Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61164

⸱

29 stycznia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy niezawodną metodę przygotowania ekstraktów z całych komórek z drożdży lub innych komórek za pomocą kriogenicznego młyna zamrażającego, który minimalizuje degradację i denaturację białek. Ekstrakty komórkowe nadają się do oczyszczania funkcjonalnych kompleksów białkowych, analiz proteomicznych, badań koimmunoprecypitacji i wykrywania labilnych modyfikacji białek.

Streszczenie

Łatwość manipulacji genetycznej i silne ewolucyjne zachowanie eukariotycznej maszynerii komórkowej w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae uczyniły z nich wybitny genetyczny organizm modelowy. Ponieważ jednak skuteczna izolacja białek zależy od optymalnego rozerwania komórek, użycie drożdży do analizy biochemicznej białek komórkowych jest utrudnione przez ich ścianę komórkową, która jest kosztowna w trawieniu enzymatycznym (przy użyciu litykazy lub zymolyazy) i trudna do mechanicznego zakłócenia (przy użyciu tradycyjnego ubijaka do kulek, prasy francuskiej lub młynka do kawy) bez powodowania podgrzewania próbek. co z kolei powoduje denaturację i degradację białek. Chociaż ręczne mielenie komórek drożdży w ciekłym azocie (LN2) za pomocą moździerza i tłuczka pozwala uniknąć przegrzania próbek, jest pracochłonne i podlega zmienności w lizie komórek między operatorami. Od wielu lat z powodzeniem przygotowujemy wysokiej jakości ekstrakty drożdżowe metodą kriomielenia komórek w zautomatyzowanej zamrażarce. Temperatura -196 °C osiągnięta przy użyciu LN2 chroni materiał biologiczny przed degradacją przez proteazy i nukleazy, umożliwiając odzyskanie nienaruszonych białek, kwasów nukleinowych i innych makrocząsteczek. Tutaj szczegółowo opisujemy tę technikę pączkowania komórek drożdży, która polega najpierw na zamrożeniu zawiesiny komórek w buforze do lizy poprzez jej kroplowe dodanie do LN2 w celu wytworzenia zamrożonych kropelek komórek znanych jako "popcorn". Ten popcorn jest następnie proszkowany pod LN2 w młynie zamrażarkowym w celu wytworzenia zamrożonego "sproszkowanego" ekstraktu, który jest powoli rozmrażany i klarowany przez wirowanie w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Otrzymane ekstrakty są gotowe do dalszych zastosowań, takich jak oczyszczanie białek lub kwasów nukleinowych, analizy proteomiczne lub badania koimmunoprecypitacji. Technika ta ma szerokie zastosowanie do przygotowywania ekstraktów komórkowych z różnych mikroorganizmów, tkanek roślinnych i zwierzęcych, okazów morskich, w tym koralowców, a także do izolowania DNA/RNA z kryminalistycznych i wiecznych zmarzlin.

Wprowadzenie

Drożdże są popularnym organizmem modelowym do badań nad białkami, ponieważ są prostym organizmem eukariotycznym z obfitością genetycznych i biochemicznych narzędzi dostępnych dla badaczy1. Ze względu na ich solidną ścianę komórkową, jednym z wyzwań, przed którymi stoją naukowcy, jest skuteczna liza komórek bez uszkadzania zawartości komórkowej. Dostępne są różne metody otrzymywania ekstraktów białkowych poprzez rozbijanie komórek drożdży, które obejmują lizę enzymatyczną (zymolyase)2,3, liza chemiczna4, fizyczna liza przez zamrażanie-rozmrażanie5, oparte na ciśnieniu (prasa francuska)6,7, mechaniczne (szklane koraliki, młynek do kawy)8,9, sonikation-based10 i crygenic2,11. Wydajność lizy komórek i wydajność białka mogą się znacznie różnić w zależności od zastosowanej techniki, wpływając w ten sposób na wynik końcowy lub przydatność do pożądanego dalszego zastosowania lizatu. Podczas badania białek, które są niestabilne, mają ulotne modyfikacje potranslacyjne lub są wrażliwe na temperaturę, szczególnie ważne jest zastosowanie metody, która zminimalizuje utratę lub degradację próbki podczas przygotowania.

Technika przygotowania ekstraktuSzczegółyZaletyWadyDalsza analizaodniesienie
Prasa francuska: Homogenizator wysokociśnieniowy (znany również jako mikrofluidyzator) z enzymatyczną obróbką wstępną przy użyciu zymoliazyZymolyase-20T, homogenizator wysokociśnieniowy Microfluidizer. Zakłócacz składa się z napędzanej powietrzem, wysokociśnieniowej pompy (stosunek 1:250; wymagane ciśnienie powietrza 0,6 l MPa) oraz specjalnej komory zakłócającej z dodatkowym agregatem przeciwciśnieniowym. Do przetworzenia wymagana jest próbka o minimalnej wielkości 20 ml.Ostateczna całkowita przerwa uzyskana przy użyciu protokołu połączonego zbliżyła się do 100 % przy 4 przejściach pod ciśnieniem 95 MPa, w porównaniu z zaledwie 32 % zakłóceniami przy 4 przejściach przy ciśnieniu 95 MPa przy użyciu tylko homogenizacji bez Zymolyazy.Nie nadaje się do zastosowań na małą skalę. Enzymy mogą być drogie w przypadku preparatów na dużą skalę.Oczyszczanie białek6
Ubijak do koralików: Komórki poddane działaniu zymoliazy poddane lizie za pomocą szklanych kulek w instrumencie fastprepMniej więcej równa objętość zimnych, suchych, przemytych kwasem kulek szklanych o średnicy 0,5 mm jest dodawana do danej objętości osadu komórkowego w buforze do lizy, a komórki są rozbijane przez energiczne mieszanie ręczne.Jest to szczególnie przydatne przy wytwarzaniu ekstraktów z wielu różnych małych kultur drożdży do celów testowych, a nie do oczyszczania białek.Podczas procedury kulek szklanych białka są poddawane surowej obróbce, powodując nadmierne pienienie prowadzące do denaturacji białek. Stopień uszkodzenia komórek jest różny, podczas gdy proteoliza, jak również modyfikacja białek może wynikać z podgrzania ekstraktu powyżej 4°C podczas mechanicznego pękania.Głównie analizy DNA i RNA, ale także analiza białek poprzez denaturację elektrofenorezy żelowej, z Western blot lub bez.8
Leczenie zymoliazą, a następnie liza przy użyciu kombinacji wstrząsu osmotycznego i homogenizacji DouncePo enzymatycznym trawieniu ścian komórkowych sferoplasty są poddawane lizie za pomocą 15 do 20 uderzeń ciasno dopasowanego tłuczka (prześwit od 1 do 3 μm) w homogenizatorze Dounce.Korzystne jest stosowanie szczepów z niedoborem proteazy, takich jak BJ926 lub EJ101. Jest to najdelikatniejszy sposób rozbijania komórek drożdży, dlatego najlepiej nadaje się do przygotowywania ekstraktów, które mogą pełnić złożone funkcje enzymatyczne (np. translacja, transkrypcja, replikacja DNA) i w których musi być zachowana integralność struktur makromolekularnych (np. rybosomów, splicesomach). Jest również przydatny do izolowania nienaruszonych jąder, które można wykorzystać do badań chromatyny (Bloom i Carbon, 1982) lub do ekstraktów białek jądrowych (Lue i Kornberg, 1987).Główną wadą procedury lizy sferoplastów jest to, że jest ona stosunkowo żmudna i kosztowna, zwłaszcza w przypadku preparatów na dużą skalę (>10 litrów), a długie okresy inkubacji mogą prowadzić do proteolizy lub modyfikacji białek. W przypadku preparatów chromatyny wydają się one być różnej lub niższej jakości niż te wytwarzane przez wirowanie różnicowe (w oparciu o integralność drabinki nukleosomów).Izolowanie nienaruszonych jąder do badań chromatyny, ekstrakty, które mogą pełnić złożone funkcje enzymatyczne, ekstrakty wymagające integralności
struktury makromolekularne, ekstrakty białek jądrowych.		cyfra arabska
Rozbijanie komórek zamrożonych błyskawicznie przez mielenie w ciekłym azocie za pomocą moździerza/tłuczka lub blenderaKomórki są natychmiast zamrażane w ciekłym azocie, a następnie poddawane lizie poprzez ręczne mielenie w moździerzu za pomocą tłuczka lub za pomocą blendera Waring w obecności ciekłego azotu.Protokół jest szybki i łatwy. Może pomieścić różne ilości komórek drożdży, w tym bardzo duże kultury. Jego główną zaletą jest to, że komórki są natychmiast pobierane ze stanu aktywnego wzrostu do ciekłego azotu (−196°C), co zmniejsza aktywność enzymów degradacyjnych, takich jak proteazy i nukleazy, a także aktywność modyfikującą białka (np. fosfatazy i kinazy). Szczególnie nadaje się do wytwarzania ekstraktów całokomórkowych z pojedynczej kultury drożdży w celu oczyszczania białek na dużą skalę. Trochę niechlujne i potencjalnie niebezpieczne dla nieostrożnego śledczego. Małe próbki (tj. 10 do 100 ml kultur drożdży) nie są łatwe do przetworzenia, ponieważ nie ma wystarczającej masy zamrożonych grudek komórek, aby skutecznie rozbić się w mieszalniku. Przetwarzanie pojedynczych próbek i czyszczenie sprzętu między użyciami jest czasochłonne.Ekstrakty całokomórkowe z pojedynczej kultury drożdży do oczyszczania białek na dużą skalę.cyfra arabska
Autoliza, Młyn perełkowypH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 obr/min / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 minSzybka i wydajna liza, szczególnie w przypadku przygotowywania ekstraktów na małą skalęWytwarzanie ciepła prowadzi do denaturacji i degradacji makrocząsteczek. Wymagany sprzęt do ubijania koralików.Analizy na małą skalę.10
Autoliza, SonikacjapH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 obr./min, 4 × 5 min/2 min, pulsator 80%, moc 80%Sprzęt do sonikacji jest zwykle dostępny w większości instytucji.Wytwarzanie ciepła prowadzi do denaturacji i degradacji makrocząsteczek. Wymagany sprzęt do sonikacji. Powolna liza może potrwać dłużej niż 24 godziny.Preparaty ściany komórkowej drożdży.
Proces gotowania i zamrażania i rozmrażaniaNie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt poza standardową zamrażarką i blokiem grzewczym lub wanną z gorącą wodą.Wydajne, powtarzalne, proste i niedrogie.Wytwarzanie ciepła prowadzi do denaturacji i degradacji makrocząsteczek.Analizy DNA metodą PCR.5

Tabela 1: Porównanie dostępnych metod przygotowania ekstraktów drożdżowych.

Mielenie kriogeniczne (znane również jako mielenie kriogeniczne/mielenie kriogeniczne) jest powszechnie stosowane do pobierania kwasów nukleinowych, białek lub substancji chemicznych z próbek wrażliwych na temperaturę w niezawodny sposób do analiz ilościowych lub jakościowych. Jest z powodzeniem stosowany w wielu zastosowaniach w różnych dziedzinach, w tym w biotechnologii, toksykologii, kryminalistyce12,13, naukach o środowisku, biologii roślin14 i naukach o żywności. Izolacja nienaruszonych makrocząsteczek biologicznych jest zwykle krytycznie zależna od temperatury. Ekstremalnie niskie temperatury zapewniają, że proteazy i nukleazy pozostają nieaktywne, co skutkuje niezawodną izolacją nienaruszonych białek, kwasów nukleinowych i innych makrocząsteczek do późniejszych analiz. Rzeczywiście, młyn zamrażalniczy zazwyczaj utrzymuje temperaturę próbki -196 °C (temperatura wrzenia LN2), minimalizując w ten sposób denaturację i degradację DNA/RNA lub białka.

Młyn zamrażalniczy wykorzystuje elektromagnetyczną komorę mielenia, która szybko przesuwa metalowy pręt lub cylinder tam i z powrotem wewnątrz fiolki zawierającej próbkę, która ma zostać sproszkowana między zatyczkami końcowymi ze stali nierdzewnej. Przyrząd wytwarza i szybko odwraca pole magnetyczne w komorze mielenia. Gdy pole magnetyczne przesuwa się do przodu i do tyłu, magnes miażdży próbkę o korki, uzyskując w ten sposób "kriomielenie" i sproszkowanie popcornu. Młyn zamrażarkowy zastępuje moździerz i tłuczek i umożliwia sekwencyjne przetwarzanie wielu próbek (lub do 4 mniejszych próbek jednocześnie) z wysoką powtarzalnością i pozwala uniknąć zmienności między użytkownikami związanej z ręcznym mieleniem. Po przetworzeniu próbek, ekstrakty komórkowe mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie drożdżowego popcornu

  1. Hoduć komórki drożdży w 0,5 L pożywki YPD do gęstości 1 x 107 komórek/ml. Policz komórki za pomocą licznika Coulter’a lub innej metody.
  2. Wiruj komórki przez 10 min przy 2400 g i 4 °C.
  3. Każdą próbkę należy raz przemyć 500 ml lodowatej wody dejonizowanej Milli-Q o oporności 18 megaohmów.
  4. Osady resuspender w 15 ml lodowatego buforu lizującego [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerolu, z dodanym bezpośrednio przed użyciem środkiem redukującym 10 mM β-merkaptoetanolem, koktajlem inhibitorów proteaz, 10 μM inhibitor proteasomów MG-132, 1 mM inhibitor deacetylazy maślan sodu oraz inhibitory fosfataz (1 mM wanadan sodu, 50 mM fluorek sodu, 50 mM $\beta$-glicerynian sodu)]. Patrz na Tabela materiałów w celu uzyskania dodatkowych szczegółów. Przechowywać resuspenderowane komórki w lodzie do momentu przygotowania próbek do następnego etapu.
    UWAGA: Do próbek można stosować szeroki wachlarz buforów lizujących zawierających różne detergenty niejonowe oraz specyficzne inhibitory, zależnie od planowanego zastosowania w dalszych etapach analizy. Dodanie inhibitorów proteaz i proteasomów jest kluczowe dla zapobiegania degradacji białek, szczególnie po rozmrożeniu ekstraktów.
  5. Przygotuj zamrożony metodą snap-freezing „popcorn” drożdżowy, powoli dodając zawiesinę komórkową kropla po kropli za pomocą schłodzonej wcześniej pipety serologicznej do jednej lub kilku probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, umieszczonych na suchym lodzie i wypełnionych LN2.2 do poziomu tuż poniżej krawędzi. Często uzupełniać ciekły azot w probówce, aby zrekompensować jego ubytek wynikający z szybkiego odparowania. Pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, aby uniknąć zagrożeń związanych z uduszeniem azotem.
    1. Zamiast jednej probówki 50 ml, do przygotowania pop-cornu należy użyć kilku probówek 50 ml związanych ze sobą (lub dowolnego pojemnika z szerokim otworem, np. dużej plastikowej butelki do wirówki, która jest odporna na temperatury kriogeniczne) (Rycina 1A). Im większy pojemnik i jego otwór, tym łatwiejsze jest przygotowanie popcornu, ponieważ zapobiega to zbrylaniu się popcornu i tworzeniu dużych aglomeratów. Zakres wielkości ziaren popcornu od 0,3 do 0,5 cm jest idealny do uzyskania prawidłowego zmielenia/sproszkowania przy użyciu młyna kriogenicznego (Rysunek 1B).
    2. Upewnij się, że LN2 całkowicie odparowało z probówek zawierających popcorn przed ich przechowywaniem w temperaturze -80 °CMożna przerwać pracę po przygotowaniu drożdżowego „popcornu”, ponieważ są one stabilne przez kilka lat przy przechowywaniu w temperaturze -80 °C.

Przygotowanie do schładzania próbek PCR oraz porównanie rozmiaru kulek do eksperymentu z reakcją polimerazy.
Rysunek 1: Przygotowanie drożdżowego „popcornu”. (A) Drożdżowy „popcorn” powstaje poprzez zamrażanie zawiesiny komórkowej w LN2 metodą kroplową. Używamy od jednej do trzech probówek o pojemności 50 mL, spiętych gumką recepturką i umieszczonych w wiaderku z lodem wypełnionym suchym lodem. Probówki wypełnia się LN2 niemal do pełna, a poziom ciekłego azotu jest często uzupełniany, aby utrzymać go blisko krawędzi, aż cała zawiesina komórkowa zostanie zamieniona w popcorn (B) Rozmiar popcornu jest istotnym czynnikiem determinującym optymalną wydajność mielenia. Zakres rozmiaru kulek popcornu powinien wynosić od 0,3 do 0,5 cm średnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Kriotarcie

  1. Na początek należy upewnić się, że znajduje się wystarczająca ilość LN22 dostępne w celu schłodzenia młyna kriogenicznego, probówek do mielenia i materiałów pomocniczych oraz do zasilania maszyny podczas przetwarzania wszystkich próbek. Dla mniej niż pięciu próbek wymagane jest 30–35 l LN22 powinno wystarczyć. Napełnić komorę młynka kriogenicznego ciekłym azotem (LN2)2 do linii napełnienia.
    OSTRZEŻENIEWszystkie etapy obejmujące LN22 Należy przeprowadzić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu; młyn mrożący powinien znajdować się w takim miejscu, aby uniknąć ryzyka uduszenia. Należy stosować środki ochrony indywidualnej, w tym odpowiednie obuwie, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, bazową warstwę rękawiczek nitrylowych, następnie rękawice termiczne, a na koniec kolejną parę rękawiczek nitrylowych. Podczas pracy z LN należy zachować najwyższą ostrożność.2.
  2. Powoli zamknij pokrywę młyna kriogenicznego, aby uniknąć rozpryskiwania LN22 i odczekać kilka minut, aż urządzenie ostygnie. Może być konieczne ponowne napełnienie komory LN2.2 aby zrekompensować ubytki wynikające z odparowania przed przejściem do następnego etapu.
    UWAGA: Uzupełnić LN22 w razie potrzeby, maksymalnie do linii napełniania. Nie należy przepełniać komory, ponieważ może to być niebezpieczne i szkodliwe dla urządzenia. Dla młynków kriogenicznych dostępne są automatyczne systemy uzupełniania, które mogą w razie potrzeby uzupełniać odparowujący LN2 bezpośrednio ze zbiornika magazynowego podłączonego do młynka.
  3. Wstępnie schłodzić duże probówki do mielenia oraz magnetyczny pręt uderzeniowy, zanurzając je w ciekłym azocie (LN2).2 przechowywany w oddzielnym małym naczyniu Dewara. Odlać cały LN22 kiedy LN2 przestaje bąbelkować. Następnie należy przenieść próbkę/popcorn drożdżowy do fiolki mielącej i szczelnie zamknąć ją za pomocą dwóch końcówek z stali nierdzewnej.
    1. Nie należy wypełniać fiolki do mielenia próbką w więcej niż jednej trzeciej jej objętości, ponieważ może to obniżyć wydajność procesu. Większe próbki można przetworzyć, dzieląc je na dwie lub więcej fiolek i mieląc je sekwencyjnie. W przypadku mniejszych próbek (do 3 ml) można zastosować mniejsze fiolki do mielenia.
  4. Umieść fiolkę do mielenia w komorze młyna kriogenicznego i zablokuj ją. Zamknij pokrywę.
  5. W przypadku drożdży pączkujących próbki należy mielić przez łącznie trzy cykle po 2 min/cykl (z 2-minutowymi przerwami na chłodzenie między cyklami) przy prędkości kruszenia wynoszącej 14. Po zatrzymaniu urządzenia po zakończeniu cykli należy powoli otworzyć pokrywę młyna kriogenicznego, ostrożnie odblokować probówkę z zamrożonym lizatem komórkowym w postaci proszku i wyjąć ją z urządzenia. W przypadku użycia wielu małych probówek należy sprawnie wyjmować je pojedynczo i umieszczać w suchym lodzie.
    UWAGA: Zazwyczaj nie ma potrzeby korygowania parametrów mielenia przy stosowaniu probówek o różnych rozmiarach dla tego samego rodzaju próbki. Niemniej jednak parametry mielenia, takie jak liczba cykli i szybkość mielenia, muszą zostać określone empirycznie dla różnych typów próbek, w zależności od łatwości ich lizy. Większość komórek ssaków i tkanek miękkich ulega lizie w 1-2 cyklach przy szybkości kruszenia wynoszącej 10. Próbki trudniejsze do lizy, takie jak bakterie, drożdże, larwy much i dorosłe muszki owocówki, wymagają 3-6 cykli przy maksymalnej szybkości, natomiast tkanki twarde, takie jak kości, zęby itp., mogą wymagać do 10 cykli. Przed i po mieleniu niewielką alikwotę rozmrożonej próbki można obejrzeć pod mikroskopem, aby policzyć liczbę nienaruszonych, nielizowanych komórek w celu określenia wydajności lizy. Wcześniej opublikowano znakomitą analizę wpływu parametrów kriomielenia na uwalnianie białek i DNA z drożdży pączkujących.15.
  6. Pracując szybko, aby nie dopuścić do rozmrożenia próbki, należy ostrożnie odkręcić jeden z elementów końcowych (wybierając ten, który wydaje się nieco poluzować podczas mielenia), używając narzędzia do otwierania. Następnie, za pomocą długiej pęsety (wcześniej schłodzonej w pojemniku z suchym lodem), należy wyjąć pręt uderzający. Sproszkowaną próbkę zbiera się poprzez odwrócenie i opukanie fiolki do mielenia nad polistyrenową szalką wagową, uprzednio schłodzoną w LN2.2 i przechowywano na suchym lodzie.
  7. Po odzyskaniu całego sproszkowanego mrożonego lizatu komórkowego z fiolki do rozcierania, przelać sproszkowany lizat z naczynia wagowego z powrotem do probówki 50 ml i niezwłocznie przystąpić do opisanego poniżej etapu powolnego rozmrażania, aby uzyskać najlepsze wyniki. Alternatywnie, mrożony sproszkowany lizat można przechowywać przez noc w temperaturze -80 °Cchoć może to doprowadzić do częścikowej degradacji.
  8. Przygotuj naczynie z 50% zawiesiną lodu i wody i umieść je na mieszadle magnetycznym z mieszadłem. Zanurz w zawiesinie lodowej statyw druciany lub inny odpowiedni statyw do utrzymania próbek.
    1. Następnie powoli rozmrozić próbki w kąpieli z zawiesiny lodowej, stale mieszając zawiesinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodawać lód w celu zastąpienia lodu, który się roztopił (być może konieczne będzie odlanie części wody, aby zapobiec przelaniu się naczynia z lodem). Ponieważ kilka inhibitorów ma krótki okres półtrwania w buforach wodnych, dodać dodatkowy koktajl inhibitorów proteaz (patrz Tabela materiałów) i 10 μM inhibitor proteasomów MG-132 do lizatu, gdy próbki zaczną tajać (po około 30 min).
    2. Co 5 minut usuwaj lód utworzony na zewnętrznych ściankach probówek, aby przyspieszyć proces rozmrażania. Należy pamiętać, że szybkie rozmrażanie próbek w temperaturze pokojowej lub wyższej może prowadzić do ich znacznej degradacji.
  9. Po całkowitym rozmrożeniu próbek (co, w zależności od ich ilości, może zająć ponad godzinę), odwirować lizat przy przyspieszeniu ok. 3220 g przez 20 min w chłodzonej wirówce nakładkowej przy 4 °C aby usunąć większość szczątków komórkowych z lizatu.
  10. Przenieś nadsącz do schłodzonych wcześniej na lodzie poliwęglanowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wiruj próbki z przyspieszeniem 16 000 g przez 20 min w temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów).
  11. Bardzo powoli i ostrożnie przenieś tylko przejrzysty nadsącz, składający się z oczyszczonego ekstraktu z całych komórek, z centrum kolumny cieczy w probówce, aby nie zaburzyć mętnej warstwy lipidowej (Rycina 2), do schłodzonej probówki o pojemności 15 ml, używając uprzednio schłodzonych pipet serologicznych. Należy unikać pobierania całego lizatu z probówki do wirowania, aby zapobiec przeniesieniu lipidów i zanieczyszczeń. Pozostały w probówce do wirowania lizat można wirować wielokrotnie, aby po każdym cyklu odzyskać niewielkie ilości ekstraktu.
    UWAGA: Lipidy wraz z wszelkimi zdenaturowanymi białkami mają mętny lub mleczny wygląd i znajdują się na granicy fazy ciekłej i powietrznej, a okazjonalnie powyżej samego osadu, który składa się z nierozpuszczalnych resztek komórkowych (Rysunek 2).

Schemat frakcjonowania komórkowego: warstwa lipidowa, ekstrakt z całych komórek, osad z zdenaturowanymi białkami.
Rycina 2: Warstwy ekstraktu w probówce do wirowania. Wskazano główne widoczne cechy ekstraktu z całych komórek w probówce po wirowaniu przy 16,000 g przez 20 min. Względna ilość każdego z tych elementów zależy od rodzaju próbki, fazy wzrostu komórek (eksponencjalnej w stosunku do stacjonarnej), ilości buforu do lizy użytego do resuspensji komórek oraz wydajności lizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wirować pozostały lizat przez 5 min, aby odzyskać więcej ekstraktu. W razie potrzeby powtórzyć to 5-minutowe wirowanie wielokrotnie, aby odzyskać jak największą ilość klarownego ekstraktu. Odrzucić mętny lizat zawierający lipidy, znajdujący się przy dnie probówki w pobliżu osadu.
  2. Wykorzystać uzyskane ekstrakty w dalszych zastosowaniach, takich jak oczyszczanie kompleksów białkowych, immunoprecypitacja oraz analiza proteomiczna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównaliśmy dwie różne metody lizy komórek drożdży, mianowicie rozcieranie z użyciem szklanych kulek w temperaturze 4 °C oraz zautomatyzowaną metodę kriomielenia w temperaturze -196 °C, aby ocenić względną odzyskiwalność białek w ekstraktach komórkowych przygotowanych obiema metodami. W badaniu tym zdecydowaliśmy się na użycie szczepu drożdży pączkujących YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ograniczeniem w badaniu natywnych białek drożdży jest nieefektywna liza komórek drożdży ze względu na ich twardą ścianę komórkową. Chociaż opracowano kilka metod, najbardziej spójną i wydajną metodą w naszych rękach jest kriomielenie komórek drożdży zamrożonych błyskawicznie jako popcorn. Ta metoda pozwala na niezawodne przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z całych komórek z pączkujących drożdży w porównaniu z innymi metodami lizy. Reprezentatywne wyniki wykazały, że kriomielenie jest lepsze od popularnej mechaniczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania w laboratorium Gunjan są wspierane przez fundusze z National Institutes of Health, National Science Foundation i Departamentu Zdrowia Florydy. Dziękujemy studentowi studiów licencjackich Johnowi Parkerowi za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki poliwęglanowe 50 ml z nakrętkamiBeckman357002Probówki wirówkowe
BD Bacto PeptoneBD Biosiences211677Drożdże Składnik podłoża YPD
Ekstrakt drożdżowy Bacto BDBiosiences212750Składnik pożywki drożdżowej YPD
Wirówka Beckman AvantiBeckmanB38624Wirówka szybkoobrotowa
Beckman JLA-9.1000Beckman366754Rotor
D-(+)-dekstroza bezwodnaMP Biomedicals901521Drożdże YPD składnik podłoża
Eppendorf A-4-44Eppendorf22637461Obrotowy wirnik kubełkowy
Eppendorf Wirówka z chłodzeniem Eppendorf 5810 REppendorf22625101Wirówka z chłodzeniem
GlicerolSIGMA-ALDRICHG5150-1GAOgranicznik objętości i krioprotektant
HEPESFisherBiotechBP310-100Bufor
Przeciwciało HIS6Przeciwciało Novagen70796dla znacznika HIS
KClSIGMA-ALDRICHP9541-1KGSól do utrzymania siły jonowej
MG-132CALBIOCHEM474790Inhibitor proteasomu
Koktajl inhibitorów fosfatazyThermoFisher ScientificA32957Koktajl inhibitorów fosfatazy
Ponceau SSIGMAP7170-1Lbiałkowej ThermoFisher
ScientificA32963Koktajl inhibitorów proteazy
Rotor JLA 25.500BeckmanJLA 25.500Rotor
Maślan soduEM ScienceBX2165-1Inhibitor deacetylazy histonowej
Fluorek soduSigma-AldrichS6521Inhibitor fosfatazy
Wanadan soduMP Biomedicals159664Inhibitor fosfatazy
Sodu β-glicerofosforanAlfa Aesar13408-09-8Inhibitor fosfatazy
Młyn zamrażarkowy Spex Certiprep 6850SPEX Przygotowanie próbki6850Młyn zamrażarkowy
TALON Powinowactwo do metalu ŻywicaBD Biosiences635502Do ściągania białek oznaczonych tagiem HIS
Tween 20VWR InternationalVW1521-07Niejonowy detergent
i beta;-merkaptoetanolAMRESCOM131-250MLŚrodek redukujący
Koktajl inhibitorów proteazy

Bibliografia

  1. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  2. Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
  3. Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
  4. Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
  5. Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
  6. Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
  9. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  10. Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  12. Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
  13. Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
  14. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751(2010).
  15. Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
  16. Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
  17. Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
  18. Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295(2012).
  19. Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
  20. Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
  21. Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
  22. Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468(2019).
  23. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101(2014).
  24. Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
  25. Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
  26. Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
  27. Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
  28. da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
  29. Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
  30. Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
  31. Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ciek y azotlizy kom rek dro d yekstrakcja bia ekizolacja kwas w nukleinowychrozbijanie kom rekm yn automatycznyprzygotowanie pr bekinhibicja proteaz
Przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.