Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61132

⸱

28 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustowy test ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) dla Caenorhabditis elegans, który jest szybki, solidny i bardzo czuły. Protokół ten pozwala na uzyskanie precyzyjnych pomiarów ekspresji genów od pojedynczych robaków lub z próbek zbiorczych. Przedstawiony tutaj protokół stanowi nowatorską adaptację istniejących metod otrzymywania komplementarnego DNA (cDNA) sprzężonego z nanofluidyczną platformą RT-qPCR. Pierwsza część tego protokołu, nazwana "Worm-to-CT", umożliwia produkcję cDNA bezpośrednio z nicieni bez konieczności wcześniejszej izolacji mRNA. Zwiększa przepustowość eksperymentalną, umożliwiając przygotowanie cDNA z 96 robaków w ciągu 3,5 godziny. Druga część protokołu wykorzystuje istniejącą technologię nanofluidyczną do przeprowadzania wysokoprzepustowego RT-qPCR na cDNA. W artykule tym oceniano dwa różne chipy nanofluidyczne: pierwszy obejmuje 96 próbek i 96 celów, co daje 9216 reakcji w ciągu około 1,5 dnia pracy laboratoryjnej. Drugi typ układu składa się z sześciu układów 12 x 12, co daje 864 reakcje. W tym przypadku metoda Worm-to-CT została zademonstrowana poprzez ilościowe określenie poziomów mRNA genów kodujących białka szoku cieplnego z pojedynczych robaków i z próbek zbiorczych. Dostarczono obszerną listę starterów przeznaczonych do amplifikacji przetworzonego RNA dla większości genów kodujących w genomie C. elegans.

Wprowadzenie

Optymalizacja sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i qPCR ujawniła, że impulsy transkrypcyjne lub impulsy mogą prowadzić do ogromnych różnic w liczbie cząsteczek RNA na komórkę1. Co więcej, technologie te ujawniły znaczną heterogeniczność komórkową, która wcześniej była pomijana w standardowych masowych pomiarach transkryptomicznych. W zależności od kontekstu, pewna zmienność transkrypcyjna pojedynczej komórki jest spowodowana mieszanym składem komórkowym tkanek. Jednak nawet w izogenicznych populacjach komórek hodowanych w tym samym środowisku występuje powszechna heterogeniczność transkrypcyjna2,3. Ta "biologiczna zmienność" jest coraz częściej identyfikowana jako wszechobecna właściwość sieci komórkowych, od bakterii po człowieka. W niektórych przypadkach może mieć fenotypowe konsekwencje w rozwoju, progresji raka, opóźnieniu HIV i odpowiedzi na chemioterapię4,5.

Nicień Caenorhabditis elegans jest unikalnym organizmem modelowym o idealnych cechach do badania przyczyn i konsekwencji biologicznej zmienności między osobnikami. Nicienie te są prostym organizmem modelowym składającym się z 959 komórek, a ich przezroczysty naskórek sprawia, że są podatne na badania obrazowe in vivo6. C. elegans jest gatunkiem hermafrodytycznym, który rozmnaża się głównie poprzez samozapłodnienie; W ten sposób powstały izogeniczne szczepy laboratoryjne. Pomimo izogeniczności i kontrolowanych warunków hodowli, wiele fenotypów i transkryptów jest zmiennych u poszczególnych osób, co sugeruje, że różnice stochastyczne lub mikrośrodowiskowe przyczyniają się do niejednorodności między osobnikami7,8. Taka zmienność ekspresji genów ma wielorakie konsekwencje związane z przystosowaniem, w tym zmienność w penetracji mutacji, przeżywalności, czasie rozwoju i płodności7,8,9. Ze względu na te cechy, badania nad pojedynczymi robakami dają niespotykaną dotąd możliwość badania zmienności biologicznej w całym organizmie.

Istnieje fundamentalna potrzeba rozwoju i optymalizacji technologii do dokładnego wykrywania transkryptów na poziomie pojedynczego robaka. Nowe technologie, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego robaka10, sekwencjonowanie RNA z izolowanych tkanek11 oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek12 są teraz dostępne dla C. elegans. Pozostaje jednak główne wyzwanie: podczas monitorowania interindywidualności geny o słabej ekspresji często spadają poniżej wykrywalnych poziomów13. Jest to szczególnie istotne w przypadku rzadkich transkryptów wyizolowanych z niewielkich ilości materiału wyjściowego, ponieważ istnieje dobrze ugruntowana, odwrotna zależność między średnim wyrażeniem a wariancją techniczną, co często powoduje, że rzadkie transkrypty spadają poniżej statystycznych punktów odcięcia13. Optymalizacja wysokoprzepustowych technologii multipleksowanego qPCR okazała się przydatna w badaniach pojedynczych komórek ssaków, w szczególności podczas badania ekspresji rzadkich transkryptów14,15. Technologia ta może być również wykorzystywana do celów analizy porównawczej i walidacji innych technologii pojedynczych robaków.

Worm-to-CT to szybka, solidna metoda zaadaptowana z zestawu używanego w badaniach biologii komórki, do przygotowania cDNA pojedynczego robaka. cDNA uzyskane tą metodą w połączeniu z multipleksowaną nanofluidyczną technologią qPCR zostało wybrane, ponieważ zapewnia wyższą przepustowość eksperymentalną, szerszy zakres dynamiczny wykrywania i zostało zatwierdzone do celów jednokomórkowych14,15. Opisany preparat cDNA ma również zastosowanie do stosowania ze standardowymi technologiami PCR. Przepustowość zwiększa się na dwa sposoby: po pierwsze, przygotowanie cDNA jest szybsze i bardziej niezawodne niż tradycyjna ekstrakcja tiocyjanianianem guanidu, fenolem i chloroformem, ponieważ robaki są bezpośrednio dodawane do buforu do lizy, pomijając bezpośrednią izolację łatwo degradowalnego RNA. Po drugie, wykorzystanie technologii nanofluidycznych znacznie zwiększa liczbę próbek i celów, które można badać jednocześnie. W tym artykule porównano dwa układy scalone: układ jednoukładowy i układ wielomacierzowy. Pojedynczy układ scalony może uruchomić 96 pojedynczych robaków i 96 zestawów starterów, co daje 9 216 reakcji na eksperyment. Osiągnięcie podobnej przepustowości przy użyciu standardowych technologii qPCR wymagałoby 96 oddzielnych eksperymentów qPCR przy użyciu 96-dołkowych płytek. Mniejszy i bardziej elastyczny układ wielomacierzowy składa się z sześciu macierzy 12 x 12, co daje 864 reakcje. Wyjątkowa niezawodność i czułość metody została zwiększona dzięki technologii nanofluidycznej i wprowadzeniu etapu preamplifikacji. Metoda przedstawiona w tym artykule ma być stosowana w połączeniu z najnowocześniejszym algorytmem statystycznym do wyodrębniania wariancji biologicznej. W artykule przedstawiono protokół szybkiego przygotowania cDNA i wysokoprzepustowego qPCR zarówno dla próbek pojedynczych robaków, jak i próbek wsadowych; Algorytm zostanie opublikowany w innym miejscu. W przypadku tego protokołu organizacja każdego chipa powinna być przygotowana przed eksperymentem. Tabele 1 i Tabela 2 pokazują przykłady tych planów odpowiednio dla układu wielomacierzowego i jednomacierzowego. Znajdują się tam również przeglądy protokołu Worm-to-CT szczegółowo opisane w Rysunek 1 oraz uruchamianie układów wielomacierzowych i jednotablicowych w Rysunek 2.

Protokół

UWAGA: W całym tym protokole Caenorhabditis elegans jest określany jako "robak" lub "robaki". Różnorodne szczepy C. elegans można zamawiać za pośrednictwem internetowych baz danych lub kontaktując się bezpośrednio z laboratoriami, które korzystają z organizmu modelowego. Część I tego protokołu (sekcje 1−3) opisuje przygotowanie cDNA za pomocą protokołu Worm-to-CT. Część II tego protokołu (sekcje 4−13) opisuje uruchamianie wysokoprzepustowego RT-qPCR przy użyciu nanofluidyki, zaadaptowanej z protokołu opracowanego przez Fluidigm16. Protokół ten dotyczy stosowania dwóch typów chipów nanofluidycznych zdefiniowanych wcześniej, chipa z pojedynczą matrycą, który może monitorować 96 celów w 96 próbkach (łącznie 9 216 reakcji RT-qPCR) lub chipa wielomacierzowego, który działa jako podjednostki 12 próbek docelowych x 12. Każdy układ wielomacierzowy zawiera sześć niezależnych macierzy, które mogą być uruchamiane razem lub osobno. Na przykład, używając całego układu z wieloma macierzami, można monitorować 72 cele x 12 próbek (lub odwrotnie) lub 36 celów x 24 próbki (lub odwrotnie). Więcej informacji na temat materiałów wykorzystanych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Walidacja startera RT-qPCR

UWAGA: Startery działające w czasie rzeczywistym zostały zaprojektowane na podstawie zalecanych właściwości pierwotnie wydanych przez wytyczne MIQUE17. Aby uzyskać startery specyficzne dla przetworzonego RNA, produkty zaprojektowano w taki sposób, aby dwa startery wiązały się po obu stronach co najmniej jednego złącza spawowego. Wymagania dotyczące odpowiednich podkładów obejmowały 20%−80% zawartości guaniny i cytozyny, temperaturę topnienia 58−60 °C, różnicę temperatur topnienia między parami podkładów ≤0,5 °C i długość produktu 70–120 pz. Sekwencję wygenerowanych starterów można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1. Otwarty kod źródłowy skryptów używanych do generowania starterów można znaleźć na stronie https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Pary starterów dla transkryptów z miejscami splicingu zostały zaprojektowane tak, aby leżały w dwóch eksonach flankujących intron, ale nie zostały zaprojektowane tak, aby były specyficzne dla wariantu splicingu, przy użyciu oprogramowania NCBI Primer Blast 18. W tym badaniu zestawy starterów zostały zestawione z genomem C. elegans w celu przetestowania komplementarności poza celem.

  1. Pobrać startery z bazy danych starterów RT-qPCR (Tabela uzupełniająca 1). Alternatywnie, zaprojektuj pary starterów qPCR za pomocą narzędzi online, takich jak NCBI Primer Blast18.
  2. Wykonaj standardową krzywą qPCR, aby monitorować swoistość i skuteczność PCR dla każdej pary starterów przy użyciu standardowych technik qPCR luzem19 i zgodnie z wytycznymi MIQUE17,20.
    UWAGA: Należy stosować wyłącznie pary starterów o > R2 0,98 i skuteczności PCR między 85% a 115%. Sekwencja, skuteczność PCR i R2 dla starterów użytych w tym badaniu są szczegółowo opisane w Tabeli 3.

2. Weryfikacja robaków za pomocą Worm-to-CT

  1. Zbierz robaki z trawnika bakteryjnego na świeżą, nieobsianą płytkę NGM i pozwól robakom poruszać się po talerzu przez 5 minut, aby usunąć większość bakterii z robaka poprzez jego ruch.
    UWAGA: Trawnik bakteryjny i warunki wzrostu będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. Przedstawione tutaj eksperymenty wymagają 6 cm płytek NGM wysianych OP50 Escherichia coli z interesującymi robakami wyhodowanymi do stadium L4.9 w inkubatorze o temperaturze 20 °C.
  2. W kapturze wolnym od RNaz przygotuj mieszankę wzorcową składającą się z 12,5 μl 2x buforu RT, 1,25 μl 20x buforu enzymatycznego RT i 0,25 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę. Dodać 14 μl mieszanki wzorcowej do 11 μl każdej próbki z kroku 2.8.
  3. Umieść pokrywkę paska PCR do góry nogami na platformie lunety sekcyjnej i dodaj 10 μl mieszaniny do lizy do wypukłych nasadek probówek PCR pod mikroskopem złożonym.
    UWAGA: W przypadku tylko jednej lub dwóch próbek lepiej jest użyć paska PCR zawierającego co najmniej cztery probówki, ponieważ zmniejsza to ryzyko otwarcia nakrętek w kolejnych etapach zamrażania i rozmrażania. Alternatywnie można użyć gumek do przytrzymania nasadek na miejscu. W takim przypadku upewnij się, że nakrętki są prawidłowo zamknięte za każdym razem, gdy rurki są przenoszone.
  4. Podnieś robaki z talerza do każdej szczeliny pokrywki zawierającej mieszankę do lizy, "nabierając" je (tj. łapiąc robaki pod spodem kilofem), aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego. Zamknij probówki i obracaj je przez 5 sekund za pomocą mikrowirówki stołowej (tabela materiałów) przed umieszczeniem ich w kolbie Dewara wypełnionej ciekłym azotem.
    UWAGA: Do eksperymentów masowych należy użyć od 15 do 30 robaków, a 1 robaka do pomiarów pojedynczego robaka.
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić rękawice kriogeniczne oraz okulary ochronne i przestrzegać standardowych przepisów dotyczących odzieży, ponieważ kontakt ze skórą lub oczami może spowodować poważne odmrożenia.
  5. Zamroź i rozmroź probówki do PCR 10x, przenosząc je między ciekłym azotem a łaźnią wodną o temperaturze ~40 °C. Pozostaw probówki w ciekłym azocie na co najmniej 5 sekund, aby upewnić się, że próbki są całkowicie zamrożone. Pozostawić probówki w łaźni wodnej do czasu rozmrożenia próbek. Nie pozostawiaj na dłużej, ponieważ prowadzi to do degradacji RNA.
    UWAGA: Probówki można pozostawić w ciekłym azocie przez dłuższy czas, ponieważ próbki są zamrażane do około -200 °C, co zmniejsza degradację RNA. Nie powinien to być jednak punkt zatrzymania protokołu, ponieważ ciekły azot szybko odparowuje.
  6. Próbki mieszać na mieszalniku termicznym (tabela materiałów) ustawionym na 4 °C przez 20−30 minut, obracając się z prędkością ~1 800 obr./min.
  7. Podczas mieszania próbek rozmrozić roztwór zatrzymujący na lodzie.
  8. Odwirować próbki za pomocą mikrowirówki stołowej (tabela materiałów) i dodać 1 μl roztworu zatrzymującego do każdej probówki.
    UWAGA: Próbki można pozostawić w temperaturze -80 °C do 1 tygodnia przed odwrotną transkrypcją RNA (sekcja 3).

3. Odwrotna transkrypcja

UWAGA: Dla odwrotnej transkrypcji pojedynczych robaków, pokazane tutaj wyniki zostały wygenerowane przy użyciu odczynników dostarczonych z nanofluidycznymi chipami (opcja 2 w Rysunek 1). Odczynniki wyróżnione w opcji 2 Rysunek 1 zostały również użyte do odwrotnej transkrypcji próbek zbiorczych. Każda z tych metod działa zamiennie dla różnych typów próbek.

  1. Odwrotna transkrypcja pojedynczych robaków
    1. W kapturze wolnym od RNaz dodaj 1,25 μl mieszanki do odwrotnej transkrypcji (tabela materiałów) do świeżej probówki PCR.
      UWAGA: W przypadku wielu próbek można użyć 96-dołkowej płytki do PCR i pipety automatycznej. Protokół producenta podaje, że na próbkę można użyć 1 μl.
    2. Pobrać 5 μl roztworu do lizy i zatrzymać mieszanie roztworu z kroku 2.8 i dodać go do świeżej probówki PCR zawierającej mieszaninę do odwrotnej transkrypcji.
      UWAGA: Protokół producenta podaje, że na jedną reakcję można użyć 1 μl RNA (2,5 pg/μL–250 ng/μL). Ujemną kontrolę RT na płytkę można dodać, zastępując mieszaninę odwrotnej transkrypcji 5 μl próbki zlizowanej i 1,25 μl wody wolnej od RNAzy.
    3. Uruchomić próbki przy użyciu następującego programu odwrotnej transkrypcji na termocyklerze: 25 °C przez 5 minut, 42 °C przez 30 minut, 85 °C przez 5 minut i 4 °C dla ∞,
      UWAGA: Wytworzone cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do amplifikacji i zbierania danych za pomocą wysokoprzepustowego qPCR.
  2. Odwrotna transkrypcja dla próbek masowych (15−30 robaków)
    1. W kapturze wolnym od RNaz przygotuj mieszankę wzorcową składającą się z 12,5 μl 2x buforu RT, 1,25 μl 20x buforu enzymatycznego RT i 0,25 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę. Dodać 14 μl mieszanki wzorcowej do 11 μl roztworu do lizy i zatrzymać mieszanie roztworu z kroku 2.8.
      UWAGA: W przypadku dużej liczby próbek można to wykonać w płytkach 96-dołkowych.
    2. Przepuść próbki przez termocykler przy użyciu następującego programu odwrotnej transkrypcji: 37 °C przez 60 minut, 95 °C przez 5 minut i 4 °C przez ∞.
    3. Rozcieńczyć wytworzone cDNA w stosunku 1:4 w wodzie wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, produkty osiągają końcową objętość 25 μl, w takim przypadku należy dodać 75 μl. Jednak ze względu na kondensację ostateczna objętość może się różnić. Dlatego odpowiednio dostosuj, aby uzyskać stosunek 1:4 w końcowym roztworze. Ten etap rozcieńczania nie ma zastosowania w przypadku przeprowadzania qPCR na pojedynczych robakach. Wytworzone cDNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do amplifikacji i zbierania danych za pomocą wysokoprzepustowego qPCR.

4. Przygotowanie mieszanki podkładów do multipleksów

  1. Przygotować podkład do przodu/do tyłu (F/R) dla każdej pary starterów o końcowym stężeniu 50 μM. Wymieszać tę samą objętość starterów do przodu i do tyłu po 100 μM każdy.
  2. Połączyć 1 μl startera 50 μM F/R dla każdej pary starterów, która ma być testowana. Dodać bufor zawiesiny DNA do całkowitej objętości 100 μl.
    UWAGA: Stężenia podstawowych starterów różnią się tutaj od tych opisanych w protokole producenta16, ale zachowują to samo końcowe stężenie 500 nM.

5. Preamplifikacja specyficzna dla celu

  1. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 1 μl mieszanki mastermix przed amplifikacją (tabela materiałów), 0,5 μl zbiorczej mieszanki starterów (krok 4.2) i 2,25 μl wody wolnej od nukleaz na reakcję przy 10% całkowitej nadwyżce objętości.
  2. Na płytce 96-dołkowej podwielokrotność 3,75 μl roztworu wzorcowego należy wymieszać z tyloma studzienkami, ile jest wymagane do uzyskania określonej liczby próbek.
  3. Dodać 1,25 μl roztworów cDNA będących przedmiotem zainteresowania wygenerowanych na etapie 3.1.3 lub 3.2.3 do każdej studzienki.
  4. Przykryj płytkę taśmą uszczelniającą z 96 dołkami, krótko zawiruj i odwiruj za pomocą wirówki stołowej. Przenieś do termocyklera i uruchom następujący program: 95 °C przez 2 min, 15 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 s, wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 60 °C przez 4 minuty i 4 °C dla ∞,
    UWAGA: Producent zaleca od 10−20 cykli do reakcji przedamplifikacji16. Protokół ten zaleca 10 lub 15 cykli w zależności od poziomów ekspresji docelowych genów.

6. Leczenie egzonukleazą I

UWAGA: To ma na celu usunięcie niewbudowanych starterów z preamplifikacji.

  1. Przygotować mieszaninę egzonukleazy I zawierającą 0,2 μl buforu reakcyjnego egzonukleazy I (tabela materiałów), 0,4 μl egzonukleazy I w stężeniu 20 U/μl (tabela materiałów) i 1,4 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę. Wszystkie odczynniki należy przechowywać na lodzie, zwłaszcza egzonukleazę I.
  2. Wyjmij płytkę 96-dołkową (krok 5.4) z termocyklera, odwiruj za pomocą wirówki stołowej i ostrożnie zdejmij uszczelkę. Dodać 2 μl egzonukleazy, którą mieszam, do każdej reakcji przed amplifikacją. Ponownie zamknąć, odwirować i umieścić 96-dołkową płytkę z powrotem w termocyklerze, używając następującego programu: 37 °C przez 30 minut, 80 °C przez 15 minut i 4 °C przez ∞.
  3. Wyjąć próbki z termocyklera i rozcieńczyć je w stosunku 1:5, dodając 18 μl 1x buforu Tris EDTA (tabela materiałów).
    UWAGA: Możliwe jest przechowywanie próbek cDNA w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Protokół producenta sugeruje potencjalne rozcieńczenia 5x, 10x lub 20x na tym etapie16, w zależności od poziomu ekspresji interesujących nas celów.

7. Przygotowanie mieszanek testowych

UWAGA: Mieszanki testowe mogą być przygotowywane na płytkach 384-dołkowych, ponieważ dołki mają takie same odstępy jak chipy nanofluidyczne, co ułatwia ładowanie.

  1. Przygotowanie mieszanin testowych dla układu wielomacierzowego
    1. Przygotować mieszankę wzorcową składającą się z 2 μl 2x odczynnika ładującego do oznaczania (tabela materiałów) i 1,6 μl buforu zawiesiny DNA (tabela materiałów) dla każdej studzienki zgodnie z przygotowanym planem. Podwielokrotność 3,6 μl tej mieszanki wzorcowej na dołek do płytki 384-dołkowej.
    2. Dodać 0,4 μl startera 50 μM F/R przygotowanego w kroku 4.1 do odpowiednich studzienek zgodnie z przygotowanym planem.
      UWAGA: Daje to łącznie 4 μl mieszanki testowej na studzienkę, z nadwyżką 1 μl.
  2. Przygotowanie mieszanek testowych dla układu scalonego z pojedynczą matrycą
    1. Przygotować mieszankę wzorcową składającą się z 3 μl 2x odczynnika ładującego test i 2,4 μl buforu zawiesiny DNA dla każdej studzienki zgodnie z przygotowanym planem. Podwielokrotność 5,4 μl tego wzorca miesza się na studzienkę z oznaczoną płytką 384-dołkową.
    2. Dodać 0,6 μl startera 50 μM F/R do odpowiednich dołków zgodnie z przygotowanym planem.
      UWAGA: Daje to łącznie 6 μl mieszanki testowej na studzienkę, przy nadwyżce 1 μL.

8. Przygotowanie próbek mieszanych

UWAGA: Próbki mieszanek mogą być przygotowane do 1 dnia wcześniej i przechowywane w temperaturze 4 °C.

  1. Przygotowanie próbek do układu scalonego z wieloma macierzami
    1. Przygotować wzorcową mieszaninę próbki składającą się z 2 μl 2x supermiksu sondy fluorescencyjnej o niskim ROX (tabela materiałów) i 0,2 μl odczynnika próbki (tabela materiałów) na próbkę. Dozować 2,2 μl tej mieszanki do oznaczonej płytki 384-dołkowej.
      UWAGA: Producent zaleca, aby nie wirować odczynnika próbki16.
    2. Odpipetować 1,8 μl każdej wstępnie amplifikowanej, egzonukleazy I potraktować próbkę z kroku 3.2.3 do odpowiednich studzienek zgodnie z przygotowanym planem.
      UWAGA: Daje to w sumie 4 μL, przy nadwyżce 1 μL.
  2. Przygotowanie próbek do układu scalonego z pojedynczą matrycą
    1. Przygotować wzorcową mieszankę próbki składającą się z 3 μl 2x supermiksu sondy fluorescencyjnej o niskim ROX (Tabela materiałów) i 0,3 μL 20x odczynnika do ładowania próbki barwnika wiążącego DNA (Tabela materiałów) na próbkę. Dozuj 3,3 μl tej mieszanki do oznaczonej płytki 384-dołkowej.
    2. Odpipetować 2,7 μl każdego wstępnie amplifikowanego i egzonukleazy Potraktowałem próbkę z kroku 6.3 do odpowiednich studzienek zgodnie z przygotowanym planem.
      UWAGA: Daje to łącznie 6 μL, przy nadwyżce 1 μL. Jeśli istnieją jakieś studnie, które mają być uruchomione bez próbki, należy je załadować mieszanką wzorcową próbki i 2,7 μl wody zamiast cDNA. Jest to zalecane dla obu typów chipów. Maszyna potrzebuje niskiego ROX na każdym wlocie, aby wykryć siatkę chipa.

9. Przygotowanie nanofluidycznego chipa

UWAGA: Układ wielomacierzowy musi być zagruntowany tylko przy pierwszym uruchomieniu. Jeśli występują kolejne serie tego samego chipa, ten etap można pominąć. Te kroki są takie same dla obu typów chipów.

  1. Powoli i ostrożnie wstrzyknąć pełne 150 μl płynu z przewodu kontrolnego ze strzykawek dołączonych do akumulatorów chipa. Upewnij się, że żadna ciecz kontrolna nie dotyka chipa, trzymając wiór pod kątem 45° i trzymając końcówkę strzykawki z daleka, aby uniknąć rozlania.
  2. Usuń niebieską folię ochronną ze spodu chipa.
  3. Umieść chip w maszynie do konsyfikowania PCR metodą nanofluidyczną (tabela materiałów), z kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz. Uruchom skrypt "Prime (153x)", który zajmuje ~15–20 min.
    UWAGA: Na tym etapie włącz termocykler nanofluidyczny (Tabela materiałów), ponieważ aparat potrzebuje około 10 minut, aby schłodzić się do temperatury poniżej 0 °C.

10. Ładowanie chipa nanofluidycznego

  1. Zaślepki zaporowe należy usuwać sekwencyjnie w miarę załadunku. Zmniejsza to ryzyko nieprawidłowego załadowania studni.
  2. Przenieść 3 μl dla chipa wielomatrycowego lub 5 μl dla chipa z pojedynczą matrycą z każdego testu starterowego mieszanin i mieszanin próbek do odpowiednich wlotów chipa nanofluidycznego zgodnie z przygotowanym planem. Upewnij się, że nie wprowadzasz bąbelków, które mogą spowodować, że całkowita przenoszona objętość będzie mniejsza niż pożądana.
    UWAGA: Jeśli są jakieś studnie, które będą uruchamiane bez podkładu, ważne jest, aby zostały one załadowane mieszanką główną, zastępując objętość podkładu wodą. Dotyczy to obu typów chipów. Na tym etapie łatwiej jest umieścić chip na ciemnej powierzchni, co pozwoli na łatwiejsze widzenie studzienek.

11. Uruchamianie chipa nanofluidycznego

UWAGA: Przy pierwszym uruchomieniu układu z wieloma macierzami, skonfiguruj plik śledzenia, wybierając Narzędzia | Śledzenie użycia Flex Six, kliknij przycisk Nowy, wprowadź nazwę pliku i wybierz lokalizację przed kliknięciem przycisku Gotowe.

  1. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych. Kliknij przycisk Rozpocznij nowy przebieg. Umieść załadowany chip w termocyklerze nanofluidyki z kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz.
  2. Wybierz ustawienia projektu, jeśli ma to zastosowanie, a następnie kliknij przycisk Dalej | Obciążenie. Jeśli ładujesz układ z wieloma macierzami, wybierz partycje (tablice), które mają zostać uruchomione.
  3. Wybierz sondy referencyjne aplikacji, a następnie zmień typ aplikacji na Ekspresja genów i zmień odniesienie pasywne na ROX. Wybierz test pojedynczej sondy, zmień typ sondy na Eva Green i kliknij przycisk Dalej.
  4. Wybierz protokół cykli termicznych GE FLEX six Fast PCR+Melt v1, aby uruchomić układ z wieloma macierzami, lub protokół GE 96.96 Fast PCR+Melt v2, aby uruchomić układ z jedną macierzą.
  5. Upewnij się, że wybrano opcję Auto Exposure (Automatyczna ekspozycja), a następnie kliknij przycisk Start Run (Rozpocznij uruchamianie).

12. Przebieg po żetonie

UWAGA: Ta sekcja jest potrzebna tylko dla układów wielomacierzowych, gdy nie używa się całego układu.

  1. Wyjmij chip z termocyklera nanofluidycznego i załaduj go do maszyny do konsyfikowania nanofluidics PCR i uruchom skrypt Post Run (153x), który trwa 5 minut.
  2. Oznacz wtyczki używane do użytku osobistego.
    UWAGA: Chip może być teraz przechowywany w temperaturze pokojowej, a pozostałe macierze na chipie można uruchomić w ciągu 2 miesięcy.

13. Czyszczenie i analiza danych

  1. Otwórz dane w oprogramowaniu "Real-Time PCR Analysis" (Tabela materiałów). Sprawdź szczytową temperaturę topnienia dla każdej badanej pary starterów. Wyeliminuj wyniki wykazujące więcej niż jeden szczyt temperatury topnienia dla danej pary starterów.
    UWAGA: Wiele pików pojawia się tylko sporadycznie, przypuszczalnie, gdy pary starterów tworzą dimery lub w wyniku interakcji docelowych starterów z innymi starterami w zbiorczej mieszance starterów.
  2. Eksportuj dane jako plik arkusza kalkulacyjnego "mapy cieplnej" i wyeliminuj nieudane próbki lub startery.
  3. Analizowanie danych przy użyciu standardowej metody Delta-Ct21. W celu oceny statystycznej należy przeprowadzić jednoczynnikową ANOVA na względnych poziomach ekspresji.

Wyniki

Walidacja metody Worm-to-CT jako sposobu przygotowania cDNA

Aby sprawdzić, czy protokół Worm-to-CT jest prawidłową metodą ekstrakcji cDNA, porównano go ze standardowymi metodami ekstrakcji z użyciem tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu. Wyniki przedstawiono na Rysunku 3, gdzie cDNA przygotowano ze średnio ~1 000 nicieni przy użyciu standardowych technik ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem22 oraz z 30 nicieni przy użyciu metody Worm-to-CT. Próbki poddano jednoczesnemu szokowi termicznemu (30 min w 34 °C). Ogólnie poziomy ekspresji mRNA hsp-70 na 100 ng całkowitego RNA były porównywalne przy zastosowaniu obu metod. Jednak w przypadku najwyższej ekspresji hsp-70 (tj. w szczepie N2 po szoku termicznym) poziomy ekspresji były wyższe przy zastosowaniu metody Worm-to-CT, co wskazuje na poprawioną czułość.

Aby sprawdzić, czy można odtworzyć oczekiwany spadek ekspresji hsp u hsf-1(sy441)23, mutacji głównego regulatora transkrypcyjnego chaperonów molekularnych23,24, porównano indukcję transkrypcyjną chaperonów po krótkim szoku termicznym. W obu metodach stwierdzono spadek indukcji hsp-70 u zwierząt hsf-1(sy441). Było to spodziewane, ponieważ mutanty hsf-1(sy441) wykazują obniżoną zdolność do indukcji chaperonów z powodu truncacji w domenie transaktywacyjnej HSF-1. W przypadku ekstrakcji guanidianem tiocyjanianu-fenolem-chloroformem poziom hsp70 spadł o 82,7% w porównaniu z kontrolą, a w metodzie Worm-to-CT o 92,3% w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego (Rycina 3). Wyniki były porównywalne dla obu metod oraz zgodne z wcześniejszymi doniesieniami23. Wyniki te wskazują, że metoda Worm-to-CT stanowi poprawną alternatywę dla standardowych technik syntezy cDNA.

Walidacja platformy nanofluidycznej PCR wykorzystywanej do amplifikacji celów mRNA

Aby przetestować spójność wyników uzyskanych przy użyciu nanofluidycznej qPCR w celu amplifikacji transkryptów, porównano wyniki PCR otrzymane metodą masową Worm-to-CT zarówno w standardowym systemie qPCR (Tabela materiałów) oraz nanofluidyczny system qPCR z wykorzystaniem chipa wielkoprzestrzennego. Krotność zmiany ekspresji trzech różnych genów, sma-3 (Rysunek 4A), sma-10 (Rycina 4B), i dnj-26, monitorowano (Rysunek 4C) u zwierząt posiadających allel null w dbl-1 (dbl-1(nk3))25 w porównaniu do odpowiedników typu dzikiego. Dbl-1 koduje jedyny ligand szlaku sygnalizacyjnego białka morfogenetycznego kości (BMP). sma-3 i sma-10 są genami kodującymi ortologi SMAD, kluczowe komponenty kaskady sygnałowej BMP. Dnj-26 koduje chaperonę molekularną, będącą celem sygnalizacji BMP. Wyniki te wykazują niewielką lub żadną różnicę w krotności zmiany (fold change) przy porównaniu rezultatów obu metod, co skutkuje nieistotnymi statystycznie wartościami P wynoszącymi odpowiednio 0,3113, 0,2635 i 0,3481 dla sma-3, sma-10i dnj-26odpowiednio. Łącznie wyniki te wykazują, że metoda Worm-to-CT zastosowana do próbek zbiorczych jest wydajnym i szybkim sposobem izolacji RNA z niewielkiej liczby nicieni i dostarcza wiarygodnych danych w połączeniu ze standardowymi systemami PCR lub wysokoprzepustowymi platformami qPCR opartymi na nanofluidyce.

Porównanie poziomów ekspresji uzyskanych z próbek zbiorczych z wartościami średnimi uzyskanymi z pojedynczych nicieni

Względne poziomy ekspresji obliczono, wykorzystując cDNA uzyskane z próbek zbiorczych (25 nicieni) lub ze średniej z 36 próbek pojedynczych nicieni (Rysunek 5). Oba rodzaje cDNA uzyskano metodą Worm-to-CT i powielono z wykorzystaniem technologii nanofluidycznej PCR. Jak zaobserwowano na Rysunku 5A–C, dla wszystkich badanych chaperonów (tj. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70) obie metody wykryły porównywalne poziomy ekspresji. Wyniki te wskazują, że parametry uzyskane z pojedynczych nicieni są wiarygodne.

Zastosowanie technologii Worm-to-CT połączonej z nanofluidyką do szacowania parametrów ekspresji genów pojedynczych nicieni

Ponieważ chip z jedną macierzą umożliwia monitorowanie do 96 transkryptów docelowych w 96 pojedynczych próbkach, nadaje się on do badania zmienności osobniczej w ekspresji transkryptów między pojedynczymi nicieniami. Rycina 6A przedstawia reprezentatywny wynik ukazujący średnią ekspresję wielu transkryptów hsp z pojedynczych nicieni po krótkim szoku termicznym. Jak zaobserwowano na rycinie, zmienność ekspresji transkryptów różniła się drastycznie w zależności od genu (Rycina 6A). Aby uzyskać więcej informacji, obliczono współczynnik zmienności (CV), dzieląc odchylenie standardowe przez średnią poziomów ekspresji26 (Rycina 6B). Monitorowano trzy geny, których wartości CV zostały wcześniej oszacowane alternatywnymi metodami (dane niepublikowane). Dwa stabilne transkrypty (ife-1 oraz Y45F10D.4) i jeden zmienny (nlp-2927) wykazały oczekiwaną zmienność. Wykres wyraźnie przedstawia również znany odwrotny związek między wartościami zmienności a poziomami ekspresji26 (Rycina 6B).

Powtórzenia techniczne są kluczowe dla zapewnienia powtarzalności w przypadku stosowania próbek zbiorczych. Niekoniecznie ma to jednak miejsce w eksperymentach na pojedynczych komórkach.14,15,28Aby ustalić, czy w przypadku stosowania próbek pojedynczych nicieni konieczne jest wykorzystanie powtórzeń technicznych do szacowania parametrów, 28 pobrano pojedyncze nicienie, po krótkim szoku termicznym, a następnie przetworzono z wykorzystaniem triplikatów technicznych. Wartości CV obliczone z danych dla pojedynczych nicieni uzyskanych w trzech powtórzeniach (niebieskie kropki w Rycina 7, techniczny współczynnik zmienności (CV)) w porównaniu do tych dla każdego transkryptu uzyskanego z poszczególnych nicieni (czerwone kropki w Rycina 7, zmienności biologicznej) poddano porównaniu. W przypadku każdego przetestowanego transkryptu współczynniki zmienności (CV) technicznej były niższe niż współczynniki zmienności biologicznej, co wskazuje, że do oszacowania parametrów nie były wymagane powtórzenia techniczne w trzech kopiach. Brak konieczności wykonywania powtórzeń technicznych zwiększa przepustowość eksperymentu bez obniżania jego jakości.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu Worm-to-CT.
Na tym rysunku przedstawiono krótki przegląd poszczególnych etapów wymaganych do przeprowadzenia analizy nicieni zgodnie z protokołem Worm-to-CT. Przedstawiono dwie opcjonalne metody dla etapu odwrotnej transkrypcji; są to metody zamienne, możliwe do zastosowania dla każdego typu chipa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przegląd przygotowania i przeprowadzania nanofluidycznego qPCR.
Na tym rysunku przedstawiono przygotowania do uruchomienia nanofluidycznego systemu qPCR z wykorzystaniem chipa wielomaćcianowego oraz chipa jednocząstkowego. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-3
Rysunek 3: Protokół Worm-to-CT zastosowany do próbek zbiorczych dostarczył wiarygodnych wyników.
Porównanie protokołu Worm-to-CT z regularną ekstrakcją tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem22 w próbkach zbiorczych. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, u mutantów hsf-1(sy441)23 poziomy transkryptów hsp w odpowiedzi na szok termiczny uległy obniżeniu. Powyższe histogramy przedstawiają indukcję hsp-70 w przypadku braku (-) lub po (+) krótkim szoku termicznym trwającym 30 min w 34 °C. cDNA uzyskano za pomocą ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem zastosowanej do 1 000 nicieni (lewo) lub za pomocą metody Worm-to-CT zastosowanej do 30 połączonych nicieni (prawo). Porównano poziomy ekspresji hsp-70 na 100 ng całkowitego RNA uzyskanego każdą z metod. Zgodnie z oczekiwaniami, u hsf-1(sy441) indukcja transkrypcyjna hsp-70 w odpowiedzi na szok termiczny znacząco spadła o 82,7% przy użyciu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu oraz o 92,3% przy użyciu metody Worm-to-CT. Poziomy mRNA genów docelowych znormalizowano względem średniej z trzech genów housekeepingowych: cdc-42, pmp-3 i ire-1. Każda kropka reprezentuje powtórzenie biologiczne. Dane zostały poddane transformacji logarytmicznej do analizy statystycznej, ponieważ nie spełniały założeń wymaganych do analizy parametrycznej. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą RM-One-way ANOVA z zastosowaniem testu wielokrotnych porównań Sidaka. Typ dziki = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Słupki oznaczają błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wzorce ekspresji były spójne pomiędzy standardowymi systemami qPCR a nanofluidycznymi systemami qPCR.
(A) Poziom ekspresji mRNA dla sma-3 (A), sma-10 (B) lub dnj-26 (C) został określony za pomocą standardowego qPCR oraz nanofluidycznego qPCR (chip wielkopolowy) z trzech powtórzeń biologicznych cDNA otrzymanego metodą Worm-to CT z dzikiego szczepu (N2) oraz szczepu z nokautem dbl-1(nk3)25. Względne poziomy ekspresji mRNA dla każdego szczepu określono metodą Delta-Ct21. Następnie obliczono krotność zmiany (fold change), dzieląc poziomy ekspresji uzyskane u nicieni dbl-1(nk3) przez odpowiadające im poziomy mRNA w szczepie N2. Jak pokazano na panelu A, wzorce były spójne dla obu metod w każdym poszczególnym powtórzeniu biologicznym. (B) i (C) przedstawiają analogiczne wyniki jak w przypadku (A) dla poziomów mRNA sma-10 i dnj-26 odpowiednio. Poziomy docelowego mRNA znormalizowano względem genów housekeepingowych cdc-42 i pmp-3. Analizę statystyczną dla każdego genu przeprowadzono za pomocą sparowanego testu t, porównując wyniki trzech powtórzeń biologicznych uzyskanych za pomocą standardowego qPCR z wynikami uzyskanymi za pomocą nanofluidycznego qPCR. Wartości P dla tych porównań wynosiły odpowiednio 0,3113, 0,2635 i 0,3481 dla sma-3, sma-10 i dnj-26. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Zastosowanie metody Worm-to-CT w próbkach zbiorczych lub w pojedynczych nicieniach pozwoliło uzyskać podobne poziomy ekspresji po normalizacji na jednego nicienia.
Poziomy ekspresji (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 oraz (C) hsp-70 (C12C8.1) analizowano u młodych osobników dorosłych w warunkach braku szoku termicznego, przeprowadzając procedurę Worm-to-CT albo na zbiorczej próbce 25 osobników, albo na 36 pojedynczych osobnikach. Po normalizacji danych na jednego nicienia nie stwierdzono istotnych różnic między poziomami uzyskanymi na jednego nicienia dla każdego transkryptu przy zastosowaniu obu metod. Poziomy mRNA genów docelowych znormalizowano względem średniej z trzech genów pomocniczych (housekeeping genes): cdc-42, pmp-3 oraz ire-1. Słupki reprezentują błąd standardowy średniej. Analiza statystyczna = test t dla prób zależnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Wysokoprzepustowa analiza RT-qPCR pojedynczych nicieni z wykorzystaniem metody Worm-to-CT pozwala na monitorowanie zmienności międzyosobniczej w ekspresji genów.
(A) średnie poziomy ekspresji 53 transkryptów uzyskane po krótkotrwałym szoku termicznym (30 min w temperaturze 34 °C). Wykresy pudełkowe przedstawiają rozkład średniej ekspresji mRNA z poszczególnych nicieni (dla każdego osobnika wykorzystano średnią z trzech powtórzeń technicznych). Kropki reprezentują poziomy ekspresji u 28 poszczególnych nicieni. Poziomy mRNA genów docelowych znormalizowano względem średniej z trzech genów pomocniczych. cdc-42, pmp-3i ire-1. (B) Współczynnik zmienności26 (CV) jako funkcja średniej ekspresji mRNA dla 53 transkryptów po ekspozycji na krótki szok termiczny została obliczona na podstawie danych z 28 osobników (surowe dane przedstawiono w panelu B). Zbiór transkryptytów obejmuje zmienną nlp-29 transkrypcja27 oraz dwa stabilne transkrypty (ife-1 i Y45F10D.4; niepublikowane dane). CV (współczynnik zmienności) jest stosunkiem odchylenia standardowego do średniej. Współczynnik ten wykorzystano do oszacowania zmienności międzyosobniczej w ekspresji transkryptów pomiędzy poszczególnymi osobnikami nicieni. Zgodnie z oczekiwaniami, zmienność międzyosobnicza rosła wraz ze spadkiem średnich poziomów ekspresji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Powtórzenia techniczne nie były konieczne podczas analizy zmienności międzyosobniczej w ekspresji genów z wykorzystaniem chipa nanofluidycznego.
Dane przedstawione na tym wykresie uzyskano u 28 poszczególnych nicieni po krótkim szoku termicznym (30 min w 34 °C). Każda czerwona kropka reprezentuje współczynnik zmienności (CV) średnich poziomów ekspresji transkryptu dla jednego badanego transkryptu pomiędzy 28 poszczególnymi nicierniami (bio CV). Każda niebieska kropka reprezentuje CV poziomów ekspresji pomiędzy trzema powtórzeniami technicznymi uzyskanymi z jednego nicienia, na każdy badany transkrypt (technical CV). Wykres ten pokazuje, że zmienność techniczna (między powtórzeniami technicznymi) była znacznie niższa niż zmienność biologiczna (między poszczególnymi nicierniami), co sugeruje, że przy badaniu ekspresji genów w pojedynczych nicierniami, podobnie jak w badaniach pojedynczych komórek14,15,28, nie ma potrzeby wykonywania powtórzeń technicznych na nanofluidycznym układzie do ekspresji genów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Schemat rozmieszczenia dla chipa wielomatrycowego. Powyższa tabela przedstawia prosty układ, który można wykorzystać podczas planowania analizy na chipie wielomatrycowym. Po lewej stronie znajdują się miejsca, które należy wypełnić docelowymi starterami, a po prawej miejsca przeznaczone na analizowane próbki. Każda matryca testów i próbek jest sparowana numerycznie w obrębie chipa. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Plan układu dla chipa z pojedynczą macierzą. Powyższa tabela przedstawia prosty układ, który można wykorzystać podczas planowania pracy z chipem z pojedynczą macierzą. Po lewej stronie znajdują się miejsca, które należy wypełnić docelowymi starterami, a po prawej miejsca przeznaczone na badane próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Lista starterów RT-qPCR użytych w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 1: Primery z bazy danych primerów do RT-qPCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tym artykule wykazano, że protokół Worm-to-CT jest szybką i skuteczną metodą ekstrakcji RNA z pojedynczych robaków lub małej puli robaków. Wysoka przepustowość oferowana przez system nanofluidyczny sprawia, że idealnie nadaje się on do ilościowego określania pomiarów zmienności międzyosobniczej. Co więcej, wysoka czułość tej metody pozwala na wykrycie genów ulegających ekspresji na niskich poziomach, które są poniżej wykrywalności w przypadku stosowania technologii sekwencjonowania RNA pojedynczego robaka9.

Rozważając wybór metody przygotowania cDNA z pojedynczych robaków. Ly i wsp.29 zoptymalizowali protokół, który opiera się na proteinazie K do trawienia kutykuli. Naskórek jest główną przeszkodą w izolacji cząsteczek od robaków, a proteinaza K stanowi skuteczną metodę jego rozbicia. Jednak proteinaza K musi być inaktywowana termicznie, aby móc używać enzymów do odwrotnej transkrypcji. Podczas gdy Ly i in. zastosowali 10-minutową ekspozycję na temperaturę 96 °C, ten krok został pominięty w tym protokole, ponieważ RNA łatwo ulega degradacji. Zamiast używać proteinazy K, zastosowano powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić naskórek. Zamrożenie i rozmrożenie jest skuteczną metodą rozbijania naskórka, ponieważ można wyizolować więcej RNA na robaka. Ly i in. podają, że całkowite RNA wyekstrahowane na robaka wynosi 35 ng przy użyciu proteinazy K, podczas gdy ten protokół uzyskuje 51,75 ng ± 6,74 SEM całkowitego RNA na robaka. Unikanie ekspozycji na ciepło w połączeniu z etapami preamplifikacji najwyraźniej poszerza zakres dynamiczny wykrywania Worm-to-CT w porównaniu ze standardowymi protokołami. Ly i wsp. podają bezwzględne wartości Ct wynoszące 21,1 ± 0,15 dla hsp-16,2 i 22,8 ± 0,17 dla hsp-70 po szoku cieplnym. Korzystając z tych samych warunków szoku cieplnego (1 h w temperaturze 30 °C), protokół ten uzyskuje bezwzględne wartości Ct wynoszące 17,93 ± 0,57 dla hsp-16,2 i 21,13 ±0,33 dla hsp-70. Oznacza to, że metoda lizy zamrażania i rozmrażania zapewnia wyższą wydajność RNA i jest bardziej odpowiednia dla transkryptów o niskiej ekspresji.

Systemy nanofluidyczne idealnie sprawdzają się przy badaniu danego zestawu docelowych transkryptów i wykorzystaniu mniejszej (układ wielomacierzowy) lub większej (układ jednomacierzowy) liczby próbek, co pozwala na dostosowanie do skali eksperymentu. Aby uzyskać bezstronny obraz wszystkich transkryptów wyrażonych w pojedynczym robaku, oczywistym wyborem jest użycie sekwencjonowania RNA. Jeśli jednak eksperyment skupia się na mniejszym, ale wciąż stosunkowo dużym zestawie genów docelowych, bardziej opłacalne jest wykorzystanie tego protokołu, pod warunkiem, że badacz ma dostęp do maszyny do PCR w technologii nanofluidycznej. Koszt odczynników systemu nanofluidycznego i chipa z pojedynczą macierzą szacuje się na około 13 funtów na robaka, podczas gdy koszt odczynników do sekwencjonowania pojedynczego robaka wyniósłby około 60 funtów na robaka, nie wliczając kosztów sekwencjonowania.

Zastanawiając się, jaką platformę PCR zastosować, metoda Worm-to-CT w połączeniu z nanofluidycznym qPCR oferuje korzyści pod względem czasu i przepustowości. Możliwe jest uzyskanie 9 216 wyników RT-qPCR w ciągu około 2 dni pracy, podczas gdy amplifikacja tej samej liczby celów przy użyciu standardowej platformy qPCR zajęłaby około 5 tygodni roboczych przy użyciu 96 testów płytkowych, przy użyciu czterech płytek dziennie. Jeśli jednak liczba celów do przetestowania jest mniejsza, bardziej opłacalne jest użycie Worm-to-CT w połączeniu ze standardową maszyną qPCR. Układy scalone z pojedynczą macierzą nie mogą być ponownie uruchomione, więc uruchamianie pustych studni zmniejsza opłacalność.

Jednym z ograniczeń metody jest potencjalne tworzenie dimerów starter-starter podczas etapu multipleksowania, ale występuje to w mniej niż 1% przypadków. Chociaż protokół Worm-to-CT jest skuteczny i zapewnia wiarygodne wyniki, gdy jest stosowany do pojedynczych robaków, wskaźnik niepowodzeń wynosi około 5%, co prawdopodobnie odpowiada przypadkom, w których robak pozostaje uwięziony w nasadce lub górnej części rurki podczas etapu zbioru.

Ta wszechstronna i niezawodna metoda zapewnia większą przepustowość i czułość w porównaniu z bardziej standardowymi technikami. Metoda ta może być bardzo przydatna do walidacji wysokoprzepustowych badań przesiewowych i jest doskonałym wyborem do monitorowania lub walidacji poziomów ekspresji genów pojedynczego robaka. Metoda ta może być stosowana do innych wymagających technik, takich jak kwantyfikacja ekspresji genów z izolowanych tkanek. Na przykład izolacja pełnych tkanek, takich jak jelito, gonady lub komórki wyizolowane przez FAC, zapewnia wystarczającą ilość materiału do przeprowadzenia eksperymentów sekwencjonowania RNA. Jednak ograniczone ilości materiału często prowadzą do zduplikowanych odczytów, co wyklucza ilościowe określenie ilości rzadkich transkrypcji. W tym scenariuszu zastosowanie technologii opartej na nanofluidyce powinno zapewnić dodatkową czułość eksperymentów i zwiększyć efektywność kosztową, jeśli naukowcy muszą monitorować tylko podzbiór wszystkich transkryptów w tych tkankach lub komórkach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Sharlene Murdoch i Babraham Institute Facilities za ich wsparcie. JLP był wspierany przez Wellcome Trust (093970/Z/10/Z), a OC jest wspierany przez ERC 638426 i BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 i mikro; M podstawowe startery dla genów będących przedmiotem zainteresowania.
20X Barwnik wiążący DNAFluidigm100-7609do chipa 96.96 (chip z pojedynczą matrycą)
2X Test ładowania odczynnikaFluidigm100-7611
384-dołkowe
płytki 8-paskowe probówki
96-dołkowe płytki z blokiem
96 dołków
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M-96.96Określany w całym manuskrypcie jako "Single-Array Chip"
96-dołkowa taśma
BioMark & Oprogramowanie EP1Fluidigm101-6793Zawiera: oprogramowanie Biomark HD Data Collection, oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym, oprogramowanie do analizy genotypowania SNP, oprogramowanie do cyfrowej analizy PCR, oprogramowanie do analizy krzywej topnienia
BioMark lub system BioMark HDFluidigm100-2451 K1Określany w całym manuskrypcie jako "termocykler nanofluidyczny"
Zestaw płynów do przewodów kontrolnych dla 96.96 i FlexSix IFCFluidigm89000021Określany w całym manuskrypcie jako "płyn linii kontrolnej"
Bufor zawiesinowyDNA TEKnovaT0021
kopulaste kapsułki
Egzonukleaza IEngland BioLabsM0293L
Bufor reakcyjny egzonukleazy IEngland BioLabsB0293S
FLEXsix DELTAgene Odczynnik do próbkiFluidigm100-7673określany w całym manuskrypcie jako "odczynnik próbki"
FLEXsix Gene Expression IFCFluidigm100-6308określany w całym manuskrypcie jako "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User GuideFluidigm68000088Jest to protokół używany jako podstawa sekcji 2 protokołu, do którego odwołuje się manuskrypt.
Kontroler IFC MXFluidigm68000112 I1Określany w całym manuskrypcie jako "maszyna do gruntowania nanofluidyki PCR"
Kontrolery IFC SOFTWEARFluidigm100-2297Zawiera wszystkie oprogramowanie i skrypty wymagane do uruchomienia kontrolera IFC
MX ciekły azot w mikrowirówce Dewara
StarLabC1301B-230VSłuży do odkręcania pasków probówki PCR w protokole.
Wirówka do płytek
LabnetK4050725mini wirówka do płytek, mps 1000. określany w protokole jako "spinner talerzowy"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kitinvitrogen4402955Ten zestaw jest przystosowany do stosowania w nicieniach w protokole Worm-to-CT. Contense: Store Stop Solution, DNase I i 20X RT Enzyme Mix w temperaturze -20°C. Przechowuj roztwór do lizy, 2X SYBR RT Buffer (określany w całym manuskrypcie jako bufor RT) i Power SYBR® Green PCR Master Mix (określany w manuskrypcie jako PCR Master Mix). Ten zestaw jest przeznaczony na 400 reakcji, zestawy dostępne są również dla 40 i 100 reakcji.
PreAmp Master MixFluidigm100-5580, 100-5581
Mistrz odwrotnej transkrypcji Mix— 480 reakcjiFluidigm100-6299Jedna probówka dostępna również dla 96 reakcji (PN100-6298)
Woda
SsoFast EvaGreen Supermix z Low ROXBio-Rad Laboratories172-5211określany w całym manuskrypcie jako "supermix sondy fluorescencyjnej"
Standardowy 96-dołkowy i 384-dołkowy bufor termocyklera
TE (10mM Tris, pH 8,0, 1,0 mM EDTATEKnovaT0224Określany w całym manuskrypcie jako bufor Tris-EDTA
ThermoMixer CEppendorf5382000031Określany w tekście jako "mieszalnik termiczny"
TrizolThermo-Fisher15596026Określany w protokole jako "tiocyjanian guanidu-fenol-chloroform"
Ciepła kąpiel
PCRloduuszczelniającaPCR New New wodnych bez nukleazwolna od rnaz wodna

Bibliografia

  1. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309(2006).
  2. Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
  7. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729(2018).
  11. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559(2018).
  12. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
  19. Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85(2006).
  22. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wysokoprzepustowe RT qPCRekspresja gen w u C elegansmetoda Worm to CTanaliza pojedynczych nicieniprzetwarzanie pr bek zbiorczychprzygotowanie cDNAodwrotna transkrypcjaprotok preamplifikacjitraktowanie egzonukleaz I
Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.