Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie falowodów w trybie zerowym do mikroskopii pojedynczych cząsteczek o wysokim stężeniu

DOI:

10.3791/61154

⸱

12 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj jest metoda litografii nanosferycznej do równoległego wytwarzania falowodów w trybie zerowym, które są układami nanoapertur w pokrytym metalem szkiełku nakrywkowym do mikroskopii szklanej do obrazowania pojedynczych cząsteczek przy stężeniach fluoroforów od nano do mikromolowych. Metoda wykorzystuje samoorganizację kryształów koloidalnych w celu stworzenia szablonu falowodu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W enzymologii fluorescencji pojedynczej cząsteczki, fluorescencja tła z oznakowanych substratów w roztworze często ogranicza stężenie fluoroforu do zakresów piko- do nanomolowych, kilka rzędów wielkości mniej niż wiele fizjologicznych stężeń ligandów. Nanostruktury optyczne zwane falowodami w trybie zerowym (ZMW), które mają otwory o średnicy 100−200 nm wykonane z cienkiego metalu przewodzącego, takiego jak aluminium lub złoto, umożliwiają obrazowanie pojedynczych cząsteczek w mikromolowych stężeniach fluoroforów poprzez ograniczenie wzbudzenia światła widzialnego do efektywnych objętości zeptolitrów. Jednak zapotrzebowanie na drogi i specjalistyczny sprzęt do nanowytwarzania wykluczyło powszechne stosowanie ZMW. Zazwyczaj nanostruktury, takie jak ZMW, uzyskuje się przez bezpośrednie zapisywanie przy użyciu litografii wiązką elektronów, która jest sekwencyjna i powolna. W tym przypadku litografia koloidalna lub nanosferyczna jest stosowana jako alternatywna strategia tworzenia masek w skali nanometrowej do produkcji falowodów. W niniejszym raporcie szczegółowo opisano to podejście, wraz z praktycznymi rozważaniami dotyczącymi każdego etapu. Metoda ta pozwala na równoległe wytwarzanie tysięcy aluminiowych lub złotych ZMW, o końcowych średnicach i głębokościach falowodu 100−200 nm. Wymagany jest tylko zwykły sprzęt laboratoryjny i parownik termiczny do osadzania metalu. Czyniąc ZMW bardziej dostępnymi dla społeczności biochemicznej, metoda ta może ułatwić badanie procesów molekularnych w stężeniach i szybkościach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki jednocząsteczkowe, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) lub spektroskopia korelacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki (FCS) są potężnymi narzędziami dla biofizyki molekularnej, pozwalającymi na badanie dynamicznych ruchów, konformacji i interakcji poszczególnych biomolekuł w procesach takich jak transkrypcja1,2,3, tłumaczenie4,5,6, i wiele innych7. W przypadku smFRET powszechną metodą jest mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), ponieważ wiele cząsteczek na uwięzi może być obserwowanych w czasie, a fala ulotna generowana przez TIR jest ograniczona do obszaru 100−200 nm przylegającego do szkiełka nakrywkowego8. Jednak nawet przy tym ograniczeniu objętości wzbudzenia, interesujące nas fluorofory nadal muszą być rozcieńczone do zakresów pM lub nM, aby wykryć sygnały pojedynczej cząsteczki powyżej fluorescencji tła9. Ponieważ stałe Michaelisa-Mentena enzymów komórkowych mieszczą się zazwyczaj w zakresie od μM do mM10, reakcje biochemiczne w badaniach pojedynczych cząsteczek są zwykle znacznie wolniejsze niż te w komórce. Na przykład synteza białek zachodzi z prędkością 15−20 aminokwasów na sekundę w E. coli11,12, podczas gdy większość rybosomów prokariotycznych w eksperymentach smFRET ulega translacji w tempie 0,1−1 aminokwasu na sekundę13. W syntezie białek struktury krystaliczne i smFRET na zablokowanych rybosomach wykazały, że transferowe RNA (tRNA) wahają się między stanami "hybrydowymi" i "klasycznymi" przed etapem translokacji tRNA-mRNA14,15. Jednakże, gdy fizjologiczne stężenia czynnika translokacji GTPazy, EF-G, były obecne, zaobserwowano inną konformację, pośrednią między stanami hybrydowymi i klasycznymi, w smFRET6. Badanie dynamicznych procesów molekularnych zachodzących w tempie i stężeniach podobnych do tych zachodzących w komórce jest ważne, ale pozostaje wyzwaniem technicznym.

Strategia zwiększania stężenia substratu fluorescencyjnego polega na użyciu metalowych, podwidocznych apertur o długości fali, zwanych falowodami w trybie zerowym (ZMW), do generowania ograniczonych pól wzbudzenia, które selektywnie wzbudzają biomolekuły zlokalizowane w aperturach16 (Rysunek 1). Otwory mają zazwyczaj średnicę 100−200 nm i głębokość 100−150 nm17. Powyżej granicznej długości fali związanej z rozmiarem i kształtem studni (λc ≈ 2,3 razy większa średnica dla falowodów kołowych z wodą jako ośrodkiem dielektrycznym18), w falowodzie nie są dozwolone żadne mody propagacji, stąd termin falowody w trybie zerowym. Jednak oscylujące pole elektromagnetyczne, zwane falą ulotną, wykładniczo zanikające w intensywności, nadal drąży tunel na niewielką odległość w falowodzie18,19. Chociaż podobne do fal ulotnych TIR, fale ulotne ZMW mają krótszą stałą zaniku, co skutkuje efektywnym obszarem wzbudzenia 10−30 nm w falowodzie. Przy stężeniach mikromolowych ligandów znakowanych fluorescencyjnie tylko jedna lub kilka cząsteczek jest jednocześnie obecnych w obszarze wzbudzenia. To ograniczenie objętości wzbudzenia i wynikające z niego zmniejszenie fluorescencji tła umożliwia obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych cząsteczek w biologicznie istotnych stężeniach. Zostało to zastosowane do wielu systemów20, w tym pomiary FCS dyfuzji pojedynczego białka21, pomiary pojedynczej cząsteczki FRET ligand-białko22 i interakcje białko-białko23, oraz spektro-elektrochemiczne pomiary zdarzeń pojedynczej wymiany molekularnej24.

ZMW zostały wyprodukowane przez bezpośrednie modelowanie warstwy metalu za pomocą frezowania wiązką jonów25,26 lub litografia wiązką elektronów (EBL), a następnie trawienie plazmowe16,27. Te bezmaskowe metody litografii tworzą falowody szeregowo i zazwyczaj wymagają dostępu do specjalistycznych urządzeń do nanoprodukcji, co zapobiega powszechnemu zastosowaniu technologii ZMW. Inna metoda, ultrafioletowa litografia nanoimprintowa lift-off28, wykorzystuje formę do szkiełka kwarcowego do wciskania odwróconego szablonu ZMW na folię rezystancyjną, taką jak stempel. Chociaż ta metoda jest bardziej uproszczona, nadal wymaga EBL do produkcji formy kwarcowej. W artykule przedstawiono protokół prostej i niedrogiej metody wytwarzania szablonowego, która nie wymaga frezowania EBL ani wiązką jonów i opiera się na ścisłym upakowaniu nanosfer w celu utworzenia maski litograficznej.

Nanosfera lub "naturalna" litografia, która została po raz pierwszy zaproponowana w 1982 roku przez Deckmana i Dunsmuira29,30, wykorzystuje samoorganizację monodyspersyjnych cząstek koloidalnych, od dziesiątek nanometrów do dziesiątek mikrometrów31, do tworzenia szablonów do modelowania powierzchni poprzez trawienie i/lub osadzanie materiałów. Dwuwymiarowe (2D) lub trójwymiarowe (3D) rozszerzone układy okresowe cząstek koloidalnych, określane jako kryształy koloidalne, charakteryzują się jasną opalizacją wynikającą z rozpraszania i dyfrakcji32. Chociaż ta metodologia maskowania jest mniej rozpowszechniona niż wiązka elektronów lub fotolitografia, jest prosta, tania i łatwa do skalowania w dół w celu uzyskania rozmiarów elementów poniżej 100 nm.

Kierowanie samoorganizacją cząstek koloidalnych decyduje o sukcesie użycia kryształów koloidalnych jako masek do modelowania powierzchni. Jeśli rozmiar i kształt cząstek są jednorodne, cząstki koloidalne mogą być łatwo samoorganizujące się za pomocą sześciokątnego upakowania, napędzanego przez zubożenie entropii33. Odparowanie wody po nałożeniu powłoki kroplowej jest skuteczną drogą do osadzania cząstek koloidalnych, chociaż inne metody obejmują powlekanie zanurzeniowe34, powlekanie wirowe35, osadzanie elektroforetyczne36 i konsolidację na granicy faz powietrze-woda37. Przedstawiony poniżej protokół opiera się na metodzie sedymentacji przez parowanie, która była najprostsza do wdrożenia. Trójkątne szczeliny między ciasno upakowanymi kulkami polistyrenowymi tworzą otwory, w których można pokryć metalową protektor, formując słupki (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 1). Krótkie wyżarzanie ściegów przed tym etapem dostosowuje kształt i średnicę tych słupków. Koraliki są usuwane, wokół słupków nakładana jest ostatnia warstwa metalu, a następnie słupki są usuwane. Po dwóch etapach osadzania metalu na koloidalnej nanomasce, usunięciu słupków pośrednich i modyfikacji chemii powierzchni w celu pasywacji i wiązania, macierze ZMW są gotowe do użycia do obrazowania pojedynczych cząsteczek. Bardziej szczegółową charakterystykę właściwości optycznych ZMW po wyprodukowaniu można znaleźć w towarzyszącym artykule38. Oprócz parownika termicznego do osadzania metali z fazy gazowej nie są wymagane żadne specjalistyczne narzędzia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie kroki można wykonać w ogólnej przestrzeni laboratoryjnej.

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

  1. Aby zapewnić czystą powierzchnię do osadzania parnego cząstek koloidalnych, umieść szkiełka nakrywkowe ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 24 x 30 mm (grubość 0,16−0,19 mm) w rowkowanych wkładkach słoika do barwienia ze szkła coplin w celu czyszczenia.
    UWAGA: Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe stoją pionowo i są dobrze oddzielone, tak aby wszystkie powierzchnie były wyraźnie odsłonięte podczas procesu czyszczenia.
  2. Wlej tyle acetonu do słoika do barwienia, aby przykryć szkiełka nakrywkowe, nałóż pokrywę i poddaj sonikacji przez 10 minut w temperaturze 40 °C.
  3. Wylej aceton i spłucz szkiełka nakrywkowe, napełniając słoik do barwienia destylowanymH2Oi wylewając wodę. Powtórz jeszcze 2 razy.
  4. Powtórzyć sonikację acetonu (kroki 1.2 i 1.3) jeszcze raz.
  5. Wlać do słoika tyle 200 mM KOH, aby przykryć szkiełka nakrywkowe i sonizować pod przykryciem przez 20 minut w temperaturze 40 °C.
    UWAGA: KOH lekko wytrawia szkło.
  6. Szkiełka nakrywkowe spłukać destylowanym H2O 6 razy.
  7. Dodać etanol, aby przykryć szkiełka nakrywkowe, dodać pokrywkę i sonikować przez 10 minut w temperaturze 40 °C.
  8. Opłucz szkiełka nakrywkowe destylowanymH2O3 razy.
  9. Podnieś każde szkiełko nakrywkowe na krawędzi za pomocą delikatnych kleszków i osusz szkiełka nakrywkowe gazemN2. Dotykaj tylko krawędzi szkiełka nakrywkowego. Umieść każde z wysuszonych, oczyszczonych szkiełek nakrywkowych na osobnej, czystej szalce Petriego.

2. Osadzanie się parowania kulek polistyrenowych

  1. Aby stworzyć koloidalną maskę krystaliczną dla matrycy ZMW, odwiruj 50 μl o średnicy 1 μm, niefunkcjonalizowane kulki polistyrenowe (2,5% w/v w wodzie) przy 15 000 x g, 25 °C przez 5 min.
    UWAGA: Przed pipetowaniem kulek roztwór podstawowy należy na krótko przepłukać wirem na wypadek, gdyby kulki osiadły na dnie butelki.
  2. Wyrzucić supernatant, pozostawiając jak najmniej wody.
    UWAGA: Woda resztkowa może zmienić właściwości parowania reformulacji etanolu39, więc usunięcie niewielkiej ilości kulek w celu usunięcia całej wody jest dopuszczalne.
  3. Zawiesić kulki z kroku 2.2 w 50 μl rozpuszczalnika 1:400 TritonX-100:etanol. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać kulki z rozpuszczalnikiem.
    UWAGA: TritonX-100: rozpuszczalnik etanolowy należy po użyciu uszczelnić folią parafinową i przygotowywać na świeżo raz w miesiącu. Koraliki mają tendencję do przylegania do ścianek plastikowego naczynia, takiego jak probówka do mikrowirówki, więc pipetuj wzdłuż boków, aby upewnić się, że wszystkie kulki są ponownie zawieszone.
  4. Aby przygotować komorę wilgotnościową do osadzania, umieść 6 szalek Petriego, każda z jednym szkiełkiem nakrywkowym, na ławce w linii z lekko uchylonymi pokrywkami. W każdym naczyniu przesuń szkiełko nakrywkowe na otwarty obszar, tak aby szkiełka nakrywkowe były wystawione na działanie środowiska, gdy wilgotność wzrośnie w następnym kroku.
  5. Umieść higrometr i mały wentylator elektryczny wyśrodkowane za szalkami Petriego.
  6. Zapisz początkową wilgotność względną (RH) w laboratorium. Napełnij zlewkę o pojemności 200 ml 150-200 ml wody o temperaturze ~75 °C i umieść ją za wentylatorem.
  7. Włącz wentylator i przykryj szalki Petriego, wentylator, zlewkę i higrometr przewróconym, przezroczystym plastikowym pojemnikiem do przechowywania (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Niech wilgotność względna w komorze wzrośnie do 70−75%, co zwykle zajmuje 5−10 min.
    UWAGA: Jeśli wilgotność względna w laboratorium otoczenia jest niska (poniżej ~50%), pozwól komorze osiągnąć wyższą wilgotność względną, ale nie wyższą niż 80%, aby skompensować utratę wilgoci podczas osadzania (patrz poniżej).
  9. Gdy wilgotność względna osiągnie 70−75%, zapisz wilgotność względną i lekko podnieś plastikowy pojemnik do przechowywania, aby szybko założyć pokrywy na szalki Petriego, co zapobiega nadmiernemu zwilżeniu szkiełek nakrywkowych.
    UWAGA: W wyniku nawilżania temperatura w komorze będzie nieco wyższa niż temperatura pokojowa, zwykle 25−26 °C. Jeśli na szkiełkach nakrywkowych widoczna jest wilgoć, oznacza to, że szklane powierzchnie są zbyt mokre. Komercyjny schowek na rękawiczki może uprościć tę część protokołu.
  10. Niech wilgotność względna w komorze nadal wzrasta do 85%. W tym momencie zanotować wilgotność względną w komorze wilgotnościowej i odpipetować 5 μl zawiesiny kulek na środek każdego szkiełka nakrywkowego.
  11. Zamknij komorę i szalki Petriego po każdym osadzaniu, aby zminimalizować utratę wilgoci. Staraj się ukończyć wszystkie 6 depozycji w ciągu 2 minut.
  12. Zapisz wilgotność względną w komorze po osadzaniu.
    UWAGA: Wilgotność względna po osadzeniu pomoże ocenić, jak szybko wilgoć została utracona podczas osadzania, co zależy od warunków otoczenia w laboratorium. W przypadku typowego udanego przebiegu komora rozpocznie się przy 85% wilgotności względnej przed osadzaniem i zakończy się przy wilgotności względnej 70-75% po osadzaniu.
  13. Pozwól kropelkom kulki rozprzestrzenić się i wyschnąć przez 5 min.
    UWAGA: Jeśli kryształy koloidalne mają wiele lub wielowarstwowych obszarów, to prawdopodobnie komora była odpowiednio zbyt wilgotna lub sucha. Dostosuj wilgotność względną, przy której należy zamknąć szalki Petriego i rozpocząć osadzanie (więcej informacji na temat optymalizacji można znaleźć w sekcji dotyczącej wyników).

3. Wyżarzanie ściegów w celu zmniejszenia wielkości porów w szablonie kryształu koloidalnego

  1. Aby zapewnić jednolitą powierzchnię temperaturową do wyżarzania kulek polistyrenu, która zwęża szczeliny między ściegami i zaokrągla rogi szczelin, umieść płaską, frezowaną aluminiową płytkę na standardowej ceramicznej płycie grzejnej.
  2. Ustaw temperaturę płyty grzejnej na 107 °C, temperaturę zeszklenia styropianu40.
    UWAGA: Aby uzyskać stabilną i dokładną temperaturę, sonda termopary została umieszczona w otworze o szerokości 2−3 mm i głębokości 4−5 mm w aluminiowej płycie.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe zawierające szablon ściegu na gorącej płycie aluminiowej i wyżarzaj przez 20 s (patrz sekcja dyskusji, aby uzyskać wyjaśnienie czasu topnienia).
  4. Po podgrzaniu zdejmij szkiełko nakrywkowe z aluminiowej płyty i natychmiast umieść je na innej aluminiowej powierzchni o temperaturze pokojowej, aby je schłodzić.
    UWAGA: Pomocne jest, aby szkiełka nakrywkowe zwisały lekko z krawędzi płyty lub frezowały płytkie kanały (patrz załączony film) w płycie, aby ułatwić pobieranie szkiełek nakrywkowych.

4. Nanowytwarzanie aluminiowych falowodów w trybie zerowym przy użyciu szablonu kryształu koloidalnego

  1. Stosując osadzanie termiczne lub odparowujące wiązką elektronów, osadź 300 nm miedzi z prędkością 2 A / s na koloidalnym szablonie kryształu, aby wygenerować słupki w szczelinach między kulkami.
  2. Usuń nadmiar metalu z wierzchu koralików, delikatnie dociskając powierzchnię taśmą. Powoli odklej taśmę, aby ściągnąć metal.
    UWAGA: Po pociągnięciu taśmy mogą pozostać pewne małe plamy odblaskowego nadmiaru metalu, które często można usunąć strumieniem gazuN2. Jeśli po pociągnięciu taśmy pozostaną znaczne plamy odblaskowego nadmiaru metalu, spróbuj namoczyć szablony w toluenie przez 2 godziny, aby częściowo rozpuścić kulki polistyrenu. Umyj szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, osuszN2 i powtórz ściąganie taśmy. Dodatkowe namoczenie nie powinno całkowicie rozpuścić koralików, ponieważ koraliki pomagają chronić słupki przed uszkodzeniem podczas ciągnięcia taśmy.
  3. Aby rozpuścić kulki polistyrenu, umieść szablony koralików w toluenie i namocz je przez noc.
    UWAGA: Opary toluenu mogą być toksyczne. Pracuj z toluenem pod dobrze wentylowanym kapturem i noś środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Toluen należy przechowywać w wentylowanych szafkach przeznaczonych do cieczy łatwopalnych.
  4. Po inkubacji toluenu przepłukać matryce raz chloroformem i dwa razy etanolem. W tym momencie należy ostrożnie obchodzić się ze szkiełkami nakrywkowymi, ponieważ delikatne metalowe słupki o wysokości 200−300 nm są teraz odsłonięte. Osuszyć szablony za pomocąN2 i usunąć resztki polimeru i zanieczyszczenia w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmą tlenową przez 30 min.
    UWAGA: Opary chloroformu mogą być toksyczne. Pracuj z chloroformem pod dobrze wentylowanym kapturem i noś środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Chloroform należy przechowywać w wentylowanych szafkach, z dala od innych łatwopalnych rozpuszczalników.
  5. Stosując osadzanie termiczne lub odparowujące wiązką elektronów, nałóż 3 nm tytanowej warstwy adhezyjnej z prędkością 1 Κ/s, a następnie 100−150 nm aluminium z prędkością 4 Κ/s wokół i na górze miedzianych słupków.
    UWAGA: Można użyć grubszej okładziny, aby uzyskać głębsze prowadnice i lepsze tłumienie fluorescencji tła, ale to również zmniejsza wydajność po naświetleniu i rozpuszczeniu słupków w następnym kroku (patrz sekcja dyskusji).
  6. Aby rozpuścić metalowe wkładki, namocz szkiełka nakrywkowe w wytrawiaczu miedzi (na bazie kwasu cytrynowego; Tabela materiałów) za 2 godz.
    UWAGA: Wytrawiacz do metalu może powodować oparzenia skóry. Pracuj z wytrawiaczami pod dobrze wentylowanym kapturem i noś sprzęt ochronny. Po użyciu dokładnie umyć ręce. Wytrawiacz do metalu należy przechowywać w wentylowanych szafkach przeznaczonych do cieczy.
  7. Opłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, osusz N2 i delikatnie wypoleruj powierzchnię metalowej okładziny papierem do soczewek, aby odsłonić wszystkie słupki, które są nadal pokryte okładziną. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w miedzianym wytrawiaczu na kolejne 2 godziny, a następnie ponownie spłucz wodą destylowaną i wysusz N2,
    UWAGA: Szkiełka ZMW należy przechowywać na przykrytych, czystych szalkach Petriego, aby były wolne od zanieczyszczeń.

5. Nanowytwarzanie złotych falowodów w trybie zerowym przy użyciu szablonu kryształu koloidalnego

UWAGA: Metoda wytwarzania złotych ZMW (Rysunek uzupełniający 1), która odzwierciedla protokół produkcji aluminiowych ZMW, jest podana w tej sekcji.

  1. Stosując osadzanie termiczne lub odparowujące wiązką elektronów, nałóż 3 nm warstwy adhezyjnej tytanu przy 1 Ι/s, a następnie 300 nm aluminium przy 4 Κ/s.
  2. Usuń nadmiar metalu z wierzchu koralików, delikatnie dociskając powierzchnię taśmą. Powoli odklej taśmę, aby ściągnąć metal.
  3. Aby rozpuścić kulki polistyrenowe, umieść szablony koralików w toluenie i namocz je przez noc.
  4. Po inkubacji toluenu przepłukać matryce raz chloroformem i dwa razy etanolem. Osuszyć szablony za pomocąN2 i usunąć resztki zanieczyszczeń polimerowych w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmą przez 30 minut.
  5. Za pomocą osadzania termicznego lub odparowywania wiązką elektronów osadź 100−150 nm złota z prędkością 5 Μ/s wokół i na aluminiowych słupkach.
  6. Aby rozpuścić metalowe wkładki, namocz szkiełka nakrywkowe w wytrawiaczu aluminiowym (na bazie kwasu fosforowego; Tabela materiałów) przez 1 h.
  7. Opłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną, osusz N2 i delikatnie wypoleruj powierzchnię metalowej okładziny papierem do soczewek, aby odsłonić wszystkie słupki, które są nadal pokryte okładziną. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w aluminiowym wytrawiaczu na 1 godzinę, a następnie ponownie spłucz wodą destylowaną i wysusz N2,
    UWAGA: Szkiełka ZMW należy przechowywać na przykrytych, czystych szalkach Petriego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samoorganizacja cząstek koloidalnych polistyrenu poprzez sedymentację przez parowanie (kroki 2.1−2.13) może przynieść szereg rezultatów, ponieważ wymaga kontroli szybkości parowania rozpuszczalnika. Ponieważ jednak osadzanie jest szybkie (10-15 minut na rundę), procedurę można szybko zoptymalizować pod kątem różnych warunków otoczenia w laboratorium. Rysunek 3A pokazuje dobrze uformowany szablon koloidalny po osadzeniu i odparowaniu. Makroskopowo obszar koralików jest okrągły, z obramowaniami zdefinio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku samoorganizacji koloidalnej (sekcja 2 protokołu) użycie etanolu zamiast wody jako rozpuszczalnika zawiesiny przyspiesza proces parowania, tak że matryce są gotowe w ciągu 2−3 min po osadzeniu, a nie 1−2 h, jak w poprzednich metodach48,49. Przedstawiony tutaj protokół sedymentacji wyparnej jest również prostszy niż poprzednie protokoły sedymentacji, które wymagają kontrolowania nachylenia powierzchni, temperatury i objętości powietrza nad zawieszeniem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01GM080376, R35GM118139, oraz NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 dla Y.E.G., oraz przez stypendium NIAID pre-doctoral NRSA F30AI114187 dla R.M.J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Szkiełko nakrywkowe do czyszczenia
AcetonSigma322011 L
Słoik do barwienia szkła CoplinFisher Scientific08-817Słoik do barwienia z 8 rowkami i formowaną szklaną pokrywą
Szkiełka nakrywkoweVWR48404-46724 mm x 30 mm (No.1½, Prostokątne)
EtanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Wodorotlenek potasu
szalki PetriegoFisher ScientificR80115TSśrednicy 100 mm, głębokości 15 mm
SonicatorBransonZ245143Myjka ultradźwiękowa stołowa, 5510
2. Osadzanie parowe kulek polistyrenowych
Przezroczysty pojemnik do przechowywaniaFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 cali.
Wentylator biurkowyO2CoolFD05001AKażdy mały wentylator biurkowy (~5 cali) będzie działał
Szklana zlewkaFisher Scientific02-555-25B250 ml
Miernik wilgotnościFisher Scientific11-661-19
Probówki do mikrowirówekFisher Scientific21-402-9031,5 ml
Mikrosfery polistyrenowePolysciences18602-151,00 &mikro; m średnicy, niefunkcjonalizowany
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3. Wyżarzanie koralików w celu zmniejszenia wielkości porów w krysztale koloidalnym Szablon< / mocna>
aluminiowa płytaFisher Scientific AA11062RYDostosowana we własnym zakresie do 14 cm x 14 cm
Ceramiczna płyta grzejnaFisher ScientificHP8885710013 x 8,2 x 3,8 cala.
Regulator temperaturyMcMaster-Carr38615K71Odczyt temperatury za pomocą sondy termopary
Sonda termoparyMcMaster-Carr9251T93Typ K, sonda powierzchniowa
4/5. Nanowytwarzanie falowodów w trybie zerowym przy użyciu koloidalnego szablonu kryształowego
Granulki aluminioweKurt J. LeskerEVMAL40QXHBDo odparowywania wiązką elektronów
ChloroformSigma2883061 L
Wytrawiacz miedziTransene49-1
Granulki miedziKurt J. LeskerEVMCU40QXQADo odparowywania wiązką elektronów
Złote granulkiKurt J. LeskerEVMAUXX40GDo odparowywania wiązką elektronów
Papier do soczewekThorlabsMC-5
Środek do czyszczenia plazmowegoHarrick PlasmaPDC-32G
Taśma klejącaZszywkiMMM119
System osadzania cienkowarstwowegoKurt J. LeskerPVD-75Stołowy system termicznego odparowywania również będzie działał
Granulki tytanuKurt J. LeskerEVMTI45QXQADo odparowywania wiązką elektronów
ToluenSigma2445111 L
Reprezentatywne wyniki
COMSOL Multiphysics Modeling SoftwareCOMSOL, Inc.
Rozdzielacz spektralny Dual ViewPhotometrics, Inc.
Aluminium wytrawiacz Transene typu A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001(2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797(2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401(2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301(2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06(2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011(2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229(2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888(2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964(2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800(2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418(2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Litografia nanokulowalitografia koloidalnatermiczne osadzanie z fazy paraluminiowe falowodymiedziane s upkimikroskopia si atomowychFRET pojedynczych cz steczekkomora wilgotno ciowa

Powiązane artykuły