Method Article

Rozszyfrowywanie strukturalnych skutków aktywacji mutacji somatycznych EGFR za pomocą symulacji dynamiki molekularnej

DOI:

10.3791/61125

⸱

May 20th, 2020

 ,  ,  , 
1Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering, Åbo Akademi University, 2Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine, University of Turku, 3Turku Bioscience Centre, University of Turku and Åbo Akademi University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, University of Turku and Turku University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wykorzystanie symulacji dynamiki molekularnej do zbadania dynamicznych zmian strukturalnych, które zachodzą w wyniku aktywacji mutacji białka kinazy EGFR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne mutacje somatyczne występujące w rodzinie receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) (ErbB) receptorowych kinaz tyrozynowych (RTK) zostały zgłoszone u pacjentów z rakiem, chociaż stosunkowo niewiele z nich zostało przebadanych i wykazano, że powodują funkcjonalne zmiany w ErbB. Receptory ErbB są dimeryzowane i aktywowane po związaniu liganda, a dynamiczne zmiany konformacyjne receptorów są nieodłączne dla indukcji dalszej sygnalizacji. Dla dwóch mutacji, które wykazano eksperymentalnie, że zmieniają funkcję EGFR, A702V i mutacji delecyjnej Δ746ELREA750, ilustrujemy w poniższym protokole, w jaki sposób symulacje dynamiki molekularnej (MD) mogą badać (1) stabilność konformacyjną struktury zmutowanej kinazy tyrozynowej w porównaniu z EGFR typu dzikiego; (2) konsekwencje strukturalne i przemiany konformacyjne oraz ich związek z obserwowanymi zmianami funkcjonalnymi; (3) wpływ mutacji na siłę wiązania ATP, jak również na wiązanie między domenami kinazy w aktywowanym dimerze asymetrycznym; oraz (4) wpływ mutacji na kluczowe interakcje w obrębie miejsca wiązania EGFR związanego z aktywowanym enzymem. Protokół zawiera szczegółową procedurę krok po kroku, a także wytyczne, które mogą być bardziej ogólnie przydatne do badania struktur białkowych przy użyciu symulacji MD jako środka do badania dynamiki strukturalnej i związku z funkcjami biologicznymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzina receptorów receptorowych kinaz tyrozynowych (RTK) ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) (ErbB) składa się z czterech członków - EGFR/ErbB1/HER1, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 i ErbB4/HER4. Receptory ErbB regulują podstawowe procesy komórkowe, takie jak wzrost i proliferacja komórek, różnicowanie, migracja i przeżycie1,2, a zatem są silnymi protoonkogenami. Nieprawidłowa aktywność receptorów ErbB, zwłaszcza EGFR i ErbB2, jest często związana z nowotworami u ludzi, co sprawia, że receptory ErbB są kluczowymi celami terapii przeciwnowotworowych2,3.

Kilka zmian somatycznych genów ERBB zostało zgłoszonych z powodu nowotworów złośliwych u ludzi3,4,5. Najlepiej scharakteryzowanymi przykładami są nawracające, aktywujące mutacje punktowe i krótkie delecje w ramce w domenie kinazy EGFR w niedrobnokomórkowym raku płuca (NSCLC). Te mutacje EGFR stanowią kluczowe czynniki wzrostu raka i przewidują wrażliwość na EGFR ukierunkowaną na leki przeciwnowotworowe6,7,8. Jednak w większości nowotworów mutacje somatyczne w EGFR występują poza tymi nawracającymi "gorącymi punktami" i są rozmieszczone w całym zakresie 1210 reszt receptora. Rzeczywiście, stwierdzono, że większość pozostałości wzdłuż pierwotnej sekwencji EGFR jest zmutowana w ludzkim raku9. Niemniej jednak, poza nielicznymi punktami zapalnymi, znaczenie funkcjonalne zdecydowanej większości mutacji EGFR związanych z rakiem pozostaje nieznane.

Monomeryczna struktura ErbB składa się z dużej domeny zewnątrzkomórkowej aminokońcowej, po której następuje pojedyncza transbłonowa helisa prowadząca do wewnątrzkomórkowej domeny kinazy tyrozynowej i C-końcowego regionu ogonowego, który zawiera miejsca dokowania dla wewnątrzkomórkowych białek sygnałowych. Wiązanie ligandów wywołuje dramatyczną zmianę konformacyjną w domenie zewnątrzkomórkowej, co ułatwia tworzenie dimerów receptorowych poprzez odsłonięcie ramion dimeryzacji, które symetrycznie krzyżują się ze sobą i oddziałują z ich aromatycznymi/hydrofobowymi powierzchniami. Po utworzeniu dimeru receptora domeny kinazy tyrozynowej stykają się asymetrycznie (ryc. 1), co powoduje aktywację kinaz, które fosforylują C-końcowe ogony monomerów receptora, a następnie aktywację dalszej sygnalizacji10,11.

Schemat sygnalizacji EGFR; struktura receptora, domena zewnątrzkomórkowa do kinazy, lokalizacja błony.
Rysunek 1: Struktura dimeru EGFR. EGFR dimeryzuje, gdy domeny zewnątrzkomórkowe wiążą czynnik wzrostu (EGF, naskórkowy czynnik wzrostu). Domena kinazy odbiorczej jest następnie aktywowana poprzez asymetryczną interakcję z domeną kinazy aktywatora, a ogony C-końcowe są autofosforylowane na resztach tyrozyny (zmodyfikowane z Tamirat et al.12). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ze względu na dynamiczne przegrupowania strukturalne, które zachodzą podczas monomeru Wykres równowagi statycznej, ΣFx=0, metoda równoważenia sił, koncepcja fizyki edukacyjnej. przejścia dimerów, wraz z aktywacją kinazy, która jest związana z tworzeniem asymetrycznego dimeru, mutacje na całej długości struktury receptora mogą potencjalnie mieć wpływ na funkcję receptora. Poniżej opisujemy kilka przykładów z naszych poprzednich badań, w których modelowanie mutacji i wizualizacja były wystarczające do wyjaśnienia konsekwencji dla funkcji.

Przykład 1: Jedna zgłoszona mutacja, D595V w ErbB413, doprowadziła do zwiększonej dimeryzacji i fosforylacji ErbB414. Wizualizacja lokalizacji mutacji była kluczowym czynnikiem w zrozumieniu obserwowanych efektów funkcjonalnych: D595V wystąpił w symetrycznym skrzyżowaniu dimerycznych ramion ektodomeny (Figura 2A). Ramiona są w dużej mierze aromatyczne i hydrofobowe, a zastąpienie polarnego kwasu asparaginowego waliną powinno zwiększyć "lepkie" oddziaływania hydrofobowe, stabilizując dimer, a tym samym wydłużając czas, w którym zachodzi fosforylacja14. Na początku zaskoczeniem było znalezienie asparaginianu w każdym ramieniu, ale z perspektywy czasu można o tym myśleć jako o mechanizmie czasowym aktywności, w którym łańcuchy boczne kwasu polarnego zmniejszają powinowactwo i żywotność nienaruszonego dimeru, a tym samym ograniczają fosforylację i sygnalizację za pośrednictwem kinazy. Zastąpienie przez walinę usunęłoby to zabezpieczenie poprzez dalszą stabilizację dimera ErbB4.

Interakcja białko-ligand, diagram molekularny, wyświetlanie reszt aminokwasowych, analiza strukturalna.
Rycina 2: Lokalizacja mutacji aktywującej ErbB4 i mutacji wytwarzających ErbB4 martwą w wyniku kinazy. (A) D595 (aktywująca mutację D595V) znajduje się na aromatyczno-hydrofobowych ramionach dimerycznych modelu ektodomeny ErbB4; ramiona kojarzą się na wiązaniu czynnika wzrostu; (pobliskie pozostałości są pokazane jako patyczki). (B) W ErbB4, G802 (inaktywacja mutacji G802dup) pomaga tworzyć kieszeń wiążącą wokół pierścienia adeninowego ATP, a katalityczna D861 (inaktywująca mutacja D861Y) wiąże zarówno Mg2+ (nie pokazano), jak i grupę γ-fosforanową ATP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przykład 2: Można by się spodziewać, że mutacje somatyczne, które celują w miejsce wiązania ATP w domenie kinazy, zmienią lub wyeliminują aktywność enzymatyczną, prowadząc do upośledzenia lub martwego receptora kinazy niezdolnego do sygnalizacji. Spośród dziewięciu mutacji zgłoszonych u pacjentów z piersią, żołądkiem, jelitem grubym lub NSCLC15, dwie z dziewięciu mutacji podczas testowania miały znacznie zmniejszoną aktywność fosforylacyjną16: G802dup (G → GG) i D861Y. Obie inaktywujące mutacje somatyczne znaleziono w miejscu wiązania ATP struktury domeny kinazy tyrozynowej (ryc. 2B): elastyczna glicyna, zduplikowana, zmieniłaby miejsce pierścienia adeninowego, a mały kwas asparaginowy zastąpiony przez masywną tyrozynę w pobliżu końcowych fosforanów fizycznie uniemożliwiłby wiązanie Mg2 + -ATP. Ponieważ jednak ErbB4 może tworzyć heterodimer z ErbB2 - ErbB2 nie wiąże czynnika wzrostu i zależy od asocjacji z ErbB, który to robi w celu heterodimeryzacji - heterodimer ErbB2 (aktywny)-ErbB4 (martwy w kinazie) stymulowałby proliferację komórek poprzez szlak sygnałowy Erk / Akt, ale komórki nie różnicowałyby się z powodu martwego kinazy ErbB4 i braku aktywacji szlaku STAT516.

W nowszych badaniach stało się jasne, że dynamiczne ruchy ErbB były istotne dla zrozumienia wpływu niektórych mutantów na funkcję ErbB, zwłaszcza mutacji występujących w domenie kinazy tyrozynowej. Domena kinazy tyrozynowej składa się z płata N (głównie arkuszy β) i płata C (w dużej mierze alfa helikalnego), które są oddzielone miejscem katalitycznym, w którym wiąże się ATP. Płat N zawiera helisę αC i pętlę P, podczas gdy aktywacja (pętla A) i pętle katalityczne są obecne w C-lobe17,18,19. Struktury krystaliczne domeny kinazy tyrozynowej wykazały dwie nieaktywne konformacje, większość struktur ma stan nieaktywny podobny do Src. W konformacji aktywnej asparaginian katalityczny pętli A jest skierowany w stronę miejsca wiązania ATP, a helisa αC jest zorientowana w kierunku kieszeni wiążącej ATP (konformacja "αC-in"), tworząc silne oddziaływanie par jonów glutaminianu i lizyny.

Ponieważ ErbB i domena kinazy składowej są wysoce dynamicznymi jednostkami, a szczególnie w przypadkach, gdy wpływ mutacji na funkcję i aktywność biologiczną może być ściśle związany ze stanami konformacyjnymi ErbB, ważne jest, aby ocenić mutacje w odniesieniu do zakresu dynamicznych zmian, których doświadczają. Rentgenowskie struktury krystaliczne ErbB dostarczają statycznych migawek struktury 3D, które mogą, ale nie muszą, być istotne dla zrozumienia dynamicznych konsekwencji mutacji. W celu zbadania zakresu zmian dynamicznych odpowiadających "krajobrazowi energetycznemu" dostępnemu dla struktury trójwymiarowej (3D), szeroko stosuje się symulacje dynamiki molekularnej (MD) 20. W przypadku mutacji, które prowadziłyby do miejscowych zmian konformacyjnych w obrębie domeny kinazy tyrozynowej lub stabilizacji kompleksu, wystarczające mogą okazać się symulacje rzędu 100 ns. Jednak zmiany konformacyjne na większą skalę (np. przejścia między aktywnymi i nieaktywnymi konformacjami domeny kinazy) wymagają dłuższego czasu symulacji - rzędu mikrosekund21.

W odniesieniu do opisanego poniżej protokołu rozważamy dwie mutacje aktywujące w domenie kinazy tyrozynowej (Rysunek 3). Obie mutacje są zlokalizowane w domenie kinazy w miejscach, w których występują lokalne zmiany konformacyjne, które decydują o tym, czy kinaza jest aktywna, czy nie, dlatego w obu przypadkach zastosowano symulacje MD. W pierwszym przypadku rozważamy zmiany, które bezpośrednio wpływają na miejsce wiązania ATP i maszynerię katalityczną domeny kinazy odbiorczej EGFR, w szczególności badając konsekwencje mutacji delecji eksonu 19, która jest szeroko związana z NSCLC4,7. Mutacja Δ746ELREA750, która zmniejsza długość pętli β3-αC poprzedzającej helisę αC - helisę, która porusza się w kierunku miejsca wiązania/aktywnego aktywacji kinazy i uczestniczy w tworzeniu krytycznej interakcji elektrostatycznej między E762 helisy a K745 poprzez pozycjonowanie lizyny do interakcji z ATP - predysponuje domenę do aktywacji12. W drugim przypadku rozważamy mutację A702V EGFR, która okazała się być nową mutacją aktywującą wzmocnienie funkcji, ujawnioną przez platformę iScream9 i zidentyfikowaną u pacjenta z niedrobnokomórkowym rakiem płuca22. Alanina-702 w domenie kinazy odbiorczej znajduje się na przystawionym segmencie błonowym B na granicy domen kinazy odbiornika i aktywatora, w której ten asymetryczny kompleks dimerów kinazy i zmiany konformacyjne kinazy są wymagane do aktywacji9.

Diagram interakcji białek; Struktura kinaz aktywatorowych i odbiorczych z znakowanymi helisami.
Ryc. 3: Asymetryczny dimer domeny kinazy EGFR. Mutacja A702V byłaby zlokalizowana na krytycznym granicy domen kinazy aktywatora i odbiornika, w sąsiedztwie helisy αC i blisko izoleucyny 941 kinazy aktywatora. Zmiany konformacyjne wywołane powstaniem asymetrycznego dimeru prowadzą do aktywacji kinazy. Pętla β3-αC zawierająca sekwencję ELREA bezpośrednio poprzedza helisę αC; podczas aktywacji helisa αC przesuwa się do wewnątrz w kierunku miejsca wiązania ATP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Szczegółowe kroki podjęte w celu zbadania wpływu mutacji ΔELREA i A702V na strukturę EGFR za pomocą symulacji MD są omówione w następujący sposób:

1. Przygotowanie struktury

UWAGA: W celu zbadania strukturalnych skutków mutacji ΔELREA, dzikie i zmutowane formy aktywnych apo, aktywnych i nieaktywnych struktur monomeru EGFR związanych z ATP są przygotowywane w następujący sposób.

  1. Otwórz program wizualizacyjny Chimera23 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/), aby przygotować strukturę aktywnej kinazy EGFR typu dzikiego. W menu Plik kliknij opcję Pobierz według identyfikatora i wybierz bazę danych Protein Data Bank (PDB24) i określ kod PDB 2GS225 (rozdzielczość 2,8 A). PDB jest repozytorium struktur 3D rozwiązywanych za pomocą różnych technik eksperymentalnych, w tym krystalografii rentgenowskiej, spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, mikroskopii krioelektronowej i dyfrakcji neutronów.
  2. Zbuduj brakujące elementy konstrukcyjne 2GS2, pobierając te segmenty ze struktur EGFR PDB 1M1426 (2.6 A) i 3W2S27 (1.9 A). Aby to zrobić, otwórz 1M14 i 3W2S i nałóż je na 2GS2 za pomocą opcji MatchMaker w menu Narzędzia → Porównanie struktur.
    1. Wytnij segmenty, które mają zostać dodane, z 1M14 i 3W2S. Wybrać końcowe atomy reszty przed przerwami w 2GS2 oraz atomy do dodania z 1M14 i 3W2S (szczegółowe informacje na temat dodanych segmentów znajdują się w tabeli 1). W wierszu poleceń wpisz bond sel i naciśnij Enter. Ta struktura jest strukturą szablonu.
  3. Użyj struktury szablonu z kroku 1.2, aby skonstruować zmutowaną formę delecji ΔELREA domeny kinazy EGFR. Utwórz sekwencję w formacie FASTA ΔELREA EGFR, zapisując sekwencję struktury szablonu (Ulubiona sekwencja → → Plik → zapisz jako), a następnie usuwając sekwencję ELREA pod numerami pozostałości 746-750.
    1. Otwórz sekwencję ΔELREA EGFR w Chimerze i wyrównaj ją z sekwencją struktury szablonu 2GS2 za pomocą menu Sekwencja. W oknie wyrównania wybierz opcję Structure → Modeller (homology)28.
    2. W oknie podręcznym określ strukturę złożoną 2GS2 jako szablon, a sekwencję mutantów jako zapytanie, które ma być modelowane. Następnie naciśnij przycisk OK. Wybierz model mutanta spośród wynikowych modeli, na podstawie wyniku zDOPE (zazwyczaj najniższego wyniku) i oględzin.
  4. Aby przygotować strukturę kinazy EGFR typu dzikiego związaną z ATP, należy użyć struktury PDB 2ITX29 (2,98 A) jako struktury głównej. Zbuduj brakujące segmenty (patrz Tabela 1) przy użyciu struktur 2GS625 (2.6 A) i 3W2S, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.2. Przekształć ligand ANP w wynikowej strukturze na ATP, otwierając plik PDB w edytorze tekstu i zmieniając atom azotu N3B ANP na atom tlenu.
  5. Otwórz strukturę w kroku 1.4 w Chimerze, jak podano w kroku 1.1. Dodaj jon magnezu do tej struktury ze struktury PDB 2ITN29 (2,47 A) w celu uzyskania podobnego położenia dla jonu Mg2+.
  6. Ze strukturą wynikającą z kroku 1.5 modeluj zmutowaną formę ΔELREA zgodnie z krokiem 1.3.
Apo active EGFRApo nieaktywny EGFRAktywny EGFR związany z ATP
Główna strukturaZobacz materiał 2GS2Zobacz materiał 2GS72ITX
Struktury używane do budowy brakujących pętli1M14 (723-725)3W2S (958-984)2GS6 (862-865)
3W2S (967-981)4HJO (848-850)3W2S (990-1001)

Tabela 1: Struktury używane do budowy złożonych modeli aktywnych struktur apo, nieaktywnych apo i ATP. Brakujące regiony (zakres aminokwasów w nawiasach) w strukturze głównej zostały zbudowane z wymienionych struktur.

  1. Aby przygotować strukturę nieaktywnej kinazy EGFR typu dzikiego, otwórz strukturę PDB 2GS725 (2.6 A) jak w kroku 1.1 i usuń związane ligandy i wody krystalograficzne. Dodaj brakujące segmenty w 2GS7 (patrz Tabela 1) ze struktur 3W2S i 4HJO30 (2.75 A), korzystając z procedury opisanej w kroku 1.2. Na podstawie końcowej nieaktywnej struktury EGFR przygotuj model mutanta, korzystając z procedury opisanej w kroku 1.3.
    UWAGA: W przypadku badania mutacji A702V badana jest asymetryczna struktura dimerów EGFR, ponieważ mutacja znajduje się w segmencie B błony przybłonowej domeny kinazy, która stanowi dużą część interfejsu dimerów. Struktury EGFR typu dzikiego i zmutowane A702V przygotowuje się w następujący sposób:
  2. Asymetryczna struktura dimerów typu dzikiego jest zbudowana ze struktury PDB 2GS2, która początkowo jest wyświetlana w postaci monomerycznej. Aby przekształcić się w zespół biologiczny, który zawiera kinazy aktywatora i odbiornika w układzie asymetrycznym, otwórz 2GS2 w Chimerze jak w (1.1) i przeprowadź obliczenia symetrii, klikając menu Narzędzia → Struktura wyższego rzędu → Komórka elementarna. Wybierz strukturę 2GS2 i wprowadź Utwórz kopie. Na koniec wybierz i zapisz pojedynczy asymetryczny dimer z wielu kopii dimeru wynikających z operacji symetrii.
  3. Korzystając z asymetrycznej struktury EGFR typu dzikiego z kroku 1.8, zbuduj mutanta A702V, zastępując alaninę 702 waliną, korzystając z opcji Narzędzia → edycji struktury → Rotamery w Chimera.
    UWAGA: Łącznie przygotowano sześć monomerycznych i dwie dimeryczne struktury EGFR do badań mutacji ΔELREA i A702V. Każda struktura jest następnie przetwarzana do symulacji za pomocą kreatora przygotowania białka w programie Maestro31, a symulacje MD są wykonywane za pomocą Amber program32.
  4. Otwórz strukturę w Maestro za pomocą opcji Plik → importuj strukturę. Następnie kliknij na przycisk kreatora przygotowania białka i wybierz: dodaj atomy wodoru, zbuduj brakujące atomy łańcucha bocznego, określ stany protonacji reszt jonizowalnych przy pH 7,0 za pomocą PROPKA, zoptymalizuj orientację reszt asparaginy, glutaminy i histydyny do wiązania wodorowego, a na koniec zminimalizuj strukturę.

2. Ustawienia systemu

  1. Otwórz program skokowy zawarty w pakiecie oprogramowania Amber. Zaimportuj pole siłowe ff14SB 33 (źródło leaprc.protein.ff14SB) i cząsteczki wody TIP3P34 (źródło leaprc.water.tip3p). Dla systemów powiązanych z ATP należy również zaimportować parametry dla ATP35 (loadamberparams frcmod.phosphate, loadamberprep ATP.prep). Następnie załaduj strukturę (mol = loadpdb structure.pdb).
  2. Roztworować strukturę w oktaedrycznym pudełku z wyraźnymi cząsteczkami wody TIP3P, które rozciągają się na 10 A we wszystkich kierunkach od atomów powierzchniowych białka (solwateoct mol TIP3PBOX 10,0).
  3. Sprawdź zbudowany system (Sprawdź mol) i zneutralizuj go, dodając niezbędne jony (addions mol Na+ 0). Aby wystarczająco modelować układy biomolekularne, dodaj dodatkowe atomy Na+/Cl- do pola symulacji, aby doprowadzić stężenie soli w układzie do 0,15 M (addions mol Na+ X, addions mol Cl- X), gdzie X jest zastępowane przez wynik: pożądane stężenie soli * liczba cząsteczek wody * objętość na cząsteczkę wody * liczba Avogadro.
  4. Wygeneruj i zapisz pliki topologii i współrzędnych systemu, które służą jako dane wejściowe do późniejszej symulacji produkcji (saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd).

3. Symulacja dynamiki molekularnej

  1. Korzystając z bursztynu, początkowo poddaj system symulacji 5000 cyklom najbardziej stromego zejścia i sprzężonej minimalizacji energii gradientu, aby obejść niekorzystne konfiguracje. Minimalizację należy przeprowadzić w wielu etapach, stopniowo zmniejszając ograniczenie stosowane do atomów substancji rozpuszczonej z 25 kcal mol-1 A-2 do 0 kcal mol-1 A-2.
    1. W pliku wejściowym minimalizacji min.in dostosuj zmienną maxcyc dla całkowitego cyklu minimalizacji (maxcyc = 5000) i ncyc, aby określić liczbę cykli dla algorytmu najbardziej stromego spadania. Użyj zmiennej restraint_wt, aby zastosować siłę utwierdzenia do atomów substancji rozpuszczonej określonych przez parametr maski utwierdzenia. Następnie uruchom minimalizację w następujący sposób:
      $AMBERHOME/bin/sander -O -i min.in -o min.out -p X.prmtop -c X.inpcrd -r min.rst -ref X.inpcrd
      UWAGA: Zastosowana strategia i rzeczywiste parametry mogą się różnić w zależności od własnych preferencji. Szczegóły i wskazówki można znaleźć w podręczniku i na stronie internetowej Amber (https://ambermd.org/index.php)
  2. Podgrzać układ przez 100 ps od 0 K do 300 K, ustawiając ograniczenie 10 kcal mol-1 A-2 na atomach substancji rozpuszczonej. Aby to zrobić, ustaw tempi = 0.0, temp0 = 300.0, dt = 0.002 ps, nstlim = 50000 i restraint_wt = 10 w pliku wejściowym heat.in. Uruchom ogrzewanie za pomocą następującego polecenia:
    $AMBERHOME/bin/szlifierka -O -i heat.in -o heat.out -p X.prmtop -c min.rst -r heat.rst -x heat.mdcrd -ref min.rst
  3. Zrównoważyć układ przez 900 ps w zespole NPT; stała liczba atomów, temperatura (temp0 = 300,0) i ciśnienie (ntp = 1), kontrolując je metodą Berendsena (ntt = 1). Ustaw granicę odległości 9 A (cięcie = 9,0) dla oddziaływań elektrostatycznych dalekiego zasięgu. Stopniowo zmniejszać ograniczenie atomu substancji rozpuszczonej do 0,1 kcal mol-1 Å-2 (restraint_wt = 0,1). Uruchom plik wejściowy równoważności equil.in opisujący powyższe parametry w następujący sposób:
    $AMBERHOME/bin/szlifierka -O -i equil.in -o equil.out -p X.prmtop -c ciepło.rst -r ekwiwalent.rst -x ekwiwal.mdcrd -ref ciepło.rst
  4. Zakończ równoważenie za pomocą nieograniczonej symulacji 5 ns (zestaw dt = 0,002 ps, ntslim = 2500000).
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i equil_final.in -o equil_final.out -p X.prmtop -c equil.rst -r equil_final.rst -x equil_final.mdcrd -ref equil.rst
  5. Sprawdź, czy system jest zrównoważony, badając wartości temperatury, ciśnienia, gęstości i energii.
    $AMBERHOME/bin/process_mdout.perl heat.out equil.out equil_final.out
    Podsumowanie xmgrace. TEMPERATURA/GĘSTOŚĆ/ETOT/EPTOT/EKTOT
  6. Przeprowadź symulację produkcji dla 100 ns (ustaw dt = 0,002 ps, ntslim = 50000000 in prod.in) i zapisuj konformacje co 10 ps (ntwx = 5000).
    $AMBERHOME/bin/sander -O -i prod.in -o prod.out -p X.prmtop -c equil_final.rst -r prod.rst -x prod.mdrcd -ref equil_final.rst

4. Analiza

  1. Oględziny
    1. Wizualizuj konformacje próbkowane podczas symulacji kinazy EGFR typu dzikiego i zmutowanego, otwierając pliki topologii bursztynowej X.prmtop i odpowiadające im pliki trajektorii prod.mdcrd w VMD36. Korzystając z wygodnych reprezentacji struktury drugorzędowej, przeanalizuj ogólną dynamikę strukturalną białek na podstawie zarejestrowanej trajektorii. Zobacz konkretne interakcje między atomami/resztami będącymi przedmiotem zainteresowania, takie jak katalitycznie niezbędny mostek solny K745 - E762.
    2. Alternatywnie, można zapisać wiele konformacji próbkowanych podczas symulacji w formacie PDB i otworzyć je za pomocą programu Chimera. Nałóż struktury na strukturę początkową lub środkową za pomocą opcji MatchMaker. Początkową/środkową strukturę można wyświetlić w bryle, a pozostałe wyrównane struktury w kolorze wyblakłej bieli. Takie podejście pozwala na bardziej przejrzystą wizualizację zarejestrowanych ruchów strukturalnych.
      UWAGA: Sugestie dotyczące efektywnych reprezentacji i przetwarzania zespołów konformacyjnych z MDS można znaleźć w Melvin et al.37.
  2. Analiza RMSD i RMSF
    1. Obliczaj obliczenia odchylenia średniokwadratowego (RMSD) i fluktuacji średniej kwadratowej (RMSF) za pomocą programu Cpptraj 38, aby przeanalizować globalną stabilność białek i zbadać elastyczność różnych jednostek strukturalnych. W plikach wejściowych rmsd.in i rmsf.in należy wskazać atomy szkieletu (dla RMSD) i atomy Cα (dla RMSF) struktury początkowej jako odniesienie dla dopasowania RMS. Do plików rmsd/rmsf.in zaimportuj bursztynowe pliki topologii (parm X.promtop) i odpowiadające im pliki trajektorii (trajin prod.mdcrd). Następnie uruchom polecenie Cpptraj -i rmsd/rmsf.in. Wykreśl dane wyjściowe do analizy.
    2. Alternatywnie, wyrównaj zespoły konformacyjne i pokoloruj każdą resztę na podstawie atomu Cα RMSD. Aby to zrobić, otwórz konformacje w Chimerze i dostosuj je do opcji Matchmaker.
      1. Przejdź do pozycji Narzędzia → Przedstawianie → Renderuj według atrybutu. Jako atrybuty wybierz Reszty zespołu konformacyjnego i Cα RMSD i kliknij przycisk OK. Ślad łańcucha konformacji zostanie następnie pokolorowany od niebieskiego → białego → czerwonego, odpowiednio odzwierciedlając obszary o wysokiej, średniej i niskiej stabilności strukturalnej.
  3. Analiza wiązań wodorowych
    1. Przeanalizuj interakcję wiązań wodorowych między ATP a EGFR typu dzikiego/ΔELREA. Przygotuj skrypt Cpptraj hbond.in, aby wykonać to zadanie. Zdefiniować wiązanie wodorowe o odległości donor-akceptor mniejszej lub równej 3,5 A i kącie wiązania większym lub równym 135°. Należy określić analizę tylko dla międzycząsteczkowych wiązań wodorowych ze zmienną nointramolową, tj. wiązań wodorowych między ATP i EGFR (hbond All nointramol dist 3,5 out nhb.agr avgout avghb.dat). Uruchom skrypt jako Cpptraj -i hbond.in.
    2. Użyj tego skryptu do oceny oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych, na przykład między resztami K745 i E762, które są kluczowymi resztami dla aktywności kinazy EGFR. Aby to zrobić, określ K745 jako donora wiązań wodorowych i E762 jako akceptora wiązań wodorowych w hbond.in i uruchom odpowiednio skrypt.
  4. Monitorowanie odległości między atomami
    1. Zmierz odległość między K745 i E762, otwierając trajektorie EGFR typu dzikiego i ΔELREA apo w VMD. Wybierz Cδ z Glu762 i Nz z Lys745, klikając Mysz → etykietę → wiązanie. Monitoruj odległość podczas symulacji, kreśląc wykres z grafiką → etykietami → wykresem → wiązania.
  5. Obliczenia darmowej energii
    1. Aby obliczyć szacowane energie swobodne wiązania między ATP a EGFR typu dzikiego/ΔELREA oraz między kinazami aktywatora i odbiornika EGFR typu dzikiego/A702V, należy użyć modułu uogólnionej powierzchni Borna (MM-GBSA) z mechaniką molekularną39 dostępnego w pakiecie AMBER. Ustaw ATP jako ligand, a EGFR jako receptor w badaniu ΔELREA. W badaniu A702V określ kinazę odbiorczą jako ligand, a kinazę aktywatora jako receptor.
    2. Najpierw przygotuj pliki PDB kompleksu ligand, receptor i ligand-receptor oddzielnie w programie skokowym, ustawiając wartość PBRadii na mbondi2. W przypadku plików PDB zapisz pliki bursztynowej topologii fazy gazowej (.prmtop) i plików współrzędnych (.inpcrd).
    3. Następnie w pliku wejściowym mmgbsa, mmgbsa.in, ustaw igb = 2, saltcon = 0.1. Obliczenia energii wiązania należy wykonać na podstawie trajektorii symulacji, przygotowanych plików bursztynowych receptora/liganda oraz parametrów w mmgbsa.in za pomocą skryptu MMPBSA.py dostępnego w języku Amber w następujący sposób:
      $AMBERHOME/bin/MMPBSA.py -O -i mmgbsa.in -o mmgbsa.dat -sp X.prmtop -cp complex.prmtop -rp receptor.prmtop -lp ligand.prmtop -y prod.mdcrd -eo output.csv
    4. Analizuj dane wyjściowe output.csv, kreśląc wykresy.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół został wykorzystany do zbadania strukturalnego wpływu mutacji ΔELREA i A702V na strukturę kinazy EGFR. Jednym z zastosowań protokołu było zbadanie wpływu mutacji na lokalną stabilność strukturalną/konformacyjną poprzez obliczenie wartości RMSD i RMSF na podstawie symulacji MD. Ponieważ mutacja A702V znajduje się w segmencie b. błony przykśtamowej, wartość RMSD tego segmentu kinazy odbiorczej w stosunku do struktury wyjściowej została obliczona zarówno dla EGFR typu dzikiego, jak i A702V. Wynik (Rysunek 4A) ujawnił, że segment B juxtramembrane mutanta ma zwiększoną stabilność konformacyjną podczas symulacji 100 ns (średnia RMSD 0,7 A - 95% przedział ufności (CI) 0,009) w porównaniu z domeną kinazy EGFR typu dzikiego (średnia RMSD 1,1 A - 95% CI 0,01). Jest to bardzo prawdopodobne w wyniku ściślejszych oddziaływań hydrofobowych na granicy dimerów spowodowanych zamianą alaniny 702 (łańcuch boczny grupy metylowej) na większą resztę hydrofobową, walinę (łańcuch boczny grupy izopropylowej), co prowadzi do zwiększonych oddziaływań hydrofobowych V702 na domenie kinazy odbiorczej z izoleucyną 941 domeny kinazy aktywatora.

Mutacja ΔELREA znajduje się w pętli β3-αC, w sąsiedztwie funkcjonalnie krytycznej helisy αC; konformacja helisy αC jest kluczem do przesunięć między stanami aktywnymi i nieaktywnymi kinazy EGFR. Stabilność konformacyjną helisy αC w stanie aktywnym oceniono, badając RMSF nad atomami Cα reszt w helisie podczas symulacji MD (Rysunek 4B): ogólnie występują mniejsze wahania w mutancie (średnia RMSF 1,1 A - 95% CI 0,4) w porównaniu z typem dzikim (średnia RMSF 1,5 A - 95% CI 0,57); z największą różnicą w wahaniach odnotowanych dla N-końcowych pozostałości. Próbkowane konformacje odpowiednio nałożone na strukturę mediany domeny kinazy typu dzikiego i domeny kinazy ΔELREA również potwierdzają te wyniki (Rysunek 4C): zarówno domeny kinazy typu dzikiego, jak i ΔELREA mają ogólnie podobną stabilność dla nałożonych konformacji, z wyjątkiem pętli β3-αC i helisy αC, które są wyraźnie bardziej stabilne w ΔELREA EGFR. Wyniki te wskazują, że delecja sekwencji ELREA hamuje ruch helisy αC w stanie aktywnym, a tym samym ogranicza, a tym samym stabilizuje aktywną konformację. Ponadto, ponieważ helisa αC stanowi część asymetrycznego interfejsu dimerów, ograniczenia na helisie αC w mutancie z dużym prawdopodobieństwem ustabilizowałyby asymetryczny dimer, wydłużając czas trwania stanu aktywowanego.

Innym zastosowaniem protokołu jest badanie zachowania kluczowych interakcji wewnątrz- i międzycząsteczkowych zachodzących podczas symulacji. W związku z tym interakcja między K745 i E762, która ma fundamentalne znaczenie dla aktywności enzymatycznej EGFR, została przeanalizowana zarówno dla aktywnej formy kinazy typu dzikiego, jak i kinazy ΔELREA EGFR, mierząc procentowe zajęcie wiązań wodorowych utworzonych między polarnymi atomami łańcucha bocznego dwóch reszt podczas symulacji MD (Rysunek 5A): ta kluczowa interakcja elektrostatyczna powstawała częściej w domenie kinazy ΔELREA w porównaniu z domeną kinazy typu dzikiego, ze względu na bardziej stabilną helisę αC, która mieści E762. Oceniono również interakcje między Mg2 + -ATP a domenami kinazy EGFR typu dzikiego i ΔELREA (Rysunek 5B) podczas symulacji ( Rysunek 5C): liczba wiązań wodorowych była większa dla ΔELREA (średnia wartość 4,0 - 95% CI 0,03) niż dla EGFR typu dzikiego (średnia wartość 3,2 - 95% CI 0,04). Dalsza analiza wiązań wodorowych wykazała, że K745 oddziałuje częściej z grupami fosforanowymi ATP w ΔELREA EGFR, co jest związane z bardziej stabilną interakcją K745-E762 odnotowaną w symulacji domeny kinazy EGFR z mutacją ΔELREA.

Symulacje MD opisane w protokole są również przydatne do oceny względnej energii swobodnej wiązania dla interakcji białko-białko i białko-ligand. Energie wiązania między domenami kinazy aktywatora i odbiornika EGFR typu dzikiego i A702V oraz między ATP a domenami kinazy EGFR typu dzikiego i zmutowanego ΔELREA, obliczono na podstawie uogólnionych obliczeń pola powierzchni Borna (MMGBSA) mechaniki molekularnej (Rysunek 6A): mutant A702V wytwarzał niższą średnią wartośćwiązania ΔG (średniawartość wiązania ΔG = -76 kcal/mol - 95% CI 0,47), co oznacza korzystniejsze interakcje dimerów, w przeciwieństwie do domeny EGFR typu dzikiego (średniewiązanie ΔG = -61 kcal/mol - 95% CI 0,61). Obserwacja ta jest zgodna z bardziej stabilnym segmentem B przybłony przykwociowej i ściślejszym interfejsem dimerów ze względu na zwiększone oddziaływania hydrofobowe obserwowane dla domeny kinazy A702V EGFR. W przypadku wiązania ATP z domenami kinazy EGFR typu dzikiego i ΔELREA (Figura 6B), obliczenia MMGBSA przewidują silniejsze wiązanie ATP z mutantem ΔELREA (średniewiązanie ΔG -57 kcal/mol - 95% CI 0,43) w porównaniu z EGFR typu dzikiego (średniewiązanie ΔG -48 kcal/mol - 95% CI 0,33). Wynik ten jest zgodny z większą liczbą wiązań wodorowych zarejestrowanych między ATP a ΔELREA EGFR (Rysunek 5C) w porównaniu z domeną typu dzikiego.

Protokół może być również wykorzystany do badania zmian konformacyjnych zaobserwowanych podczas symulacji. W obecnym badaniu wpływ mutacji ΔELREA na nieaktywną konformację EGFR badano poprzez oględziny i superpozycję pobranych konformacji z symulacji. Analiza ujawniła ruch helisy αC do wewnątrz w domenie kinazy ΔELREA EGFR (Rysunek 7A), zmiana strukturalna oczekiwana podczas przejścia do stanu aktywnego. W przeciwieństwie do tego, helisa αC nieaktywnego EGFR typu dzikiego zachowała swoją początkową konformację (Rysunek 7B). Tak więc symulacje MD wspierają propozycję, że mutacja delecji, która wykazała eksperymentalnie, zwiększa aktywność kinazy40,41, promuje konformacyjne przesunięcie z nieaktywnej kinazy w kierunku stanu aktywnego.

Analiza dynamiki białek; Wykresy symulacyjne EGFR A/B, zmiany konformacyjne C; badanie molekularne.
Rycina 4: Stabilność konformacyjna typu dzikiego i zmutowanego domeny aktywnej kinazy EGFR podczas symulacji MD. (A) RMSD (atomy szkieletu) nad przylegającym segmentem B błony typu dzikiego (niebieskiego) i A702V (czerwonego) domeny kinazy odbiorczej. (B) RMSF (atomy Cα) nad resztą helisy αC: typ dziki (niebieski) i ΔELREA (złoto). (C) Nałożone na siebie konformacje konformacji kinazy EGFR typu dzikiego (po lewej) i ΔELREA (po prawej); ślady łańcuchowe zabarwione na podstawie RMSD (atomów Cα) każdej reszty w odniesieniu do struktury środkowej. Kolorystyka waha się od niebieskiego przez biały do czerwonego, reprezentując obszary o wysokiej lub niskiej stabilności konformacyjnej. Należy zauważyć, że "wolne" N-końcowe regiony izolowanej domeny kinazy, pokolorowane na czerwono, nie wykazywałyby tego poziomu mobilności w nienaruszonej strukturze EGFR. Rysunki zaczerpnięte z Chakroborty et al.9 (Rysunek 4A reprodukowany za zgodą Journal of Biological Chemistry) i Tamirat et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

analiza wiązania białek EGFR; wykres słupkowy, diagram struktury molekularnej, wykres wiązań wodorowych.
Ryc. 5: Kluczowe cechy zaobserwowane w aktywnej kinazie odbiorczej podczas symulacji MD: mostek solny K745-E762, helisa αC i interakcje z ATP. (A) Procentowe obłożenie oddziaływania K745-E762 podczas symulacji domen kinazy EGFR typu dzikiego (niebieskiego) i ΔELREA (złotego). B) Pozostałości mutanta typu dzikiego i ΔELREA oddziałujące z ATP (pałeczki). Mg2+ (zielony) współrzędne z ATP i D855. (C) Liczba wiązań wodorowych utworzonych przez ATP zarówno z domenami kinazy EGFR typu dzikiego, jak i ΔELREA podczas symulacji MD. Rysunek z Tamirat et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wiążący wykres energii swobodnej; ΔG (kcal/mol) w funkcji czasu (ns) dla wariantów EGFR, A702V, ΔELREA.
Rysunek 6: Podczas symulacji obserwuje się niższe względne energie swobodne wiązania dla domen zmutowanych kinaz. (A) Energie wiązania obliczone dla interakcji między domenami kinazy aktywatora i odbiornika EGFR typu dzikiego (niebieskiego) i A702V (czerwonego). (B)Wiązanie ΔG ATP z domenami kinazy EGFR typu dzikiego (niebieskiego) i ΔELREA (złotego). Rysunki zaczerpnięte z Chakroborty et al.9 (Rysunek 6A reprodukowany za zgodą Journal of Biological Chemistry) i Tamirat et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagramy struktury białka EGFR, typu dzikiego i ΔELREA, ilustrujące zmiany helisy αC i pętli A.
Ryc. 7: Nałożone konformacje z domeny kinazy EGFR typu dzikiego i nieaktywnej ΔELREA. Konformacja helisy αC i helisy pętli A (A) typu dzikiego (struktura środkowa na niebiesko) i (B) ΔELREA EGFR (złoto). Inne próbkowane konformacje, wyblakła biel; początkowe struktury przed symulacjami MD, różowe. Rysunek z Tamirat et al.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym badaniu koncentruje się na wykorzystaniu symulacji dynamiki molekularnej do badania lokalnych i globalnych zmian strukturalnych, które powstają w wyniku aktywacji mutacji somatycznych domeny kinazy EGFR. Chociaż rentgenowskie struktury krystaliczne EGFR typu dzikiego i zmutowanego dostarczają nieocenionego wglądu strukturalnego, przedstawiają one jedną lub kilka statycznych reprezentacji. Jednak nieodłączną funkcją biologiczną ErbB są niezbędne przejścia między enzymatycznie nieaktywną a aktywną kinazą tyrozynową, wywołujące dynamiczne zmiany zarówno w strukturze, jak i wewnątrzcząsteczkowych oddziaływaniach między monomerami kinazy. W związku z tym przeprowadzono symulacje MD w celu zbadania dynamicznej natury domeny kinazy tyrozynowej EGFR, w tym struktury typu dzikiego, wprowadzonej mutacji delecyjnej ΔELREA i mutacji A702V. Symulacje te zakończyły się sukcesem w wyjaśnieniu prawdopodobnej roli tych mutacji w strukturach oraz tego, w jaki sposób ich wpływ na konformację domeny kinazy tyrozynowej doprowadzi do obserwowanego eksperymentalnie wzrostu aktywności kinazy EGFR.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest wykorzystanie odpowiedniej struktury do oceny wpływu mutacji. Jednym ze sposobów wyboru odpowiedniej struktury wejściowej symulacji jest wizualizacja lokalizacji mutacji w statycznej strukturze 3D i zbadanie jej możliwego wpływu w odniesieniu do sąsiednich aminokwasów i jednostek strukturalnych. Na przykład w tym badaniu, ponieważ mutacja EGFR A702V znajduje się w segmencie błony B, który tworzy asymetryczny interfejs dimerów, zastosowanie struktury dimeru do symulacji w przeciwieństwie do monomeru ma kluczowe znaczenie. Zastosowanie struktury monomerycznej wystawiłoby przybłonowy segment B kinazy odbiorczej na działanie rozpuszczalnika, pozbawiając go oddziaływań stabilizujących, wzmocnionych przez mutację do większej reszty hydrofobowej i interakcje z izoleucyną 941 z reszt płata C kinazy aktywatora. Ponadto warto zauważyć, że struktura 3D reprezentowana przez współrzędne w pliku PDB niekoniecznie odpowiada biologicznie istotnej strukturze, która powinna być wykorzystana do badań. Na przykład przy strukturze ErbB4, kod PDB 3BCE, współrzędne PDB odpowiadają trimerowi, ale wynika to z kontaktów kryształów (podczas wizualizacji tej struktury widać niewiele kontaktów między monomerami). Macierze w pliku PDB mogą być używane (np. w Chimerze) do rekonstrukcji struktur powiązanych krystalograficznie, które można wizualizować w celu identyfikacji łańcuchów odpowiadających biologicznie istotnej strukturze 3D, jak opisano w oryginalnej publikacji42. Kolejnym istotnym krokiem protokołu jest odpowiednie przygotowanie struktury wejściowej symulacji, takie jak zbudowanie brakujących aminokwasów w różnych regionach pętli, a zwłaszcza tam, gdzie znajdują się w pobliżu mutacji. Chociaż w PDB istnieje wiele struktur EGFR typu dzikiego, dostępna jest tylko ograniczona liczba zmutowanych struktur EGFR. W związku z tym struktury mutantów również muszą być modelowane; w przypadku mutacji pojedynczej reszty, takiej jak A702V, do mutacji reszty użyto Chimery; natomiast w przypadku mutacji delecyjnej ΔELREA zastosowano Modeller.

Różne parametry wykorzystywane w plikach wejściowych symulacji - na przykład liczba cykli minimalizacji, nagrzewanie systemu do żądanej temperatury za jednym razem lub zamiast tego powolne nagrzewanie przez kilka temperatur pośrednich, okres równowagi i symulacji produkcyjnych - mogą być modyfikowane w zależności od cząsteczki badania, celu pracy i własnych preferencji. Podczas przeprowadzania symulacji MD często można również natknąć się na błędy, które mogą wynikać z plików wejściowych, problemy związane z używanym oprogramowaniem symulacyjnym, a nawet błąd użytkownika. Dlatego bardzo ważne jest, aby zrozumieć źródło błędów poprzez dokładne zbadanie wszelkich komunikatów o błędach. Większość programów symulacyjnych posiada listę mailingową, na której użytkownicy mogą zadawać pytania twórcom oprogramowania i innym użytkownikom, dzięki czemu można rozwiązać większość problemów. Ponadto instrukcje obsługi stanowią istotną pomoc w zrozumieniu szczegółów protokołu symulacji, w tym założeń i ograniczeń. Chociaż symulacja MD jest ważnym narzędziem do badania dynamicznych właściwości cząsteczek, należy pamiętać, że wyniki obliczeń muszą być dokładnie oceniane w połączeniu z innymi źródłami informacji, aby ocenić ich trafność. Tam, gdzie to możliwe, należy współpracować z badaczami, którzy są ekspertami w dziedzinie badanych białek, zwłaszcza w przypadku przeprowadzania odpowiednich badań eksperymentalnych w laboratoriach mokrych, które służą dostarczeniu wyników do interpretacji strukturalnej, a także zasugerowaniu eksperymentów, które można przeprowadzić w oparciu o obserwacje strukturalne w celu przetestowania hipotez.

W tym badaniu protokół okazał się skuteczny w badaniu dynamicznego wpływu strukturalnego mutacji ΔELREA i A702V na struktury kinazy EGFR. Symulacje wykazały, że ΔELREA hamuje funkcjonalnie niezbędną helisę αC i promuje konformacyjne przejście od nieaktywnej kinazy do stabilizowanej kinazy aktywnej. Wyniki symulacji są niezależnie poparte danymi dotyczącymi odpowiedzi na leki, które wykazały wpływ inhibitorów kinazy tyrozynowej na linie komórkowe raka płuc z mutacją delecji ΔELREA i EGFR typu dzikiego, przy czym w przypadku ΔELREA odnotowano większe hamowanie przez leki rozpoznające aktywną konformację kinazy niż w przypadku EGFRtypu dzikiego. W przypadku mutacji A702V symulacje MD wskazują, w porównaniu z typem dzikim, na zwiększoną stabilizację granicy faz kinazy aktywator-odbiornik, a także większe powinowactwo kinazy aktywatora i odbiornika do siebie, co razem wspiera utrzymanie aktywowanej konformacji kinazy EGFR. Mutacja A702V, zlokalizowana na przybłonowym segmencie B kinazy odbiorczej, zwiększyłaby oddziaływania hydrofobowe z kinazą aktywatorową, działającą w celu przedłużenia czasu trwania stanu aktywowanego. Mutacja A702V wspomaga przeżycie komórek przy braku czynnika wzrostu i została zidentyfikowana w badaniach przesiewowych in vitro pod kątem mutacji EGFR9.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest finansowane z grantów dla M.S.J. z Akademii Fińskiej (308317, 320005), Fundacji Sigrid Juselius i Tor, funduszu pamięci Joe i Pentti Borg, a także dla K.E. z Akademii Fińskiej (274728, 316796), Fińskiej Fundacji Raka oraz Centralnego Szpitala Uniwersyteckiego w Turku. M.Z.T. jest finansowany przez Sieć Doktorancką Biologii Informacyjnej i Strukturalnej Åbo Akademi. Dziękujemy Centrum Informatycznemu Nauki CSC za zasoby obliczeniowe oraz dr Jukce Lehtonenowi za wsparcie informatyczne w ramach sieci bioinformatycznej Biocenter Finland; oraz sieć infrastruktury biologii strukturalnej Biocenter Finland.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amber softwareUniwersytet Kalifornijski, San FranciscoWersja 2018Wykonywalny
program ChimeraZasób dla bioinformatyki, wizualizacji i informatyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w San FranciscoWersja 1.13.1Wykonywalne
pliki struktury EGFRBankWspółrzędne 3D struktur EGFR
MaestroSchrö dinger LLCWersja 2018-3Wykonywalny
program modelarskiAndrej Š ali Lab, Wydział Nauk Biofarmaceutycznych i Chemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Kalifornijski w San FranciscoZawarte w programie Chimera
oprogramowanie VMDGrupa Biofizyki Teoretycznej i Obliczeniowej, Uniwersytet Illinois w Urbana-ChampaignWersja 1.9.3Plik wykonywalny
danych o białkach

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).">Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 127-137 (2001).
  2. The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768(2014).">Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Ferguson, K. M. The EGFR family: not so prototypical receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, a020768(2014).
  3. ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).">Arteaga, C. L., Engelman, J. A. ERBB receptors: From oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 282-303 (2014).
  4. Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications. Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).">Mishra, R., Hanker, A. B., Garrett, J. T. Genomic alterations of ERBB receptors in cancer: Clinical implications. Oncotarget. 8, 114371-114392 (2017).
  5. Cerami, E., et al. cBioPortal for Cancer Genomics. , https://www.cbioportal.org (2020).
  6. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).">Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 350 (21), 2129-2139 (2004).
  7. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).">Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
  8. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).">Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
  9. Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).">Chakroborty, D., et al. Unbiased in vitro screen for activating EGFR mutations. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9377-9389 (2019).
  10. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors. Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).">Leahy, D. J. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGF/ErbB) Family of Receptors. Advances in Protein Chemistry. 68, 1-27 (2004).
  11. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).">Roskoski, R. ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacological Research. 87, 42-59 (2014).
  12. Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation. PLoS ONE. 14 (9), e0222814(2019).">Tamirat, M. Z., Koivu, M., Elenius, K., Johnson, M. S. Structural characterization of EGFR exon 19 deletion mutation using molecular dynamics simulation. PLoS ONE. 14 (9), e0222814(2019).
  13. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455, 1069-1075 (2008).">Ding, L., et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature. 455, 1069-1075 (2008).
  14. Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer. Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).">Kurppa, K. J., Denessiouk, K., Johnson, M. S., Elenius, K. Activating somatic ERBB4 mutations in non small-cell lung cancer. Oncogene. 35 (10), 1283-1291 (2016).
  15. Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers. International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).">Soung, Y. H., et al. Somatic mutations of the ERBB4 kinase domain in human cancers. International Journal of Cancer. 118, 1426-1429 (2006).
  16. Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer. Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).">Tvorogov, D., et al. Somatic mutations of ERBB4: selective loss-of-function phenotype affecting signal transduction pathways in cancer. Journal of Biological Chemistry. 284, 5582-5591 (2009).
  17. Protein tyrosine kinase structure and function. Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).">Hubbard, S. R., Till, J. H. Protein tyrosine kinase structure and function. Annual Review of Biochemistry. 69 (1), 373-398 (2000).
  18. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109 (3), 275-282 (2002).">Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109 (3), 275-282 (2002).
  19. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms. Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).">Jura, N., et al. Catalytic control in the EGF receptor and its connection to general kinase regulatory mechanisms. Molecular Cell. 42, 9-22 (2011).
  20. Molecular dynamics and protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).">Karplus, M., Kuriyan, M., J, Molecular dynamics and protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102 (19), 6679-6685 (2005).
  21. Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).">Shan, Y., Arkhipov, A., Kim, E. T., Pan, A. C., Shaw, D. E. Transitions to catalytically inactive conformations in EGFR kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (18), 7270-7275 (2013).
  22. A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).">Reckamp, K. L., et al. A phase I trial to determine the optimal biological dose of celecoxib when combined with erlotinib in advanced non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 12 (11 Pt 1), 3381-3388 (2006).
  23. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).">Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).">Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  25. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor. Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).">Zhang, X., Gureasko, J., Shen, K., Cole, P. A., Kuriyan, J. An Allosteric Mechanism for Activation of the Kinase Domain of Epidermal Growth Factor Receptor. Cell. 125 (6), 1137-1149 (2006).
  26. Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).">Stamos, J., Sliwkowski, M. X., Eigenbrot, C. Structure of the epidermal growth factor receptor kinase domain alone and in complex with a 4-anilinoquinazoline inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46265-46272 (2002).
  27. Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).">Sogabe, S., et al. Structure-Based Approach for the Discovery of Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine-Based EGFR T790M/L858R Mutant Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters. 4 (2), 201-205 (2013).
  28. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).">Sali, A., Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. Journal of Molecular Biology. 234 (3), 779-815 (1993).
  29. Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity. Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).">Yun, C. H., et al. Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity. Cancer Cell. 11 (3), 217-227 (2007).
  30. Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain. Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).">Park, J. H., Liu, Y., Lemmon, M. A., Radhakrishnan, R. Erlotinib binds both inactive and active conformations of the EGFR tyrosine kinase domain. Biochemical Journal. 448 (3), 417-423 (2012).
  31. Schrödinger LLC. Release 2018-3: Maestro. , https://www.schrodinger.com/maestro (2018).
  32. AMBER 2018. , University of California. San Francisco. (2018).">Case, D. A., et al. AMBER 2018. , University of California. San Francisco. (2018).
  33. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).">Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., Simmerling, C. ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
  34. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).">Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., Klein, M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. Journal of Chemical Physics. 79 (2), 926-935 (1983).
  35. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).">Meagher, K. L., Redman, L. T., Carlson, H. A. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. Journal of Computational Chemistry. 24 (9), 1016-1025 (2003).
  36. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).">Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD: Visual molecular dynamics. Journal of Molecular Graphics. 14 (1), 33-38 (1996).
  37. Visualizing ensembles in structural biology. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).">Melvin, R. L., Salsbury, F. R. Visualizing ensembles in structural biology. Journal of Molecular Graphics and Modelling. 67, 44-53 (2016).
  38. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).">Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
  39. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).">Miller, B. R., et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. Journal of Chemical Theory and Computation. 8 (9), 3314-3321 (2012).
  40. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).">Guha, U., et al. Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancer-specific alleles of EGFR and KRAS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (37), 14112-14117 (2008).
  41. Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).">Furuyama, K., et al. Sensitivity and kinase activity of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 19 and others to EGFR-tyrosine kinase inhibitors. Cancer Science. 104 (5), 584-589 (2013).
  42. Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase. Structure. 6 (3), 460-467 (2008).">Qiu, C., et al. Mechanism of Activation and Inhibition of the HER4/ErbB4 Kinase. Structure. 6 (3), 460-467 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Molecular Dynamics SimulationEGFR MutationsProtein Structure AnalysisConformational StabilityATP BindingAsymmetric DimerHydrogen Bond AnalysisBinding Free EnergyRoot Mean Square DeviationVisual Molecular Dynamics

Related Articles