Celem testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego jest ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych poprzez pomiar produkcji produktów peroksydacji lipidów, głównie dialdehydu malonowego, przy użyciu spektrofotometrii o długości fali widzialnej przy długości fali 532 nm. Opisana tutaj metoda może być stosowana do ludzkiej surowicy, lizatów komórkowych i lipoprotein o niskiej gęstości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych za pomocą testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo ograniczonej specyfiki analitycznej i wytrzymałości, test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) jest szeroko stosowany jako ogólny wskaźnik peroksydacji lipidów w płynach biologicznych. Często uważa się, że jest dobrym wskaźnikiem poziomu stresu oksydacyjnego w próbce biologicznej, pod warunkiem, że próbka była odpowiednio obsługiwana i przechowywana. Test polega na reakcji produktów peroksydacji lipidów, przede wszystkim dialdehydu malonowego (MDA), z kwasem tiobarbiturowym (TBA), co prowadzi do powstania adduktówMDA-TBA2 zwanych TBARS. TBARS daje czerwono-różowy kolor, który można zmierzyć spektrofotometrycznie przy 532 nm. Test TBARS przeprowadza się w warunkach kwaśnych (pH = 4) i w temperaturze 95 °C. Czysty MDA jest niestabilny, ale warunki te pozwalają na uwolnienie MDA z MDA bis(octan dimetylu), który jest stosowany jako wzorzec analityczny w tej metodzie. Test TBARS jest prostą metodą, którą można wykonać w ciągu około 2 godzin. Przygotowanie odczynników do oznaczania jest szczegółowo opisane tutaj. Badacze dbający o budżet mogą używać tych odczynników do wielu eksperymentów przy niskich kosztach, zamiast kupować drogi zestaw testowy TBARS, który pozwala na skonstruowanie tylko jednej krzywej wzorcowej (a zatem może być użyty tylko w jednym eksperymencie). Zastosowanie tego testu TBARS wykazano w surowicy ludzkiej, lipoproteinach o niskiej gęstości i lizatach komórkowych. Test jest spójny i powtarzalny, a granice wykrywalności mogą zostać osiągnięte na poziomie 1,1 μM. Podano zalecenia dotyczące stosowania i interpretacji spektrofotometrycznego testu TBARS.
Wprowadzenie
Peroksydacja lipidów to proces, w którym wolne rodniki, takie jak reaktywne formy tlenu i reaktywne formy azotu, atakują podwójne wiązania węgiel-węgiel w lipidach, proces, który polega na abstrahowaniu wodoru z węgla i wstawieniu cząsteczki tlenu. Proces ten prowadzi do powstania mieszaniny złożonych produktów, w tym nadtlenków lipidowych i wodoronadtlenków jako produktów pierwotnych, a także dialdehydu malonowego (MDA) i 4-hydroksynonenalu jako dominujących produktów wtórnych1.
MDA jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych jako marker peroksydacji lipidów ze względu na łatwą reakcję z kwasem tiobarbiturowym ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Próbki ludzkiej surowicy zostały pobrane od ochotników, którzy wyrazili zgodę na to za zgodą IRB i zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Próbki zostały zakodowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed przekazaniem do laboratorium analitycznego.
1. Przygotowanie próbki
- Lizaty komórek HepG2
- Wysiewać około 10 x 106 komórek HepG2 na kolbę w 16 kolbach T75 z 14 ml pożywki EMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i rosnąć komórki przez 2 dni.
- Przygotuj bufor RIPA: do probówki o pojemności 50 ml dodaj 1,5 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M Tris-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W warunkach kwasowych (pH = 4) i w temperaturze 95 °C malonodialdehyd (MDA) bis(dimetyloacetal) tworzy MDA23. MDA oraz blisko spokrewnione związki chemiczne reagują z dwiema cząsteczkami kwasu tiobarbiturowego (TBA), tworząc związki zwane substancjami reagującymi z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), które nadają barwę czerwoną do różowej i wykazują maksimum absorbancji λmax przy 532 nm (Rysunek 1, Rysunek 2). Używając MDA bis(dime.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo swoich ograniczeń 1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 i braku przydatności do porównania między laboratoriami, test TBARS jest jednym z najstarszych <.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Opisane tutaj badania były częściowo wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody nr R33 CA217702 oraz programu Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x Sterylny PBS pH 7,4 1 L | VWR, PA | --262 | odczynnik do lizy komórek |
| 50 ml samostojąca probówka wirówkowa | Corning, NY | CLS430897 | Materiał ogólny |
| Płytka 96-dołkowa, nieobrobiona, przezroczysta, z pokrywką, niesterylna | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | Do pomiaru absorbancji |
| Amicon Ultra-0,5 100 kD odśrodkowy filtr wirowy | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | Oczyszczanie LDL |
| Nasadki do probówek szklanych | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | do testu TBARS |
| Chlorek miedzi II | SIGMA, MO | 222011-250G | do indukcji utleniania |
| Probówki hodowlane, jednorazowe, z nakrętką, szkło borokrzemianowe (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | do testu TBARS |
| Minimalna niezbędna pożywka Eagle'a (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | Pożywka komórkowa HepG2 |
| Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml | eppendorf, Nowy Jork | 22363204 | Materiał ogólny |
| Probówki Eppendorf Safe-Lock, 2,0 ml | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | Materiał ogólny |
| Surowica bydlęca płodu USA Źródło | : Omega Scientific, CA | FB-11 | do hodowli komórkowych |
| Lodowaty kwas octowy | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Odczynnik |
| Halt Inhibitor proteazy Koktajl (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | odczynnik do lizy komórek |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | Rozpuszczalnik |
| LDL Komórki HepG2 | ATCC, VA | HB-8065 | Prototyp matrycy biologicznej |
| Kwas hydrokwarowy (HCl) | Fisher Scientific, odczynnik | ||
| do lizy komórek NH A144-212Wirówka Legend Micro 17 | Thermo Scientific, MA | 75002431 | Materiał ogólny |
| Lipoproteiny o niskiej gęstości, osocze ludzkie | Badania i Technologia, GA | 12-16-120412 | Prototyp matrycy biologicznej |
| Mieszacze magnetyczne, ośmiokąt 6-Asortyment | VWR, PA | 58948-025 | Materiał ogólny |
| Dialdehyd malonowy bis (octan dimetylu) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standardowy |
| spektrofotometr mikropłytkowy Multiskan Go | Fisher Scientific, NH | 51119200 | Do pomiaru absorbancji |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | odczynnik do lizy komórek |
| Chlorek sodu | SIGMA, MO | S7653-1KG | odczynnik do lizy komórek |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | Odczynnik TBARS |
| Wodorotlenek sodu | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | Odczynnik TBARS |
| Koncentrator SpeedVac | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | Do koncentratoryzacja lizatów komórkowych |
| Kolba T-75, poddawana działaniu kultur tkankowych, 250 mL, z nasadką filtrującą | USA Scientific, FL | 658175 | hodowla komórkowa |
| Kwas tiobarbiturowy | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Odczynnik |
| TRIS na bazie | Fluka, GA | 93362 | odczynnik do lizy komórek |
| Trypsyna (1x) | VWR, PA | 16777-166 | Do odłączania komórek HepG2 |
Bibliografia
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
