Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

10 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ubikwitylacja CENP-A jest ważnym wymogiem dla depozycji CENP-A w centromerze, dziedziczonym przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i nieodzownym dla żywotności komórki. Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP.

Streszczenie

Badanie struktury i dynamiki kinetochorów i centromerów jest ważne dla zrozumienia niestabilności chromosomalnej (CIN) i progresji raka. Fundamentalnym pytaniem jest, w jaki sposób lokalizacja i funkcja chromosomów centromeru (tj. tożsamość centromerów) są określane i uczestniczą w dokładnej segregacji chromosomów. Proponuje się, że CENP-A jest nie-DNA wskaźnikiem (znacznikiem epigenetycznym) tożsamości centromerów, a ubikwitylacja CENP-A jest wymagana do odkładania CENP-A w centromerze, dziedziczona przez dimeryzację między podziałami komórkowymi i niezbędna do żywotności komórki.

Tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu zidentyfikowania ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R, sugerując, że ubikwitylacja przy innej lizynie jest indukowana przez znacznikowanie EYFP w białku mutanta CENP-A K124R. Udało się zidentyfikować ubikwitylację lizyny 306 (K306) w EYFP-CENP-A K124R, która odpowiada lizynie 56 (K56) w CENP-A za pomocą analizy spektrometrii mas. Omówiono zastrzeżenie dotyczące stosowania GFP/EYFP lub znakowania białka o dużej masie cząsteczkowej jako narzędzia do analizy funkcji białka. Omówiono również obecne limity techniczne dla wykrywania ubikwitylowanych prążków, identyfikacji ubikwitylacji specyficznej dla miejsca oraz wizualizacji ubikwitylacji w żywych komórkach lub określonej pojedynczej komórce podczas całego cyklu komórkowego.

Przedstawiona tutaj metoda analizy spektrometrii mas może być zastosowana do ludzkiego białka CENP-A z różnymi znacznikami i innych białek centromer-kinetochoru. Te metody łączące, składające się z kilku testów/analiz, mogą być zalecane dla badaczy, którzy są zainteresowani identyfikacją funkcjonalnych ról ubikwitylacji.

Wprowadzenie

U większości eukariontów mikrotubule wrzecionowate muszą przyczepiać się do pojedynczego regionu każdego chromosomu, określanego jako centromer. Kinetochor to kompleks białek, które znajdują się w centromerze. Badanie czasu ruchów centromerów i białek kinetochorowych oraz struktury kinetochorów i centromerów jest ważne dla zrozumienia niestabilności chromosomów (CIN) i progresji raka. Kluczowe pytania dotyczą tego, w jaki sposób określa się lokalizację i funkcję chromosomów centromerów (tj. tożsamość centromerów) oraz w jaki sposób uczestniczą one w dokładnej segregacji chromosomów. U większości gatunków obecność specjalnego nukleosomu zawierającego specyficzne białko podobne do histonów zwane CENP-A określa tożsamość centromerów. W związku z tym proponuje się, że CENP-A jest nie-DNA wskaźnikiem (znacznikiem epigenetycznym) tożsamości centromerów. Ważne jest, aby wyjaśnić mechanizm, w jaki sposób CENP-A definiuje tożsamość centromerów u ludzi.

Białko rozpoznające złącze Hollidaya (HJURP) to opiekun specyficzny dla CENP-A, który deponuje CENP-A w centromerowych nukleosomach1,2,3. Wcześniej informowaliśmy, że ligaza CUL4A-RBX1-COPS8 E3 jest wymagana do ubikwitylacji CENP-A na lizynie 124 (K124) i lokalizacji centromerów4. Ponadto nasze wyniki pokazały, że rekrutacja centromerów nowo zsyntetyzowanego CENP-A wymaga wcześniej istniejącego ubikwitylowanego CENP-A5. W związku z tym dostarczono model sugerujący, że ubikwitylacja CENP-A jest dziedziczona poprzez dimeryzację między podziałami komórkowymi.

W przeciwieństwie do naszych ustaleń oraz wyników Yu et al., ostatnio opublikowano negatywne wyniki dotyczące CENP-A i jego lokalizacji centromerowej6. W artykule stwierdzono, że modyfikacje CENP-A lizyny 124 (K124) są zbędne dla ustanowienia, utrzymania i długotrwałego funkcjonowania ludzkich centromerów, w oparciu o ich negatywne wyniki pokazujące, że mutacja K124R nie wpłynęła na lokalizację centromerów CENP-A ani na żywotność komórek6. Jest jednak wystarczająco dużo miejsca na dyskusję w ich wynikach i wnioskach, a jaki problem może wystąpić już w ich poprzedniej publikacji7. Należy zwrócić uwagę, że połączyli białka z CENP-A, które mają znacznie większą masę cząsteczkową niż rozmiar endogennego CENP-A: np. połączyli białko żółtej fluorescencji o masie ~30 kDa (EYFP) do ~16 kDa CENP-A i przeanalizowali białko fuzyjne EYFP-CENP-A K124R w swoim systemie nokautującym RPE-1 CENP-A-/F. Nie oczekuje się, że ubikwityna K124 wiąże się bezpośrednio z HJURP na podstawie przewidywań strukturalnych4, jednak przewiduje się, że dodanie mono-ubikwityny będzie miało wpływ na konformację białka CENP-A. Białko konformacji CENP-A może być zmienione przez obecność dużego białka fuzyjnego, a ta zmiana konformacyjna może maskować zmiany strukturalne spowodowane utratą ubikwitylacji. Sugerujemy, że fuzja białka o dużych rozmiarach indukuje ubikwitylację lizyny innej niż K124 w mutancie EYFP-CENP-A K124R, a ta ubikwitylacja w innym miejscu hamuje / maskuje oryginalny fenotyp pojedynczego mutanta K124R. Dowody na to, że ubikwitylacja zachodzi przy różnych lizynach w zmutowanym białku CENP-A K124R z białkiem dużego znacznika (EYFP), zostały przedstawione w naszej poprzedniej publikacji8. Stwierdzono, że znakowanie EYFP indukuje ubikwitynację innego miejsca lizyny EYFP-CENP-A K124R i że mutant EYFP-CENP-A K124R wiąże się z HJURP. W rezultacie, ta ubikwitylacja w innym miejscu hamuje/maskuje oryginalny fenotyp pojedynczego mutanta K124R, a zarówno mutanty EYFP-CENP-A WT, jak i K124R wykazały lokalizację centromerów (użyliśmy i porównaliśmy mutanta pBabe-EYFP-CENP-A WT i K124R, wraz z kontrolą pBabe-EYFP). Wyniki wykazały, że mutanty CENP-A K124R znakowane lub nieoznakowane są śmiertelne, ale można je uratować przez fuzję monoubikwityny, co sugeruje, że ubikwitylacja CENP-A jest niezbędna do żywotności komórek.

W ostatnich latach wiele badań opracowało różne testy do identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych (PTM) białka CENP-A i innych białek centromer-kinetochoru zarówno in vivo, jak i in vitro9,10,11. Analogicznie do PTM białek histonowych, które są głównym mechanizmem regulującym funkcję chromatyny, PTM składników chromatyny centromerowej są również zaangażowane w niezbędny mechanizm regulacji ogólnej struktury i funkcji centromerów. Większość miejsc CENP-A PTM jest specyficzna dla nukleosomów zawierających CENP-A, chociaż kilka z nich jest konserwatywnych w histonie H3, co sugeruje, że modyfikacja tych reszt przyczynia się do funkcji specyficznej dla centromeru. PTM CENP-A, w tym fosforylacja, acetylacja, metylacja i ubikwitylacja, były wcześniej opisywane9, co sugeruje, że CENP-A jest poddawany różnym PTM i ich układom kombinatorycznym na swoim końcu aminowym i domenie fałdowania histonów C-końca. Znaczenie modyfikacji CENP-A w wielu funkcjach zostało ujawnione przez wiele grup, w tym naszą. Funkcje te obejmują depozycję CENP-A w centromerach, stabilność białka i rekrutację CCAN (konstytutywnej sieci związanej z centromerami)9. Jednak ograniczone badania i odkrycia dotyczące PTM CENP-A są tworzone, w których dokonuje się porównań z jednym z kanonicznych histonów, które bezpośrednio lub pośrednio regulują ich funkcję. Raporty techniczne koncentrujące się na metodologii identyfikacji tych PTM CENP-A są również ograniczone.

Ponieważ ubikwitylacja CENP-A jest wymagana do depozycji CENP-A w centromerze12, dziedziczona przez dimeryzację między podziałami komórek5, i niezbędna do żywotności komórki8, metoda identyfikacji ubikwitylacji CENP-A będzie w przyszłości niezbędna do zbadania funkcjonalnej aktywności, położenia i struktury centromeru. Dlatego tutaj opisujemy analizę spektrometrii mas w celu zidentyfikowania ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R, co sugeruje, że znakowanie EYFP indukuje ubikwitylację przy innej lizynie w zmutowanym białku CENP-A K124R8. Przedstawiono również protokoły innych testów kontrolnych i analiz (analiza immunofluorescencyjna, test przerostu kolonii i test ubikwitylacji in vivo) w celu omówienia prawidłowego wyniku analizy głównej spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i transfekcja retrowirusów konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A

UWAGA: EYFP-CENP-A jest wyrażany z pBabe-EYFP-CENP-A na podobnym poziomie białka do endogennego CENP-A. Całkowite komórkowe białko CENP-A jest zastępowane tym EYFP-CENP-A po przerwaniu allelu CENP-A-/F przez rekombinazę Cre, jak w RPE-1 CENP-A-/- cells6.

  1. Przygotowanie supernatantu zawierającego retrowirusa przy użyciu komórek pakujących 293T.
    1. Dzień 0: Rozłóż komórki pakujące 293T na 6-dołkowej płytce hodowlanej (1,0 x 106 komórek/dołek). Hodowla komórek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, empirycznie określ gęstość komórek, która ma być używana podczas wysiewu.
    2. Dzień 1: Przygotować reakcję transfekcji około 23 godziny po rozlaniu (punkt 24 h to punkt 0 h transfekcji). Transfekcyjna ekspresja plazmidu każdego pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) i pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (patrz Tabela 1).
    3. Należy wybrać jedną kombinację plazmidów pomocniczych/opakowaniowych wymienionych w Tabeli 2 i dodać je do probówek zawierających jeden z plazmidów wymienionych powyżej. Przeważnie istnieją te 3 kombinacje dla plazmidów pomocniczych/pakujących (Tabela 2). Każda kombinacja działała w tych eksperymentach i wykazała podobną skuteczność transfekcji.
    4. Przygotować 50 μl zredukowanej pożywki surowicy i zmieszać 2,0 μg każdego pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) i pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (patrz Tabela 1), dodając jedną kombinację plazmidów pomocniczych/pakujących wymienionych w Tabeli 2 (patrz poniżej). Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ta mieszanina jest roztworem A.
    5. Przygotować kolejne 50 μl zredukowanej pożywki surowicy i zmieszać 1,5 μl odczynników do transfekcji odpowiednio I i II (tabela materiałów). Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Mieszanina ta jest roztworem B.
      UWAGA: Opcjonalnie dodać tylko 6,0 μl odczynnika do transfekcji III (polietylenoiminy [PEI]; 1,0 mg/ml) w roztworze B lub dodać 6,0 μl odczynnika do transfekcji III oprócz odczynników do transfekcji I i II w roztworze B (tabela materiałów).
    6. Wymieszaj ze sobą roztwory A i B i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    7. Po jednokrotnym umyciu wyhodowanych komórek PBS, dodać mieszaninę roztworów A i B (tj. kompleksu DNA-lipid) bezpośrednio do każdej studzienki 6-dołkowej płytki hodowlanej, która ma 500 μl zredukowanej pożywki surowicy. Końcowe stężenie plazmidu wynosi 3,3 μg/ml.
    8. Po inkubacji komórek w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 4,5 godziny, należy zmienić podłoże DMEM na DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Umieścić 2 ml / dołek pożywki po zmianie pożywki na 6-dołkowej płytce hodowlanej.
    9. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin po transfekcji. Przeprowadzić infekcję retrowirusem w dniu 3 przy użyciu supernatantu zawierającego retrowirusa.
  2. Zakażenie retrowirusowe komórek docelowych CENP-A-/F RPE-1.
    1. Dzień 2: Dzień przed zakażeniem rozprowadzić komórki docelowe CENP-A-/F RPE-1 do transfekcji w basenie 6-dołkowym (2,25 x 105 komórek/basenik). Hodowla komórek w DMEM: pożywka F12 (tabela materiałów) z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
      UWAGA: Komórki rozsiane do testów wzrostu kolonii, immunofluorescencji i analizy western blot jako kontrola. Aby uzyskać optymalne wyniki, empirycznie określ gęstość komórek, która ma być używana podczas wysiewu.
    2. Dzień 3 (dzień zakażenia wirusem): Po 48 godzinach od transfekcji komórek pakujących 293T, zebrać supernatant zawierający wirusa i przefiltrować przez filtr 0,45 μm (nie należy używać filtra 0,2 μm, który będzie ścinał otoczkę wirusa). Zaleca się stosowanie filtrów polieterosulfonowych (PES).
    3. Zakażenie komórek CENP-A-/F RPE-1 wirusem. Do jednego dołka z 6-dołkowej płytki hodowlanej dodać 1 ml świeżej pożywki, 1 ml supernatantu wirusa i polibrenu do końcowego stężenia 8 μg/ml. Inkubować komórki CENP-A-/F RPE-1 w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 4 dni do 7 dnia po transfekcji.
      UWAGA: Okres inkubacji wzrostu komórek CENP-A-/F RPE-1 musi być określony empirycznie poprzez przeprowadzenie analiz w celu uzyskania optymalnych wyników.

2. Analiza immunofluorescencyjna komórek zawierających pBabe-EYFP-CENP-A

  1. Dzień 7: 4 dni po zakażeniu retrowirusem konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A należy usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację. Przepłukać komórki raz TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl). Nałożyć TBS na bok studzienek hodowlanych, aby uniknąć naruszenia powierzchni komórek.
    UWAGA: Optymalny punkt czasowy dla utrwalenia komórek musi być określony empirycznie. Sygnały immunofluorescencyjne zarówno EYFP-CENP-A WT, jak i K124R są wykrywalne w centromerze co najmniej 4 dni po zakażeniu retrowirusem konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A nawet bez infekcji Cre (dane nie pokazane, Rysunek 1C-E dla danych z infekcją Cre).
  2. Wykonaj utrwalanie komórek metanolem i barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z wcześniejszym opisem13.
  3. Jako przeciwciała pierwszorzędowe należy użyć przeciwciała anty-GFP (rozcieńczenie 1:1 000) i przeciwciała anty-CENP-B (stosunek rozcieńczenia 1:200) dla markera lokalizacji centromerów w TBS zawierającego 4% surowicy koziej (patrz Tabela materiałów dla zastosowanych przeciwciał).
  4. Usuń nadmiar podłoża montażowego ręcznikiem papierowym i na ostatnim etapie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
  5. Zapoznaj się z wcześniej opisaną metodą13 w celu obserwacji obrazu immunofluorescencyjnego, akwizycji, kwantyfikacji i analizy pozostałych sygnałów EYFP-CENP-A w centromerze.
  6. Wykonaj akwizycję, przetwarzanie, w tym dekonwolucję, kwantyfikację i analizę obrazu przy użyciu oprogramowania A lub oprogramowania B1 i B2 (patrz tabela materiałów). Opcjonalnie należy użyć oprogramowania C1-C3 (patrz tabela materiałów) dla konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.
    UWAGA: Patrz 2.6.1 w Dodatkowych plikach kodowania, aby zapoznać się ze wszystkimi poleceniami używanymi w Oprogramowaniu A. Patrz 2.6.2 w Dodatkowych plikach kodowania, aby zapoznać się ze wszystkimi poleceniami używanymi w Oprogramowaniu B1 i B2.

3. Testy wzrostu kolonii za pomocą pBabe-EYFP-CENP-A po zakażeniu wirusem retro-Cre

UWAGA: Powodem przeprowadzenia tego testu jest porównanie żywotności komórek między mutantem EYFP-CENP-A WT i K124R po przerwaniu allelu CENP-A-/F przez rekombinazę Cre (po zastąpieniu całkowitego komórkowego białka CENP-A).

  1. Transfekcja retrowirusa konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A.
    1. Przeprowadzić transfekcję retrowirusa komórek CENP-A-/F RPE-1 zgodnie z opisem w sekcji 1. Hodowla komórek w DMEM: pożywka F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny przez 72 godziny po zakażeniu wirusem.
    2. Trzy dni po zakażeniu retrowirusem konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A (w dniu 6) dodać blastycydynę S (10 μg / ml) do studzienek zawierających transfekowane komórki, które mają być użyte do testu wzrostu kolonii i eksperymentów kontrolnych. Komórki hoduje się co najmniej 14 dni po zakażeniu wirusem w obecności blastycydyny S. Zmieniaj pożywkę zawierającą blasticydynę S co 5 dni.
      UWAGA: Jeśli komórki osiągną około 80% konfluencji przed wysiewem do testu kolonii (3.2.7. i 3.2.8), należy pasżować komórki w stosunku 1:2 i 1:5 przez trypsynizację i posiew na 6-dołkowej płytce hodowlanej.
    3. Zbierz komórki do western blot w dniu 7, aby potwierdzić ekspresję białka konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A bez infekcji Cre. Przeprowadzić analizę western blot zgodnie z opisem w sekcji 4. Wyniki są pokazane w Rysunek 1B (pasy 1-4).
    4. W przypadku testu wzrostu kolonii z zakażeniem wirusem Cre, utrzymuj wzrost komórek przez 14 dni po zakażeniu wirusem w obecności blasticydyny S (tj. hoduj komórki w pożywce zawierającej blasticydynę S do 17 dnia, aby uzyskać przedstawione tutaj wyniki).
  2. Zakażenie wirusem Retro-Cre pBabe-puro-Cre
    UWAGA: Dzień 0 w kroku 3.2.1 odpowiada dniu 13 w sekcji 3.1.
    1. Dzień 0 do dnia 3: Przeprowadzić transfekcję retrowirusa komórek CENP-A-/F RPE-1 przy użyciu pBabe-puro-Cre (B3027) jako plazmidu ekspresyjnego (szczegóły w sekcji 1). Upewnij się, że blasticydyna S (10 μg/ml) została dodana do pożywki hodowlanej.
    2. Dzień 4: Trypsynizuj komórki, aby oderwać je od płytki. Płytkę 500 lub 5 000 komórek w trzech egzemplarzach na 6-dołkowej płytce hodowlanej. Hodowla komórek w DMEM: pożywka F12 z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
    3. Dzień 5: Dodać blasticydynę S (10 μg/ml) do pożywki hodowlanej. Do posiewu 5 000 lub 500 komórek wybierz komórki z blastycydyną S (10 μg/ml) 3-24 dni (do 14 dnia w [3.2.7]) lub 3-28 dni (do 18 dnia w [3.2.8]) po zakażeniu wirusem konstruktów (konstrukty pBabe-EYFP-CENP-A).
      UWAGA: W tym teście wzrostu kolonii transfekcja pBabe-puro-Cre jest dodawana wraz z transfekcją pBabe-EYFP-CENP-A. Transfekcja pBabe-EYFP-CENP-A jest przeprowadzana w ppkt 3.1. Transfekcja pBabe-puro-Cre jest przeprowadzana w 3.2.1.
    4. Dzień 10 (7 dni po zakażeniu wirusem retro-Cre): Zebrać komórki do analizy western blotting w celu potwierdzenia zubożenia białek endogennego CENP-A po zakażeniu wirusem retro-Cre i/lub ekspresji białka konstruktów pBabe-EYFP-CENP-A w tym samym dniu 10.
    5. Wykonać western blot zgodnie z opisem w punkcie 4 tego samego dnia 10. Wyniki są pokazane w Rysunek 1B (pasy 5-7).
    6. Przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną (sekcja 2 powyżej), aby potwierdzić, że zarówno EYFP-CENP-A WT, jak i K124R zlokalizowały się w centromerze 7 dni po inaktywacji pozostałego endogennego allelu CENP-A. Wyniki są pokazane w Rysunek 1C-1E.
    7. Dzień 14: Wykonaj test wzrostu kolonii z płytką wysianą 5,000 komórek. Utrwal komórki przez 10 minut w metanolu i barwić przez 10 minut w roztworze fioletu krystalicznego (2,3% fioletu krystalicznego, 0,1% szczawianu amonu, 20% etanolu (patrz Rysunek 2B). Policz liczbę kolonii za pomocą oprogramowania OpenCFU (patrz Rysunek 2C).
    8. Dzień 18: Użyj płytki wysianej 500 komórkami. Napraw i zabarwij komórki zgodnie z opisem w kroku 3.2.7 (patrz Rysunek 2B). Policz liczbę kolonii (patrz Rysunek 2C).

4. Analiza Western blot za pomocą pBabe-EYFP-CENP-A

UWAGA: Zapoznaj się z poprzednio opisaną metodą13 dla analizy Western blot przy użyciu przeciwciał wskazanych w Rysunek 1B i Rysunek 2A i Tabela materiałów dla białek EYFP-CENP-A.

  1. Wyizoluj białka poprzez lizę komórek wyhodowanych z różnymi infekcjami wirusowymi. Następnie należy użyć 20 μg białka w jednym dołku żelu SDS PAGE. Przenieś białka do membrany PVDF, jak opisano wcześniej13.
  2. Przemyć membranę 3x po inkubacji przeciwciałami pierwszorzędowo-drugorzędowymi. Wykrywaj i analizuj prążki białkowe na membranie za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni i/lub obrazowania chemiluminescencyjnego w celu wykrycia immunoblotów. Wyniki te są pokazane w Rysunek 1B i Rysunek 2A.
    1. Aby uzyskać informacje na temat systemu obrazowania w podczerwieni do wykrywania i analizowania prążków białkowych, zobacz krok 4.2.1 w Dodatkowe pliki kodowania.
    2. Użyj imagera chemiluminescencyjnego, aby wykryć i przeanalizować prążki białek, patrz krok 4.2.2 w Dodatkowe pliki kodowania. W tym systemie należy użyć ultraczułego ulepszonego podłoża chemiluminescencyjnego (ECL) (tabela materiałów).
    3. Opcjonalnie użyj buforu do usuwania western blot, aby usunąć wstępnie inkubowane przeciwciała z membrany PVDF i ponownie umieścić je w różnych przeciwciałach do następnej tury analizy zachodniej. Empirycznie określ zoptymalizowany czas inkubacji i temperaturę do użycia.

5. Testy hodowli komórkowej, transfekcji i ubikwitylacji in vivo z użyciem pQCXIP-EYFP-CENP-A

UWAGA: Poziom białka EYFP-CENP-A wyrażony z wektora pQCXIP jest ~ 10x wyższy niż poziom białka endogennego CENP-A. Zastosowanie tego wektora ułatwia immunoprecypitację większej ilości białek EYFP-CENP-A, obserwację pasm ubikwitylacji EYFP-CENP-A oraz identyfikację ubikwitylacji białka CENP-A (EYFP-CENP-A) znakowanego EYFP poprzez analizę spektrometrii mas.

  1. Transfekcja do testów ubikwitylacji in vivo przy użyciu pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Wysiewać 36,2 x 105 komórek CENP-A-/F RPE-1 w 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej. Hodowla komórek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, empirycznie określ gęstość komórek, która ma być użyta podczas wysiewu. Przygotuj co najmniej 2 szalki na jedną próbkę immunoprecypitacyjną (IP), aby uzyskać co najmniej 1 mg białka całkowitego.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 18 godzin.
    3. Po 17 godzinach od wysiewu przygotować odczynniki do transfekcji.
    4. Przygotować roztwór A, mieszając 6,7 μg plazmidu z każdego pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabela 1) w 335 μl zredukowanej pożywki surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 6,7 μg plazmidu pCGN-HA-Ubikwityny (B2806) do wszystkich próbek.
      UWAGA: Wszystkie wektory są wymienione w tabeli 1.
    5. Przygotować roztwór B, mieszając 10,1 μl odczynników do transfekcji I i II, odpowiednio w 335 μl zredukowanej pożywki surowicy, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Opcjonalnym krokiem jest dodanie tylko 40,2 μl odczynnika do transfekcji III (polietylenoiminy [PEI]; 1,0 mg/ml) w roztworze B lub dodanie 40,2 μl odczynnika do transfekcji III oprócz odczynników do transfekcji I i II w roztworze B (tabela materiałów).
    6. Wymieszaj ze sobą roztwory A i B i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    7. Po jednokrotnym umyciu wyhodowanych komórek PBS, dodać mieszaninę roztworów A i B (tj. kompleksu DNA-lipid) bezpośrednio do każdej z pojedynczych 10-centymetrowych naczyń do hodowli tkankowych, które mają 3,35 ml μl zredukowanej pożywki surowicy.
      UWAGA: Końcowe stężenie wynosi 1,67 μg/ml plazmidu.
    8. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4,5 godziny. Po 4,5 godziny zmienić DMEM o wysokiej zawartości glukozy na wysoki poziom glukozy z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.
    9. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin po transfekcji. Zbierz komórki do przygotowania lizatów komórkowych.
  2. Preparat kulek białka A związanych przeciwciałem anty-GFP.
    1. Weź 25 μl (50% v/v) kulek białka A na jedną reakcję immunoprecypitacji (IP). Przemyć buforem A1 (tabela materiałów) co najmniej 3 razy w celu usunięcia EtOH i przygotować 50% roztwór buforem A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% nonidet P-40; 0,5% deoksycholan; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; kompletny odczynnik inhibitora proteazy wolny od EDTA).
    2. Dodaj 2,0 μl przeciwciała anty-GFP (Anti#76: przeciwciało domowej roboty) do przygotowanych powyżej kulek i dodaj 10x objętość buforu A1 porównując objętość kulek netto.
    3. Wykonywać obrót od końca do końca w temperaturze 4 °C przez 4-18 godzin. Optymalna długość czasu rotacji od końca do końca musi zostać określona empirycznie na podstawie skuteczności immunoprecypitacji.
    4. Odwirować kulki o masie 100 x g przez 1 minutę i usunąć niezwiązany supernatant. Dodaj bufor A1, aby ponownie przygotować 50% (v/v) roztwór kulek. Użyj 25 μl (50% v/v) tego roztworu na jedną reakcję IP.
  3. Immunoprecypitacja (IP) przy użyciu kulek sefarozy białka A związanych przeciwciałem anty-GFP.
    1. Lizować komórki otrzymane w kroku 5.1.9 w buforze A1 za pomocą sonikacji i procesu zamrażania i rozmrażania.
    2. Mierz stężenia białek i normalizuj ilości białka w różnych próbkach IP. Usuń 5% próbki z każdej probówki, aby uruchomić ją jako 5% próbkę wejściową w SDS-PAGE.
      UWAGA: Próbkę wejściową 5% można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostanie załadowana w ciągu jednego dnia.
    3. Wymieszaj resztę 95% lizatu z 25 μl (50% v/v) kulek białka A związanych z przeciwciałem anty-GFP, które zostało przygotowane w kroku 5.2. Wykonywać obrót od końca do końca w temperaturze 4 °C przez 4-18 h.
      UWAGA: Optymalna długość czasu dla rotacji od końca do końca musi być określona empirycznie.
    4. Odwirować kulki białka A z białkiem związanym z nim (tj. immunoprecypitatami) ze 100 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant. Przemyć immunoprecypitaty buforem A1 przez odwirowanie przy 100 x g przez 1 minutę. Wykonaj ten krok 4 razy.
    5. Wymieszaj 5% danych wejściowych i resztę 95% immunoprecypitatów z odpowiednio 2x i 4x buforem ładowania SDS-PAGE14. Gotuj te dwie próbki przez 5 minut, a następnie załaduj je na 10,0% denaturujący żel poliakryloamidowy SDS do elektroforezy na różnych torach. Do elektroforezy użyj większego żelu SDS-PAGE (np. 17 cm x 15 cm). Jeśli próbki są prowadzone w mniejszym żelu, może nie być możliwe zaobserwowanie wyraźnych/ostrych prążków ubikwitylacji.
    6. Przeprowadzić analizę western blot zgodnie z opisem w sekcji 4 przy użyciu przeciwciał wskazanych w poprzednim raporcie8. Wynik jest pokazany w Rysunek 2A.
    7. Użyj buforu do usuwania western blot, aby usunąć wstępnie inkubowane przeciwciała z błony PVDF i ponownie umieścić je w różnych przeciwciałach do następnej rundy analizy western blot.

6. Spektrometria mas do identyfikacji miejsca ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R

  1. Transfekcja do analizy spektrometrii mas przy użyciu pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Wysiewaj komórki CENP-A-/F RPE-1 w 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej. Sprawdź, czy gęstość komórek wynosi 36,2 x 105 komórek na naczynie. Hodowla komórek w DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Przygotować co najmniej 20 szalek na jedną próbkę immunoprecypitacyjną (IP), aby otrzymać co najmniej 10 mg białka całkowitego (patrz 5.3).
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, empirycznie określ gęstość komórek, która ma być używana podczas wysiewu.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 18 godzin. Przygotować odczynniki do transfekcji ~ 23 godziny po rozprowadzeniu (punkt 24 h to punkt 0 h transfekcji).
    3. Po upływie 17 godzin od wysiewu przygotować odczynniki do transfekcji i komórki transfekcyjne jak w (4.1.3). Transfekowane komórki zawierają pCGN-HA-ubikwitynę (B2806) i pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 48 godzin po transfekcji. Zbierz komórki do lizatów komórkowych.
    5. Lizować komórki w buforze A1 i przeprowadzić immunoprecypitację jak (5.2) i (5.3). Uruchom te dwa lizaty immunoprecypitacyjne w następujący sposób (6.1.6) i (6.1.7).
      UWAGA: W (6.1.6) uruchom próbkę w standardowych żelach tris-glicynowych. W (6.1.7) umieść próbkę w dostępnych na rynku żelach białkowych Bis-Tris o stężeniu 4%-12%. Zobacz także Dyskusja.
    6. Przechowywać jedną próbkę dla 10% wszystkich leków immunostrącających w celu potwierdzenia ubikwitylacji EYFP-CENP-A i precyzyjnego określenia położenia ubikwitynowanego EYFP-CENP-A, jak opisano w punkcie 5. Uruchom tę próbkę w standardowych żelach tris-glicynowych. SDS-PAGE i western blot wykonano jako (5.3).
    7. Zachowaj inną próbkę dla 90% wszystkich immunoprecypitentów do analizy spektrometrii mas. Uruchom tę próbkę w dwóch dołkach dostępnych na rynku żeli białkowych Bis-Tris o stężeniu 4%-12%. Wykonaj barwienie Coomassie na niebiesko za pomocą niebieskiego roztworu Coomassie. Wyciąć i wyciąć obszar żelu o masie 50-70 kDa (przypuszczalny region mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R). Użyj tego obszaru żelu do analizy spektrometrii mas.
  2. Analiza spektrometrii mas z wykorzystaniem mineralizacji w żelu.
    1. Pokrój w kostkę każdy interesujący Cię plasterek żelu na małe kawałki (1 mm2) i umieść go w 0,5 ml probówek o niskim poziomie wiązania białka.
    2. Przemyć 100 μL 50% (v/v) acetonitrylu w 25 mM NH4HCO3, wirować 10-15 min, odwirować, wyrzucić supernatant, powtórzyć 3x.
    3. Zagęścić próbkę za pomocą laboratoryjnego koncentratora próżniowego przez 30 minut, aby wysuszyć kawałki żelu.
    4. Dodaj 10 μl trypsyny o stężeniu 10 ng/μl do sekwencjonowania i pozwól kawałkom żelu nawodnić się przez 5 minut.
    5. Dodać 25 mM NH4HCO3 tylko tyle, aby przykryć kawałki żelu, trawić w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Przetrawiony supernatant przenieść do czystej silikonowanej probówki o pojemności 0,65 ml. Dodać 50% (v/v) acetonitrylu/5% (v/v) kwasu mrówkowego (30 μl lub tyle, aby pokryć), wirować przez 10 minut, wirować i przenieść do tej samej probówki ekstrakcyjnej. Powtórz 3 razy.
    7. Dodaj 10 μl acetonitrylu do kawałków żelu, wiruj 5 minut i odwiruj. Przenieść supernatant do tej samej probówki.
    8. Zagęścić próbki za pomocą laboratoryjnego koncentratora próżniowego do 2 μl, dodać 8 μl 3% (v/v) acetonitrylu / 2% (v/v) kwasu mrówkowego do próbki, wirować przez 15 minut i wirować do 16 000 x g przez 30 min. Próbki są gotowe do analizy spektrometrii mas.
    9. Przeprowadzić akwizycję danych MS za pomocą LC-MS/MS przy użyciu systemu chromatografii cieczowej (tabela materiałów) sprzężonej z instrumentem do spektrometrii mas (tabela materiałów).
    10. Wstrzyknąć 8 μl odtworzonej próbki do kolumny chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPLC).
    11. Oddzielić peptydy z gradientem 2-80% rozpuszczalnika B w ciągu 60 minut. Upewnij się, że gradient składa się z rosnącego procentu rozpuszczalnika B od 2% do 22% w ciągu 40 minut, od 22% do 35% rozpuszczalnika B w ciągu 12 minut, następnie do 80% rozpuszczalnika B w ciągu 4 minut, a na końcu trzymaj w 80% rozpuszczalnika B przez ostatnie 4 minuty. Ustaw stałe natężenie przepływu na 300 nL/min.
      UWAGA: Rozpuszczalnik A zawiera 0,1% kwasu mrówkowego i 2% acetonitrylu, rozpuszczalnik B zawiera 0,1% kwasu mrówkowego i 98% acetonitrylu. Wszystkie stężenia są podawane jako objętość/objętość.
    12. Zbieraj dane spektrometrii mas w trybie akwizycji zależnej od danych. Krótko mówiąc, zbieraj widma MS w zakresie 350–1500 m/z przez 250 ms. Wybierz 50 najbardziej intensywnych prekursorów z ładunkiem 2–5 w celu dalszej fragmentacji. Zbieraj widma MS/MS w zakresie 100–2000 m/z przez 100 ms, wyłącz jony prekursorowe z ponownej selekcji na 15 s.
    13. Aby przeszukać bazę danych, otwórz komercyjne oprogramowanie (patrz Spis materiałów), aby przeanalizować dane spektrometrii mas na pulpicie.
    14. Aby dokonać nowego wyszukiwania, kliknij przycisk "LC" w górnym menu. Następnie kliknij przycisk "Dodaj", aby przesłać oryginalne pliki surowych danych MS.
    15. Wybierz "Human Protein ID" w "Paragon Method" jako metodę przeszukiwania bazy danych. Przeszukaj oryginalne pliki surowych danych MS w bazie danych UniProt Homo Sapiens (zawierającej 160 566 sekwencji http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Ustaw parametry wyszukiwania w następujący sposób: wybierz trypsynę jako enzym trawienny, pozwól na maksymalnie 3 brakujące rozszczepienia, 4 modyfikacje i 2-5 ładunków na peptyd. Ustaw błąd masy do 20 ppm dla pierwszego wyszukiwania i 0,02 Da dla rozdrobnionych jonów. Określ progi współczynnika fałszywych odkryć (FDR) dla białek, peptydów i miejsc modyfikacji mniejszych niż 1%. Ustaw wszystkie inne parametry w oprogramowaniu na wartości domyślne (patrz Rysunek 3 dla analizy spektrometrii mas).
    17. Kliknij przycisk "Zapisz jako" po prawej stronie górnego menu, wybierz folder do przechowywania wyników wyszukiwania, wprowadź nazwę wyszukiwania i kliknij przycisk "Zapisz".
    18. Kliknij przycisk "Proces" po prawej stronie górnego menu, aby rozpocząć wyszukiwanie. Po zakończeniu wyszukiwania dane z wprowadzoną nazwą wyszukiwania zostaną automatycznie zapisane w wybranym folderze. Dane można łatwo otworzyć za pomocą oprogramowania F.
    19. Aby uzyskać widma MS/MS dowolnego określonego peptydu, kliknij dwukrotnie wyniki wyszukiwania, aby otworzyć je za pomocą oprogramowania F. Najpierw kliknij białko na liście białek u góry menu, a następnie kliknij peptyd na środku menu. MS/MS tego peptydu jest pokazane na dole menu.
    20. Aby wyeksportować i zapisać widma MS/MS, kliknij prawym przyciskiem myszy widma MS/MS na dole menu, wybierz kopiuj, a następnie wklej do odpowiedniego pliku, takiego jak PPT lub doc. format.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mutant EYFP-CENP-A K124 wykazuje ubikwitynację, interakcję z HJURP oraz brak defektów w lokalizacji centromerycznej i brak letalności komórkowej. W niniejszej pracy odtworzono system opisany przez Fachinetti i wsp. (2017)6: w diploidalnych ludzkich komórkach (RPE-1) posiadających jeden uszkodzony i jeden „floxed” allel CENP-A (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A był ekspresowany z wektora retrowirusowego pBabe-EYFP. W tym systemie ekspresja endogennego CENP-A z al...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy metody analizy spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji mutanta EYFP-CENP-A K124R, co sugeruje, że znakowanie EYFP indukuje ubikwitylację przy innej lizynie w zmutowanym białku CENP-A K124R8. W naszych wynikach udało nam się zidentyfikować ubikwitylację lizyny 306 (K306) w EYFP-CENP-A K124R, która odpowiada lizynie 56 (K56) w CENP-A poprzez analizę spektrometrii mas. Opisana tutaj analiza spektrometrii mas jest metodą mimiczną, ponieważ wcześniej zidentyfikowal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Chao-Jun Li z Centrum Badań nad Modelowymi Zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie za analizę spektrometrii mas. Dziękujemy Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawie i obecnym naukowcom z Model Animal Research Center, Nanjing University i Greehey Children's Cancer Research Institute za pomocną dyskusję, wskazówki eksperymentalne i odczynniki. Dziękujemy Donowi W. Clevelandowi, Daniele Fachinettiemu, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, Johnowi Thompsonowi, Lawrence'owi S. Kirschnerowi, Amruta Ashtekar, Benowi E. Blackowi, Glennisowi A. Logsdonowi, Kenjiemu Tago i Dawn S. Chandler za hojne dary w postaci odczynników. Y.N. był wspierany przez Fundusz Budowlany Prowincji Jiangsu "Podwójnie Pierwszej Klasy", Fundusz Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (SBK2019021248), Szesnasty Fundusz Sześciu Szczytów Wielkich Talentów Prowincji Jiangsu (TD-SWYY-001), Fundusz Prowincji Jiangsu "Program Stu Talentów Ekspertów Zagranicznych" (SBK2019010048) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych w Chinach (31970665). Badanie to było częściowo wspierane przez grant NCI R21 CA205659.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akcesoria/Narzędzia
0,5 ml probówki białkowe o niskim poziomie wiązaniaEppendorf022431064Do analizy spektrometrii mas
10-centymetrowa szalka do hodowli komórkowychBIOFIL/JET, Chiny70022410-dołkowa miska do hodowli tkankowych (Yohei lab, PN63)
6-dołkowy klaster do hodowli komórkowychFisher/Corning Incorporated07-200-83Hodowla 6-dołkowa płyta
CentriVapLABCONCO-Stacjonarnykoncentrator próżniowy do suchych peptydów próżniowych do analizy metodą spektrometrii mas
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μ mEksigent Technologies805-00120Kolumna do chromatografii cieczowej (RPLC) do analizy spektrometrii mas
HCX PL APO 100x soczewka zanurzeniowa w olejuLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Soczewka olejowa
HCX PL APO 63x Soczewka olejowaLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Soczewka olejowa
Immobilon-FL PVDF Membrana transferowaEMD MilliporeIPVH00010Do
zmotoryzowanego mikroskopu fluorescencyjnego Western blot Leica DM IRE2 Mikroskop fluorescencyjnynapędem silnikowym
Leica Kompaktowe źródło światła Leica EL6000LeicaZewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnego
Szkło Micro Cover (22 mm x 22 mm)Surgipath105Szkło nakrywkowe (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 aparat do elektroforezy w żelu poliakrylamidowymApogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010Aparatura do elektroforezy żelowej I do aplikacji większego żelu SDS-PAGE
nanoLC.2DEksigentTechnologies-systemchromatografii cieczowej do analizy spektrometrii
mas NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein GelsThermo FisherNP0335BOXDostępne na rynku żele białkowe Bis-Tris 4%-12% do analizy
spektrometrii masKonfokalny laserowy mikroskop skaningowy Olympus FLUOVIEW FV3000Olympus-Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ pliki do pobrania/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCDkameraHamamatsuC10600-10B
wiązaniapióra PAPAD100.1Do hydrofobowej bariery w barwieniu immunofluorescencyjnym
TKANKA NACZYNIE HODOWLANE 10 CMVWR25382-166Naczynie do hodowli tkankowych 10 cm
Pionowa elektroforeza do biegania z żelem (duży rozmiar)Junyi, ChinyJY-SCZ6 +Aparat do elektroforezy żelowej II do nakładania większego żelu SDS-PAGE (Yohei lab, PE23)
Mikroprowadnice VWR, matoweVWR International48312-013Mikroszkiełka
Przeciwciała pierwotne
Przeciwciało anty-CENP-AStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Mysie przeciwciało monoklonalne
Przeciwciało anty-CENP-BNovus BiologicalsH00001059-B01PMysie przeciwciało monoklonalne
anty-GAPDHABCAMab37168Królicze przeciwciało poliklonalne
anty-GAPDHInvitrogenPA1987Przeciwciało
poliklonalne królikaprzeciwciało anty-GFPANTI # 76 (przeciwciało domowej roboty)Przeciwciało poliklonalne królika
anty-HA (3F10)Roche11815016001Przeciwciało monoklonalne przeciw
HJURPProteintech Group15283– 1-APKrólicze przeciwciało poliklonalne
anty-UbikwitynaBethyl LaboratoriesA300-317A-1Królicze przeciwciało poliklonalne
Odczynniki
Bio-Rad Test białkowyBio-Rad500-0006Komercyjny odczynnik do oznaczania białek I do pomiaru stężenia białka (zgodny z 0,1% SDS)
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics Sonicator Microtip Step, solidny, gwintowany 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325Klakson zakłócający do sonikacji
Branson Ultrasonics sonikator Mikrokońcówka stożkowa 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185Mikrokońcówka do sonikacji
Bufor A1--20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoksycholan; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; kompletny odczynnik inhibitora proteazy wolny od EDTA
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche11-873-580-001Kompletny odczynnik inhibitora proteazy bez EDTA do buforu A1
Coomassie błękit brylantowy R-250BBI Nauki przyrodniczeCAS 6104-59-2Niebieski roztwór Coomassie do analizy spektrometrii mas
Roztwór fioletu krystalicznego (2,3% fioletu krystalicznego, 0,1% oksylanu amonu, 20% etanolu)SigmaI-AldrichHT90132-1LDo barwienia kolonii
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Do barwienia jądrowego
DMEM: F12 MediumATCC30-2006DMEM: F12 Średnia
płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, ciepło inaktywowany, pochodzenia amerykańskiegoLife Technologies/Gibco10082FBS (płodowa surowica bydlęca)
DMEM o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM o wysokiej zawartości glukozy
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000Odczynnik do transfekcji transfekcyjnej I do transfekcji chemicznej
Lipofectamin 3000, roztwór P3000Life Technologies/InvitrogenL3000Odczynnik do transfekcji chemicznej
MetanolFisherA412-4Fixation reagant
Beztłuszczowe mleko w proszku (zatwierdzony zamiennik mleka w proszku z goździków)Fisher ScientificNC9255871 (nr zamówienia 190915; Lot# 90629)Odtłuszczone mleko odtłuszczone
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Zredukowane podłoże surowicy
p-fenylenodiaminaSIGMA-SLDRICHP6001Do montażu podłoża
Penicylina, Streptomycyna; LiquidFisher/Gibco15-140Penicylina-streptomycyna
Poli-L-lizyna ROZTWÓRSIGMA-SLDRICHP 8920Poli-L-lizyna, 0,1% w/v, w wodzie
Polietylenoimina [PEI]; 1,0 mg/mlPolysciences23966– 2Odczynnik do transfekcji III do transfekcji chemicznej
Sefaroza białka A Koraliki CL-4BGE Healthcare/Amersham17-0963-03Białko A sefaroza CL-4B kulki do testów ubikwitylacji in vivo przy użyciu pQCXIP-EYFP-CENP-A
Przywróć bufor do usuwania Western BlotThermo ScientificPI21059Western Blot Stripping Buffer I
Trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111Do analizy spektrometrii
mas SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateThermo34095Ultraczuły ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL)
UltraPure Distilled WaterLife Technologies/Invitrogen/Gibco10977Sterylna woda klasy kulturowej
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-merkaptoetanol)--Bufor do usuwania Western Blot II
silne> przeciwciała drugorzędowe
Alexa Fluor 488 Goat Anti-RabbitIgG Life Technologies/InvitrogenA11008drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (przeciwciało drugorzędowe oczyszczone z powinowactwa)
Softwares
Acquisition FV31S-SW softwareOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Oprogramowanie analityczne FV31S-DTOlympus-Oprogramowanie Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ pliki do pobrania/#!dlOpen=%23detail847250519)
oprogramowanie cellSens Dimension Ver. 1. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0LI-COR Biosciences-Software
D Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-Obrazowanie chemiluminescencyjne do wykrywania immunoblot
System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLxLI-COR Biosciences-Systemobrazowania w podczerwieni do wykrywania immunoblot
OpenCFU saftware-Do liczenia kolonii (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab wersja 5.5.2. Oprogramowanie do obrazowania naukowegoImprovision/PerkinElmer-SoftwareA
Oprogramowanie ProteinPilot wersja 4.5AB SCIEX-SoftwareF do analizy spektrometrii mas
Ilość Jedno oprogramowanie do analizy 1-DBio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-Przyrząd
do spektrometrii masVolocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (akwizycja objętości)PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity wersja 6.3 Oprogramowanie do analizy obrazu 3D (kwantyfikacja objętości)PerkinElmer-SoftwareB2
z Miejsce< przeciwciało

Bibliografia

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Identyfikacja ubikwitynowaniaProtokół immunoprecypitacjiAnaliza LC-MS/MSMetoda wycinania z żeluTrawienie trypsynąKulki z białkiem APrzeciwciało anty-GFPTożsamość centromeryczna
Analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji ubikwitylacji CENP-A znakowanego EYFP (EYFP-CENP-A)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.