu.
    6. Zebrać lizaty do odpowiednio oznakowanych probówek polipropylenowych typu snap-cap o pojemności 2 ml i inkubować na lodzie przez 10 minut.
    7. Wirować lizaty przy 5 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zebrać resztki komórek, a następnie odessać supernatanty do pojedynczej probówki o pojemności 15 ml.
    8. Stężyć supernatant lizatu komórkowego czterokrotnie za pomocą Speed Vac w temperaturze 50 °C i ciśnieniu 3 mbar i zrobić porcje po 94 μl każda w probówkach polipropylenowych typu snap-cap o pojemności 2 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ich wykorzystania do utleniania in vitro i/lub testu TBARS.
      UWAGA: Aby uniknąć zagęszczenia supernatantu lizatu komórkowego, komórki można również odłączyć za pomocą 3 ml 1x trypsyny, zneutralizować 6 ml pożywki i przemyć 2x 5 ml zimnego PBS. Granulki komórkowe można następnie rozpuścić w 250 μl buforu do lizy, a następnie wykonać kroki 1.1.6 i 1.1.7.
    9. Przygotować 35 mM CuCl2 roztwór podstawowy w kwasie octowym (pH = 4).
      1. Przygotować roztwór kwasu octowego (pH = 4): Rozcieńczyć 1 μl lodowatego kwasu octowego w 100 ml wody demineralizowanej (pH powinno wynosić około 4, ale potwierdź to pH-metrem). Dodaj więcej wody lub kwasu octowego, aby dostosować pH do 4.
      2. Odważyć około 0,1936 g chlorku miedzi II i rozpuścić w 10 ml roztworu kwasu octowego (pH = 4), aby uzyskać 144 mM CuCl2 bulion. Podać 490 μl z tego roztworu i dodać do 1,510 μl kwasu octowego (pH = 4) w celu uzyskania 35 mM roztworu CuCl2.
    10. Podwielokrotność 6 μl z 35 mM roztworu podstawowego CuCl2 i dodać do sześciu próbek zawierających 94 μl lizatu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie CuCl2 około 2 mM. Dodać 6 μl roztworu kwasu octowego (pH = 4), który nie ma CuCl2, do sześciu próbek zawierających 94 μl lizatów komórkowych do wykorzystania jako kontrole. Ostateczna objętość lizatu komórkowego powinna wynosić 100 μl, czyli tyle, ile zostanie użyte do testu TBARS.
      UWAGA: Przygotowanie 35 mM roztworu podstawowego CuCl2 w kwasie octowym (pH = 4) jest konieczne, aby zapobiec wytrącaniu się wodorotlenku miedzi.
    11. Inkubować próbki w piecu w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i przeprowadzić test TBARS na każdej próbce zawierającej końcową objętość 100 μl.
    12. Powtórz kroki 1.1.9 i 1.1.11 2 razy w różnych dniach, aby sprawdzić odtwarzalność testu TBARS dla lizatów komórek HepG2.
  2. Lipoproteiny o niskiej gęstości
    UWAGA: Zazwyczaj wstępnie oczyszczona lipoproteina o niskiej gęstości (LDL) zawiera pewną ilość EDTA. Użyte tutaj próbki LDL zawierają 0,01% EDTA. EDTA może hamować utlenianie LDL za pośrednictwem Cu(II) in vitro. W związku z tym może być konieczne usunięcie EDTA z próbek LDL przed eksperymentami lub analizą. Kroki 1.2.1–1.2.5 opisują ten proces.
    UWAGA: Wodorotlenek sodu działa żrąco i powoduje podrażnienia skóry i oczu. Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
    1. Podwielokrotność 24 μl z 5,51 mg/ml LDL (stężenie białka określone zmodyfikowaną metodą Lowry'ego przy użyciu BSA jako standardu) do odpowiednio oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 1 ml typu snap-cap. Przygotować tyle porcji, ile potrzeba i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia w teście utleniania i/lub TBARS.
    2. Przygotować 10 mM bufor HEPES w 0,15 M NaCl doprowadzonym do pH = 7 za pomocą kulek NaOH: rozpuścić 4,39 g NaCl w 0,49 l wody, następnie dodać 1,19 g HEPES. Dobrze rozpuść za pomocą mieszadła. Dodaj kulki wodorotlenku sodu, aż pH wyniesie 7. Rozcieńczyć do 0,5 l wodą. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy.
    3. Dodać 476 μl 10 mM buforu HEPES w 0,15 M NaCl (pH = 7) do poddanych próbek LDL, aby uzyskać końcową objętość do 500 μl. Dodać rozcieńczoną próbkę LDL do 0,5 ml odśrodkowego filtra wirowego z odciętą masą cząsteczkową 100K.
    4. Próbki należy wirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, pozostawiając końcową objętość retentatu około 30 μl. Próbki należy rozpuścić w 480 μl buforu 10 mM HEPES w 0,15 M NaCl (pH = 7) i ponownie wirować w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj ten krok 2 razy, aby uzyskać łącznie cztery odwirowania.
    5. Umieść urządzenie filtrujące do góry nogami w nowej probówce polipropylenowej o pojemności 2 ml typu snap-cap i odwiruj przy 1000 x g przez 2 minuty, aby pobrać próbkę LDL (objętość końcowa = około 30 μl).
    6. Podwielokrotną próbkę przelać do odpowiednio oznakowanej probówki o pojemności 1 ml i dodać 20 μl wody do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość 50 μl.
    7. Przygotowanie 200 μM roztworu podstawowego CuCl2 w kwasie octowym (pH = 4)
      1. Przygotować roztwór kwasu octowego (pH = 4): patrz krok 1.1.9.1.
      2. Przygotować roztwór podstawowy 144 mM CuCl2 (patrz krok 1.1.9.2), następnie podwielokrotność 5,5 μl z 144 mM CuCl2 i rozpuścić w końcowej objętości 4 ml kwasu octowego (pH = 4) w celu uzyskania roztworu 200 μM.
    8. Podwielokrotność 2,7 μl z 200 μM roztworu podstawowego CuCl2 i dodać do sześciu próbek zawierających 50 μl LDL, aby uzyskać końcowe stężenie CuCl2 ~10 μM. Dodać 2,7 μl z roztworu kwasu octowego (pH = 4), który nie zawiera CuCl2, do sześciu próbek zawierających 50 μl LDL, które mają być użyte do kontroli.
    9. Próbki LDL inkubować przez 2 godziny w piecu w temperaturze 37 °C. Po 2 godzinach doprowadzić końcową objętość do 100 μl dla każdej próbki z 10 mM buforem HEPES w 0,15 M NaCl (pH = 7). Natychmiast wykonaj test TBARS.
    10. Powtórz kroki 1.2.3–1.2.9 2x w dwóch różnych dniach, aby sprawdzić reprodukcję testu TBARS.
  3. Surowica ludzka
    1. Z próbki surowicy ludzkiej pobrać porcje po 94 μl każda do probówek polipropylenowych typu snap-cap o pojemności 2 ml i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotować 35 mM roztwór podstawowy CuCl2 w kwasie octowym (pH = 4): patrz krok 1.1.9.
    3. Podwielokrotność 6 μl z roztworu podstawowego CuCl2 i dodać do sześciu próbek zawierających 94 μl surowicy ludzkiej, aby uzyskać końcowe stężenie CuCl2 około 2 mM. Dodać 6 μl roztworu kwasu octowego (pH = 4), który nie ma CuCl2, do sześciu próbek zawierających 94 μl surowicy ludzkiej do wykorzystania jako kontrole.
    4. Próbki surowicy ludzkiej inkubować przez 24 godziny w piecu w temperaturze 37 °C i oznaczać poziomy utlenienia za pomocą testu TBARS (sekcja 4).
    5. Powtórz kroki 1.3.2–1.3.4 2x w dwóch oddzielnych dniach, aby określić odtwarzalność testu TBARS.

2. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Kwas tiobarbiturowy powoduje podrażnienie skóry i oczu i może być szkodliwy przez wdychanie lub wchłanianie przez skórę. Kwas octowy może uszkodzić narządy wewnętrzne w przypadku wdychania. Przygotuj wszystkie roztwory kwasów w dygestorium.

  1. Przygotowanie 8,1% (w/v) roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS)
    1. Odważyć 32,4 g SDS i rozpuścić w 350 ml wody demineralizowanej w zlewce. Użyj mieszadła magnetycznego, aby delikatnie rozpuścić SDS i uniknąć tworzenia bąbelków. Doprowadzić końcową objętość do 400 ml za pomocą wody DI i przechowywać roztwór SDS w RT.
      UWAGA: Tutaj przygotowuje się nadmiar 8,1% roztworu SDS; jednak w przypadku 96 próbek potrzeba tylko około 20 ml 8,1% roztworu SDS. Przygotuj ten roztwór zgodnie z liczbą analizowanych próbek.
  2. Przygotowanie 3,5 M buforu octanu sodu (pH = 4)
    1. Rozcieńczyć 100 ml lodowatego kwasu octowego w 350 ml wody demineralizowanej w zlewce. Użyj magnetycznego mieszadła, aby delikatnie go rozpuścić.
    2. Przygotować 6,5 M roztwór NaOH za pomocą kulek wodorotlenku sodu w wodzie. Rozpuścić 13 g kulek NaOH w 40 ml wody DI i doprowadzić do końcowej objętości 50 ml wodą DI.
    3. Powoli dodawać około 46 ml 6,5 M roztworu NaOH do roztworu kwasu octowego, mieszając z mieszadłem (powinno to podnieść pH do 4, ale potwierdź, powoli dodając roztwór NaOH podczas odmierzania za pomocą pH-metru).
    4. Doprowadzić końcową objętość do 500 ml wodą demineralizowaną i przechowywać bufor octanu sodu w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotowanie 0,8% wodnego roztworu kwasu tiobarbiturowego (dostosowanego do pH = 4)
    UWAGA: Na tym etapie przygotowanie kwasu tiobarbiturowego jest zoptymalizowane dla dużych objętości, ponieważ analizowana będzie duża liczba próbek (108 próbek, nie wliczając wzorców). Roztwór ten należy przygotować w zależności od liczby próbek planowanych do analizy.
    1. Przygotować 5 M roztwór wodorotlenku sodu, używając kulek wodorotlenku sodu i wody: rozpuścić 4 g kulek wodorotlenku sodu w końcowej objętości 20 ml wody. Przechowywać w plastikowym pojemniku. Roztwór ten powinien być świeżo przygotowany dla każdej partii.
    2. Odważyć 4 g kwasu tiobarbiturowego i dodać 450 ml wody demineralizowanej. Użyj mieszadła magnetycznego, aby delikatnie go rozpuścić.
      UWAGA: Ten roztwór zostanie ostatecznie doprowadzony do całkowitej objętości 500 ml.
    3. Rozpuszczając kwas tiobarbiturowy za pomocą mieszadła, dodawać (powoli i kroplami) około 3 ml 5 M roztworu NaOH w odstępach co 100 μl. Po dodaniu roztworu NaOH cząsteczki kwasu tiobarbiturowego zaczną się rozpuszczać.
    4. Jeżeli cząstki kwasu tiobarbiturowego nadal nie rozpuściły się całkowicie, dodać więcej 5 M roztworu NaOH w odstępach co 100 μl, aż wszystkie cząstki kwasu tiobarbiturowego zostaną całkowicie rozpuszczone. Do tej konkretnej objętości roztworu dodaje się łącznie 4 ml 5 M roztworu NaOH w celu całkowitego rozpuszczenia cząstek kwasu tiobarbiturowego.
      UWAGA: Przy tym stężeniu kwas tiobarbiturowy nie rozpuści się całkowicie, chyba że pH będzie bliskie 4.
    5. Przestań dodawać NaOH po całkowitym rozpuszczeniu całego kwasu tiobarbiturowego. Unikaj przekraczania pH 4. Końcowe pH można sprawdzić, pobierając 1 μl z mieszającego roztworu kwasu tiobarbiturowego i umieszczając go na bibułce pH.
    6. Doprowadzić końcową objętość do 500 ml wodą demineralizowaną i przechowywać wodny roztwór 0,8% kwasu tiobarbiturowego w temperaturze pokojowej.

3. Przygotowanie standardowej próbki dialdehydu malonowego bis(acetalu dimetylu)

UWAGA: Dialdehyd malonowy (MDA) jest niestabilny i niedostępny na rynku. Istnieją jednak różne formy chemiczne MDA, które są dostępne na rynku, takie jak sól tetrabutyloamoniowa MDA, bis MDA (octan dimetylu) i bis MDA (acetal dietylowy). Spośród tych trzech form chemicznych stosuje się tutaj MDA bis(octan dimetylu), ponieważ większość badań używa tego samego standardu21,22. W przypadku wyboru pozostałych dwóch form chemicznych MDA należy przeprowadzić uprzednią walidację ich odpowiedniości.

  1. Przygotować 550 μM roztwór podstawowy bis(octanu dimetylu) MDA, rozcieńczając 92 μl czystego bis(octanu dimetylu) MDA w 1 l wody demineralizowanej. Za pomocą mieszadła magnetycznego dokładnie mieszaj roztwór przez 10 minut. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.
  2. Przygotować 200 μM MDA bis(octan dimetylu), rozcieńczając 726 μl z 550 μM bis(octanu dimetylu) MDA w 1274 μl wody demineralizowanej. Ten 200 μM roztwór bis(octanu dimetylu) MDA powinien być przygotowywany na świeżo za każdym razem, gdy przeprowadzany jest test TBRES.
  3. Przygotowanie krzywej wzorcowej: wziąć osiem probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml typu snap-cap i oznaczyć je literami od A do H. Dodać bis(octan dimetylu) MDA z 200 μM i rozcieńczyć w wodzie, jak opisano w tabeli 1.
  4. Weź osiem szklanych probówek (13 mm x 100 mm) i oznacz je jako A–H, a następnie dodaj 100 μl wzorca do odpowiednich probówek. Wykonać sześć powtórzeń dla wzorca próby ślepej (próbka A) w celu obliczenia granic wykrywalności testu TBARS.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać na nie dłużej niż 1 godzinę.

4. Test TBARS

UWAGA: Gdy test TBARS zostanie rozpoczęty, powinien zostać zakończony bez zatrzymywania.

  1. Weź tyle szklanych probówek, ile potrzeba do liczby próbek do analizy i oznacz je nazwami próbek. Następnie dodać 100 μl każdej przygotowanej próbki (jak opisano powyżej) do każdej szklanej probówki.
  2. Dodać 200 μl 8,1% SDS do każdej próbki i wzorca i delikatnie obracać szklaną probówkę okrężnymi ruchami, aby wymieszać próbkę.
  3. Dodać 1,5 ml 3,5 M buforu octanu sodu (pH = 4) do każdej próbki i wzorca.
  4. Dodać 1,5 ml wodnego roztworu 0,8% kwasu tiobarbiturowego (pH = 4) do każdej próbki i wzorca.
  5. Doprowadzić końcową objętość do 4 ml dla każdej próbki i wzorca, dodając 700 μl wody DI.
  6. Szczelnie zakryj każdą szklaną probówkę i inkubuj w bloku grzewczym ustawionym na 95 °C przez 1 godzinę. Przykryj szklane rurki folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na górze probówek.
  7. Wyjmij szklane rurki z bloku grzewczego i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
  8. Odwirować próbki i wzorce przy 1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu szklane probówki zawierające próbki i wzorce należy przechowywać w temperaturze RT.
    UWAGA: Trzymanie próbek na lodzie lub w temperaturze 4 °C spowoduje wytrącenie się całej próbki lub wzorca.
  9. Natychmiast po odwirowaniu podamy 150 μl supernatantu z każdej probówki i umieścimy w oddzielnym dołku na 96-dołkowej płytce.
  10. Usuń wszelkie pęcherzyki z każdej studzienki za pomocą końcówki pipety.
    UWAGA: Obecność pęcherzyków spowoduje niespójne odczyty absorbancji, co doprowadzi do wysokiej niedokładności testu.
  11. Odczyt absorbancji przy 532 nm. Odjąć średni odczyt absorbancji próbek ślepych od wszystkich innych odczytów absorbancji.
  12. Utwórz krzywą wzorcową, wykreślając odczyty absorbancji odjęte od ślepej próby przy 532 nm w porównaniu ze znanym stężeniem każdego wzorca. Dopasuj punkty danych przy użyciu regresji liniowej. Obliczyć nieznane stężenia próbki, korzystając z równania linii regresji liniowej uzyskanej z krzywej standardowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W kwaśnych warunkach (pH = 4) i w temperaturze 95 °C, dialdehyd malonowy (MDA) bis(dimetyloacetal) daje MDA23. MDA i blisko spokrewnione kongenery chemiczne reagują z dwiema cząsteczkami kwasu tiobarbiturowego (TBA), tworząc związki zwane substancjami reaktywnymi kwasu tiobarbiturowego (TBARS), które nadają czerwono-różowy kolor i mają absorbancję λmax przy 532 nm (Rysunek 1, Rysunek 2). Używając MDA bis (octan dimetylu) jako wzorca, wygenerowano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo swoich ograniczeń 1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 i braku przydatności do porównania między laboratoriami, test TBARS jest jednym z najstarszych <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj badania były częściowo wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody nr R33 CA217702 oraz programu Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x Sterylny PBS pH 7,4 1 LVWR, PA--262odczynnik do lizy komórek
50 ml samostojąca probówka wirówkowaCorning, NYCLS430897Materiał ogólny
Płytka 96-dołkowa, nieobrobiona, przezroczysta, z pokrywką, niesterylnaThermo Fisher Scientific, MA280895Do pomiaru absorbancji
Amicon Ultra-0,5 100 kD odśrodkowy filtr wirowyFisher Scientific, NHUFC510024Oczyszczanie LDL
Nasadki do probówek szklanychThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Ddo testu TBARS
Chlorek miedzi IISIGMA, MO222011-250Gdo indukcji utleniania
Probówki hodowlane, jednorazowe, z nakrętką, szkło borokrzemianowe (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800do testu TBARS
Minimalna niezbędna pożywka Eagle'a (EMEM)ATCC, VAHB-8065Pożywka komórkowa HepG2
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mleppendorf, Nowy Jork22363204Materiał ogólny
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mlGenesee Sceitific, CA22363352Materiał ogólny
Surowica bydlęca płodu USA Źródło: Omega Scientific, CAFB-11do hodowli komórkowych
Lodowaty kwas octowySIGMA, MO27225-1L-RTBARS Odczynnik
Halt Inhibitor proteazy Koktajl (100x)Thermo Scientific, MA87786odczynnik do lizy komórek
HEPESSIGMA, MOH3375-250GRozpuszczalnik
LDL Komórki HepG2ATCC, VAHB-8065Prototyp matrycy biologicznej
Kwas hydrokwarowy (HCl)Fisher Scientific, odczynnik
do lizy komórek NH A144-212Wirówka Legend Micro 17Thermo Scientific, MA75002431Materiał ogólny
Lipoproteiny o niskiej gęstości, osocze ludzkieBadania i Technologia, GA12-16-120412Prototyp matrycy biologicznej
Mieszacze magnetyczne, ośmiokąt 6-AsortymentVWR, PA58948-025Materiał ogólny
Dialdehyd malonowy bis (octan dimetylu)SIGMA, MO8207560250TBARS Standardowy
spektrofotometr mikropłytkowy Multiskan GoFisher Scientific, NH51119200Do pomiaru absorbancji
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLodczynnik do lizy komórek
Chlorek soduSIGMA, MOS7653-1KGodczynnik do lizy komórek
Dodecylosiarczan sodu (SDS)SIGMA, MO436143-100GOdczynnik TBARS
Wodorotlenek soduSIGMA, MO367176-2.5KGOdczynnik TBARS
Koncentrator SpeedVacThermo Scientific, MASC250EXPDo koncentratoryzacja lizatów komórkowych
Kolba T-75, poddawana działaniu kultur tkankowych, 250 mL, z nasadką filtrującąUSA Scientific, FL658175hodowla komórkowa
Kwas tiobarbiturowySIGMA, MOT5500-100GTBARS Odczynnik
TRIS na bazieFluka, GA93362odczynnik do lizy komórek
Trypsyna (1x)VWR, PA16777-166Do odłączania komórek HepG2
101642

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Thiobarbituric Acid Reactive SubstancesTBARS AssayLipid PeroxidationOxidative StressMalondialdehydeSpectrophotometric AnalysisBiological SamplesStandard Curve PreparationHeating Block IncubationAbsorbance Measurement

Powiązane artykuły