Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Summary

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Abstract

Identyfikacja specyficznych interakcji białko-DNA w genomie jest ważna dla zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) jest szeroko stosowana do identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących DNA w całym genomie. Jednak metoda ChIP-seq jest ograniczona przez niejednorodność długości sonikowanych fragmentów DNA i niespecyficznego DNA tła, co skutkuje niską rozdzielczością mapowania i niepewnością co do miejsc wiązania DNA. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, połączenie ChIP z trawieniem egzonukleazą (ChIP-exo) wykorzystuje trawienie egzonukleazą od 5' do 3' w celu przycięcia niejednorodnej wielkości immunologicznego DNA do miejsca sieciowania białko-DNA. Leczenie egzonukleazą eliminuje również niespecyficzne DNA tła. Przygotowane w bibliotece i strawione egzonukleazą DNA można wysłać do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ChIP-exo pozwala na rozdzielczość mapowania blisko par zasad z większą czułością wykrywania i zmniejszonym sygnałem tła. Zoptymalizowany protokół ChIP-exo dla komórek ssaków i sekwencjonowania nowej generacji opisano poniżej.

Introduction

Lokalizacje interakcji białko-DNA dostarczają wglądu w mechanizmy regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) jest stosowana od dekady do badania interakcji białko-DNA w całym genomie w żywych komórkach^1,2. Jednak metoda ChIP-seq jest ograniczona przez niejednorodność fragmentacji DNA i zanieczyszczenie niezwiązanego DNA, które prowadzą do niskiej rozdzielczości mapowania, wyników fałszywie dodatnich, nieodebranych połączeń i niespecyficznego sygnału tła. Połączenie ChIP z trawieniem egzonukleazą (ChIP-exo) ulepsza metodę ChIP-seq poprzez przyci....

Protocol

UWAGA: Autoklawowana woda destylowana i dejonizowana (ddH₂O) jest zalecana do tworzenia i głównych mieszanek reakcji. Sekcje 1−4 opisują lizę i sonikację komórek, sekcje 5−7 opisują immunoprecypitację chromatyny (ChIP), sekcje 8−11 opisują reakcje enzymatyczne na kulkach, sekcje 12 i 13 opisują elucję ChIP i oczyszczanie DNA, a sekcje 14−19 opisują przygotowanie biblioteki.

1. Zbieranie i sieciowanie komórek

1. Po różnicowaniu mysich komórek ES w neurony postmitotyczne, dodaj 11% formaldehydu do pobranych komórek do końcowego stężenia 1% (v/v). Komórki skalne na platformie kołyszącej (kołysce, wytrząsarc....

Results

Rysunek 2A ilustruje wyniki sonikacji po lizie komórek i sonikacji, z różnymi cyklami, komórek neuronu ruchowego różnicowanych od mysich komórek ES. Optymalna liczba cykli sonikacji (na przykład 12 cykli w Rysunek 2A) generowała silną intensywność DNA we fragmentach DNA o długości 100−400 pz. Wysokiej jakości biblioteki ChIP-exo opierają się na wielkości i ilości pofragmentowanego DNA chromatyny. W związku z tym zaleca się optymalizację sonikacji dla każdego typu komórki .......

Discussion

W tym protokole ChIP, po którym następuje trawienie egzonukleazą, jest wykorzystywane do uzyskania bibliotek DNA do identyfikacji interakcji białko-DNA w komórkach ssaków w bardzo wysokiej rozdzielczości mapowania. Na jakość eksperymentu ChIP-exo składa się wiele zmiennych. Krytyczne parametry eksperymentalne obejmują jakość przeciwciał, optymalizację sonikacji oraz liczbę cykli LM-PCR. Te krytyczne parametry eksperymentalne są również tym, co może ograniczać eksperymenty ChIP-exo i zostaną omówione poniżej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agaroza, UltraPure	Invitrogen	16500	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.6) i oczyszczanie żelem amplifikowanego DNA LM-PCR (sekcja 19.1)
Albumina, surowica bydlęca (BSA), wolna od proteazy, izolacja szoku cieplnego, min. 98%	BioShop	ALB003	Roztwór blokujący
Przeciwciało przeciwko Isl1	DSHB	39.3F7	Inkuacja przeciwciała z kulkami (sekcja 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp;	Diagenoda	B01060010	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.3)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), klasa biologii molekularnej	New England BioLabs	B9000S	Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie startera i rozszerzanie startera (sekcja 14.2)
Wirówka 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonikacja chromatyny (sekcja 3.5), kontrola sonikacji (sekcja 4.3.1, 4.3.3 i 4.3.4)
Wirówka 5804 R	Eppendorf	22623508	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3), liza komórek (sekcja 2.2 i 2.3), sonikacja chromatyny (sekcja 3.1)
cOmpete, Mini, wolny od EDTA inhibitor proteazy Koktajl	Roche	4693159001	Dodawany do wszystkich, z wyjątkiem buforu proteinazy K i buforu elucyjnego ChIP
Roztwór dATP	New England BioLabs	N0440S	Reakcja dA-tailing (sekcja 15.1)
Kwas deoksycholowy Sól sodowa	fisher scientific	BP349	Bufor do lizy 3, Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i Bufor do płukania LiCl
dNTP Mix, Klasa biologii molekularnej	Thermo Scientific	R0192	Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie i rozszerzanie podkładu (sekcja 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x	Thermo Scientific	K1081	PCR z podwiązaniem (sekcja 18.1)
EDTA, 0,5 M, sterylny roztwór, pH 8,0	BioShop	EDT111	Bufor do lizy 1-3, kontrola sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor płuczący LiCl i bufor elucyjny ChIP
Bezwodny alkohol etylowy, 100%	alkohole handlowe	P006EAAN	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
Formaldehyd, 36,5-38%, zawiera 10-15% metanol	Sigma	F8775	Żniwa, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.1)
Glicerol, klasa odczynnika, min 99,5%	BioShop	GLY002	Bufor do lizy 1
Glicyna, klasa biotechnologiczna, min. 99%	BioShop	GLN001	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.2)
Glikogen, klasa RNA	Thermo Scientific	R0551	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
HEPES, 1 M sterylnie przefiltrowany roztwór, pH 7,3	BioShop	HEP003	Bufor do lizy 1, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Fragment Klenowa (3->5 egzo-)	New England BioLabs	M0212S	Reakcja dA-ogonowa (sekcja 15.1)
Egzonukleaza lambda	Nowa Anglia BioLabs	M0262S	Trawienie egzonukleazą lambda na kulkach (sekcja 11.2)
Wzmacniacz ligazy	New England BioLabs	E7645S	Zestaw biblioteki DNA NEBNext Ultra II. Ligacja adaptera indeksowego na koralikach (sekcja 9.1) i uniwersalna ligacja adaptera (sekcja 16.1)
Ligase Master Mix	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Indeks Ligacja adaptera na kulkach (sekcja 9.1) i uniwersalna ligacja adaptera (sekcja 16.1)
Chlorek litu (LiCl), odczynnik Bioshop		LIT704	LiCl Wash Buffer
Kulki magnetyczne do ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)	Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)	Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5)
Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA (AMPure XP Beads)	Beckman Coulter	A63880	Ekstrakcja DNA (sekcja 13.3) i oczyszczanie DNA (sekcja 17.1)
Stojak magnetyczny (magnes DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Używany w wielu krokach w sekcjach: 5 - 11, 13
Zestaw do ekstrakcji żelu MinElute	Qiagen	28604	Oczyszczanie żelowe amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.2)
Roztwór soli sodowej N-lauroilosarkozyny, 30% roztwór wodny, ≥ 97,0% (HPLC)	Sigma	61747	Bufor do lizy 3
Etoksylan oktylofenolu (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	Bufor do lizy 1 i bufor do płukania LiCl
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy, klasa biotechnologiczna (25:24:1)	BioShop	PHE512	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.1)
Polimeraza DNA phi29	New England BioLabs	M0269L	Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie i przedłużanie gruntu (sekcja 14.3 i 14.4)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x	Corning	21040CV	Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3) oraz chromatyna sonikująca (sekcja 3.1), inkubacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.1)
Podstawowy zasilacz PowerPac	BioRad	1645050	sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.6) i oczyszczanie żelem amplifikowanego DNA LM-PCR (sekcja 19.1)
System ProFlex PCR	System Biosystems stosowany	System	ProFlex PCRstosowany w sekcjach: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 i 18.2
Białkowa rurka LoBind, 2,0 mL	Eppendorf	22431102	Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5.2) i immunoprecypitacja chromatyny (sekcja 6.3)
Roztwór proteinazy K,	25530049	invitrogenu	Sonikacja (sekcja 4.2) oraz elucja i odwrotne sieciowanie (sekcja 12.3)
Fluorometr Qubit 4.0	Invitrogen	Q33226	Oczyszczanie żelowe amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.3)
Test BR Quibit dsDNA zestaw	Invitrogen	Q32853	Żelowe oczyszczanie amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.3)
Rnaza A, Dnazy i wolne od proteazy	Thermo Scientific	EN0531	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.2) i ekstrakcji DNA (sekcja 13.2)
Chlorek sodu (NaCl), Bioodczynnik	Sigma	S5886	Bufor do lizy 1-3, Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Dodecylosiarczan sodu (SDS), klasa elektroforezy	BioShop	SDS001	Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i bufor elucyjny ChIP
Koraliki soniczne i 15 ml probówek Bioruptor	Diagenoda	C01020031	Chromatyna sonikująca (sekcja 3.1 i 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Sekcja 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 i 16.2
Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 7,4	Sigma	T2194	10 mM Tris-HCl Bufor
roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 8,0	Sigma	T2694	Bufor do lizy 2, bufor do lizy 3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor płuczący LiCl i
moduł naprawczy końca elucyjnego Ultra II Ultra II (24 rxn -> 120 rxn)	New England BioLabs	E7546S	Mieszanka reakcyjna przygotowania końcowego i mieszanina enzymów przygotowania końcowego. Naprawa końcowa i reakcja ogona dA na kulkach (sekcja 8.2)
VWR Mini Tube Rocker, zmienna prędkość	VWR	10159-752	Stosowany w wielu etapach w sekcjach: 1, 2, 5, 6 i 7
2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol, Triton X-100, odczynnik BioShop		TRX506	Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (sekcja 3.4) i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli