Artykuł metodologiczny

Rozszyfrowywanie strukturalnych skutków aktywacji mutacji somatycznych EGFR za pomocą symulacji dynamiki molekularnej

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61125

⸱

20 maja 2020

 ,  ,  , 
1Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering, Åbo Akademi University, 2Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine, University of Turku, 3Turku Bioscience Centre, University of Turku and Åbo Akademi University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, University of Turku and Turku University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest wykorzystanie symulacji dynamiki molekularnej do zbadania dynamicznych zmian strukturalnych, które zachodzą w wyniku aktywacji mutacji białka kinazy EGFR.

Streszczenie

Liczne mutacje somatyczne występujące w rodzinie receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) (ErbB) receptorowych kinaz tyrozynowych (RTK) zostały zgłoszone u pacjentów z rakiem, chociaż stosunkowo niewiele z nich zostało przebadanych i wykazano, że powodują funkcjonalne zmiany w ErbB. Receptory ErbB są dimeryzowane i aktywowane po związaniu liganda, a dynamiczne zmiany konformacyjne receptorów są nieodłączne dla indukcji dalszej sygnalizacji. Dla dwóch mutacji, które wykazano eksperymentalnie, że zmieniają funkcję EGFR, A702V i mutacji delecyjnej Δ746ELREA750, ilustrujemy w poniższym protokole, w jaki sposób symulacje dynamiki molekularnej (MD) mogą badać (1) stabilność konformacyjną struktury zmutowanej kinazy tyrozynowej w porównaniu z EGFR typu dzikiego; (2) konsekwencje strukturalne i przemiany konformacyjne oraz ich związek z obserwowanymi zmianami funkcjonalnymi; (3) wpływ mutacji na siłę wiązania ATP, jak również na wiązanie między domenami kinazy w aktywowanym dimerze asymetrycznym; oraz (4) wpływ mutacji na kluczowe interakcje w obrębie miejsca wiązania EGFR związanego z aktywowanym enzymem. Protokół zawiera szczegółową procedurę krok po kroku, a także wytyczne, które mogą być bardziej ogólnie przydatne do badania struktur białkowych przy użyciu symulacji MD jako środka do badania dynamiki strukturalnej i związku z funkcjami biologicznymi.

Wprowadzenie

Rodzina ludzkich receptorów epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR) (ErbB), będąca grupą receptorowych tyrozynowych kinaz (RTKs), obejmuje czterech członków: EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 oraz ErbB4/HER4. Receptory ErbB regulują podstawowe procesy komórkowe, takie jak wzrost i proliferacja komórek, różnicowanie, migracja i przeżycie1,2, przez co stanowią silne protoonkogeny. Nieprawidłowa aktywność receptorów ErbB, zwłaszcza EGFR i ErbB2, jest często powiązana z nowotworami u ludzi, co sprawia, że receptory ErbB są kluczowymi celami dla terapii przeciwnowotworowych2,3.

W nowotworach ludzkich zgłoszono szereg somatycznych zmian w genach ERBB3,4,5. Do najlepiej opisanych przykładów należą nawracające, aktywujące mutacje punktowe oraz krótkie delecje wewnątrzramkowe w domenie kinazy EGFR w niedrobnokomórkowym raku płuca (NSCLC). Mutacje EGFR te stanowią kluczowe czynniki napędzające wzrost nowotworu i pozwalają przewidzieć wrażliwość na leki przeciwnowotworowe celowane w EGFR6,7,8. Jednak w większości nowotworów mutacje somatyczne w EGFR występują poza tymi nawracającymi „punktami zapalnymi” (hotspots) i są rozłożone na całym obszarze 1210 reszt receptora. W rzeczywistości stwierdzono, że większość reszt w sekwencji pierwotnej EGFR ulega mutacjom w nowotworach ludzkich9. Niemniej jednak, poza nielicznymi punktami zapalnymi, znaczenie funkcjonalne ogromnej większości mutacji EGFR związanych z rakiem pozostaje nieznane.

Struktura monomeryczna receptorów ErbB składa się z dużej, aminokońcowej domeny zewnątrzkomórkowej, po której następuje pojedyncza helisa transbłonowa prowadząca do wewnątrzkomórkowej domeny tyrozynowej kinazy oraz regionu ogona C-końcowego, który zawiera miejsca dokowania dla wewnątrzkomórkowych białek sygnałowych. Wiązanie ligandu wywołuje gwałtowną zmianę konformacyjną w domenie zewnątrzkomórkowej, co ułatwia tworzenie dimerów receptorowych poprzez odsłonięcie ramion dimeryzacyjnych, które symetrycznie krzyżują się i oddziałują ze sobą swoimi powierzchniami aromatycznymi/hydrofobowymi. Po utworzeniu dimeru receptorowego domeny tyrozynowej kinazy stykają się asymetrycznie (Rysunek 1), co prowadzi do aktywacji kinaz, które fosforylują ogony C-końcowe monomerów receptora, a w konsekwencji do aktywacji szlaków sygnałowych poniżej (10,1).

Schemat szlaku sygnalizacyjnego EGFR, przedstawiający aktywację kinazy w obrębie błony komórkowej oraz wiązanie EGF.
Rysunek 1: Struktura dimeru EGFR. EGFR dimerizuje, gdy domeny zewnątrzkomórkowe wiążą czynnik wzrostu (EGF, czynnik wzrostu naskórka). Domena kinazy odbiorczej zostaje następnie aktywowana poprzez asymetryczną interakcję z domeną kinazy aktywującej, a końce C-terminalne ulegają autofosforylacji w obrębie reszt tyrozynowych (Zmodyfikowano na podstawie Tamirat et al.12). Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.

Ze względu na dynamiczne reorganizacje strukturalne, które zachodzą podczas monomeru Koncepcja równowagi chemicznej; równanie reakcji; proces dynamiczny; reakcja odwracalna; stan równowagi. przejścia dimerów, wraz z aktywacją kinazy związaną z tworzeniem asymetrycznego dimeru, sprawiają, że mutacje w całej strukturze receptora mogą potencjalnie wpływać na jego funkcję. Opisujemy tutaj kilka przykładów z naszych poprzednich badań, w których modelowanie mutacji oraz wizualizacja były wystarczające do wyjaśnienia skutków dla funkcji.

Przykład 1: Jedna z opisanych mutacji, D595V w ErbB413, prowadziła do zwiększonej dimeryzacji i fosforylacji ErbB414. Wizualizacja lokalizacji mutacji była kluczowym czynnikiem w zrozumieniu obserwowanych efektów funkcjonalnych: D595V wystąpiła w symetrycznym punkcie przecięcia ramion dimeru ektodomeny (Rysunek 2A). Ramiona te są w dużej mierze aromatyczne i hydrofobowe, a zastąpienie polarnego kwasu asparaginowego waliną powinno zwiększyć hydrofobowe oddziaływania typu „sticky”, stabilizując dimer i tym samym wydłużając czas trwania fosforylacji14. Początkowo obecność asparaginianu w każdym ramieniu była zaskoczeniem, ale z perspektywy czasu można to uznać za mechanizm czasowy regulujący aktywność, w którym polarne łańcuchy boczne kwasu zmniejszają powinowactwo i czas życia nienaruszonego dimeru, a tym samym ograniczają fosforylację i sygnalizację zależną od kinazy. Zastąpienie go waliną usuwa ten mechanizm zabezpieczający poprzez dalszą stabilizację dimeru ErbB4.

Schemat oddziaływań białko-ligand z oznaczonymi aminokwasami D595, G802, D861; analiza strukturalna.
Rysunek 2: Lokalizacja aktywującej mutacji ErbB4 oraz mutacji powodujących powstanie nieaktywnej kinazy ErbB4. (A) D595 (aktywująca mutacja D595V) znajduje się na aromatycznych/hydrofobowych ramionach dimerycznych modelu domeny zewnątrzkomórkowej ErbB4; ramiona łączą się podczas wiązania czynnika wzrostu; (bliskie reszty przedstawiono w formie kikutów). (B) W białku ErbB4 G802 (nieaktywująca mutacja G802dup) pomaga tworzyć kieszeń wiążącą wokół pierścienia adeninowego ATP, a katalityczny D861 (nieaktywująca mutacja D861Y) wiąże oba jony Mg2+ (nie pokazano) oraz grupa γ-fosforanowa ATP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przykład 2: Można przypuszczać, że mutacje somatyczne celujące w miejsce wiązania ATP domeny kinazy zmieniłyby lub zniosły aktywność enzymatyczną, prowadząc do powstania upośledzonego lub nieaktywnego kinazy receptora, niezdolnego do przesyłania sygnałów. Z dziewięciu zgłoszonych mutacji u pacjentów z rakiem piersi, żołądka, jelita grubego lub NSCLC15, dwie z dziewięciu mutacji w testach wykazały znacznie zmniejszoną aktywność fosforylacyjną16: G802dup (G → GG) oraz D861Y. Obie inaktywujące mutacje somatyczne znajdowały się w miejscu wiązania ATP struktury domeny tyrozynowej kinazy (Rysunek 2B): elastyczna glicyna, zduplikowana, zmieniłaby miejsce pierścienia adeniny, a mały kwas asparaginy zastąpiony przez rozbudowaną tyrozynę w pobliżu fosforanów końcowych fizycznie uniemożliwiłby wiązanie Mg2+-ATP. Jednakże, ponieważ ErbB4 może tworzyć heterodimer z ErbB2 – ErbB2 nie wiąże czynnika wzrostu i zależy od asocjacji z ErbB, który taki czynnik wiąże, aby ulegnąć heterodimeryzacji – heterodimer ErbB2(aktywny)-ErbB4(nieaktywny kinazy) stymulowałby proliferację komórek poprzez szlak sygnałowy Erk/Akt, lecz komórki nie uległyby różnicowaniu z powodu nieaktywnego kinazy ErbB4 i braku aktywacji szlaku STAT516.

W nowszych badaniach stało się jasne, że dynamiczne ruchy białek ErbB są istotne dla zrozumienia wpływu niektórych mutantów na funkcję ErbB, szczególnie w przypadku mutacji występujących w obrębie domeny tyrozynowej kinazy. Domena tyrozynowej kinazy składa się z płata N (głównie arkusze β) i płata C (w przeważającej mierze helisy alfa), które są rozdzielone centrum katalitycznym, w którym wiąże się ATP. Płat N obejmuje helisę αC oraz pętlę P, natomiast pętla aktywacyjna (A-loop) i pętle katalityczne znajdują się w płacie C17,18,19. Struktury krystaliczne domeny tyrozynowej kinazy ujawniły dwie nieaktywne konformacje, przy czym większość struktur wykazuje nieaktywny stan typu Src. W konformacji aktywnej asparaginian katalityczny pętli A jest skierowany w stronę miejsca wiązania ATP, a helisa αC jest zorientowana w stronę kieszeni wiążącej ATP (konformacja „αC-in”), co tworzy silną oddziaływanie pary jonowej glutaminian-lizyna.

Ponieważ białka ErbB oraz tworząca je domena kinazy są bytami wysoce dynamicznymi, a zwłaszcza w przypadkach, gdy wpływ mutacji na funkcję i aktywność biologiczną jest prawdopodobnie ściśle powiązany ze stanami konformacyjnymi białek ErbB, istotne jest ocenianie mutacji w odniesieniu do zakresu zmian dynamicznych, jakich mogą one ulec. Struktury krystalograficzne ErbB uzyskane metodą rentgenowską stanowią statyczne obrazy struktury 3D, które mogą, ale nie muszą, mieć znaczenie dla zrozumienia dynamicznych skutków mutacji. Aby zbadać zakres zmian dynamicznych odpowiadających „krajobrazowi energetycznemu” dostępnemu dla struktury trójwymiarowej (3D), powszechnie stosuje się symulacje dynamiki molekularnej (MD)20. W przypadku mutacji prowadzących do lokalnych zmian konformacyjnych w obrębie domeny tyrozynowej kinazy lub stabilizacji kompleksu, symulacje rzędu 10 ns mogą być wystarczające. Jednakże zmiany konformacyjne na większą skalę (np. przejścia między konformacją aktywną a nieaktywną domeny kinazy) wymagają dłuższego czasu symulacji – rzędu mikrosekund21.

W odniesieniu do opisanego poniżej protokołu rozważamy dwie mutacje aktywujące w obrębie domeny tyrozynowej kinazy (Rysunek 3). Obie mutacje znajdują się w domenie kinazy w miejscach, w których zachodzą lokalne zmiany konformacyjne decydujące o aktywności kinazy, dlatego w obu przypadkach zastosowano symulacje MD. W pierwszym przypadku analizujemy zmiany bezpośrednio wpływające na miejsce wiązania ATP i mechanizm katalityczny domeny kinazy odbiorczej EGFR, badając w szczególności konsekwencje delecji w eksonie 19, która jest powszechnie powiązana z NSCLC4,7. Mutacja Δ746ELREA750, która skraca pętlę β3-αC poprzedzającą helisę αC – helisę, która podczas aktywacji kinazy przesuwa się w stronę miejsca wiązania/aktywnego i uczestniczy w tworzeniu kluczowej oddziaływania elektrostatycznego między E762 helisy a K745 poprzez odpowiednie ustawienie lizyny do oddziaływania z ATP – predysponuje domenę do aktywacji12. W drugim przypadku rozważamy mutację A702V EGFR, która okazała się nową aktywującą mutacją typu gain-of-function ujawnioną przez platformę iScream9 i zidentyfikowaną u pacjenta z NSCLC2. Alanina-702 w domenie kinazy odbiorczej znajduje się w segmencie B obszaru przybłonastowego, na styku domen kinazy odbiorczej i aktywatora, gdzie ten asymetryczny kompleks dimeru kinaz oraz zmiany konformacyjne kinazy są niezbędne do aktywacji9.

Trójwymiarowy schemat oddziaływań kinazy, struktura białka, aktywator i odbiornik, badanie z zakresu biologii molekularnej.
Rysunek 3: Asymetryczny dimer domeny kinazy EGFR. Mutacja A702V znajdowałaby się na krytycznym interfejsie domen kinazy aktywatora i kinazy odbiornika, w sąsiedztwie helisy αC oraz blisko izoleucyny 941 kinazy aktywatora. Zmiany konformacyjne wywołane tworzeniem się asymetrycznego dimeru prowadzą do aktywacji kinazy. Pętla β3-αC zawierająca sekwencję ELREA bezpośrednio poprzedza helisę αC; podczas aktywacji helisa αC przesuwa się do wewnątrz w kierunku miejsca wiązania ATP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Protokół

UWAGA: Szczegółowe kroki podjęte w celu zbadania wpływu mutacji ΔELREA i A702V na strukturę EGFR za pomocą symulacji MD są omówione w następujący sposób:

1. Przygotowanie struktury

UWAGA: W celu zbadania strukturalnych skutków mutacji ΔELREA, dzikie i zmutowane formy aktywnych apo, aktywnych i nieaktywnych struktur monomeru EGFR związanych z ATP są przygotowywane w następujący sposób.

  1. Otwórz program wizualizacyjny Chimera23 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/), aby przygotować strukturę aktywnej kinazy EGFR typu dzikiego. W menu Plik kliknij opcję Pobierz według identyfikatora i wybierz bazę danych Protein Data Bank (PDB24) i określ kod PDB 2GS225 (rozdzielczość 2,8 A). PDB jest repozytorium struktur 3D rozwiązywanych za pomocą różnych technik eksperymentalnych, w tym krystalografii rentgenowskiej, spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, mikroskopii krioelektronowej i dyfrakcji neutronów.
  2. Zbuduj brakujące elementy konstrukcyjne 2GS2, pobierając te segmenty ze struktur EGFR PDB 1M1426 (2.6 A) i 3W2S27 (1.9 A). Aby to zrobić, otwórz 1M14 i 3W2S i nałóż je na 2GS2 za pomocą opcji MatchMaker w menu Narzędzia → Porównanie struktur.
    1. Wytnij segmenty, które mają zostać dodane, z 1M14 i 3W2S. Wybrać końcowe atomy reszty przed przerwami w 2GS2 oraz atomy do dodania z 1M14 i 3W2S (szczegółowe informacje na temat dodanych segmentów znajdują się w tabeli 1). W wierszu poleceń wpisz bond sel i naciśnij Enter. Ta struktura jest strukturą szablonu.
  3. Użyj struktury szablonu z kroku 1.2, aby skonstruować zmutowaną formę delecji ΔELREA domeny kinazy EGFR. Utwórz sekwencję w formacie FASTA ΔELREA EGFR, zapisując sekwencję struktury szablonu (Ulubiona sekwencja → → Plik → zapisz jako), a następnie usuwając sekwencję ELREA pod numerami pozostałości 746-750.
    1. Otwórz sekwencję ΔELREA EGFR w Chimerze i wyrównaj ją z sekwencją struktury szablonu 2GS2 za pomocą menu Sekwencja. W oknie wyrównania wybierz opcję Structure → Modeller (homology)28.
    2. W oknie podręcznym określ strukturę złożoną 2GS2 jako szablon, a sekwencję mutantów jako zapytanie, które ma być modelowane. Następnie naciśnij przycisk OK. Wybierz model mutanta spośród wynikowych modeli, na podstawie wyniku zDOPE (zazwyczaj najniższego wyniku) i oględzin.
  4. Aby przygotować strukturę kinazy EGFR typu dzikiego związaną z ATP, należy użyć struktury PDB 2ITX29 (2,98 A) jako struktury głównej. Zbuduj brakujące segmenty (patrz Tabela 1) przy użyciu struktur 2GS625 (2.6 A) i 3W2S, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.2. Przekształć ligand ANP w wynikowej strukturze na ATP, otwierając plik PDB w edytorze tekstu i zmieniając atom azotu N3B ANP na atom tlenu.
  5. Otwórz strukturę w kroku 1.4 w Chimerze, jak podano w kroku 1.1. Dodaj jon magnezu do tej struktury ze struktury PDB 2ITN29 (2,47 A) w celu uzyskania podobnego położenia dla jonu Mg2+.
  6. Ze strukturą wynikającą z kroku 1.5 modeluj zmutowaną formę ΔELREA zgodnie z krokiem 1.3.
Apo active EGFRApo nieaktywny EGFRAktywny EGFR związany z ATP
Główna strukturaZobacz materiał 2GS2Zobacz materiał 2GS72ITX
Struktury używane do budowy brakujących pętli1M14 (723-725)3W2S (958-984)2GS6 (862-865)
3W2S (967-981)4HJO (848-850)3W2S (990-1001)

Tabela 1: Struktury używane do budowy złożonych modeli aktywnych struktur apo, nieaktywnych apo i ATP. Brakujące regiony (zakres aminokwasów w nawiasach) w strukturze głównej zostały zbudowane z wymienionych struktur.

  1. Aby przygotować strukturę nieaktywnej kinazy EGFR typu dzikiego, otwórz strukturę PDB 2GS725 (2.6 A) jak w kroku 1.1 i usuń związane ligandy i wody krystalograficzne. Dodaj brakujące segmenty w 2GS7 (patrz Tabela 1) ze struktur 3W2S i 4HJO30 (2.75 A), korzystając z procedury opisanej w kroku 1.2. Na podstawie końcowej nieaktywnej struktury EGFR przygotuj model mutanta, korzystając z procedury opisanej w kroku 1.3.
    UWAGA: W przypadku badania mutacji A702V badana jest asymetryczna struktura dimerów EGFR, ponieważ mutacja znajduje się w segmencie B błony przybłonowej domeny kinazy, która stanowi dużą część interfejsu dimerów. Struktury EGFR typu dzikiego i zmutowane A702V przygotowuje się w następujący sposób:
  2. Asymetryczna struktura dimerów typu dzikiego jest zbudowana ze struktury PDB 2GS2, która początkowo jest wyświetlana w postaci monomerycznej. Aby przekształcić się w zespół biologiczny, który zawiera kinazy aktywatora i odbiornika w układzie asymetrycznym, otwórz 2GS2 w Chimerze jak w (1.1) i przeprowadź obliczenia symetrii, klikając menu Narzędzia → Struktura wyższego rzędu → Komórka elementarna. Wybierz strukturę 2GS2 i wprowadź Utwórz kopie. Na koniec wybierz i zapisz pojedynczy asymetryczny dimer z wielu kopii dimeru wynikających z operacji symetrii.
  3. Korzystając z asymetrycznej struktury EGFR typu dzikiego z kroku 1.8, zbuduj mutanta A702V, zastępując alaninę 702 waliną, korzystając z opcji Narzędzia → edycji struktury → Rotamery w Chimera.
    UWAGA: Łącznie przygotowano sześć monomerycznych i dwie dimeryczne struktury EGFR do badań mutacji ΔELREA i A702V. Każda struktura jest następnie przetwarzana do symulacji za pomocą kreatora przygotowania białka w programie Maestro31, a symulacje MD są wykonywane za pomocą Amber program32.
  4. Otwórz strukturę w Maestro za pomocą opcji Plik → importuj strukturę. Następnie kliknij na przycisk kreatora przygotowania białka i wybierz: dodaj atomy wodoru, zbuduj brakujące atomy łańcucha bocznego, określ stany protonacji reszt jonizowalnych przy pH 7,0 za pomocą PROPKA, zoptymalizuj orientację reszt asparaginy, glutaminy i histydyny do wiązania wodorowego, a na koniec zminimalizuj strukturę.

2. Ustawienia systemu

  1. Otwórz program skokowy zawarty w pakiecie oprogramowania Amber. Zaimportuj pole siłowe ff14SB 33 (źródło leaprc.protein.ff14SB) i cząsteczki wody TIP3P34 (źródło leaprc.water.tip3p). Dla systemów powiązanych z ATP należy również zaimportować parametry dla ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep). Następnie załaduj strukturę (mol = loadpdb structure.pdb).
  2. Roztworować strukturę w oktaedrycznym pudełku z wyraźnymi cząsteczkami wody TIP3P, które rozciągają się na 10 A we wszystkich kierunkach od atomów powierzchniowych białka (solwateoct mol TIP3PBOX 10,0).
  3. Sprawdź zbudowany system (Sprawdź mol) i zneutralizuj go, dodając niezbędne jony (addions mol Na+ 0). Aby wystarczająco modelować układy biomolekularne, dodaj dodatkowe atomy Na+/Cl- do pola symulacji, aby doprowadzić stężenie soli w układzie do 0,15 M (addions mol Na+ X, addions mol Cl- X), gdzie X jest zastępowane przez wynik: pożądane stężenie soli * liczba cząsteczek wody * objętość na cząsteczkę wody * liczba Avogadro.
  4. Wygeneruj i zapisz pliki topologii i współrzędnych systemu, które służą jako dane wejściowe do późniejszej symulacji produkcji (saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).

3. Symulacja dynamiki molekularnej

  1. Korzystając z bursztynu, początkowo poddaj system symulacji 5000 cyklom najbardziej stromego zejścia i sprzężonej minimalizacji energii gradientu, aby obejść niekorzystne konfiguracje. Minimalizację należy przeprowadzić w wielu etapach, stopniowo zmniejszając ograniczenie stosowane do atomów substancji rozpuszczonej z 25 kcal mol-1 A-2 do 0 kcal mol-1 A-2.
    1. W pliku wejściowym minimalizacji min.in dostosuj zmienną maxcyc dla całkowitego cyklu minimalizacji (maxcyc = 5000) i ncyc, aby określić liczbę cykli dla algorytmu najbardziej stromego spadania. Użyj zmiennej restraint_wt, aby zastosować siłę utwierdzenia do atomów substancji rozpuszczonej określonych przez parametr maski utwierdzenia. Następnie uruchom minimalizację w następujący sposób:
      $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd
      UWAGA: Zastosowana strategia i rzeczywiste parametry mogą się różnić w zależności od własnych preferencji. Szczegóły i wskazówki można znaleźć w podręczniku i na stronie internetowej Amber (https://ambermd.org/index.php)
  2. Podgrzać układ przez 100 ps od 0 K do 300 K, ustawiając ograniczenie 10 kcal mol-1 A-2 na atomach substancji rozpuszczonej. Aby to zrobić, ustaw tempi = 0.0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 ps, nstlim = 50000 i restraint_wt = 10 w pliku wejściowym heat.in. Uruchom ogrzewanie za pomocą następującego polecenia:
    $AMBERHOME/bin/szlifierka -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
  3. Zrównoważyć układ przez 900 ps w zespole NPT; stała liczba atomów, temperatura (temp0 = 300,0) i ciśnienie (ntp = 1), kontrolując je metodą Berendsena (ntt = 1). Ustaw granicę odległości 9 A (cięcie = 9,0) dla oddziaływań elektrostatycznych dalekiego zasięgu. Stopniowo zmniejszać ograniczenie atomu substancji rozpuszczonej do 0,1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0,1). Uruchom plik wejściowy równoważności equil.in opisujący powyższe parametry w następujący sposób:
    $AMBERHOME/bin/szlifierka -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c ciepło.rst -r ekwiwalent.rst -x ekwiwal.mdcrd -ref ciepło.rst
  4. Zakończ równoważenie za pomocą nieograniczonej symulacji 5 ns (zestaw dt = 0,002 ps, ntslim = 2500000).
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
  5. Sprawdź, czy system jest zrównoważony, badając wartości temperatury, ciśnienia, gęstości i energii.
    $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out
    Podsumowanie xmgrace. TEMPERATURA/GĘSTOŚĆ/ETOT/EPTOT/EKTOT
  6. Przeprowadź symulację produkcji dla 100 ns (ustaw dt = 0,002 ps, ntslim = 50000000 in prod.in) i zapisuj konformacje co 10 ps (ntwx = 5000).
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst

4. Analiza

  1. Oględziny
    1. Wizualizuj konformacje próbkowane podczas symulacji kinazy EGFR typu dzikiego i zmutowanego, otwierając pliki topologii bursztynowej X.prmtop i odpowiadające im pliki trajektorii prod.mdcrd w VMD36. Korzystając z wygodnych reprezentacji struktury drugorzędowej, przeanalizuj ogólną dynamikę strukturalną białek na podstawie zarejestrowanej trajektorii. Zobacz konkretne interakcje między atomami/resztami będącymi przedmiotem zainteresowania, takie jak katalitycznie niezbędny mostek solny K745 - E762.
    2. Alternatywnie, można zapisać wiele konformacji próbkowanych podczas symulacji w formacie PDB i otworzyć je za pomocą programu Chimera. Nałóż struktury na strukturę początkową lub środkową za pomocą opcji MatchMaker. Początkową/środkową strukturę można wyświetlić w bryle, a pozostałe wyrównane struktury w kolorze wyblakłej bieli. Takie podejście pozwala na bardziej przejrzystą wizualizację zarejestrowanych ruchów strukturalnych.
      UWAGA: Sugestie dotyczące efektywnych reprezentacji i przetwarzania zespołów konformacyjnych z MDS można znaleźć w Melvin et al.37.
  2. Analiza RMSD i RMSF
    1. Obliczaj obliczenia odchylenia średniokwadratowego (RMSD) i fluktuacji średniej kwadratowej (RMSF) za pomocą programu Cpptraj 38, aby przeanalizować globalną stabilność białek i zbadać elastyczność różnych jednostek strukturalnych. W plikach wejściowych rmsd.in i rmsf.in należy wskazać atomy szkieletu (dla RMSD) i atomy Cα (dla RMSF) struktury początkowej jako odniesienie dla dopasowania RMS. Do plików rmsd/rmsf.in zaimportuj bursztynowe pliki topologii (parm X.promtop) i odpowiadające im pliki trajektorii (trajin prod.mdcrd). Następnie uruchom polecenie Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. Wykreśl dane wyjściowe do analizy.
    2. Alternatywnie, wyrównaj zespoły konformacyjne i pokoloruj każdą resztę na podstawie atomu Cα RMSD. Aby to zrobić, otwórz konformacje w Chimerze i dostosuj je do opcji Matchmaker.
      1. Przejdź do pozycji Narzędzia → Przedstawianie → Renderuj według atrybutu. Jako atrybuty wybierz Reszty zespołu konformacyjnego i Cα RMSD i kliknij przycisk OK. Ślad łańcucha konformacji zostanie następnie pokolorowany od niebieskiego → białego → czerwonego, odpowiednio odzwierciedlając obszary o wysokiej, średniej i niskiej stabilności strukturalnej.
  3. Analiza wiązań wodorowych
    1. Przeanalizuj interakcję wiązań wodorowych między ATP a EGFR typu dzikiego/ΔELREA. Przygotuj skrypt Cpptraj hbond.in, aby wykonać to zadanie. Zdefiniować wiązanie wodorowe o odległości donor-akceptor mniejszej lub równej 3,5 A i kącie wiązania większym lub równym 135°. Należy określić analizę tylko dla międzycząsteczkowych wiązań wodorowych ze zmienną nointramolową, tj. wiązań wodorowych między ATP i EGFR (hbond All nointramol dist 3,5 out nhb.agr avgout avghb.dat). Uruchom skrypt jako Cpptraj -i hbond.in.
    2. Użyj tego skryptu do oceny oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych, na przykład między resztami K745 i E762, które są kluczowymi resztami dla aktywności kinazy EGFR. Aby to zrobić, określ K745 jako donora wiązań wodorowych i E762 jako akceptora wiązań wodorowych w hbond.in i uruchom odpowiednio skrypt.
  4. Monitorowanie odległości między atomami
    1. Zmierz odległość między K745 i E762, otwierając trajektorie EGFR typu dzikiego i ΔELREA apo w VMD. Wybierz Cδ z Glu762 i Nz z Lys745, klikając Mysz → etykietę → wiązanie. Monitoruj odległość podczas symulacji, kreśląc wykres z grafiką → etykietami → wykresem → wiązania.
  5. Obliczenia darmowej energii
    1. Aby obliczyć szacowane energie swobodne wiązania między ATP a EGFR typu dzikiego/ΔELREA oraz między kinazami aktywatora i odbiornika EGFR typu dzikiego/A702V, należy użyć modułu uogólnionej powierzchni Borna (MM-GBSA) z mechaniką molekularną39 dostępnego w pakiecie AMBER. Ustaw ATP jako ligand, a EGFR jako receptor w badaniu ΔELREA. W badaniu A702V określ kinazę odbiorczą jako ligand, a kinazę aktywatora jako receptor.
    2. Najpierw przygotuj pliki PDB kompleksu ligand, receptor i ligand-receptor oddzielnie w programie skokowym, ustawiając wartość PBRadii na mbondi2. W przypadku plików PDB zapisz pliki bursztynowej topologii fazy gazowej (.prmtop) i plików współrzędnych (.inpcrd).
    3. Następnie w pliku wejściowym mmgbsa, mmgbsa.in, ustaw igb = 2, saltcon = 0.1. Obliczenia energii wiązania należy wykonać na podstawie trajektorii symulacji, przygotowanych plików bursztynowych receptora/liganda oraz parametrów w mmgbsa.in za pomocą skryptu MMPBSA.py dostępnego w języku Amber w następujący sposób:
      $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
    4. Analizuj dane wyjściowe output.csv, kreśląc wykresy.

Wyniki

Opisany protokół został wykorzystany do zbadania wpływu mutacji ΔELREA i A702V na strukturę kinazy EGFR. Jednym z zastosowań protokołu była analiza wpływu mutacji na lokalną stabilność strukturalną/konformacyjną poprzez obliczenie wartości RMSD i RMSF z symulacji MD. Ponieważ mutacja A702V znajduje się w segmencie B obszaru przybłonastowego, obliczono RMSD tego segmentu kinazy odbiorczej względem struktury wyjściowej zarówno dla typu dzikiego, jak i dla EGFR A702V. Wynik (Rysunek 4A) wykazał, że segment B obszaru przybłonastowego mutanta wykazuje zwiększoną stabilność konformacyjną podczas symulacji trwającej 10 ns (średnie RMSD 0,7 Å - 95% przedział ufności (CI) 0,09) w porównaniu z domeną kinazy EGFR typu dzikiego (średnie RMSD 1,1 Å - 95% CI 0,01). Jest to najprawdopodobniej wynik silniejszych oddziaływań hydrofobowych na styku dimeru, spowodowanych zastąpieniem alaniny 702 (łańcuch boczny grupy metylowej) bardziej rozbudowanym aminokwasem hydrofobowym, waliną (łańcuch boczny grupy izopropylowej), co prowadzi do zwiększenia oddziaływań hydrofobowych V702 w domenie kinazy odbiorczej z izoleucyną 941 w domenie kinazy aktywującej.

Mutacja ΔELREA znajduje się w pętli β3-αC, sąsiadującej z funkcjonalnie krytyczną helisą αC; konformacja helisy αC ma kluczowe znaczenie dla przejść między aktywnym a nieaktywnym stanem kinazy EGFR. Stabilność konformacyjną helisy αC w stanie aktywnym oceniono poprzez analizę RMSF atomów Cα reszt w obrębie helisy podczas symulacji MD (Rysunek 4B): ogólnie odnotowano mniejsze fluktuacje u mutanta (średnie RMSF 1,1 Å - 95% CI 0,4) w porównaniu z typem dzikim (średnie RMSF 1,5 Å - 95% CI 0,57); najwyższą różnicę w fluktuacjach zarejestrowano dla reszt N-końcowych. Próbkowane konformacje nałożone odpowiednio na strukturę medianową domeny kinazy typu dzikiego oraz domeny kinazy ΔELREA również potwierdzają te wyniki (Rysunek 4C): obie domeny kinazy, zarówno typu dzikiego, jak i ΔELREA, wykazują ogólnie podobną stabilność dla nałożonych konformacji z wyjątkiem pętli β3-αC i helisy αC, które są wyraźnie bardziej stabilne w EGFR ΔELREA. Wyniki te wskazują, że delecja sekwencji ELREA ogranicza ruchomość helisy αC w stanie aktywnym, a tym samym ogranicza i stabilizuje konformację aktywną. Ponadto, ponieważ helisa αC stanowi część interfejsu dimeru asymetrycznego, ograniczenia helisy αC u mutanta najprawdopodobniej stabilizowałyby dimer asymetryczny, przedłużając czas trwania stanu aktywnego.

Kolejnym zastosowaniem protokołu jest badanie zachowania kluczowych oddziaływań wewnątrz- i międzycząsteczkowych występujących podczas symulacji. W ten sposób przeanalizowano oddziaływanie między K745 a E762, które jest fundamentalne dla aktywności enzymatycznej EGFR, zarówno dla aktywnej formy typu dzikiego, jak i kinazy ΔELREA EGFR, mierząc procentową zajętość wiązań wodorowych tworzonych między polarnymi atomami łańcuchów bocznych obu reszt podczas symulacji MD (Rysunek 5A): to kluczowe oddziaływanie elektrostatyczne tworzyło się częściej w domenie kinazy ΔELREA w porównaniu z domeną kinazy typu dzikiego, co wynikało z bardziej stabilnej helisy αC, w której znajduje się E762. Oceńiono również oddziaływania między Mg2+-ATP a domenami kinazy EGFR typu dzikiego i ΔELREA (Rysunek 5B) podczas symulacji (Rysunek 5C): liczba wiązań wodorowych była większa dla ΔELREA (wartość średnia 4,0 - 95% CI 0,03) niż dla EGFR typu dzikiego (wartość średnia 3,2 - 95% CI 0,04). Dalsza analiza wiązań wodorowych wykazała, że K745 częściej oddziałuje z grupami fosforanowymi ATP w ΔELREA EGFR, co wiąże się z bardziej stabilnym oddziaływaniem K745-E762 odnotowanym w symulacji domeny kinazy mutant EGFR ΔELREA.

Symulacje MD opisane w protokole są również przydatne do oceny względnej wolnej energii wiązania dla oddziaływań białko-białko i białko-ligand. Energie wiązania pomiędzy domenami aktywującymi i odbiorczymi kinaz EGFR typu dzikiego i wariantu A702V, a także pomiędzy ATP a domenami kinazy EGFR typu dzikiego i mutanta ΔELREA, obliczono za pomocą metody MMGBSA (molecular mechanics generalized Born surface area) (Rysunek 6A): mutant A702V wykazał niższą średnią wartość ΔGbind (średnia ΔGbind = -76 kcal/mol - 95% CI 0,47), co wskazuje na korzystniejsze oddziaływania dimerów, w przeciwieństwie do domeny EGFR typu dzikiego (średnia ΔGbind = -61 kcal/mol - 95% CI 0,61). Obserwacja ta jest zgodna z bardziej stabilnym segmentem B obszaru przybłonastowego oraz ciaśniejszym interfejsem dimeru wynikającym ze zwiększonych oddziaływań hydrofobowych zaobserwowanych dla domeny kinazy EGFR A702V. W przypadku wiązania ATP z domenami kinazy EGFR typu dzikiego i ΔELREA (Rysunek 6B), obliczenia MMGBSA przewidują silniejsze wiązanie ATP w przypadku mutanta ΔELREA (średnia ΔGbind -57 kcal/mol - 95% CI 0,43) w porównaniu do EGFR typu dzikiego (średnia ΔGbind -48 kcal/mol - 95% CI 0,3). Wynik ten jest zgodny z większą liczbą wiązań wodorowych odnotowanych pomiędzy ATP a ΔELREA EGFR (Rysunek 5C) w porównaniu do domeny typu dzikiego.

Protokół ten może być również wykorzystany do badania zmian konformacyjnych zaobserwowanych podczas symulacji. W niniejszej pracy wpływ mutacji ΔELREA na nieaktywną konformację EGFR badano poprzez inspekcję wizualną i superpozycję próbkowanych konformacji z symulacji. Analiza wykazała ruch do wewnątrz helisy αC w domenie kinazy EGFR z mutacją ΔELREA (Rysunek 7A), co jest zmianą strukturalną oczekiwaną podczas przejścia do stanu aktywnego. W przeciwieństwie do tego, helisa αC nieaktywnego EGFR typu dzikiego zachowała swoją pierwotną konformację (Rysunek 7B). Zatem symulacje MD wspierają tezę, że mutacja delecyjna, w której eksperymentalnie wykazano wzrost aktywności kinazy40,41, sprzyja przesunięciu konformacyjnemu z nieaktywnej kinazy w stronę stanu aktywnego.

Dynamika białka EGFR; wykresy RMSD, RMSF; analiza strukturalna; modelowanie białek; porównanie stabilności.
Rysunek 4: Stabilność konformacyjna domeny kinazy EGFR typu dzikiego i mutantów podczas symulacji MD. (A) RMSD (atomy szkieletu) w obrębie segmentu B przylegającego do błony dla domeny kinazy odbiorczej typu dzikiego (kolor niebieski) i wariantu A702V (kolor czerwony). (B) RMSF (atomy Cα) w funkcji reszt helisy αC: typy dziki (niebieski) i ΔELREA (złoty). (C) Nałożone próbkowane konformacje domeny kinazy EGFR typu dzikiego (po lewej) i ΔELREA (po prawej); ślady łańcuchów pokolorowane na podstawie RMSD (atomy Cα) każdego residuum względem struktury medianowej. Kolorystyka obejmuje zakres od niebieskiego, przez biały, do czerwonego, reprezentując obszary od wysokiej do niskiej stabilności konformacyjnej. Należy zauważyć, że „wolne” regiony N-końcowe wyizolowanej domeny kinazy, zaznaczone na czerwono, nie wykazywałyby takiego poziomu mobilności w pełnej strukturze EGFR. Rysunki zaadaptowane z Chakroborty et al.9 (Rycina 4A odtwarzane za zgodą Journal of Biological Chemistry) oraz Tamirat et al.12. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza oddziaływań EGFR: wykres słupkowy stopnia zajętości, schemat molekularny, graf wiązań wodorowych w badaniu białka.
Rysunek 5: Kluczowe cechy widoczne w aktywnej kinazie odbiorczej podczas symulacji MD: mostek solny K745-E762, helisa αC oraz oddziaływania z ATP. (A) Procentowy stopień zajętości oddziaływania K745-E762 podczas symulacji domen kinaz EGFR typu dzikiego (niebieski) oraz ΔELREA (złoty). (B) Pozostały fragmenty typu dzikiego i mutanta ΔELREA oddziałujące z ATP (kije). Mg2+ (zielony) koordynuje z ATP i D85. (C) Liczba wiązań wodorowych tworzonych przez ATP z domenami kinazy EGFR typu dzikiego oraz ΔELREA podczas symulacji MD. Rycina z Tamirat et al.12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres energii swobodnej wiązania EGFR, ΔG_bind w funkcji czasu, porównanie typu dzikiego i wariantów, kcal/mol, ns.
Rysunek 6: Podczas symulacji zaobserwowano niższe względne swobodne energie wiązania dla zmutowanych domen kinazy. (A) Energie wiązania obliczone dla oddziaływań między domenami aktywatora i kinazy odbiorczej w przypadku EGFR typu dzikiego (niebieski) oraz wariantu A702V (czerwony). (B) ΔGwiązanie ATP do domen kinazy EGFR typu dzikiego (niebieski) i ΔELREA (złoty). Rysunki zaadaptowano z pracy Chakroborty i wsp.9 (Rysunek 6A reprodukowano za zgodą Journal of Biological Chemistry) oraz Tamirat i wsp.12. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat struktury helikalnej EGFR; typ dziki vs mutacja ΔELREA; analiza fałdowania białka.
Rysunek 7: Nałożone konformacje dzikiego typu oraz nieaktywnej domeny kinazy EGFR ΔELREA. Konformacja helisy αC oraz helisy pętli A (A) typu dzikiego (struktura medianowa zaznaczona kolorem niebieskim) i (B) ΔELREA EGFR (złoty). Inne pobrane konformacje, blady biały; struktury początkowe przed symulacjami MD, różowy. Rysunek z pracy Tamirat et al.12. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół opisany w tym badaniu koncentruje się na wykorzystaniu symulacji dynamiki molekularnej do badania lokalnych i globalnych zmian strukturalnych, które powstają w wyniku aktywacji mutacji somatycznych domeny kinazy EGFR. Chociaż rentgenowskie struktury krystaliczne EGFR typu dzikiego i zmutowanego dostarczają nieocenionego wglądu strukturalnego, przedstawiają one jedną lub kilka statycznych reprezentacji. Jednak nieodłączną funkcją biologiczną ErbB są niezbędne przejścia między enzymatycznie nieaktywną a aktywną kinazą tyrozynową, wywołujące dynamiczne zmiany zarówno w strukturze, jak i wewnątrzcząsteczkowych oddziaływaniach między monomerami kinazy. W związku z tym przeprowadzono symulacje MD w celu zbadania dynamicznej natury domeny kinazy tyrozynowej EGFR, w tym struktury typu dzikiego, wprowadzonej mutacji delecyjnej ΔELREA i mutacji A702V. Symulacje te zakończyły się sukcesem w wyjaśnieniu prawdopodobnej roli tych mutacji w strukturach oraz tego, w jaki sposób ich wpływ na konformację domeny kinazy tyrozynowej doprowadzi do obserwowanego eksperymentalnie wzrostu aktywności kinazy EGFR.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest wykorzystanie odpowiedniej struktury do oceny wpływu mutacji. Jednym ze sposobów wyboru odpowiedniej struktury wejściowej symulacji jest wizualizacja lokalizacji mutacji w statycznej strukturze 3D i zbadanie jej możliwego wpływu w odniesieniu do sąsiednich aminokwasów i jednostek strukturalnych. Na przykład w tym badaniu, ponieważ mutacja EGFR A702V znajduje się w segmencie błony B, który tworzy asymetryczny interfejs dimerów, zastosowanie struktury dimeru do symulacji w przeciwieństwie do monomeru ma kluczowe znaczenie. Zastosowanie struktury monomerycznej wystawiłoby przybłonowy segment B kinazy odbiorczej na działanie rozpuszczalnika, pozbawiając go oddziaływań stabilizujących, wzmocnionych przez mutację do większej reszty hydrofobowej i interakcje z izoleucyną 941 z reszt płata C kinazy aktywatora. Ponadto warto zauważyć, że struktura 3D reprezentowana przez współrzędne w pliku PDB niekoniecznie odpowiada biologicznie istotnej strukturze, która powinna być wykorzystana do badań. Na przykład przy strukturze ErbB4, kod PDB 3BCE, współrzędne PDB odpowiadają trimerowi, ale wynika to z kontaktów kryształów (podczas wizualizacji tej struktury widać niewiele kontaktów między monomerami). Macierze w pliku PDB mogą być używane (np. w Chimerze) do rekonstrukcji struktur powiązanych krystalograficznie, które można wizualizować w celu identyfikacji łańcuchów odpowiadających biologicznie istotnej strukturze 3D, jak opisano w oryginalnej publikacji42. Kolejnym istotnym krokiem protokołu jest odpowiednie przygotowanie struktury wejściowej symulacji, takie jak zbudowanie brakujących aminokwasów w różnych regionach pętli, a zwłaszcza tam, gdzie znajdują się w pobliżu mutacji. Chociaż w PDB istnieje wiele struktur EGFR typu dzikiego, dostępna jest tylko ograniczona liczba zmutowanych struktur EGFR. W związku z tym struktury mutantów również muszą być modelowane; w przypadku mutacji pojedynczej reszty, takiej jak A702V, do mutacji reszty użyto Chimery; natomiast w przypadku mutacji delecyjnej ΔELREA zastosowano Modeller.

Różne parametry wykorzystywane w plikach wejściowych symulacji - na przykład liczba cykli minimalizacji, nagrzewanie systemu do żądanej temperatury za jednym razem lub zamiast tego powolne nagrzewanie przez kilka temperatur pośrednich, okres równowagi i symulacji produkcyjnych - mogą być modyfikowane w zależności od cząsteczki badania, celu pracy i własnych preferencji. Podczas przeprowadzania symulacji MD często można również natknąć się na błędy, które mogą wynikać z plików wejściowych, problemy związane z używanym oprogramowaniem symulacyjnym, a nawet błąd użytkownika. Dlatego bardzo ważne jest, aby zrozumieć źródło błędów poprzez dokładne zbadanie wszelkich komunikatów o błędach. Większość programów symulacyjnych posiada listę mailingową, na której użytkownicy mogą zadawać pytania twórcom oprogramowania i innym użytkownikom, dzięki czemu można rozwiązać większość problemów. Ponadto instrukcje obsługi stanowią istotną pomoc w zrozumieniu szczegółów protokołu symulacji, w tym założeń i ograniczeń. Chociaż symulacja MD jest ważnym narzędziem do badania dynamicznych właściwości cząsteczek, należy pamiętać, że wyniki obliczeń muszą być dokładnie oceniane w połączeniu z innymi źródłami informacji, aby ocenić ich trafność. Tam, gdzie to możliwe, należy współpracować z badaczami, którzy są ekspertami w dziedzinie badanych białek, zwłaszcza w przypadku przeprowadzania odpowiednich badań eksperymentalnych w laboratoriach mokrych, które służą dostarczeniu wyników do interpretacji strukturalnej, a także zasugerowaniu eksperymentów, które można przeprowadzić w oparciu o obserwacje strukturalne w celu przetestowania hipotez.

W tym badaniu protokół okazał się skuteczny w badaniu dynamicznego wpływu strukturalnego mutacji ΔELREA i A702V na struktury kinazy EGFR. Symulacje wykazały, że ΔELREA hamuje funkcjonalnie niezbędną helisę αC i promuje konformacyjne przejście od nieaktywnej kinazy do stabilizowanej kinazy aktywnej. Wyniki symulacji są niezależnie poparte danymi dotyczącymi odpowiedzi na leki, które wykazały wpływ inhibitorów kinazy tyrozynowej na linie komórkowe raka płuc z mutacją delecji ΔELREA i EGFR typu dzikiego, przy czym w przypadku ΔELREA odnotowano większe hamowanie przez leki rozpoznające aktywną konformację kinazy niż w przypadku EGFRtypu dzikiego. W przypadku mutacji A702V symulacje MD wskazują, w porównaniu z typem dzikim, na zwiększoną stabilizację granicy faz kinazy aktywator-odbiornik, a także większe powinowactwo kinazy aktywatora i odbiornika do siebie, co razem wspiera utrzymanie aktywowanej konformacji kinazy EGFR. Mutacja A702V, zlokalizowana na przybłonowym segmencie B kinazy odbiorczej, zwiększyłaby oddziaływania hydrofobowe z kinazą aktywatorową, działającą w celu przedłużenia czasu trwania stanu aktywowanego. Mutacja A702V wspomaga przeżycie komórek przy braku czynnika wzrostu i została zidentyfikowana w badaniach przesiewowych in vitro pod kątem mutacji EGFR9.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie jest finansowane z grantów dla M.S.J. z Akademii Fińskiej (308317, 320005), Fundacji Sigrid Juselius i Tor, funduszu pamięci Joe i Pentti Borg, a także dla K.E. z Akademii Fińskiej (274728, 316796), Fińskiej Fundacji Raka oraz Centralnego Szpitala Uniwersyteckiego w Turku. M.Z.T. jest finansowany przez Sieć Doktorancką Biologii Informacyjnej i Strukturalnej Åbo Akademi. Dziękujemy Centrum Informatycznemu Nauki CSC za zasoby obliczeniowe oraz dr Jukce Lehtonenowi za wsparcie informatyczne w ramach sieci bioinformatycznej Biocenter Finland; oraz sieć infrastruktury biologii strukturalnej Biocenter Finland.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amber softwareUniwersytet Kalifornijski, San FranciscoWersja 2018Wykonywalny
program ChimeraZasób dla bioinformatyki, wizualizacji i informatyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w San FranciscoWersja 1.13.1Wykonywalne
pliki struktury EGFRBankWspółrzędne 3D struktur EGFR
MaestroSchrö dinger LLCWersja 2018-3Wykonywalny
program modelarskiAndrej Š ali Lab, Wydział Nauk Biofarmaceutycznych i Chemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Kalifornijski w San FranciscoZawarte w programie Chimera
oprogramowanie VMDGrupa Biofizyki Teoretycznej i Obliczeniowej, Uniwersytet Illinois w Urbana-ChampaignWersja 1.9.3Plik wykonywalny
danych o białkach

Bibliografia

  1. Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).
  2. Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768(2014).
  3. Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).
  4. Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications. Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).
  5. Cerami, E., et al. cBioPortal for Cancer Genomics. , https://www.cbioportal.org (2020).
  6. Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).
  7. Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
  8. Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
  9. Chakroborty, D., et al. Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).
  10. Leahy, D. J. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors. Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).
  11. Roskoski, R. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).
  12. Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation. PLoS ONE. 14 (9), e0222814(2019).
  13. Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455, 1069-1075 (2008).
  14. Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer. Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).
  15. Soung, Y. H., et al. Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers. International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).
  16. Tvorogov, D., et al. Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer. Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).
  17. Hubbard, S. R., Till, J. H. Protein tyrosine kinase structure and function. Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).
  18. Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109 (3), 275-282 (2002).
  19. Jura, N., et al. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms. Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).
  20. Karplus, M., Kuriyan, M., J, Molecular dynamics and protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).
  21. Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).
  22. Reckamp, K. L., et al. A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  25. Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor. Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).
  26. Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).
  27. Sogabe, S., et al. Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).
  28. Sali, A., Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).
  29. Yun, C. H., et al. Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity. Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).
  30. Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain. Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).
  31. Schrödinger LLC. Release 2018-3: Maestro. , https://www.schrodinger.com/maestro (2018).
  32. Case, D. A., et al. AMBER 2018. , University of California. San Francisco. (2018).
  33. Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
  34. Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).
  35. Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).
  36. Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
  37. Melvin, R. L., Salsbury, F. R. Visualizing ensembles in structural biology. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).
  38. Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
  39. Miller, B. R., et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).
  40. Guha, U., et al. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).
  41. Furuyama, K., et al. Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).
  42. Qiu, C., et al. Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase. Structure. 6 (3), 460-467 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mutacje EGFRanaliza struktury bia ekstabilno konformacyjnawi zanie ATPdimer asymetrycznyanaliza wi za wodorowychswobodna energia wi zaniaredniokwadratowe odchylenie RMSDVisual Molecular Dynamics
Rozszyfrowywanie strukturalnych skutków aktywacji mutacji somatycznych EGFR za pomocą symulacji dynamiki molekularnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.