Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Podsumowanie

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Streszczenie

Egzosomy to małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe uwalniane przez praktycznie wszystkie komórki i wydzielane we wszystkich płynach biologicznych. Opracowano wiele metod izolacji tych pęcherzyków, w tym ultrawirowanie, ultrafiltrację i chromatografię wykluczania wielkości. Jednak nie wszystkie nadają się do oczyszczania i charakteryzowania egzosomów na dużą skalę. Przedstawiono tutaj protokół ustanawiania kultur pierwotnych fibroblastów wyizolowanych z mięśni szkieletowych dorosłych myszy, a następnie oczyszczania i charakteryzowania egzosomów z pożywki hodowlanej tych komórek. Metoda opiera się na zastosowaniu sekwencyjnych etapów wirowania, po których następują gradienty gęstości sacharozy. Czystość preparatów egzosomalnych jest następnie weryfikowana za pomocą analiz western blot przy użyciu baterii markerów kanonicznych (tj. Alix, CD9 i CD81). Protokół opisuje, jak izolować i koncentrować bioaktywne egzosomy do mikroskopii elektronowej, spektrometrii mas i eksperymentów wychwytu do badań funkcjonalnych. Można go łatwo skalować w górę lub w dół i dostosować do izolacji egzosomów z różnych typów komórek, tkanek i płynów biologicznych.

Wprowadzenie

Egzosomy to niejednorodne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o rozmiarach od 30 do 150 nm. Są uznanymi kluczowymi graczami w procesach fizjologicznych i patologicznych, biorąc pod uwagę ich wszechobecne rozmieszczenie w tkankach i narządach^1,2. Egzosomy przenoszą złożony ładunek białek, lipidów, typów DNA i typów RNA, które różnią się w zależności od typu komórek, z których pochodzą^1,2,3. Egzosomy są wzbogacone w białka, które pełnią różne funkcje (tj. tetraspaniny, w tym CD9 i CD63) są odpowiedzialne za zdarzenia fuzji. Na przykład białka szoku cieplnego HSP70 i HSP90 biorą udział w wiązaniu i prezentacji antygenu. Ponadto Alix, Tsg101 i flotylina uczestniczą w biogenezie i uwalnianiu egzosomów i są szeroko stosowane jako markery tych nanopęcherzyków^2,3,4.

Egzosomy zawierają również różne rodzaje RNA (np. mikroRNA, długie niekodujące RNA, rybosomalne RNA), które mogą być przenoszone do komórek odbiorcy, gdzie wpływają na dalsze przesyłanie sygnału³. Będąc otoczonym pojedynczą błoną jednostkową, bioaktywność egzosomów zależy nie tylko od ładunku białek i kwasów nukleinowych, ale także od składników lipidowych błony ograniczającej¹. Błony egzosomalne są wzbogacone w fosfatydyloserynę, kwas fosfatydynowy, cholesterol, sfingomielinę, kwas arachidonowy i inne kwasy tłuszczowe, z których wszystkie mogą wpływać na stabilność egzosomów i topologię błony^2,3. W wyniku ułożenia ładunku i lipidów egzosomy inicjują szlaki sygnałowe w komórkach odbiorczych i uczestniczą w utrzymaniu prawidłowej fizjologii tkanek^1,2,4,5. Wykazano, że w pewnych warunkach patologicznych (np. neurodegeneracja, zwłóknienie i rak) wywołują i rozprzestrzeniają bodźce patologiczne^{4,6,7,8,9,10,11}.

Dzięki swojej zdolności do przekazywania sygnałów do sąsiednich lub odległych miejsc, egzosomy stały się cennymi biomarkerami do diagnozowania lub prognozowania stanów chorobowych. Ponadto egzosomy zostały wykorzystane eksperymentalnie jako nośniki związków terapeutycznych^2,12. Potencjalne zastosowanie tych nanopęcherzyków w praktyce klinicznej sprawia, że metoda izolacji staje się coraz ważniejsza w celu osiągnięcia maksymalnej wydajności, czystości i odtwarzalności. Opracowano i wdrożono różne techniki izolacji egzosomów. Ogólnie rzecz biorąc, egzosomy można wyizolować z kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych lub płynów ustrojowych za pomocą wirowania różnicowego, chromatografii wykluczania wielkości i wychwytywania immunologicznego (przy użyciu dostępnych na rynku zestawów). Każde podejście ma unikalne zalety i wady, które zostały omówione wcześniej^1,2,13,14.

Opisany protokół skupia się na 1) izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów z dorosłego mięśnia brzuchatego łydki myszy oraz 2) oczyszczaniu i charakterystyce egzosomów uwalnianych do pożywki hodowlanej przez te komórki. Obecnie brakuje dobrze ugruntowanego protokołu izolacji egzosomów z pierwotnych fibroblastów do badań funkcjonalnych. Pierwotne fibroblasty nie wydzielają dużych ilości egzosomów, co sprawia, że proces izolacji i oczyszczania jest trudny. Protokół ten opisuje oczyszczanie dużych ilości czystych egzosomów z dużych objętości kultur przy zachowaniu ich integralności morfologicznej i aktywności funkcjonalnej. Oczyszczone egzosomy uzyskane z kondycjonowanej pożywki zostały z powodzeniem wykorzystane w eksperymentach wychwytu in vitro w celu indukowania specyficznych szlaków sygnałowych w komórkach biorcy. Zostały one również wykorzystane do porównawczych analiz proteomicznych ładunków egzosomalnych z wielu próbek biologicznych⁴.

Protokół

Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee oraz wytyczne National Institutes of Health.

1. Przygotowanie roztworów i mediów

1. Przygotować roztwór wytrawiający, mieszając 15,4 ml PBS z 2,5 ml kolagenazy P o stężeniu 20 mg/ml (stężenie końcowe 5 mg/ml), 2 ml 11 U/ml dyspazy II (stężenie końcowe 1,2 U/ml) i 100 μl 1,0 M CaCl₂ (stężenie końcowe 5 mM).
2. Przygotuj 500 ml pożywki dla pierwszorzędowych fibroblastów (DMEM complete), mieszając 440 ml DMEM z 50 ml FBS (10%), 5,0 ml wstrzykiwacza/paciorkowca (odpowiednio 100 U/ml i 100 μg/ml) i 5,0 ml suplementu glutaminy (2 mM). Filtruj i sterylizuj pożywkę za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm.
3. Przygotować surowicę wolną od egzosomów przez nocne ultrawirowanie FBS w probówkach polipropylenowych o pojemności 38,5 ml w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki.
4. Przygotuj 500 ml pożywki wolnej od egzosomów, mieszając 440 ml DMEM z 50 ml surowicy wolnej od egzosomów (10%), 5 ml wstrzykiwacza / paciorkowca (100 U / ml i 100 μg / ml) i 5 ml suplementu glutaminy (2 mM). Filtruj i sterylizuj pożywkę za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm.
5. Przygotować 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) rozpuszczając 6,057 g zasady Tris w 90 ml dH₂O i dostosowując pH do 7,4 za pomocą HCl. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą dH₂O.
6. Przygotować 10 mM roztworu Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM Mg(Ac)₂ (roztwór roboczy sacharozy), mieszając 97,9 ml dH₂O z 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH = 7,4) i 100 μl 1 M Mg(Ac)₂. Inhibitory proteazy dodać do roztworu tuż przed użyciem i utrzymywać roztwór na lodzie.
7. Przygotować roztwory gradientu gęstości sacharozy na lodzie zgodnie z tabelą 1. Roztwory te wystarczą do przygotowania dwóch probówek z gradientem sacharozy.
8. Przygotuj 100% TCA, dodając 40 ml dH₂O do 100 g proszku TCA i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Dostosować końcową objętość za pomocą dH₂O do 100 ml.
9. Przygotuj 80% etanolu, mieszając 20 ml dH₂O z 80 ml 100% etanolu.
10. Przygotować bufor do biegania western blot, mieszając 1,8 l dH₂O z 200 ml 10-krotnego buforu do biegania.
11. Przygotować bufor do przenoszenia western blot przez zmieszanie 1,4 l dH₂O z 200 ml 10 x buforu transferowego i 400 ml metanolu. Wstępnie schłodzić bufor transferowy do temperatury 4 °C.
12. Przygotować 20x sól fizjologiczną buforowaną Tris (TBS), rozpuszczając 122 g zasady Tris i 180 g chlorku sodu w 850 ml_dH2O(pH 8,0). Ustaw głośność na 1 L za pomocą dH₂O.
13. Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 5 g odtłuszczonego mleka w proszku w 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS i 94 ml_dH2O.
14. Przygotować bufor przeciwciał, rozpuszczając 3 g BSA w 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 20x TBS i 94 ml_dH2O.
15. Przygotować bufor do płukania, mieszając 100 ml 20x TBS i 20 ml 10% Tween-20 (10x) z 1,88 l_dH2O.
16. Przygotować roztwór rozwijający, mieszając 1 objętość luminolu/uszlachetnianie z 1 objętością stabilnego buforu nadtlenkowego.

2. Analiza mięśnia myszy mięsiowatego brzuchatego łydki (GA)^15,16

1. Przygotować na lodzie probówki o pojemności 50 ml zawierające 10 ml PBS.
2. Poddaj myszy eutanazji w komorze CO₂, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
3. Usuń mięsień brzuchaty łydki z obu nóg i przenieś je do rurki z PBS na lodzie.
   UWAGA: Usuń mięsień płaszczkowaty z mięśnia zielonego przed przeniesieniem mięśnia zielonego do PBS.

3. Pierwotna izolacja i hodowla fibroblastów myszy

1. Zważ mięśnie i przenieś je do 10-centymetrowego naczynia pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego. Zmiel mięśnie skalpelami, aż stanie się delikatną pastą.
2. Przenieść drobno rozdrobnioną pastę mięśniową do probówki o pojemności 50 ml i dodać 3,5 razy objętość/mg tkanki roztworu trawiącego do probówki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Dokładnie wymieszać zawiesinę pipetą o pojemności 5 ml co 10 minut (pomoże to w całkowitej dysocjacji).
   UWAGA: Alternatywnie do tego kroku można użyć dysocjatora tkankowego.
3. Dodać 20 ml DMEM complete do zawiesiny komórkowej, aby dezaktywować roztwór trawiący. Przenieść do sitka z nylonu o średnicy 70 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml. Zebrać przepływ i umyć sitko komórkowe dodatkowymi 5 ml DMEM complete.
4. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant.
5. Zawiesić osad w 10 ml kompletnego DMEM i wysiać komórki w naczyniu o średnicy 10 cm.
6. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 3 % O₂ (pasaż 0 lub P0).
   UWAGA: 1) Kultury te muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić warunki fizjologiczne (poziom_O2 w mięśniach szkieletowych wynosi około 2,5%)¹⁷. 2) Numer pasażu (np. P0) hodowli komórkowej jest zapisem liczby przypadków, w których kultura była subhodowana. 3) Pierwotne fibroblasty w P0 są rutynowo hodowane do 100% konfluencji plus 1 dzień (i tylko dla P0). Ma to na celu oczyszczenie innych typów komórek i zapewnienie, że komórki obecne w hodowli to tylko fibroblasty, pozbawione komórek miogennych na podstawie badania mikroskopowego. Mięśnie szkieletowe dorosłego zwierzęcia w wieku 2 miesięcy zawierają około 2% miogennych przodków⁴. Ponadto przodkowie miogenni zwykle nie przyczepiają się do niepowlekanych naczyń; W związku z tym są one tracone podczas podkulturowania^18,19,20. Komórki miogenne wymagają innego podłoża (F10) uzupełnionego o 20% FBS i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)¹⁸. W DMEM kompletne, średnie fibroblasty mają wyższy współczynnik proliferacji niż komórki miogenne, co powoduje eliminację tych zanieczyszczających komórek przed pierwszym pasażem.
7. Przepłucz komórki P0 PBS, gdy 100% zlewa się plus 1 dzień. Dodać 1 ml roztworu trypsynizacyjnego i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 3% O₂ w celu odłączenia komórek. Zatrzymaj aktywność enzymatyczną, używając 10 ml DMEM complete.
8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w 20 ml kompletnego DMEM i wysiać w naczyniu o średnicy 15 cm (przejście 1 lub P1). Komórki są hodowane do 80%-90% konfluencji i mogą być ekspandowane do pasażu 3,
   UWAGA: W zależności od dalszych eksperymentów można użyć przejścia 1, przejścia 2 (P2) lub przejścia 3 (P3).

4. Wysiewanie komórek i zbieranie kondycjonowanego podłoża

1. Przemyć fibroblasty (P1, P2 lub P3) 10 ml PBS, dodać 2,5 ml roztworu trypsynizacji do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, 3% O_{2 .} Zatrzymaj aktywność enzymatyczną, stosując 10 ml DMEM complete.
   UWAGA: Po przejściu 4 komórki pierwotne są odrzucane i nie powinny być używane do dalszych eksperymentów, ponieważ zmieniają charakterystykę.
2. Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wolnej od egzosomów i policzyć komórki.
4. Wysiewać komórki w temperaturze 1,5–2,0 x 10⁶ komórek na naczynie (15 cm) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i 3% O₂ .
5. Kondycjonowaną pożywkę należy zbierać przez 16–24 godzin w probówkach o pojemności 50 ml na lodzie.
   UWAGA: Jeśli komórki nie są w 80% zlewne, można ponownie dodać świeżą pożywkę wolną od egzosomalnego i zebrać ją po dodatkowym okresie 16–24 godzin. Obie kolekcje można łączyć w celu dalszej obróbki.

5. Oczyszczanie egzosomów za pomocą wirowania różnicowego i ultra-wirowania

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze 4 °C lub na lodzie. W razie potrzeby zrównoważyć rurkę rurką wypełnioną wodą.

1. Odwirować kondycjonowaną pożywkę o sile 300 x g przez 10 minut w celu usunięcia żywych komórek i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml.
2. Usunąć martwe komórki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 10 minut i przenieść supernatant do probówki polipropylenowej o pojemności 38,5 ml.
3. Odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 30 minut w celu usunięcia organelli, ciał apoptotycznych i fragmentów błony. Przenieść supernatant do ultra przezroczystej probówki o pojemności 38,5 ml.
4. Ultraodwiruj supernatant przy 100 000 x g przez 1,5 godziny, aby osadzać egzosomy.
5. Ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając około 1 ml kondycjonowanej pożywki i umyj osad egzosomu w całkowitej objętości 30 ml lodowatego PBS.
6. Wirować przy 100 000 x g przez 1,5 godziny i ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć egzosomalnego osadu.
7. Zawiesić osad w lodowatym PBS (~25 μL na 15 cm naczynie) i zmierzyć stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i czytnika mikropłytek przy 562 nm.
   UWAGA: Stężenie białka mierzy się przez rozcieńczenie 1:2 z 0,1% Triton-X100 w dH₂O. Wydajność egzosomów z 15 cm szalki (20 ml kondycjonowanej pożywki) pierwotnych fibroblastów przy 80% zbiegu wynosi ~3–4 μg.

6. Charakterystyka egzosomów za pomocą gradientu gęstości sacharozy

1. Załaduj gradient sacharozy do ultra przezroczystej probówki o pojemności 13 ml, pipetując (od dołu do góry) następujące elementy: 1,5 ml z 2,0 M, 2,5 ml z 1,3 M, 2,5 ml z 1,16 M, 2,0 ml z 0,8 M i 2,0 ml z 0,5 M roztworów sacharozy.
2. Wymieszaj 30–100 μg egzosomów z 0,25 M roztworem sacharozy i dostosuj objętość do 1 ml.
3. Ostrożnie załaduj egzosomy na wierzch gradientów i ultraodwiruj próbki przez 2,5 godziny w temperaturze 100 000 x g i 4 °C.
4. Wyjmij probówki z ultrawirówki i umieść je na lodzie i zbierz frakcje o pojemności 1,0 ml, zaczynając od góry gradientu. Przenieś je do probówek o pojemności 1,7 ml na lodzie.
5. Dodaj 110 μl 100% TCA do każdej probówki, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g i RT i ostrożnie wyrzucić supernatant.
7. Zawiesić osad w 500 μl wstępnie schłodzonego 80% etanolu i pozostawić próbki do przemycia na 10 minut w temperaturze -20 °C.
8. Wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
9. Suszyć osad przez 10–15 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić go w PBS do eksperymentów in vitro. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub ponownie zawieś osad bezpośrednio w 14,5 μl dH₂O, 5 μl 4x buforu Laemmli i 0,5 μl 1 M DTT do analiz western blot.

7. Wykrywanie egzosomów za pomocą analizy western blot

1. Zmieszać 5–10 μg egzosomów z kroku 5.7 z 5 μl 4x buforu Laemmli i 0,5 μl 1 M DTT, a następnie dostosować końcową objętość do 20 μl za pomocą dH₂O. Podgrzewać wszystkie próbki, w tym te z kroku 6.9, przez 5 minut w temperaturze 98 °C.
2. Załaduj próbki do 10% bezplamistego żelu TGX i załaduj drabinki białkowe zgodnie z zaleceniami producenta.
   UWAGA: Wybierz procentową zawartość żelu w zależności od masy cząsteczkowej interesującego Cię białka.
3. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez ~1 godzinę w buforze do momentu, gdy barwnik ładujący znajdzie się na dnie żelu.
   UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od używanego sprzętu lub rodzaju i procentowej zawartości żelu.
4. Wyobraź sobie żel. Obrazy bezplamnych żeli są wykorzystywane jako kontrola obciążenia dla immunoblotów.
5. Przelewać żel za pomocą membrany PVDF przez 1,5 godziny przy napięciu 80 V lub przez noc przy napięciu 30 V w temperaturze 4 °C.
6. Zablokować membrany w buforze blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Inkubować błony dla swoistych przeciwciał (tabela 2) w buforze przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C z mieszaniem.
8. Przemyć błony w buforze płuczącym i inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (tabela 2) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
9. Umyj membrany w buforze myjącym i zobrazuj membrany za pomocą roztworu wywoływania i imagera opartego na kamerze. Alternatywnie użyj filmu rentgenowskiego do wywołania membran.

Wyniki

Ten protokół jest odpowiedni do oczyszczania egzosomów z dużych ilości kondycjonowanego podłoża w opłacalny sposób. Procedura jest wysoce powtarzalna i spójna. Rysunek 1 przedstawia obraz egzosomów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oczyszczonych z pożywki hodowlanej pierwotnych fibroblastów myszy. Rysunek 2 pokazuje wzorzec ekspresji białek kanonicznych markerów egzosomalnych oraz brak zanieczyszczeń białkami cytozolowymi (LDH) i ER (kalneksyna).

Dyskusja

Kluczowym krokiem dla pomyślnego wyizolowania egzosomów z pożywki hodowlanej, jak opisano w niniejszym protokole, jest prawidłowe ustanowienie i utrzymanie pierwotnych kultur fibroblastów myszy z dorosłych mięśni szkieletowych. Kultury te muszą być utrzymywane na niskim poziomie tlenu, aby zapewnić warunki zbliżone do fizjologicznych (poziom_O2 w mięśniach szkieletowych wynosi ~2,5%)¹⁵. Pierwotne fibroblasty zmienią charakterystykę, gdy zostaną przekazane do hodowli zbyt wiele razy. W zw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki 10 cm	Midwest Scientific, TPP	TP93100
Szalki 15 cm	Midwest Scientific	TP93150
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
Albumina surowicy bydlęcej Frakcja V	Roche	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Wirówka 5430R z wirnikami FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP	BioRad	12003154
Kolagenaza P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
koktajl inhibitorów proteazy	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter z elektrodami płytkowymi	BioRad
Criterion TGX bezbarwny żel białkowy	BioRad	5678034	10% 18-well, midi-gel
Criterion pionowe ogniwo do elektroforezy (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	neutralna proteaza, stopień II
Dithiothreitol	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
Dulbecco' s Modyfikacja Eagles Medium	Corning	15-013-CV
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	21-031-CV
Etanol 200 proof	Pharmco firmy Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL stożkowe probówki wirówkowe	Corning	352070
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437-028
Wielomodowy czytnik mikropłytek Fluostar Omega	BMG Labtech
GlutaMAX suplement	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Kwas solny	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P Membrany transferowe	Bufor do próbek Millipore	IPVH00010
Laemmli (4x)	BioRad	1610747
Roztwór octanu magnezu	Sigma	63052-100ml
Odtłuszczone mleko w proszku	LabScientific	M-0842
Inkubator O2/CO2	Sanyo	MC0-18M
Penicylina-Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10 000 U/ml
Probówki do mikrowirówek premium	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1,7 ml
Chronione jednorazowe skalpele	Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
Bufor do biegania	BioRad	1610732
Chlorek sodu	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup Sterylny system filtracji próżniowej	Millipore	S2GPU05RE	500 ml
Sterylne sitko do komórek (70 mm)	Fisher Scientific, marka	Fisher22-363-548
Sacharoza	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
Cienkościenne rurki polipropylenowe	Beckman Coulter	326823
Bufor transferowy	BioRad	16110734
Kwas trichlorooctowy	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Triton-X100 roztwór	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express	Enzyme Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	No phenol red
Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-wirówka Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Ultra-przezroczysta probówka (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Ultra-przezroczyste rurki (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
Łaźnia wodna Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220