Artykuł metodologiczny

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

DOI:

10.3791/61124

⸱

14 sierpnia 2020

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja specyficznych interakcji białko-DNA w genomie jest ważna dla zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) jest szeroko stosowana do identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących DNA w całym genomie. Jednak metoda ChIP-seq jest ograniczona przez niejednorodność długości sonikowanych fragmentów DNA i niespecyficznego DNA tła, co skutkuje niską rozdzielczością mapowania i niepewnością co do miejsc wiązania DNA. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, połączenie ChIP z trawieniem egzonukleazą (ChIP-exo) wykorzystuje trawienie egzonukleazą od 5' do 3' w celu przycięcia niejednorodnej wielkości immunologicznego DNA do miejsca sieciowania białko-DNA. Leczenie egzonukleazą eliminuje również niespecyficzne DNA tła. Przygotowane w bibliotece i strawione egzonukleazą DNA można wysłać do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ChIP-exo pozwala na rozdzielczość mapowania blisko par zasad z większą czułością wykrywania i zmniejszonym sygnałem tła. Zoptymalizowany protokół ChIP-exo dla komórek ssaków i sekwencjonowania nowej generacji opisano poniżej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokalizacje interakcji białko-DNA dostarczają wglądu w mechanizmy regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) jest stosowana od dekady do badania interakcji białko-DNA w całym genomie w żywych komórkach1,2. Jednak metoda ChIP-seq jest ograniczona przez niejednorodność fragmentacji DNA i zanieczyszczenie niezwiązanego DNA, które prowadzą do niskiej rozdzielczości mapowania, wyników fałszywie dodatnich, nieodebranych połączeń i niespecyficznego sygnału tła. Połączenie ChIP z trawieniem egzonukleazą (ChIP-exo) ulepsza metodę ChIP-seq poprzez przycinanie DNA ChIP do punktów sieciowania białko-DNA, zapewniając rozdzielczość bliską parom zasad i niski sygnał tła3,4,5. Znacznie lepsza rozdzielczość mapowania i niskie tło zapewniane przez ChIP-exo pozwalają na dokładne i kompleksowe określenie lokalizacji wiązania białko-DNA w całym genomie. ChIP-exo jest w stanie ujawnić funkcjonalnie odrębne motywy wiążące DNA, kooperacyjne interakcje między czynnikami transkrypcyjnymi (TF) i wiele miejsc sieciowania białko-DNA w określonym miejscu wiązania genomu, niewykrywalne przez inne metody mapowania genomowego3,4,6,7.

ChIP-exo było początkowo używane w pączkujących drożdżach do zbadania specyficznego dla sekwencji wiązania DNA TF, do zbadania precyzyjnej organizacji kompleksu transkrypcyjnego przed inicjacją i subnukleosomalnej struktury poszczególnych histonów w całym genomie4,8,9. Od czasu wprowadzenia w 2011 roku4, ChIP-exo jest z powodzeniem stosowany w wielu innych organizmach, w tym w bakteriach, myszach i komórkach ludzkich7,10,11,12,13,14,15,16,17. W 2016 roku Rhee et al.14 po raz pierwszy zastosowali ChIP-exo w neuronach ssaków, aby zrozumieć, w jaki sposób ekspresja genów neuronalnych została utrzymana po obniżeniu programowania TF Lhx3, który tworzy kompleks heterodimerowy z innym programującym TF Isl1. Badanie to wykazało, że przy braku Lhx3, Isl1 jest rekrutowany do nowych wzmacniaczy neuronalnych związanych przez Onecut1 TF w celu utrzymania ekspresji genów efektorowych neuronów. W tym badaniu ChIP-exo ujawniło, w jaki sposób wiele TF dynamicznie rozpoznaje typ komórki i elementy regulatorowe DNA specyficzne dla etapu komórki w sposób kombinatoryczny przy rozdzielczości mapowania bliska nukleotydom. W innych badaniach wykorzystano również metodę ChIP-exo, aby zrozumieć wzajemne oddziaływanie między białkami a DNA w innych liniach komórkowych ssaków. Han et al.7 użyli ChIP-exo do zbadania organizacji całego genomu TF GATA1 i TAL1 w mysich komórkach erytroidalnych za pomocą ChIP-exo. Badanie to wykazało, że TAL1 jest rekrutowany bezpośrednio do DNA, a nie pośrednio poprzez interakcje białko-białko z GATA1 podczas różnicowania erytroidalnego. W ostatnich badaniach wykorzystano również ChIP-exo do profilowania lokalizacji wiązania CTCF w całym genomie, polimerazy RNA II i znaczników histonów w celu zbadania mechanizmów epigenomicznych i transkrypcyjnych w ludzkich liniach komórkowych18,19.

Dostępnych jest kilka wersji protokołu ChIP-exo3,5,20. Jednak te protokoły ChIP-exo są trudne do naśladowania dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z przygotowywaniem bibliotek sekwencjonowania nowej generacji. Opublikowano doskonałą wersję protokołu ChIP-exo z łatwymi do wykonania instrukcjami i video21, ale zawierała wiele etapów enzymatycznych, które wymagają znacznej ilości czasu na wykonanie. W tym miejscu przedstawiamy nową wersję protokołu ChIP-exo zawierającą zredukowane etapy enzymatyczne i czasy inkubacji oraz wyjaśnienia dla każdego kroku enzymatycznego21. Reakcje naprawy końcówki i ogonowania dA są łączone w jednym kroku za pomocą enzymu przygotowania końca. Czas inkubacji dla etapów podwiązania indeksowego i uniwersalnego adaptera został skrócony z 2 godzin do 15 minut przy użyciu wzmacniacza ligacji. Reakcja kinazy po etapie ligacji adaptera indeksowego opisanym w poprzednim protokole ChIP-exo jest usuwana. Zamiast tego grupa fosforanowa jest dodawana podczas syntezy oligo DNA do jednego z końców 5' adaptera indeksowego (Tabela 1), który zostanie wykorzystany do etapu trawienia egzonukleazą lambda. Podczas gdy poprzedni protokół ChIP-exo wykorzystywał trawienie egzonukleazą RecJf w celu wyeliminowania jednoniciowych zanieczyszczeń DNA, ten etap trawienia jest tutaj usuwany, ponieważ nie jest krytyczny dla jakości biblioteki ChIP-exo. Ponadto, w celu oczyszczenia usieciowanego DNA po elucji ChIP, zamiast metody ekstrakcji fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (PCIA) stosuje się metodę oczyszczania kulek magnetycznych. Skraca to czas inkubacji ekstrakcji DNA. Co ważne, usuwa większość dimerów adapterowych powstających podczas ligacji adaptera indeksowego, co może mieć wpływ na skuteczność PCR za pośrednictwem ligacji.

Przedstawiony tutaj protokół ChIP-exo jest zoptymalizowany do wykrywania precyzyjnych interakcji białko-DNA w neuronach ssaków zróżnicowanych od mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES). Krótko mówiąc, zebrane i usieciowane komórki neuronalne są poddawane lizie, aby umożliwić poddanie chromatyny działaniu sonikacji, a następnie sonikowane, aby uzyskać fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości (Ryc. 1). Kulki pokryte przeciwciałami są następnie wykorzystywane do selektywnego immunoprecypitacji fragmentarycznej, rozpuszczalnej chromatyny do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy immunoprecypitowane DNA nadal znajduje się na kulkach, przeprowadza się naprawę końcową, ligację adapterów sekwencjonowania, reakcję wypełnienia i etapy trawienia egzonukleazą lambda od 5 do 3 stóp. Etap trawienia egzonukleazą jest tym, co nadaje ChIP-exo ultrawysoką rozdzielczość i wysoki stosunek sygnału do szumu. Egzonukleaza lambda przycina immunologicznie wytrącone DNA o kilka par zasad (bp) od miejsca sieciowania, powodując w ten sposób degradację zanieczyszczającego DNA. DNA ChIP poddane działaniu egzonukleazy jest eluowane z kulek pokrytych przeciwciałem, wiązania krzyżowe białko-DNA są odwracane, a białka ulegają degradacji. DNA jest ekstrahowane i denaturowane do jednoniciowego DNA ChIP, a następnie wyżarzanie i wydłużanie starterów w celu wytworzenia dwuniciowego DNA (dsDNA). Następnie wykonuje się podwiązanie uniwersalnego adaptera do końców poddanych działaniu egzonukleazy. Powstałe DNA jest oczyszczane, a następnie amplifikowane metodą PCR, oczyszczane żelem i poddawane sekwencjonowaniu nowej generacji.

Protokół ChIP-exo jest dłuższy niż protokół ChIP-seq, ale nie jest zbyt trudny technicznie. Każde pomyślnie immunoprecypitowane DNA ChIP może zostać poddane działaniu ChIP-exo, z kilkoma dodatkowymi etapami enzymatycznymi. Godne uwagi zalety ChIP-exo, takie jak ultrawysoka rozdzielczość mapowania, zmniejszony sygnał tła oraz zmniejszona liczba wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w odniesieniu do miejsc wiązania genomu, przewyższają koszt czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Autoklawowana woda destylowana i dejonizowana (ddH2O) jest zalecana do tworzenia i głównych mieszanek reakcji. Sekcje 1−4 opisują lizę i sonikację komórek, sekcje 5−7 opisują immunoprecypitację chromatyny (ChIP), sekcje 8−11 opisują reakcje enzymatyczne na kulkach, sekcje 12 i 13 opisują elucję ChIP i oczyszczanie DNA, a sekcje 14−19 opisują przygotowanie biblioteki.

1. Zbieranie i sieciowanie komórek

  1. Po różnicowaniu mysich komórek ES w neurony postmitotyczne, dodaj 11% formaldehydu do pobranych komórek do końcowego stężenia 1% (v/v). Komórki skalne na platformie kołyszącej (kołysce, wytrząsarce lub rotatorze) przez 15 minut, w temperaturze pokojowej (RT, 25 °C).
    UWAGA: W zależności od białka docelowego, które ma być usieciowane, można zastosować mniej sieciowania formaldehydu (na przykład stężenie końcowe 0,5%) lub podwójne sieciowanie glutaranem disuccinimidylu (DSG).
  2. Dodać 2,5 M glicyny do końcowego stężenia 150 mM, aby zatrzymać reakcję sieciowania. Skalne komory na bujanej platformie przy dużym natężeniu ruchu, przez 5 min.
  3. Odwirować usieciowane komórki w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej, przez 6 minut, przy 1 350 x g. Odessać roztwór, a następnie ponownie zawiesić komórki w 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Usieciowane granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu ciekłym azotem.

2. Liza komórek

UWAGA: Poniższe kroki w tym protokole dotyczą około 2 x 107 komórek neuronalnych zróżnicowanych z mysich komórek ES. Aby rozbić otwarte komórki, zostaną użyte do lizy zawierające różne detergenty. Dodaj 50 μl 1000x kompletnego inhibitora proteazy (CPI) do 50 ml buforu tuż przed użyciem.

  1. Przygotować do lizy 1−3 zgodnie z opisem w tabeli 2.
  2. Rozmrozić usieciowane granulki komórkowe na lodzie, a następnie dokładnie zawiesić granulki komórkowe w 3 ml buforu do lizy 1 na 15 ml stożkowych probówek. Kołysz się w temperaturze 4 °C przez 15 minut na bujanej platformie. Wirować przy 1,350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odsysać supernatant.
  3. Dokładnie zawiesić granulowane komórki w 3 ml buforu do lizy 2. Kołysz się w temperaturze 4 °C przez 10 minut na bujanej platformie. Wirować przy 1,350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odsysać supernatant.
  4. Dodaj 1 ml buforu do lizy 3 do każdej granulki, a następnie trzymaj na lodzie. Natychmiast przystąp do sonikacji.

3. Sonikacja chromatyny

UWAGA: Trzymaj próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C podczas tej procedury sonikacji, aby zmniejszyć odwrócenie sieciowania.

  1. Za pomocą sterylnej szpatułki dodaj koraliki sonikacyjne (Tabela materiałów) do kreski podziałki 0,2 ml na rurkach z polistyrenu o pojemności 15 ml. Umyj kulki sonikacyjne poprzez wirowanie w 600 μL 1x PBS, aż nie będą widoczne suche plamy. Wirować probówki przez 5 s przy 30 x g i odssać 1x PBS.
    UWAGA: Sonikacja w rurkach polistyrenowych jest bardziej efektywna niż sonikacja w rurkach polipropylenowych. Jeśli mniejsza liczba komórek (na przykład <106 komórek) jest poddawana sonikacji, należy użyć probówek polistyrenowych o pojemności 1,5 ml bez dodawania kulek sonikacyjnych.
  2. Dokładnie zawiesić lizaty jądrowe w 1 ml buforu do lizy 3 (od kroku 2.4), a następnie przenieść do probówek polistyrenowych o pojemności 15 ml zawierających kulki sonikacyjne. Krótko wymieszaj rurki styropianowe.
  3. Aby rozdrobnić usieciowane DNA chromatyny, należy poddać sonikacji lizaty jądrowe w temperaturze 4 °C przez zoptymalizowaną liczbę cykli, z amplitudą mocy 30 W i cyklami sonikacji ustawionymi na 30 s wł.
    UWAGA: Optymalizacja sonikacji dla każdego typu komórki i partii zaowocuje najlepszą wydajnością ChIP-exo. W przypadku komórek neuronalnych myszy 2 x 107 20−30 cykli sonikacji przy wymienionych ustawieniach spowoduje fragmentację chromatyny w zakresie 100−500 pz.
  4. Po zakończeniu sonikacji przenieść cały supernatant (sonikowane lizaty) z każdej próbki do probówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanolu) do każdej próbki w końcowym stężeniu 1%. Wymieszać pipetując.
  5. Aby osadzać resztki komórek, należy odwirować próbki o masie 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść wszystkie sonikowane lizaty (supernatant) z każdej próbki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
  6. Weź 30 μl sonikowanego lizatu z każdej próbki (~3% sonikowanego lizatu) i dodaj do nowych probówek o pojemności 1,5 ml, aby sprawdzić sonikację. Pozostałe sonikowane lizaty przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do inkubacji z kulkami pokrytymi przeciwciałami.

4. Sprawdzanie sonikacji

  1. Przygotuj 20 ml buforu 2x proteinazy K, dodając 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml 0,5 M EDTA, 10 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 6 ml autoklawizowanego ddH2O. Nie dodawaj CPI do tego bufora. Przechowywać w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.
  2. Aby odwrócić usieciowanie białko-DNA, poprzez usunięcie białek, należy pobrać 30 μl sonikowanej chromatyny z każdej próbki (z kroku 3.6), dodać 166 μL autoklawizowanego ddH2O, 200 μL buforu 2x proteinazy K i 4 μL 20 mg/ml proteinazy K. Krótko zawirować próbki, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez 1-3 godziny przy 24 x g.
  3. UWAGA: Sonikowane lizaty mogą być sieciowane wstecznie w temperaturze 65 °C przez noc.
  4. Ekstrahować DNA za pomocą PCIA (25:24:1) i metody wytrącania etanolu w następujący sposób.
    UWAGA: PCIA jest toksyczna. Stosować pod wyciągiem wyciągowym ze standardowymi środkami ochrony osobistej (PPE).
    1. Dodać 400 μl PCIA do każdej próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml, ustawić wir na maksymalną prędkość i wirować próbki przez 20 s. Wirować przy 18 400 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Obserwowane będą dwie fazy. Ostrożnie przenieść górną warstwę wodną (przezroczystą fazę) każdej próbki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    3. Dodać 1 μl glikogenu 20 mg/ml do każdej próbki, a następnie wytłoć 1 ml lodowatego 100% etanolu (przechowywanego w zamrażarce o temperaturze -20 °C). Krótko wymieszać, a następnie inkubować próbki w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez 30 minut do 1 godziny. Odwirować próbki o masie 18 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie wylać 100% etanol.
    4. Umyj granulki 500 μl lodowatego 70% etanolu (przechowywanego w zamrażarce o temperaturze -20 °C). Wirować przy 18 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wylać 70% etanolu.
    5. Próbki należy inkubować w probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze 50 °C, aż do odparowania pozostałego etanolu. Zawiesić osady DNA w 15 μl autoklawizowanego ddH2O lub ddH2O wolnego od nukleaz.
    6. Uruchom wyekstrahowane próbki DNA, wraz z drabinką DNA, w 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120−180 V i sprawdź rozmiar sonizowanego DNA.

5. Inkubacja przeciwciał z koralikami

UWAGA: Poniższe kroki w tym protokole dotyczą około 2 x 107 komórek neuronalnych zróżnicowanych z mysich komórek ES. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj kulek magnetycznych w żadnym momencie protokołu ChIP-exo, ponieważ kulki mogą pęknąć, powodując zanieczyszczenie próbki lub działanie przeciwciała może być zagrożone.

  1. Po lizie komórek i sonikacji przygotuj kulki magnetyczne białka G (tabela materiałów) dla ChIP, wymieszaj kulki magnetyczne do uzyskania jednorodności, a następnie dodaj 25 μl kulek magnetycznych do 2 ml probówek białkowych o niskim wiązaniu.
    UWAGA: Rodzaj użytych kulek magnetycznych będzie zależał od gatunku przeciwciał.
  2. Umyj koraliki 1 ml roztworu blokującego (Tabela 2), dobrze wymieszaj, a następnie umieść na ruszcie magnetycznym na 1 min. Będąc jeszcze na stojaku magnetycznym, usuń supernatant, gdy będzie czysty.
  3. Dodaj 1 ml roztworu blokującego do kulek magnetycznych. Rury skalne przez 10 minut w temperaturze 4 °C na platformie bujanej. Krótko zakręć, a następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
  4. Powtórz krok 5.3 jeszcze dwa razy.
  5. Dodaj 500 μl roztworu blokującego do kulek magnetycznych. Krótko odkręć przeciwciało przeciwko Isl1 (0,04 μg/μL, tabela materiałów), a następnie dodaj 4 μg przeciwciała do odpowiednich 2 ml probówek białkowych o niskim poziomie wiązania zawierających kulki magnetyczne w roztworze blokującym.
  6. Powtórzyć krok 5.5 bez przeciwciała (tj. kontrola bez przeciwciał dla ChIP).
    UWAGA: Ilość przeciwciała do dodania można określić empirycznie, biorąc pod uwagę jakość przeciwciała i liczbę komórek użytych do ChIP.
  7. Próbki skał w temperaturze 4 °C przez 6−24 h na platformie bujanej.

6. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

  1. Przemyć kulki pokryte przeciwciałami z kroku 5.8 1 ml roztworu blokującego. Umieścić próbki na platformie bujanej w temperaturze 4 °C na 5 minut. Usunąć supernatant.
  2. Powtórz krok 6.1 jeszcze dwa razy.
  3. Ponownie zawiesić kulki pokryte przeciwciałami w 50 μl roztworu blokującego, a następnie przenieść do nowych probówek o niskiej zawartości białka o pojemności 2 ml. Do każdej próbki ChIP dodać sonikowane lizaty (~1,0 ml z kroku 3.6) do kulek pokrytych przeciwciałami w probówkach o niskim poziomie wiązania białka o pojemności 2 ml.
  4. Każdą próbkę inkubować na platformie kołyszącej przez noc w temperaturze 4 °C.

7. ChIP myje

UWAGA: Przechowuj próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby utrzymać sieciowanie białko-DNA podczas płukania ChIP.

  1. Przygotować bufor do przemywania o wysokiej zawartości soli, bufor do płukania LiCl i 10 mM bufor Tris-HCl (pH 7,4), jak opisano w Tabeli 3. Przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. Dodać 50 μl zapasu 1000x CPI do wszystkich tuż przed użyciem.
  2. Krótko odwiruj próbki w probówkach o pojemności 2 ml o niskim poziomie wiązania białka, aby zebrać płyn z nakrętek, a następnie umieść je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety.
  3. W przypadku przemywania ChIP dodać 1 ml buforu do lizy 3 (w temperaturze 4 °C) do każdej probówki. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  4. Dodaj 1 ml zimnego buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do każdej probówki. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  5. Do każdej probówki dodać 1 ml zimnego buforu do płukania LiCl. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
  6. Dodać 1 ml zimnego 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,4) do każdej probówki. Mieszać na bujanej platformie w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Krótko odwirować próbki, następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.
    UWAGA: Bufor Tris-EDTA (pH 8,0) może być stosowany zamiast buforu Tris-HCl (pH 7,4).
  7. Powtórz kroki 7.4−7.6 trzy razy.
  8. Przenieść kulki próbki z 500 μl buforu Tris-HCl (pH 7,4) do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml. Krótko odwirować próbki, a następnie umieścić je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usunąć supernatant za pomocą pipety.

8. Reakcja na naprawę końcową i dA-tailing na koralikach

UWAGA: Sonikacja często generuje nietępo zakończone dsDNA. Reakcja naprawy końca jest wymagana do wytworzenia tępo zakończonego DNA przed reakcją ogona dA, po której następuje etap ligacji adaptera wskaźnikowego. W przypadku ligacji DNA na lepkim końcu z adapterem indeksowym DNA, dATP dodaje się do końca 3' fragmentu dsDNA w reakcji ogonowania dA. Mieszanina reakcyjna przygotowania końcowego zawiera dATP.

  1. Po przepłukaniu ChIP dodać 38 μl autoklawizowanego ddH2O do kulek próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml w celu naprawy końcówki i reakcji ogonowania dA.
  2. Do każdej próbki (całkowita objętość reakcji: 46 μl) dodać 5,6 μl mieszaniny reakcyjnej z końcowym przygotowaniem i 2,4 μl mieszanki enzymatycznej z końcowym przygotowaniem (tabela materiałów). Próbki należy inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut.
  3. Umyj koraliki zgodnie z opisem w poprzednich krokach prania ChIP 7.4−7.6.

9. Podwiązanie adaptera indeksu na koralikach

UWAGA: Adapter indeksu ma 6−10 baz sekwencji indeksów z kodami kreskowymi, które są specyficzne dla danej próbki używanej do multipleksowania wielu próbek w sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości. Sekwencje indeksowego adaptera DNA opisano w tabeli 1.

  1. W przypadku ligacji adaptera indeksowego dodać 27 μl zimnego 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,4) do kulek próbki. Do każdej próbki dodać 2 μl adaptera indeksu 15 μM, 0,5 μl wzmacniacza ligacji i 15 μl głównej mieszanki ligazy (tabela materiałów) (całkowita objętość reakcji: 44,5 μl).
  2. Próbki inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut. Umyć kulki zgodnie z opisem w krokach 7.4−7.6.

10. Reakcja wypełniania na koralikach

UWAGA: Po ligacji adaptera, nie ma wiązania fosfodiestrowego między końcem 5' adaptera a końcem 3' DNA ChIP. Nacięcie można naprawić przez reakcję wypełniania.

  1. Dodać 47 μl zimnego 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,4) do kulek próbki.
  2. Sporządzić mieszaninę reakcyjną do napełniania (tabela 4 i tabela materiałów) na lodzie.
  3. Do każdej próbki dodać 11,1 μl mieszanki wypełniającej (całkowita objętość reakcji: 58,1 μl). Próbki inkubować w temperaturze 30 °C przez 20 minut. Umyj koraliki zgodnie z opisem w krokach 7.4−7.6.

11. Trawienie egzonukleazą lambda na kulkach

  1. Po reakcji wypełniania na kulkach dodać 50 μl zimnego autoklawizowanego ddH2O do kulek próbki.
  2. Aby roztrawić DNA ChIP w kierunku od 5' do 3', dodaj 6 μl 10x buforu egzonukleazy lambda i 2 μl 5 U/μL egzonukleazy lambda (tabela materiałów, całkowita objętość reakcji: 58 μL). Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Umyj koraliki zgodnie z opisem w krokach 7.4−7.6.

12. Elucja i odwrotne sieciowanie

  1. Utworzyć bufor elucyjny ChIP zgodnie z opisem w tabeli 5.
    UWAGA: Nie dodawaj CPI do bufora elucji ChIP.
  2. Aby wymyć próbki ChIP z kulek, należy ponownie zawiesić próbki w 75 μl buforu elucyjnego ChIP i inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut przy 130 g.
  3. Dodać 2,5 μl 20 mg/ml proteinazy K (tabela materiałów) do próbek. Krótko wirować, a następnie inkubować próbki przez noc w temperaturze 65 °C.

13. Ekstrakcja DNA

  1. Po nocnej inkubacji próbek w temperaturze 65 °C należy krótko odwirować próbki, umieścić na stojaku magnetycznym na 1 minutę, a następnie przenieść supernatant z każdej próbki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A do próbek. Krótko zawirować, a następnie inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodać ~25 μL autoklawizowanego ddH2O do objętości do 100 μL.
  3. Oczyść DNA za pomocą kulek magnetycznych (Tabela materiałów). Eluować DNA za pomocą 16 μl autoklawizowanego ddH2O lub wolnego od nukleaz ddH2O.

14. Denaturacja, wyżarzanie i przedłużanie gruntu

  1. Po elucji ChIP i odwrotnym sieciowaniu przenieś 16 μl wyekstrahowanych próbek DNA z kroku 13.3 do probówek PCR.
  2. Przygotować mieszankę do denaturacji i wyżarzania gruntującego (tabela 6 i tabela materiałów) na lodzie. Do każdej próbki dodać 1,2 μl mieszanki denaturującej i wyżarzającej starter (całkowita objętość reakcji: 17,2 μl). Uruchomić próbki za pomocą programu opisanego w Tabeli 6 w celu denaturacji i wyżarzania starterów do matrycy DNA.
  3. Przygotuj mieszankę przedłużającą podkład (tabela 7 i tabela materiałów) na lodzie.
  4. Po zakończeniu programu denaturacji i wyżarzania starterów dodać do próbek 3 μl mieszanki przedłużającej starter (całkowita objętość reakcji: 20,2 μl). Uruchom próbki za pomocą programu do przedłużania startera opisanego w Tabeli 7.
  5. Natychmiast przejdź do reakcji dA-tailing.

15. reakcja dA-tailing

UWAGA: Dla licytacji lepkiego końca DNA z uniwersalnym adapterem DNA, dATP jest dodawane do końca 3', dsDNA w reakcji ogonowania dA.

  1. Przygotować mieszankę dA-tailing (Tabela 8 i Tabela Materiałów) na lodzie.
  2. Do każdej próbki dodać 4,1 μl mieszaniny dA-tailing (całkowita objętość reakcji: 24,3 μl). Uruchom próbki za pomocą programu do dA-tailing (Tabela 8).
  3. Natychmiast przystąp do uniwersalnego podwiązania adaptera.

16. Podwiązanie adaptera uniwersalnego

UWAGA: Uniwersalny adapter zawiera sekwencje specyficzne dla sekwencjonowania o wysokiej przepustowości do rozpoznawania próbek DNA dla chemii sekwencjonowania. Uniwersalne sekwencje adaptacyjnego DNA opisano w tabeli 1.

  1. Po reakcji dA-tailing należy przygotować uniwersalną mieszankę do ligacji adaptera (tabela 9 i tabela materiałów) do uniwersalnego podwiązania adaptera.
  2. Dodać 21,5 μl do każdej próbki (całkowita objętość reakcji: 45,8 μl) i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 20 °C.

17. Oczyszczanie DNA

  1. Oczyść DNA za pomocą kulek magnetycznych (Tabela materiałów). Eluować DNA za pomocą 21 μl autoklawizowanego ddH2O lub ddH2O wolnego od nukleaz.
  2. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia procedury PCR (LM-PCR) i oczyszczania metodą PCR za pośrednictwem ligacji.

18. PCR z podwiązaniem

UWAGA: sekwencje starterów LM-PCR są opisane w Tabeli 1.

  1. Po oczyszczeniu DNA przygotuj mieszankę LM-PCR (Tabela 10 i Tabela materiałów) na lodzie.
  2. Dodać 29 μl mieszanki LM-PCR do każdej próbki (całkowita objętość reakcji: 50 μl) i uruchomić próbki za pomocą programu LM-PCR (Tabela 10).
  3. Natychmiast przystąp do oczyszczania żelowego amplifikowanego DNA PCR, a następnie oczyszczania DNA w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

19. DNA zamplifikacją DNA metodą LM-PCR

  1. Amplifikowane próbki DNA LM-PCR wraz z drabinką DNA należy umieścić w 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120−180 V i wyciąć pasma 200–400 pz.
  2. Oczyść DNA z wyciętego żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów).
  3. Po oczyszczeniu DNA sprawdź stężenie (tabela materiałów) każdej próbki biblioteki ChIP-exo. Przesyłanie próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości na potrzeby sekwencjonowania pojedynczego odczytu.
    UWAGA: Preferowana długość odczytu dla sekwencjonowania pojedynczego odczytu wynosi co najmniej 35 pz, co jest wystarczające do jednoznacznego dopasowania odczytów sekwencjonowania do genomu referencyjnego w komórkach mysich lub ludzkich. W przypadku większości czynników transkrypcyjnych w komórkach mysich lub ludzkich wystarczy 10-20 milionów odczytów na próbkę ChIP-exo, aby zidentyfikować ich lokalizacje wiązania genomowego. Do zmapowania regionów genomu wzbogaconych w znaczniki histonów w komórkach ssaków wymagane jest co najmniej 30 milionów odczytów na próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2A ilustruje wyniki sonikacji po lizie komórek i sonikacji, z różnymi cyklami, komórek neuronu ruchowego różnicowanych od mysich komórek ES. Optymalna liczba cykli sonikacji (na przykład 12 cykli w Rysunek 2A) generowała silną intensywność DNA we fragmentach DNA o długości 100−400 pz. Wysokiej jakości biblioteki ChIP-exo opierają się na wielkości i ilości pofragmentowanego DNA chromatyny. W związku z tym zaleca się optymalizację sonikacji dla każdego typu komórki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole ChIP, po którym następuje trawienie egzonukleazą, jest wykorzystywane do uzyskania bibliotek DNA do identyfikacji interakcji białko-DNA w komórkach ssaków w bardzo wysokiej rozdzielczości mapowania. Na jakość eksperymentu ChIP-exo składa się wiele zmiennych. Krytyczne parametry eksperymentalne obejmują jakość przeciwciał, optymalizację sonikacji oraz liczbę cykli LM-PCR. Te krytyczne parametry eksperymentalne są również tym, co może ograniczać eksperymenty ChIP-exo i zostaną omówione poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkowi laboratorium Rhee za udostępnienie niepublikowanych danych i cennych dyskusji. Prace te były wspierane przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) RGPIN-2018-06404 (HR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza, UltraPureInvitrogen16500Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.6) i oczyszczanie żelem amplifikowanego DNA LM-PCR (sekcja 19.1)
Albumina, surowica bydlęca (BSA), wolna od proteazy, izolacja szoku cieplnego, min. 98%BioShopALB003Roztwór blokujący
Przeciwciało przeciwko Isl1DSHB39.3F7Inkuacja przeciwciała z kulkami (sekcja 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp;DiagenodaB01060010Sonikacja chromatyny (sekcja 3.3)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), klasa biologii molekularnejNew England BioLabsB9000SReakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie startera i rozszerzanie startera (sekcja 14.2)
Wirówka 5424 REppendorf5404000138Sonikacja chromatyny (sekcja 3.5), kontrola sonikacji (sekcja 4.3.1, 4.3.3 i 4.3.4)
Wirówka 5804 REppendorf22623508Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3), liza komórek (sekcja 2.2 i 2.3), sonikacja chromatyny (sekcja 3.1)
cOmpete, Mini, wolny od EDTA inhibitor proteazy KoktajlRoche4693159001Dodawany do wszystkich, z wyjątkiem buforu proteinazy K i buforu elucyjnego ChIP
Roztwór dATPNew England BioLabsN0440SReakcja dA-tailing (sekcja 15.1)
Kwas deoksycholowy Sól sodowafisher scientificBP349Bufor do lizy 3, Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i Bufor do płukania LiCl
dNTP Mix, Klasa biologii molekularnejThermo ScientificR0192Reakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie i rozszerzanie podkładu (sekcja 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x Thermo ScientificK1081PCR z podwiązaniem (sekcja 18.1)
EDTA, 0,5 M, sterylny roztwór, pH 8,0BioShopEDT111Bufor do lizy 1-3, kontrola sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli, bufor płuczący LiCl i bufor elucyjny ChIP
Bezwodny alkohol etylowy, 100%alkohole handloweP006EAANSprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
Formaldehyd, 36,5-38%, zawiera 10-15% metanolSigmaF8775Żniwa, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.1)
Glicerol, klasa odczynnika, min 99,5%BioShopGLY002Bufor do lizy 1
Glicyna, klasa biotechnologiczna, min. 99%BioShopGLN001Zbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.2)
Glikogen, klasa RNAThermo ScientificR0551Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.3)
HEPES, 1 M sterylnie przefiltrowany roztwór, pH 7,3 BioShopHEP003Bufor do lizy 1, bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Fragment Klenowa (3->5 egzo-)New England BioLabsM0212SReakcja dA-ogonowa (sekcja 15.1)
Egzonukleaza lambdaNowa Anglia BioLabsM0262STrawienie egzonukleazą lambda na kulkach (sekcja 11.2)
Wzmacniacz ligazyNew England BioLabsE7645SZestaw biblioteki DNA NEBNext Ultra II. Ligacja adaptera indeksowego na koralikach (sekcja 9.1) i uniwersalna ligacja adaptera (sekcja 16.1)
Ligase Master MixNew England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA Library Kit. Indeks Ligacja adaptera na kulkach (sekcja 9.1) i uniwersalna ligacja adaptera (sekcja 16.1)
Chlorek litu (LiCl), odczynnik BioshopLIT704LiCl Wash Buffer
Kulki magnetyczne do ChIP (Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)Dynabeads Protein G (kulki magnetyczne do ChIP)Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5)
Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA (AMPure XP Beads)Beckman CoulterA63880Ekstrakcja DNA (sekcja 13.3) i oczyszczanie DNA (sekcja 17.1)
Stojak magnetyczny (magnes DynaMag-2)Invitrogen12321DUżywany w wielu krokach w sekcjach: 5 - 11, 13
Zestaw do ekstrakcji żelu MinEluteQiagen 28604Oczyszczanie żelowe amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.2)
Roztwór soli sodowej N-lauroilosarkozyny, 30% roztwór wodny, ≥ 97,0% (HPLC)Sigma61747Bufor do lizy 3
Etoksylan oktylofenolu (IGEPAL CA630)BioShopNON999Bufor do lizy 1 i bufor do płukania LiCl
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy, klasa biotechnologiczna (25:24:1)BioShopPHE512Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.1)
Polimeraza DNA phi29New England BioLabsM0269LReakcja wypełniania na kulkach (sekcja 10.2) i denaturacja, wyżarzanie i przedłużanie gruntu (sekcja 14.3 i 14.4)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x Corning21040CVZbieranie, sieciowanie i zamrażanie komórek (sekcja 1.3) oraz chromatyna sonikująca (sekcja 3.1), inkubacja przeciwciał za pomocą kulek (sekcja 5.1)
Podstawowy zasilacz PowerPacBioRad1645050sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.6) i oczyszczanie żelem amplifikowanego DNA LM-PCR (sekcja 19.1)
System ProFlex PCRSystem Biosystems stosowanySystemProFlex PCRstosowany w sekcjach: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 i 18.2
Białkowa rurka LoBind, 2,0 mL Eppendorf22431102Inkubacja przeciwciał z kulkami (sekcja 5.2) i immunoprecypitacja chromatyny (sekcja 6.3)
Roztwór proteinazy K,25530049invitrogenuSonikacja (sekcja 4.2) oraz elucja i odwrotne sieciowanie (sekcja 12.3)
Fluorometr Qubit 4.0InvitrogenQ33226Oczyszczanie żelowe amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.3)
Test BR Quibit dsDNA zestawInvitrogenQ32853Żelowe oczyszczanie amplifikowanego DNA PCR (sekcja 19.3)
Rnaza A, Dnazy i wolne od proteazyThermo ScientificEN0531Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.3.2) i ekstrakcji DNA (sekcja 13.2)
Chlorek sodu (NaCl), Bioodczynnik SigmaS5886Bufor do lizy 1-3, Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
Dodecylosiarczan sodu (SDS), klasa elektroforezyBioShopSDS001Sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor do płukania o wysokiej zawartości soli i bufor elucyjny ChIP
Koraliki soniczne i 15 ml probówek BioruptorDiagenodaC01020031Chromatyna sonikująca (sekcja 3.1 i 3.2)
ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020Sekcja 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 i 16.2
Roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 7,4SigmaT219410 mM Tris-HCl Bufor
roztwór chlorowodorku Trizma (Tris-HCl), z certyfikatem BioPerformance, 1 M, pH 8,0SigmaT2694Bufor do lizy 2, bufor do lizy 3, sprawdzanie sonikacji (sekcja 4.1), bufor płuczący LiCl i
moduł naprawczy końca elucyjnego Ultra II Ultra II (24 rxn -> 120 rxn)New England BioLabsE7546SMieszanka reakcyjna przygotowania końcowego i mieszanina enzymów przygotowania końcowego. Naprawa końcowa i reakcja ogona dA na kulkach (sekcja 8.2)
VWR Mini Tube Rocker, zmienna prędkośćVWR10159-752Stosowany w wielu etapach w sekcjach: 1, 2, 5, 6 i 7
2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol, Triton X-100, odczynnik BioShopTRX506Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (sekcja 3.4) i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
kontrola klasy RNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
  3. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147(2013).
  4. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  5. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
  6. Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
  7. Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
  8. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
  10. Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
  11. Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
  12. Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
  13. Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
  14. Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
  15. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
  16. Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
  17. Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
  18. McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030(2018).
  19. Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033(2019).
  20. Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).
  21. Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  22. Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
  23. Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  24. Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
  25. Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
  26. Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
  27. Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ChIP ExoProtein DNA InteractionsMouse Stem CellsChromatin ImmunoprecipitationLambda ExonucleaseHigh Resolution MappingIslet 1 AntibodyMagnetic BeadsNext Generation SequencingTranscription Factor Binding

Powiązane artykuły