Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

DOI:

10.3791/61140

⸱

7 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowe składanie i składanie białek i kompleksów białkowych jest niezbędne dla funkcjonowania komórki. Komórki wykorzystują szlaki kontroli jakości, które korygują, sekwestrują lub eliminują uszkodzone białka w celu utrzymania zdrowego proteomu, zapewniając w ten sposób proteostazę komórkową i zapobiegając dalszym uszkodzeniom białek. Ze względu na nadmiarowość funkcji w sieci proteostazy, badania przesiewowe w kierunku wykrywalnych fenotypów za pomocą knockdownu lub mutacji w genach kodujących białka opiekuńcze w organizmie wielokomórkowym Caenorhabditis elegans skutkują w większości przypadków wykryciem drobnych fenotypów lub ich braku. Opracowaliśmy ukierunkowaną strategię badań przesiewowych, aby zidentyfikować białka opiekuńcze wymagane do określonej funkcji, a tym samym wypełnić lukę między fenotypem a funkcją. W szczególności monitorujemy nowe interakcje opiekuńcze za pomocą syntetycznych ekranów interakcji RNAi, zmniejszając ekspresję białka opiekuńczego, jeden opiekun na raz, u zwierząt z mutacją w genie kodującym białka opiekuńczego lub z nadmierną ekspresją białka opiekuńczego. Rozbijając dwa białka opiekuńcze, które indywidualnie nie prezentują żadnego ogólnego fenotypu, możemy zidentyfikować białka opiekuńcze, które pogarszają lub ujawniają określony fenotyp, gdy oba są zaburzone. Pokazujemy, że to podejście może zidentyfikować określone zestawy białek opiekuńczych, które działają razem w celu modulowania fałdowania białka lub kompleksów białkowych związanych z danym fenotypem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki radzą sobie z uszkodzeniami białek, stosując mechanizmy kontroli jakości, które naprawiają, sekwestrują lub usuwają wszelkie uszkodzone białka1,2. Składanie i składanie kompleksów białkowych jest wspierane przez molekularne białka opiekuńcze, zróżnicowaną grupę wysoce konserwatywnych białek, które mogą naprawiać lub sekwestrować uszkodzone białka3,4,5,6,7. W usuwaniu uszkodzonych białek pośredniczy układ ubikwityna-proteasom (UPS)8 lub maszyneria autofagii9 we współpracy z opiekunami10,11,12. Homeostaza białek (proteostaza) jest zatem utrzymywana przez sieci kontroli jakości składające się z maszyn do fałdowania i degradacji3,13. Jednak zrozumienie interakcji między różnymi składnikami sieci proteostazy in vivo jest poważnym wyzwaniem. Podczas gdy badania przesiewowe interakcji białko-białko dostarczają ważnych informacji na temat interakcji fizycznych i kompleksów opiekuńczych14,15, brakuje zrozumienia organizacji i mechanizmów kompensacyjnych w tkankowo specyficznych sieciach opiekuńczych in vivo.

Interakcje genetyczne są często używane jako potężne narzędzie do badania relacji między parami genów, które są zaangażowane we wspólne lub kompensacyjne szlaki biologiczne16,17,18. Takie zależności można zmierzyć, łącząc pary mutacji i określając ilościowo wpływ mutacji w jednym genie na nasilenie fenotypowe spowodowane mutacją w drugim genie16. Podczas gdy większość takich kombinacji nie wykazuje żadnego wpływu pod względem fenotypu, niektóre interakcje genetyczne mogą albo pogorszyć, albo złagodzić nasilenie mierzonego fenotypu. Mutacje obciążające obserwuje się, gdy fenotyp mutanta podwójnej delecji jest poważniejszy niż oczekiwany fenotyp obserwowany po połączeniu mutantów z pojedynczą delecją, co oznacza, że te dwa geny funkcjonują w równoległych szlakach, razem wpływając na daną funkcję. W przeciwieństwie do tego, mutacje łagodzące obserwuje się, gdy fenotyp mutanta podwójnej delecji jest mniej dotkliwy niż fenotyp obserwowany w przypadku mutantów z pojedynczą delecją, co oznacza, że te dwa geny działają razem jako kompleks lub uczestniczą w tym samym szlaku16,18. W związku z tym do identyfikacji interakcji genetycznych wykorzystano różne fenotypy, które można określić ilościowo, w tym szerokie fenotypy, takie jak śmiertelność, tempo wzrostu i wielkość lęgu, a także określone fenotypy, takie jak reportery transkrypcyjne. Na przykład Jonikas i in. polegali na reporterze stresu ER, aby zbadać interakcje sieci proteostazy niesfałdowanej odpowiedzi białkowej Saccharomyces cerevisiae ER za pomocą analiz delecji genów parami19.

Genetyczne analizy interakcji polegają na systematycznym krzyżowaniu mutacji delecji parami w celu wygenerowania obszernego zestawu podwójnych mutantów20. Jednak w modelach zwierzęcych, a w szczególności u C. elegans, to podejście na dużą skalę nie jest wykonalne. Zamiast tego zmutowane szczepy mogą być testowane pod kątem ich genetycznych wzorców interakcji poprzez regulację w dół ekspresji genów za pomocą interferencji RNA (RNAi)21. C. elegans to potężny system dla ekranów oparty na RNAi22,23. U C. elegans dostarczanie dwuniciowego RNA (dsRNA) odbywa się poprzez odżywianie bakteryjne, co prowadzi do rozprzestrzeniania się cząsteczek dsRNA do wielu tkanek. W ten sposób wprowadzone cząsteczki dsRNA wpływają na zwierzę za pomocą szybkiej i prostej procedury21. Badanie przesiewowe interakcji genetycznych przy użyciu RNAi może zatem ujawnić wpływ regulacji w dół zestawu genów lub większości genów kodujących C. elegans za pomocą bibliotek RNAi24. Na takim ekranie trafienia, które wpływają na zachowanie interesującego mutanta, ale nie szczepu dzikiego, są potencjalnymi modyfikatorami monitorowanego fenotypu25. Tutaj stosujemy kombinację mutacji i badań przesiewowych RNAi, aby systematycznie mapować specyficzne tkankowo interakcje opiekuńcze u C. elegans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek z pożywką dla nicieni dla RNAi

  1. Do butelki o pojemności 1 l dodać 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Peptonu, 17 g agaru i wody destylowanej do 1 l i autoklaw.
  2. Schłodzić butelkę do 55 °C.
  3. Dodać 25 ml 1 M KH2PO4 o pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 i 1 ml roztworu cholesterolu (Tabela 1), aby uzyskać pożywkę wzrostową nicieni (NGM).
  4. Dodać 1 ml ampicyliny (100 mg/ml) i 0,5 ml 1 M IPTG (Tabela 1), aby uzyskać roztwór NGM-RNAi.
    UWAGA: Powszechnie stosowane bakterie E. coli HT115(DE3) zawierają indukowaną przez IPTG polimerazę DNA T7, używaną do ekspresji plazmidów kodujących dsRNA. Plazmidy te kodują również oporność na ampicylinę.
  5. Wymieszaj ciepły roztwór, obracając butelkę.
  6. W kapturze lub stosując sterylne procedury, wlać roztwór NGM do płytek lub za pomocą pompy perystaltycznej dozować roztwór do płytek. Do tego ekranu użyj płytek 6-dołkowych, 12-dołkowych, 40 mm lub 60 mm. Agar powinien wypełniać około 2/3 głębokości płytki.
  7. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc na stole w temperaturze pokojowej, trzymając talerze przykryte. Płytki NGM do RNAi można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca.

2. Hodowla bakterii RNAi i wysiewanie płytek

  1. W kapturze lub stosując sterylne procedury, dodać 1 ml ampicyliny (100 mg/ml) i 2,5 ml tetracykliny (5 mg/ml) (Tabela 1) do wstępnie autoklawowanego 1 litra roztworu LB i wymieszać.
    UWAGA: Powszechnie stosowane bakterie E. coli HT115(DE3) są odporne na tetracykliny.
  2. W kapturze lub przy użyciu sterylnych procedur dodać 600 μl roztworu LB do każdej studzienki w 96-dołkowych płytkach sterylnych o głębokości 2 ml. Do dozowania pożywki najlepiej jest używać pipety wielokanałowej.
  3. Stosując sterylne procedury, zaszczepić studzienki bakteriami E. coli HT115(DE3) przekształconymi plazmidem kodującym dsRNA ukierunkowanym na gen zainteresowania lub pusty plazmid, jako kontrolę. Przykryć płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Biblioteki, które składają się z klonów bakteryjnych eksprymujących dsRNA, odpowiadających ~94% przewidywanych genów C. elegans, zostały wcześniej skonstruowane22,23 i są dostępne na rynku. Biblioteka opiekuńcza została skonstruowana przez Dr. Richarda Morimoto laboratory26.
  4. Stosując sterylne procedury, wysiewa się 75, 150 lub 250 μl bakterii na płytki 12-dołkowe, 40 mm i 6-dołkowe lub 60 mm RNAi NGM. Wyraźnie zaznacz nazwę docelowego genu na tabliczce. Bakterie powinny pokrywać 30-50% powierzchni agaru i nie powinny dotykać krawędzi płytki.
  5. Pozostaw talerze do wyschnięcia na stole przez co najmniej 2 dni w temperaturze pokojowej, trzymając talerze pod przykryciem.
    UWAGA: Płytki można inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Upewnij się, że wewnętrzne dołki są suche przed użyciem lub przechowywaniem płytek. W przypadku wszystkich celów długoterminowych (np. suszenia lub przechowywania) należy przechowywać talerze w ciemności. Wysuszone talerze z nasionami można przechowywać w temperaturze 4 °C do miesiąca.

3. Bezstresowa synchronizacja zarodków

  1. Użyj kilofa, aby przenieść około 100 jaj z niezsynchronizowanej płytki robaka na nowo zasianą płytkę NGM.
  2. Hodować zwierzęta przez 5 dni w temperaturze 15 °C, 3,5 dnia w temperaturze 20 °C lub 2,5 dnia w temperaturze 25 °C. Zwierzęta powinny osiągnąć pierwszy dzień składania jaj.
    UWAGA: Robaki są powszechnie uprawiane w temperaturze 20 °C. Jednak różne zmutowane szczepy chaperonów mogą wymagać określonych temperatur uprawy. Na przykład wiele szczepów wrażliwych na temperaturę jest uprawianych w temperaturze 15 °C, ale zmienia się je na 25 °C, aby uwidocznić ich fenotyp.
  3. Dodawać 1 ml buforu M9 (Tabela 1) powoli i z dala od trawnika bakteryjnego. Obróć płytkę tak, aby zderzak całkowicie zakrył płytkę. Następnie przechyl go na bok i usuń płyn z talerza, a następnie zmyj zwierzęta z talerza.
    UWAGA: W przypadku stosowania zwierząt wrażliwych na temperaturę lub mutantów opiekuńczych, najlepiej jest utrzymywać stosowane w protokole w temperaturze hodowli zwierząt.
  4. Powtórz krok 3.3 trzy razy lub do momentu, gdy wszystkie zwierzęta zostaną zmyte z talerza.
  5. Za pomocą standardowej plastikowej końcówki wytnij kwadrat agaru z umytego talerza, na którym skoncentrowane są jajka i umieść kawałek agaru na nowo wysianej płytce NGM.
    UWAGA: ~ 200 jaj jest potrzebnych do wyprodukowania wystarczającej ilości zwierząt składających jaja; Zbyt wiele zwierząt zjada bakterie zbyt szybko. Niski poziom pożywienia może mieć wpływ na proteostazę27.
  6. Hodować zwierzęta przez 5 dni w temperaturze 15 °C, 3,5 dnia w temperaturze 20 °C lub 2,5 dnia w temperaturze 25 °C. W tym momencie talerze należy przykryć zsynchronizowanymi jajkami.
    UWAGA: Zwierzęta można przenieść na nową płytę na krótki czas, aby uzyskać bardziej rygorystyczną synchronizację. Jednak ważne jest, aby używać tylko dorosłych na wczesnych etapach składania jaj, ponieważ zwierzęta mogą zatrzymać jaja w macicy, wpływając na synchronizację.
  7. Powoli dodawaj 1 ml buforu M9 z dala od trawnika bakteryjnego.
  8. Obróć płytkę tak, aby zderzak całkowicie zakrył płytkę. Następnie przechyl go na bok i usuń płyn z talerza i zmyj zwierzęta z talerza.
  9. Powtórz krok 3.7 trzy razy lub do momentu, gdy wszystkie zwierzęta zostaną zmyte z płytki.
  10. Dodać 1 ml buforu M9 i użyć skrobaka do komórek, aby uwolnić jaja z płytki.
  11. Zebrać bufor M9 zawierający jaja z płytek.
  12. Odwirować bufor M9 zawierający jaja o masie 3 000 x g przez 2 minuty.
  13. Usunąć supernatant i dodać bufor M9 do uzyskania objętości 1 ml.
  14. Ponownie zawieś jaja, aby rozbić wszelkie kawałki jaj i bakterie.
  15. Powtórz procedurę prania opisaną w krokach 3.11-3.13 pięć razy. Granulki jaj powinny być białe. Jeśli nadal jest żółty/brązowy, powtarzaj pranie, aż do uzyskania białej granulki.
    UWAGA: Bakterie, które pozostają na jajach, mogą zanieczyścić bakterie wykazujące ekspresję dsRNA.
  16. Usuń większość supernatantu, pozostawiając około 200 μl. Zsynchronizowane jaja można wykorzystać do badań przesiewowych RNAi.

4. Typowe testy fenotypowe

  1. Hodowla zwierząt podczas eksperymentów
    1. Umieść kroplę ~30 jaj w pobliżu trawnika bakteryjnego na każdej talerzu wysiewanej przez RNAi. Dla porównania, umieść również ~30 jaj na talerzach wysianych pustymi bakteriami zawierającymi wektory (L4440).
    2. Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem na płytkach nasiennych RNAi NGM. Czas trwania doświadczenia będzie zależał od etapu, na którym zwierzęta mają być monitorowane, oraz od temperatury hodowli. Dostosuj temperaturę uprawy, gdy używasz zmutowanych zwierząt wrażliwych na temperaturę. Dostosuj czas trwania uprawy w przypadku stosowania zmutowanych zwierząt opóźnionych w rozwoju.
      UWAGA: Chociaż czas może się różnić, gdy zwierzęta osiągną dorosłość, składanie jaj (i wynikające z tego szybkie spożycie pokarmu), a także zależne od wieku załamanie proteosty28, mogą mieć wpływ na wyniki. Dlatego zaleca się ocenianie zwierząt przed rozpoczęciem składania jaj (1. dzień dorosłości). Zwierzęta w typie dzikim osiągają ten etap po 4,5 dniu w temperaturze 15 °C, po 3 dniach w temperaturze 20 °C lub po 2 dniach w temperaturze 25 °C.
    3. Liczba użytych powtórzeń będzie zależała od wielkości badanego zestawu genów. W przypadku biblioteki opiekuńczej (97 genów) powtórz eksperymenty co najmniej cztery razy. Wielkość populacji zależy od zastosowanego testu. W omówionych tutaj testach behawioralnych uzyskaj wynik >15 zwierząt na warunek eksperymentalny w każdym powtórzeniu. Dane i analizy statystyczne również w dużym stopniu zależą od rodzaju zastosowanego testu. Dane w omawianych tutaj testach można przedstawić jako średnie ± SEM.
    4. Porównaj zwierzęta kontrolowane RNAi i puste wektory jako niezależne populacje. Wartości P można obliczyć za pomocą jedno- lub dwukierunkowej ANOVA, w zależności od badanych zmian, a mianowicie samego pogorszenia lub złagodzenia lub obu. Badając pojedynczą obróbkę RNAi w porównaniu z kontrolą, wartości P można obliczyć za pomocą jednokierunkowego lub dwukierunkowego testu sumy rang Manna-Whitneya. Oprócz istotności statystycznej należy wziąć pod uwagę próg dla trafień oparty na stopniu wpływu na fenotyp.
  2. Zahamowanie/opóźnienie rozwoju
    1. Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, dopóki zwierzęta hodowane na pustych bakteriach kontrolnych zawierających wektory nie osiągną dorosłości, ale przed rozpoczęciem składania jaj.
    2. Monitoruj zwierzęta za pomocą mikroskopu stereoskopowego i policz liczbę larw i dorosłych, aby ocenić procent zwierząt opóźnionych w rozwoju. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolnych zawierających wektory. Leczenie RNAi hsp-1 lub hsp-90 powoduje zatrzymanie rozwoju zwierząt typu dzikiego i może być stosowane jako kontrola pozytywna.
    3. Aby ocenić procent zwierząt opóźnionych w rozwoju w czasie, powtórz krok 4.2.2.
      UWAGA: Jeśli na talerzu znajdują się dorosłe osobniki składające jaja, przenieś opóźnione w rozwoju zwierzęta na nową płytkę NGM-RNAi znakowaną dla tego samego genu docelowego, aby uniknąć pomylenia z potomstwem.
  3. Wady bezpłodności lub nieśności jaj
    1. Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, aż zwierzęta wyhodowane na pustych bakteriach kontrolujących wektory zaczną składać jaja.
    2. Monitoruj zwierzęta za pomocą mikroskopu stereoskopowego i oceń procent zwierząt, które nie mają widocznych jaj w macicy. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolujących wektory.
    3. Alternatywnie, monitoruj zwierzęta za pomocą mikroskopu stereoskopowego i oceń procent zwierząt z macicą pełną jaj, zdefiniowaną jako fenotyp wadliwego składania EGg (Egl-d)29.
  4. Śmiertelność zarodków
    1. Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, aż zwierzęta zaczną składać jaja.
    2. Przełóż ~100 jajek na pusty talerz. Rozłóż jajka w rzędach, aby uprościć liczenie.
    3. Oceń procent niewyklutych jaj na talerzu po 24-48 godzinach. Dla porównania, porównaj z jajami zwierząt leczonych pustymi bakteriami kontrolującymi wektory.
  5. Test paraliżu
    1. W przypadku osobników dorosłych w dniu 1 należy hodować zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, aż zwierzęta hodowane na pustych bakteriach kontrolujących wektory osiągną dorosłość, ale przed rozpoczęciem składania jaj.
    2. Narysuj linię na odwrocie zwykłej płytki agarowej NGM za pomocą cienkiego markera.
    3. Umieść 5-10 zwierząt na zaznaczonej linii.
    4. Ustaw minutnik i poczekaj 10 minut.
    5. Oceń procent zwierząt pozostałych na linii jako sparaliżowane robaki. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolujących wektory. Zwierzęta typu dzikiego leczone unc-45 RNAi wykazują fenotyp ciężkiego paraliżu i mogą być stosowane jako kontrola pozytywna.
      UWAGA: Ten test wyróżnia zwierzęta wykazujące średni lub ciężki paraliż. Takie zwierzęta zwykle leżą prosto na talerzu, a nie mają zwykłego zakrzywionego kształtu. Co więcej, wokół głów sparaliżowanych robaków widoczna jest plama oczyszczona z bakterii.
  6. Test młócenia
    1. Hoduj zwierzęta zsynchronizowane z wiekiem, jak w kroku 4.1, dopóki zwierzęta wyhodowane na pustych bakteriach kontrolujących wektory nie osiągną dorosłości, ale przed rozpoczęciem składania jaj.
    2. Odpipetować 100 μl buforu M9 w temperaturze hodowli zwierząt na 96-dołkową płytkę.
    3. Umieść ~15 robaków, po jednym na studzienkę, w studniach zawierających bufor M9.
    4. Pozwól zwierzętom dostosować się przez 5 minut.
    5. Zbadaj każde zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym, uruchom minutnik odliczający 15 s i policz liczbę zgięć ciała, które każde zwierzę wykonuje w tym czasie. Zliczane wartości można znormalizować do zgięć ciała na minutę. Dla porównania, porównaj ze zmutowanymi zwierzętami hodowanymi na pustych bakteriach kontrolujących wektory.
      UWAGA: Ten test ruchliwości jest bardzo czuły i może wykryć bardzo łagodne różnice między zabiegami. Jednak ruchliwość cieczy i ruchliwość na agarze mogą się różnić.

5. Walidacja knockdownu białka

  1. Umieść 250-300 zsynchronizowanych jaj na 60-milimetrowej płytce NGM-RNAi wysianej odpowiednimi bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA lub bakteriami zawierającymi pusty wektor (L4440).
    UWAGA: Knockdown RNAi może spowodować nieprawidłową akumulację zarodków, brak zarodków lub zatrzymanie rozwoju, które może wpływać na ekspresję genów. Należy to wziąć pod uwagę przy określaniu wieku zwierząt, które mają być badane.
  2. W przypadku dorosłych osobników w dniu 1 hodować zwierzęta przez 4,5 dnia w temperaturze 15 °C, 3 dni w temperaturze 20 °C lub 2 dni w temperaturze 25 °C.
  3. Zbierz i przenieś łącznie 200 młodych dorosłych zwierząt do nakrętki probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 200 μl PBS-T.
    UWAGA: W przypadku stosowania zwierząt wrażliwych na temperaturę lub mutantów opiekuńczych, najlepiej jest utrzymywać stosowane w protokole w temperaturze hodowli zwierząt.
  4. Ostrożnie zamknij nakrętkę i odwiruj przy 1 000 x g przez 1 minutę.
  5. Dodać 800 μl PBS-T (Tabela 1) i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.
  6. Ostrożnie usuń górne 900 μl.
  7. Powtórz kroki 5.4-5.6 trzy razy.
  8. Usunąć 900 μl, pozostawiając 100 μl roztworu zawierającego 200 robaków.
  9. Dodać 25 μl 5-krotnego buforu do pobierania próbek (tabela 1).
  10. Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 92°C, wstrząsając z prędkością 1000 obr./min. Próbki można następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  11. Załaduj 20 μl każdej próbki i uruchom na żelu SDS-PAGE.
  12. Przeprowadzić analizę western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu określenia względnej stabilności białka.
  13. Określ intensywność pasm za pomocą oprogramowania densytometrycznego, takiego jak ogólnodostępny moduł żelowy ImageJ. Znormalizować wszystkie wartości do wartości zmierzonych w próbce kontrolnej (próbkach kontrolnych).
    UWAGA: Celem knockdownu RNAi w naszych badaniach przesiewowych jest obniżenie poziomu białka w określonym chaperonie/ko-chaperonie. Dlatego najlepszym sposobem oceny skuteczności knockdownu RNAi jest analiza western blot. Wymaga to specyficznych przeciwciał. Alternatywnie, qPCR może być stosowany do ilościowego określania poziomów mRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używanie wrażliwych na temperaturę mutacji w UNC-45 do badania pod kątem nasilających lub łagodzących interakcji w warunkach odpowiednio dopuszczających lub ograniczających<br /> Montaż i utrzymanie mięśni oferuje skuteczny system do badania interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanki. Jednostka funkcjonalna mięśni kurczliwych, sarkomer, przedstawia krystaliczny układ białek strukturalnych i regulatorowych. Stabilność białka motorycznego miozyny i jej wbudowywanie w grube włókna kurczliwych sa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wciąż brakuje zintegrowanego obrazu sieci proteostazy, który odzwierciedlałby, w jaki sposób jest ona zorganizowana i funkcjonuje w różnych komórkach i tkankach metazoan. Aby zaradzić temu brakowi, potrzebne są szczegółowe informacje na temat interakcji różnych składników tej sieci, takich jak molekularne białka opiekuńcze, w określonych tkankach w trakcie rozwoju i starzenia się. Pokazaliśmy tutaj, w jaki sposób zastosowanie perturbacji tkankowo pozwoliło nam zbadać sieć opiekuńczą w danej tkance. Aby zbadać specyficzne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Centrum Genetyki Caenorhabditis, finansowanemu przez NIH National Center for Research Resources (NCRR), za niektóre szczepy nicieni. Przeciwciała monoklonalne opracowane przez H.F. Epsteina uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez Wydział Biologii Uniwersytetu Iowa. Badania te były wspierane przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej (grant nr 278/18) oraz przez grant z izraelskiego Ministerstwa Nauki i Technologii oraz Ministerstwa Spraw Zagranicznych i Współpracy Międzynarodowej, Generalnej Dyrekcji ds. Promocji Kraju, Republiki Włoskiej (grant nr 3-14337). Dziękujemy członkom laboratorium Ben-Zvi za pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweSPLBA3D16B
Płytki 40 mmGreiner Bio-one627160
Płytki 60 mmGreiner Bio-one628102
Płytki 6-dołkoweThermo Scientific 140675
96 mL 128,0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
niebieski bromofenolSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
Aparatfotograficzny Qimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
KonfokalnyLeicaDM5500
Filtr (0,22 &mikro; m)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Prezent od laboratorium Morimoto
Przeciwciało Myosin MHC A (MYO-3)Hybridoma Bank5-6
Na2HPO4· 7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Pompa do nalewania płytIntegrarobi to p920
Biblioteka RNAi ChaperoneNA
SDSVWR Life Science0837-500
ß- merkaptoetanolBio world41300000-1
stereomikroskopLeicaMZ6
TetracyklinaDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21(2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891(2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644(2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485(2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840(2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531(2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921(2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218(2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Syntetyczny skrining RNAiletalno embrionalnatest parali uanaliza Western blotwalidacja wyciszenia bia kaskrining interakcji genetycznychgen HSP6

Powiązane artykuły