Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61162

⸱

16 września 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular & Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Center for Skeletal Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Streszczenie

Szkieletowe komórki macierzyste okostnej (P-SSC) są niezbędne do utrzymania i naprawy kości przez całe życie, co czyni je idealnym celem dla rozwoju terapii przyspieszających gojenie złamań. Komórki okostnej szybko migrują do urazu, aby dostarczyć nowe chondrocyty i osteoblasty do gojenia złamań. Tradycyjnie, skuteczność cytokin w indukowaniu migracji komórek była badana tylko in vitro poprzez wykonanie testu transwell lub scratch. Dzięki postępom w mikroskopii przyżyciowej z wykorzystaniem wzbudzenia wielofotonowego odkryto niedawno, że 1) P-SSC wyrażają migrujący gen CCR5 i 2) leczenie ligandem CCR5 znanym jako CCL5 poprawia gojenie się złamań i migrację P-SSC w odpowiedzi na CCL5. Wyniki te zostały zarejestrowane w czasie rzeczywistym. Opisano tutaj protokół wizualizacji migracji P-SSC z niszy szkieletowych komórek macierzystych (SSC) szwu kalwaryjnego w kierunku urazu po leczeniu CCL5. Protokół szczegółowo opisuje konstrukcję urządzenia do unieruchamiania myszy i mocowania do obrazowania, chirurgiczne przygotowanie kalwarii myszy, indukcję ubytku kalwarii oraz akwizycję obrazowania poklatkowego.

Wprowadzenie

Naprawa złamań to dynamiczny, wielokomórkowy proces, który różni się od rozwoju i przebudowy embrionalnej części szkieletu. Podczas tego procesu, po indukcji sygnałów urazu z uszkodzonej tkanki następuje szybka rekrutacja, proliferacja, a następnie różnicowanie szkieletowych komórek macierzystych/progenitorowych, które mają kluczowe znaczenie dla ogólnej stabilności i utrwalenia złamań1. W szczególności wczesne etapy gojenia się złamań wymagają tworzenia miękkiego kalusa, co przypisuje się głównie komórkom rezydującym w okostnej2. Kiedy kości są uszkodzone, podzbiór komórek okostnej szybko reaguje i przyczynia się do nowo zróżnicowanych produktów pośrednich chrząstki i osteoblastów w obrębie kalus3, co sugeruje obecność odrębnej populacji szkieletowych komórek macierzystych/progenitorowych w okostnej. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka funkcjonalna szkieletowych komórek macierzystych (SSC) rezydujących w okostnej stanowi obiecujące podejście terapeutyczne w chorobach zwyrodnieniowych kości i ubytkach kostnych4.

SSC są uważane za znajdujące się w wielu miejscach tkanki, w tym w szpiku kostnym. Podobnie jak szpik kostny, osteogenne/chondrogenne SSC zostały również zidentyfikowane w periosteum4,5,6. Te okostnowe SSC (P-SSC) mogą być oznaczone wczesnymi markerami linii mezenchymalnej (tj. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, and Axin2-CreER8) podczas rozwoju kości płodu4,7,8,9,10. Istotnym ograniczeniem tych pojedynczych modeli śledzenia linii genetycznych jest znaczna heterogeniczność w znakowanych populacjach komórek. Co więcej, nie są w stanie odróżnić oznakowanych SSC od ich potomstwa in vivo. Aby rozwiązać ten problem, niedawno opracowaliśmy podwójną mysz reporterową (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+) do wyraźnej wizualizacji P-SSC z SSC szpiku kostnego (BM-SSCs)11. Dzięki temu modelowi ustalono, że P-SSC są oznaczone podwójnym znakowaniem Mx1 + αSMA +, podczas gdy bardziej zróżnicowane komórki Mx1 + znajdują się w szpiku kostnym, powierzchniach śródkostnych i okostnych oraz kościach korowych i beleczkowych11,12.

Wiele cytokin i czynników wzrostu jest znanych z regulowania przebudowy i naprawy kości i zostało przetestowanych pod kątem poprawy naprawy szkieletu w krytycznych wadach segmentu1,13. Jednak ze względu na złożoność komórkową modeli urazów generowanych przez przerwanie bariery fizycznej przedziału kostnego, bezpośredni wpływ tych cząsteczek na endogenną migrację i aktywację P-SSC podczas gojenia jest niejasny. Cechy funkcjonalne i dynamika migracji SSC są często oceniane in vitro poprzez wykonanie testu transwell lub scratch, w połączeniu z cytokinami lub czynnikami wzrostu, o których wiadomo, że indukują migrację w innych populacjach komórek. W związku z tym interpretacja wyników tych eksperymentów in vitro w celu zastosowania w odpowiadających im systemach in vivo jest trudna. Obecnie ocena in vivo migracji komórek macierzystych/progenitorowych szkieletu nie jest zwykle obserwowana w czasie rzeczywistym; Jest raczej mierzony w ustalonych punktach czasowych po złamaniu5,7,14,15,16.

Ograniczeniem tej metody jest to, że migracja nie jest oceniana na poziomie pojedynczej komórki; raczej mierzy się ją poprzez zmiany w populacjach komórek. Dzięki niedawnym postępom w mikroskopii przyżyciowej żywych zwierząt i generowaniu dodatkowych myszy reporterowych, możliwe jest teraz śledzenie pojedynczych komórek in vivo. Korzystając z mikroskopii przyżyciowej żywych zwierząt, zaobserwowaliśmy wyraźną migrację P-SSC z niszy szwu kalwarii do urazu kości w ciągu 24-48 godzin po urazie u myszy Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 został niedawno zidentyfikowany jako mechanizm regulacyjny wpływający na rekrutację i aktywację P-SSC podczas wczesnej reakcji na uraz. Co ciekawe, nie wykryto znacznej migracji P-SSC w odpowiedzi na uraz w czasie rzeczywistym. Jednak leczenie urazu za pomocą CCL5 powoduje solidną, wyraźną kierunkowo migrację P-SSC, które można uchwycić w czasie rzeczywistym. Dlatego celem tego protokołu jest zapewnienie szczegółowej metodologii rejestrowania migracji in vivo P-SSC w czasie rzeczywistym po leczeniu CCL5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Baylor College of Medicine.

1. Przygotowanie myszy

  1. Skrzyżowanie myszy Mx1-Cre17 i Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 myszy (zakupione w Jackson Laboratory) z myszami αSMA-GFP (dostarczonymi tutaj przez dr Ivo Kalajzica i Henry'ego Kronenberga), aby wygenerować myszy reporterowe Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Rysunek 2A).
  2. W przypadku indukcji Mx1-Cre należy wstrzykiwać myszom 25 mg/kg pIpC co drugi dzień przez 10 dni.
  3. Napromienij myszy 9,5 Gy na 1 dzień przed dożylnym przeszczepem 1 x 106 komórek jednojądrzastych szpiku kostnego całego szpiku kostnego od myszy C57BL / 6 typu dzikiego (WT-BMT)19.
  4. Po 6 do 8 tygodniach rekonwalescencji poddaj myszy obrazowaniu in vivo protokołu migracji komórek okostnej opisanego poniżej.
    UWAGA: Napromienianie i WT-BMT myszy Mx1-Cre są niezbędne do wyeliminowania endogennych komórek krwiotwórczych znakowanych Mx1, które mogą reagować na uraz. Sześć do ośmiu tygodni po napromieniowaniu liczba komórek krwiotwórczych gospodarza wynosi <5%, a zatem jest gotowa do obrazowania19.

2. Mocowanie myszy i montaż obrazowania

  1. Stwórz urządzenie przytrzymujące dla myszy za pomocą stożkowej rurki o pojemności 50 ml (Rysunek 1A).
    1. Za pomocą spiczastych nożyczek przebij dziurę w dolnej części stożka. Wytnij od dolnego otworu do górnej części stożka (strona cięcia będzie górną częścią ogranicznika).
    2. Wykonaj cięcie o długości około 4–5 cm równolegle do poprzedniego cięcia i w połowie wysokości (~2 cm) od górnej części utwierdzenia. Usuń tę część stożka i wygładź krawędzie, które były konieczne.
  2. Zbuduj stożkowy uchwyt do obrazowania rury, używając regulowanej płytki kątowej, słupka optycznego 0,5" i zacisku kątowego dla słupka 0,5", sześciokątnego 0,1875" (Rysunek 1B i tabela materiałów).
    1. Ustaw płytkę kątową pod kątem 35°. Po lewej stronie płytki kątowej wkręć słupek optyczny w drugi otwór z tyłu płytki.
    2. Po prawej stronie regulowanej płyty włóż sprężynową skrzydełkową 0.1875" z blokadą sześciokątną 0.25" do drugiego otworu od przodu i ostatnich otworów w płycie. Zacisk pod kątem prostym będzie używany ze słupkiem optycznym, aby zabezpieczyć stożkowe ograniczniki myszy na miejscu.

3. Przedoperacyjny zabieg chirurgiczny

  1. Znieczulenie myszy
    1. W celu złagodzenia bólu należy wstrzyknąć myszu podskórnie buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (1 mg/kg masy ciała) 30–60 minut przed zabiegiem.
    2. Znieczulenie myszy za pomocą znieczulenia kombinacją CCM gryzonia III (combo III) zawierającą 37,5 mg/ml ketaminy, 1,9 mg/ml ksylazyny i 0,37 mg/ml acepromazyny. Odpowiednia dawka dla myszy to 0,75–1,50 ml na 1 kg masy ciała. Dawka trwa 30–45 minut.
    3. Po znieczuleniu myszy nałóż maść okulistyczną na oczy za pomocą sterylnego wacika, aby zapobiec odwodnieniu oczu.
    4. W przypadku obrazowania długotrwałego (>45 min) należy ponownie podać znieczulenie, aby utrzymać odpowiednią głębokość znieczulenia w następujący sposób.
      1. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z wystarczającą ilością combo III, aby utrzymać znieczulenie przez planowany czas obrazowania (0,75 ml/kg masy ciała na 30 minut dodatkowej sedacji). Podłącz zestaw do infuzji igłami motylkowymi o pojemności 25 g z rurką 12" do strzykawki i przepchnij środek znieczulający przez rurkę i igłę.
      2. Wprowadzić igłę motylkową dootrzewnowo, a następnie przykleić igłę taśmą na miejscu.
        UWAGA: W ten sposób dodatkowa kombinacja III będzie podawana podczas obrazowania, tak aby nie było potrzeby poruszania zwierzęciem ani zakłócania płaszczyzny widzenia.
    5. Zapewnij wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37°C przez cały czas trwania zabiegu. W przypadku przedłużonego obrazowania (>1 godzina) konieczne będzie dodatkowe wspomaganie płynami. Dodatkowe płyny można podać I.P. z dodatkowym Combo III podczas obrazowania lub 33 ml/kg soli fizjologicznej (0,9 NaCl) podskórnie.
  2. Unieruchomienie myszy i przygotowanie pola operacyjnego
    1. Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć jak najwięcej włosów z czubka głowy. Nałóż krem do depilacji na ogolony obszar, aby usunąć wszelkie pozostałe włosy w miejscu operacji.
    2. Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przez brak reakcji na szczypanie palców. Po 15 minutach, jeśli mysz nie jest w pełni znieczulona, podaj drugą mniejszą dawkę combo III (<0,75 ml/kg m.c.).
    3. Umieść mysz w unieruchomieniu ogonem do przodu, przesuwając ją wystarczająco daleko do tyłu, tak aby nos lekko zwisał z krawędzi stożka.
    4. Przyklej przednie łapy do dolnej części stożkowej rurki za pomocą taśmy medycznej.
    5. Umieść rurkę stożkową z myszą na uchwycie obrazowym ustawionym pod kątem 35° i zabezpiecz za pomocą kąta prostego clamp (Rysunek 1C).
    6. Gdy mysz zostanie zabezpieczona w uchwycie do obrazowania, oczyść miejsce operacyjne 3 razy naprzemiennie peelingiem betadynowym i 70% alkoholem izopropylowym. Ponownie sprawdź, czy zwierzę jest w pełni uspokojone.
    7. Przenieś mysz do czystej podkładki chłonnej i umieść zasłonę na myszy, aby stworzyć duże sterylne pole.

4. Zabieg chirurgiczny

  1. Nacięcie otwierające
    1. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką podnieś skórę bezpośrednio przyśrodkowo do prawego ucha. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji przeciąć skórę trzymaną przez kleszcze.
      UWAGA: Zainicjowanie nacięcia metodą opisaną powyżej tworzy zaokrąglone nacięcie, które jest bardziej odpowiednie do szycia po zabiegu.
    2. Wykonaj nacięcie poprzeczne, zaczynając od początkowego nacięcia w kierunku lewego ucha (<1 cm). Wykonaj kolejne nacięcie, zaczynając od początkowego nacięcia, w kierunku nosa zwierzęcia (~2–3 mm za prawym okiem).
    3. Oddziel skórę od okostnej za pomocą kleszczy i nożyczek, aby delikatnie przeciąć tkankę łączną oddzielającą skórę od okostnej kalwarii.
    4. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż trochę maści okulistycznej na górną część płata skóry. Delikatnie podnieś płatek skóry i zawiń go nad lewym okiem. Przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych powinno być wyraźnie odsłonięte (Rysunek 1E).
      UWAGA: Maść okulistyczna służy do utrzymywania płata skórnego na miejscu.
    5. Spłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, aby oczyścić obszar z krwi i resztek włosów.
      UWAGA: W razie potrzeby użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć włosy, które pozostały po spłukaniu, ale uważaj, aby nie uszkodzić okostnej.
  2. Mikrozłamania
    1. Aby wytworzyć mikropęknięcia na kalwarii, należy zdjąć tłok strzykawki insulinowej 29 G i odciąć tylny koniec strzykawki, wokół znaczników 300–400 μl.
      UWAGA: Ten krok ułatwia manewrowanie pod lunetą sekcyjną podczas powstawania urazu.
    2. Umieść końcówkę skosu (od jednej do dwóch szerokości igły) w kierunku nosa od szwu koronalnego i od jednej do dwóch szerokości igły po prawej stronie szwu strzałkowego (Rysunek 1E).
    3. Delikatnie obrócić strzykawkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie kilka razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
      UWAGA: U młodych myszy do wytworzenia okrągłego mikropęknięcia potrzebne jest bardzo małe ciśnienie w dół. Należy uważać, aby igła nie przebiła się do mózgu, ponieważ spowoduje to krwawienie i zakłóci obrazowanie.
    4. Za pomocą igły 27 G poszerzyć mikropęknięcie do ~0,4 mm. Jeśli w mikrozłamaniu pozostaną fragmenty kości, przepłucz ten obszar PBS. Jeśli fragmenty kości nadal pozostają w mikrozłamaniu, użyj igły 29 G, aby delikatnie je zgarnąć.
    5. Powtórz kroki 4.2.1–4.2.4, aby utworzyć uraz po lewej stronie szwu strzałkowego.
      UWAGA: W tym momencie istnieją dwie opcje: 1) natychmiast przystąpić do leczenia CCL5 (sekcja 4.3) i obrazowania (sekcja 5); lub 2) zamknąć pole operacyjne po zabiegach pooperacyjnych wymienionych w punkcie 6. Po 24 godzinach należy ponownie znieczulić mysz, ponownie otworzyć wzrok chirurgiczny, opatrzyć uraz za pomocą CCL5 (sekcja 4.3) i wykonać obrazowanie przyżyciowe (sekcja 5) oraz opiekę pooperacyjną (sekcja 6).
  3. Leczenie CCL5
    1. Z zapasu RANTES (100 ng/ml) przygotować roztwór 10 ng/ml za pomocą matrycy błony podstawnej (tabela materiałów). Trzymaj ten roztwór na lodzie, aby utrzymać matrycę w postaci płynnej.
    2. Leczyć każdy uraz za pomocą 2 μl CCL5 (10 ng/μL) za pomocą pipety o pojemności 2-20 μl (ta końcówka do pipety ma większą średnicę, co jest bardziej skuteczne w przypadku stosowania lepkiej cieczy). Pozwól, aby matryca zastygła.
    3. Gdy matryca zastygnie, delikatnie przykryj kalwarię płatkiem skóry, aby upewnić się, że tkanka nie zostanie odwodniona. Inkubować przez 1 godzinę przed obrazowaniem.

5. Obrazowanie przyżyciowe

  1. Ustawienia mikroskopu
    1. Włącz laser wielofotonowy (femtosekundowy laser tytanowo-szafirowy). Ustaw długość fali na 880 nm i dostosuj moc do obrazowania drugiej harmonicznej (SHG) (440 nm) kości.
    2. Włącz lasery na ciele stałym 488 nm i 561 nm do wzbudzenia komórek wykazujących ekspresję GFP i tdTomato.
    3. Włącz detektory PMT (fotopowielacza) dla sygnałów generacji drugiej harmonicznej (detekcja 405–455 nm) i GFP (detekcja 505–550 nm). Włącz detektor HyD 3 dla sygnału pomidora (detekcja 590–620 nm).
  2. Montażu
    1. Przed przyłożeniem myszki do lunety należy sprawdzić płaszczyznę wizualną kalwarii, delikatnie naciskając tył głowy myszy. Jeśli płaszczyzna nie jest wypoziomowana, dostosuj pozycję, delikatnie obracając ogranicznik myszy w lewo lub w prawo.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok w celu zapewnienia wystarczającej jakości obrazu.
    2. Nałóż sterylną 2% metylocelulozę w wodzie (w/v), aby pokryć całą kalwarię i płat skóry i zapobiec wysuszeniu tkanki.
    3. Umieść mysz na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu z osią XYZ (Rysunek 1G). Używając światła epifluorescencyjnego, ustaw mysz tak, aby 1) była zwrócona w stronę mikroskopu i 2) przecięcie szwów czołowych i strzałkowych było wyśrodkowanym punktem odniesienia stolika.
    4. Umieść szklaną osłonę na obszarze obrazowania i dwukrotnie sprawdź wyrównanie (Rysunek 1H).
  3. Obrazowanie poklatkowe
    1. Użyj obiektywu o małym powiększeniu (obiektyw zanurzony w wodzie 25x z NA = 0,95), aby zeskanować kalwarię. Uzyskaj obraz referencyjny przecięcia szwu strzałkowego i koronalnego.
    2. Korzystając z SHG i sygnałów fluorescencyjnych z komórek, zlokalizuj każdy punkt obserwacyjny urazu i zapisz współrzędne XYZ, a także odległości od szwów strzałkowych i koronalnych (Rysunek 2B).
    3. Wybierz miejsce na szwach koronalnych lub strzałkowych do długotrwałego obrazowania. Wykonaj szczegółowy obraz stosu Z tego obszaru z punktu odniesienia podczas obrazowania.
      UWAGA: Ponieważ szwy reprezentują znaną niszę P-SSC, jest to miejsce, z którego komórki będą migrować w odpowiedzi na uraz kalwarii.
    4. Użyj ustawień oprogramowania poklatkowego, aby nagrywać obraz co 1 minutę przez co najmniej 1 godzinę. W czasie między migawkami porównaj bieżące pole widzenia z początkowym polem widzenia. Jeśli są różne, użyj obrazu stosu Z, aby określić, w którym kierunku należy dostosować pole widzenia.

6. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami

  1. Po obrazowaniu przepłucz odsłoniętą kalwarię sterylnym PBS, aby usunąć metylocelulozę.
  2. Aby zamknąć nacięcie, delikatnie umieść płat skóry nad kalwarią. Użyj sterylnych wacików, aby usunąć resztki maści okulistycznej i osuszyć miejsce nacięcia.
  3. Za pomocą monofilamentowych nylonowych szwów niewchłanialnych w rozmiarze 5-0 z dołączoną igłą do odwrotnego cięcia C-1, zamknij pole operacyjne. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby nałożyć potrójną maść z antybiotykiem na zamknięte nacięcie.
    UWAGA: Blizny są redukowane dzięki wysokiej jakości technikom szycia i minimalnemu krwawieniu.
  4. Umieść mysz w czystej klatce na ciepłej powierzchni i sprawdzaj co 15 minut, aż do osiągnięcia pozycji mostka.
  5. Drugą dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu należy podać 72 godziny po zabiegu.
  6. Codziennie monitoruj zachowanie związane ze skuleniem, potarganą sierść i/lub brak poruszania się, dopóki szwy nie zostaną usunięte (~1 tydzień).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaproponowano, że progenitorzy szkieletowi posiadają potencjał migracyjny lub krążeniowy20. Niedawno stworzono myszy reporterowe Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), w których P-SSC są znakowane podwójnie jako Mx1+αSMA+ (Rysunek 2A,B). Znaczna migracja P-SSC Mx1+αSMA+ poza mezen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gojenia się kości komórki okostnej są głównym źródłem nowo różnicujących się chondrocytów i osteoblastów w obrębie modzeliuszkodzonej 3. Podobnie jak w przypadku szpiku kostnego, osteogenne/chondrogenne SSC zostały również zidentyfikowane w okostnej 4,5,6. Ocena endogennych cech funkcjonalnych P-SSC jest technicznie trudna. Często dynamika migracji SSC jest oceniana in vitro, co sprawia, że interp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

L.C.O. i D.P. ujawniają zgłoszony patent zatytułowany "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Bone Disease Program of Texas Award, Caroline Wiess Law Fund Award oraz NIAMS of the National Institutes of Health pod numerami nagród R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 do D.P. Dziękujemy M.E. Dickinsonowi i T.J. Vadakkanowi z BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core oraz BCM Advanced Technology Cores z dofinansowaniem z NIH (AI036211, CA125123, and DK056338).

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
½ ” słupek optycznyThorLabsTR2Do montażu obrazowego
Strzykawka 1 mlBD309659
27GPercisionGlide
29GMcKesson102-SN05C905P
50 ml Falcon352098Do unieruchamiania myszy
Regulowana płytakątowa RenishawR-PCA-5023-50-20Do montażu obrazowego
Chusteczki nasączone alkoholemCoviden6818
betadynowy peeling chirurgicznyHenry Schen67618-151-16
Buprenorfina SR-LABZooPharm1mg/ml Combo o przedłużonym uwalnianiu
IIIUzyskane od lekarza weterynariiN/A37,6 mg/ml Ketamina; 1,9 mg/ml Ksylazyna; 0,37 mg/ml Acepronazyna
Szkiełko nakrywkoweFisher12-545-8724 x 40 premium superslip
Cienka końcówkaFST11254-20
KetaminaKetaVed50989-161-06100 mg/ml
Leica TCS SP8MP z DM6000CFSLeica MicrosystemsN/A
MatrigelR & D Systems344500101
Taśma medycznaMcKesson1001993" x 10 jardów (7,6 cm x 9,1 m)
MetocelulozaMikroskopia elektronowa Nauki19560
Nożyczki do mikrodysekcjiFST1456-12
Zmotoryzowany etapAutomatyka AnaheimNie dotyczy
Uchwyt na igłyFST12500-12
Szwy niewchłanialneMcKessonS913BXmonofilament nylon 5-0 nici niewchłanialne z dołączoną igłą do odwrotnego cięcia C-1
Maść okulistycznaRugby0536-1086-91
RANTESBiolegend59420210 µ g/50 i mikro; L
Zacisk kątowy do ½ ” słupek, 3/16" HexThorLabsRA90Do montażu obrazowego
Sprężynowy 3/16" Blokowanie sześciokątne ¼ ” śruba skrzydełkowaThorLabsTS25HDo montażu obrazowego
Sterylne waciki bawełnianeHenry Schen100-9249
Sterylne DPBS (1x)Corning21-030-CV
Sterylne obłożeniaMcKessen25-517
Rękawice chirurgiczneMcKessen3158VA
Maść z potrójnym antybiotykiemTaro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. 51672-2120-2
Zestaw do pobierania krwi VacutainerBDREF 367298Zestaw do infuzji igłami motylkowymi 25G z rurką 12"
Igła BD Strzykawka insulinowa 305111

Bibliografia

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
  3. Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
  4. Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
  5. Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773(2018).
  6. Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
  7. Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
  8. Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524(2016).
  9. Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
  10. Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  11. Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
  12. Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909(2018).
  13. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
  14. Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
  15. Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
  16. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  17. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  18. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).
  19. Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
  20. Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
  21. Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
  22. Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Leczenie chemokin CCL5mikroskopia wewn trz yciowamodel defektu sklepienia czaszkiobrazowanie time lapsemyszy reporterowe Mx1 Tomato Alpha SMA GFPwzbudzenie wielofotonoweledzenie migracji kom rekgojenie z ama ko cimiejsce urazu po szwie
Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.