Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61169

⸱

15 sierpnia 2020

 , 
1Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, Greece, 2Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, 70013, Crete, Greece

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Streszczenie

Walka z ludzkimi patologiami neurodegeneracyjnymi i zarządzanie ich wszechobecnym wpływem społeczno-ekonomicznym staje się globalnym priorytetem. Pomimo ich szkodliwego wpływu na jakość życia człowieka i system opieki zdrowotnej, większość chorób neurodegeneracyjnych u ludzi nadal pozostaje nieuleczalna i nie można im zapobiec. W związku z tym opracowanie nowatorskich interwencji terapeutycznych przeciwko takim chorobom staje się pilną potrzebą. Związane z wiekiem pogorszenie obwodów i funkcji neuronów jest ewolucyjnie zachowane w organizmach tak różnych, jak niski robak Caenorhabditis elegans i ludzie, co oznacza podobieństwa w podstawowych mechanizmach komórkowych i molekularnych. C. elegans jest wysoce plastycznym modelem genetycznym, który oferuje dobrze scharakteryzowany układ nerwowy, przezroczystość ciała oraz różnorodny repertuar technik genetycznych i obrazowych do oceny aktywności neuronalnej i kontroli jakości podczas starzenia się. W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywnymi kanałami jonowymi (np. Deg-3 (d) i MEC-4 (d)) oraz neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym (np. α-syuncleiną i poliglutaminianem), w celu monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw rozpadu neuronów związanego z wiekiem. Połączenie tych zwierzęcych modeli neurodegeneracji wraz z genetycznymi i farmakologicznymi badaniami przesiewowymi modulatorów śmierci komórkowej doprowadzi do bezprecedensowego zrozumienia związanego z wiekiem załamania funkcji neuronów i dostarczy krytycznych informacji o szerokim znaczeniu dla zdrowia i jakości życia ludzi.

Wprowadzenie

Przez ostatnie dwie dekady, C. elegans był szeroko stosowany jako organizm modelowy do badania molekularnych mechanizmów martwiczej śmierci komórek. C. elegans oferuje wyjątkowo dobrze scharakteryzowany i zmapowany układ nerwowy, przezroczystą strukturę ciała oraz różnorodny repertuar metod genetycznych i obrazowych do monitorowania in vivo funkcji komórkowych i przeżycia przez cały okres starzenia się. W związku z tym opracowano już kilka modeli genetycznych neurodegeneracji C. elegans w celu oceny żywotności neuronów. W szczególności dobrze opisane i używane modele nicieni obejmują martwicę wywołaną nadpobudliwym kanałem jonowym1,2,3 oraz śmierć komórki wywołana zwiększoną agregacją białek4,5,6,7,8,9,10 i heat stroke11,12, między innymi.

Krótkotrwała ekspozycja na subletalne temperatury zapewniała odporność na martwiczą śmierć komórki, wywołaną przez późniejszy stres cieplny zarówno u nicieni, jak i u neuronów ssaków11. Co ciekawe, codzienne kondycjonowanie nicieni w łagodnej podwyższonej temperaturze chroni przed neurodegeneracją, która jest wywoływana przez różne bodźce, takie jak brak równowagi jonowej (np. Mec-4(U231) i/lub Deg-3(U662)) i agregacja białek (np. α-synukleina i poliQ40)11,13.

Tutaj opisujemy wszechstronne metodologie wykorzystujące C. elegans do monitorowania i oceny zależnej od wieku neurodegeneracji w dobrze znanych modelach chorób ludzkich, takich jak śmierć komórek wywołana ekscytotoksycznością, choroba Parkinsona i Huntingtona. Ponadto podkreślamy neuroprotekcyjną rolę wstępnego kondycjonowania ciepła w kilku modelach neurodegeneracji. Połączenie tych technik wraz z genetycznymi i/lub farmakologicznymi badaniami przesiewowymi doprowadzi do identyfikacji i scharakteryzowania nowych modulatorów śmierci komórkowej, które mogą mieć potencjalne znaczenie terapeutyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Martwicza śmierć komórek wywołana przez nadpobudliwe kanały jonowe

UWAGA: Mutacje zwiększające funkcjonalność w rodzinie genów degeneryn, w tym między innymi mec-4 i deg-3, powodują generowanie nadpobudliwych kanałów jonowych, które powodują martwiczą śmierć komórek sześciu neuronów receptora dotyku wymaganych do mechanosensacji u robaków3. Nekroza wywołana nieprawidłową stymulacją degeneryn wykazuje kilka mechanistycznych i morfologicznych podobieństw do ekscytotoksyczności u ssaków. Utrzymanie metabolizmu energetycznego i homeostazy wapnia odgrywa kluczową rolę w przeżywalności neuronów podczas martwicy11. Następujące szczepy mogą być używane do monitorowania martwiczej śmierci komórek wywołanej przez nadaktywne kanały jonowe, mec-4(u231)X i deg-3(u662)V.

  1. Utrzymanie, synchronizacja i przygotowanie zmutowanych robaków do badania martwiczej śmierci komórek
    1. Dzień 1: Wybierz larwy L4 zmutowanych nicieni mec-4 (u231) lub deg-3 (u662) na pożywkę wzrostu nicieni (NGM; Tabela 1) płytki wysiane Escherichia coli (OP50) za pomocą stereomikroskopu preparacyjnego.
    2. Umieść 10 nicieni L4 na wysiewanej płytce NGM i hoduj je w standardowej temperaturze 20 °C.
    3. Dzień 5: Umyj płytki 1 ml buforu M9 (Tabela 1) i zbierz zwierzęta do probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s i usunąć supernatant.
    5. Dodać 0,5 ml roztworu wybielającego (7 mlH2O, 1 ml 5 N NaOH i 2 ml wybielacza).
      UWAGA: Roztwór wybielający stopniowo traci swoją skuteczność; dlatego należy go przygotowywać codziennie.
    6. Wiruj i monitoruj okresowo, aż robaki się rozpuszczą.
      UWAGA: Unikaj wybielania przez okres dłuższy niż 5 minut, ponieważ wpłynie to na żywotność zarodków.
    7. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s i usunąć supernatant.
    8. Umyć dwukrotnie osadki (jaja) 1 ml buforu M9.
    9. Po umyciu jaja ponownie zawiesić w 200 μl buforu M9 i inkubować je przez 25 minut w temperaturze 34 °C w łaźni wodnej.
    10. Utrzymywać oddzielną grupę próbek kontrolnych (jaja) w temperaturze 20 °C.
    11. Odpipetować 100 μl jaj kontrolnych lub poddanych szokowi termicznemu i umieścić je na niewysiewanych płytkach NGM. Każdy talerz zawiera co najmniej 100-200 jaj.
    12. Jaja inkubowały się w temperaturze 20 °C aż do wyklucia.
  2. Montaż larw L1 do badania za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC; Nomarsky) mikroskopia
    1. Przygotuj 2% płatki agarozowe.
    2. Użyj 1 ml buforu M9 do umycia płytek i zbierz larwy L1 nicienie do probówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s.
    4. Usunąć supernatant i zachować osad (nicienie).
    5. Dodać 100 μl 20 mM buforu M9/lewamizolu, aby znieczulić nicienie.
      UWAGA: Unikaj azydku sodu jako środka znieczulającego. Azydek sodu wyzwala uszkodzenia mitochondriów i stres oksydacyjny, co ostatecznie prowadzi do indukcji śmierci komórki
    6. Odpipetować 10 μl buforu M9/lewamizolu zawierającego robaki L1 i umieścić je na 2% płatkach agarozowych (Tabela 1).
    7. Delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.
      UWAGA: Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować wilgotność przez cały proces obrazowania.
    8. Obserwuj robaki za pomocą różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC; Nomarsky) mikroskopia.
    9. Oceń neurodegenerację sześciu neuronów receptora dotyku, licząc komórki o charakterystycznym wakuolizowanym wyglądzie na nicienie.

2. Neurodegeneracja wywołana agregatem białkowym

UWAGA: Następujące szczepy mogą być użyte do zbadania neurotoksyczności wywołanej przez agregaty białkowe: (A) nadekspresja ludzkiej α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] i (B) nadekspresja ludzkiego białka poliglutaminy (PolyQ) pan-neuronalnie, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.

  1. Utrzymanie, synchronizacja i przygotowanie nicieni transgenicznych do badania neurodegeneracji
    1. Użyj mikroskopu stereoskopowego do monitorowania rozwoju i wzrostu C. elegans.
    2. Dzień 1: Zsynchronizuj populację nicieni transgenicznych, wybierając i przenosząc 15-20 larw L4 z każdego szczepu na świeżo wysiane płytki NGM z nasionami OP50.
      UWAGA: Użyj co najmniej trzech płytek z każdego szczepu na warunek.
    3. Przeprowadzić inkubację i pozwolić nicieniom rosnąć w standardowej temperaturze 20 °C.
    4. Dzień 2: Przeprowadzać codzienne kondycjonowanie wstępne przez 30 minut, przenosząc płytki do inkubatora ustawionego na temperaturę 34 °C. Następnie należy zwrócić wstępnie przygotowane nicienie z powrotem do standardowej temperatury 20 °C.
      UWAGA: Różne tła genetyczne mogą być wrażliwe na wysoką temperaturę przez długi czas.
    5. (A) Jeśli badasz nadekspresję ludzkiej α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: w dniu 9 monitoruj 7-dniowe nicienie transgeniczne pod kątem śmierci dopaminergicznej komórki neuronalnej.
    6. (B) Jeśli badasz nadekspresję ludzkiego białka poliglutaminy (PolyQ) panneuronalnie, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: w dniu 5 zmierz neuronalne agregaty PolyQ w obszarze głowy 4-dniowych zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję Q40::YFP.
  2. Montaż próbek do badania mikroskopowego
    1. Przygotuj 2% płatki agarozowe (Tabela 1).
    2. Dodać 10 μl 20 mM kropli buforowej M9/lewamizolu na środek podkładki agarozowej.
    3. Wybierz odpowiednie nicienie transgeniczne i przenieś je w kropli M9/lewamizolu.
      UWAGA: Umieść 20-30 nicieni w kropli.
    4. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na wierzch próbki.
      UWAGA: Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zachować wilgotność przez cały proces obrazowania.
    5. Przystąp do badania mikroskopowego odpowiednich próbek.
  3. Proces akwizycji i analiza danych dotyczących transgenicznych nicieni wykazujących współekspresję α-synukleiny i cytozolowego GFP w neuronach dopaminergicznych
    1. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego połączonego z kamerą (np. EVOS FL Auto 2).
    2. Wykrywaj i rejestruj obrazy obszaru głowy w z-stacku przy 20-krotnym powiększeniu.
    3. Zapisuj i zbieraj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności.
    4. Przejdź do analizy pozyskanych obrazów.
    5. Zbadaj transgeniczne robaki pod kątem neurodegeneracji, oceniając następujące cechy komórkowe: (i) utrata fluorescencji z neuronów wyrażających GFP pod promotorem dat-1, (ii) neurony wykazujące pęcherzyki somy i / lub aksonów, wyrostki lub utratę dendrytyki.
    6. Importuj i analizuj dane za pomocą pakietu oprogramowania (np. Excel).

3. Proces akwizycji i analiza danych transgenicznych nicieni wykazujących panneuronalną ekspresję PolyQ40 połączonego z YFP

  1. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego połączonego z kamerą (np. EVOS FL Auto 2).
  2. Wykrywaj i rejestruj obrazy obszaru głowy w z-stacku przy 20-krotnym powiększeniu.
  3. Zapisuj i zbieraj obrazy projekcji o maksymalnej intensywności.
  4. Przejdź do analizy uzyskanych obrazów za pomocą oprogramowania Fiji.
  5. Otwórz obrazy za pomocą Fiji program14.
  6. Wybierz polecenie Podziel kanały za pomocą menu rozwijanego Obraz i kolor.
    UWAGA: Zachowaj zielony obraz kanału.
  7. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie ustawić obszar zainteresowania fluorescencyjny (ROI; np. głowa).
  8. Dodaj odpowiedni zwrot z inwestycji w Menedżerze zwrotu z inwestycji za pomocą menu rozwijanego Analiza i narzędzia.
  9. Odejmij tło do 50%, wybierając Przetwarzaj i Odejmij tło.
  10. Ustawianie i stosowanie wartości progowych za pomocą polecenia menu Obraz | Dostosuj | Próg. Zachowaj i ustaw te same wartości progowe podczas analizy obrazu w całym eksperymencie.
  11. Wybierz odpowiedni zwrot z inwestycji w Menedżerze zwrotu z inwestycji.
  12. Analizuj liczbę agregatów białkowych za pomocą polecenia menu Analizuj i analizuj cząstki.
  13. Powtórz kroki 3.5-3.12 dla każdego uzyskanego obrazu.
  14. Skopiuj wyświetlane wartości z osobnego okna Wyniki.
  15. Wklej/importuj i analizuj wyniki za pomocą pakietu oprogramowania.

4. Raport analizy statystycznej

  1. Użyj co najmniej 30 nicieni dla każdego warunku doświadczalnego. Wykonać trzy kontrpróby biologiczne.
  2. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeprowadzić test t-Studenta (porównanie między dwiema grupami) lub ANOVA (porównanie między wieloma grupami) do analizy statystycznej z p < 0,05 jako istotnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nekroza komórek wywołana przez nadaktywne kanały jonowe
Stosując przedstawione tutaj procedury, embriony mutantów mec-4(u231) oraz deg-3(u662) inkubowano przez 25 min w temperaturze 34 °C lub utrzymywano w standardowej temperaturze 20 °C. Po wykluciu określono liczbę martwych komórek neuronalnych w stadium larwalnym L1 w obu grupach. Nekroza komórek jest ograniczona u nicieni wyklutych z jaj poddanych wstępnemu przygotowaniu w formie szoku termicznego (Rysunek 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wzrostu, synchronizacji i badania mikroskopowego niektórych wszechstronnych modeli C. elegans badających neurodegenerację zależną od wieku. W szczególności oceniamy i analizujemy komórkowe i molekularne podstawy rozpadu neuronów związanego z wiekiem za pomocą nekrozy wywołanej hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczności wywołanej agregatem białkowym 1,2,3,4,5,7,9,10,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Chaniotakis M. i Kounakis K. za nagranie i edycję wideo. K.P. jest finansowany z grantu Greckiej Fundacji Badań i Innowacji (HFRI) oraz Sekretariatu Generalnego ds. Badań i Technologii (GSRT). N.T. jest finansowany z grantów Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC – GA695190 – MANNA), Programów Ramowych Komisji Europejskiej, oraz greckie Ministerstwo Edukacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarSigma-Aldrich5040
AgaroseBiozym8,40,004
AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Odwodnienie chlorku wapnia (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
Cholesterol SERVA Elektroforeza17101.01
deg-3(u662)V lub deg-3(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 ° C
Mikroskop DIC (Nomarsky)ZeissAxio Vert A1
Nikon CorporationSMZ645
Mikroskop epifluorescencyjnyThermo Fisher ScientificEVOS Cell Imaging Systems
Escherichia coli Szczep OP50Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)
Greiner Petri naczynia (60 mm x 15 mm)OprogramowanieSigma-AldrichP5237
Fidżi
https://fiji.sc KH2PO4EMD Millipore1,37,010
K2HPO4EMD Milipore1,04,873
Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
mec-4(u231)X lub mec-4(d)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 ° C
Szkiełka mikroskopowe (75 mm x 25 mm x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Szkło nasadkowe mikroskopu (18 mm x 18 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen01 010 30
Pakiet oprogramowania Microsoft Office 2011 ExcelMicrosoft Corporation, Redmond, USA
Na2HPO4EMD Milipore1,06,586
Pożywka dla nicieni (NGM) Płytki agarowe
Roztwór podstawowy nystatynySigma-AldrichN3503
PeptonBD, Bacto211677
Bufor
Chlorek sodu (NaCl)EMD Milipor1,06,40,41,000
Standardowe wyposażenie do przygotowania płytek agarowych ( autoklaw, szalki Petriego itp.)
Standardowe wyposażenie do konserwacji ślimaków (wytrychy z drutu platynowego, inkubatory itp.)
oprogramowanie do analizy statystycznejGraphPad Software Inc., San Diego, Stany ZjednoczonePakiet oprogramowania GraphPad Prism
StreptomycinSigma-AldrichS6501
Chlorowodorek tetramizoluSigma-AldrichL9756
UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]Na życzenie: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL)
Mikroskop stereoskopowy do analizy obrazu fosforanowy

Bibliografia

  1. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
  2. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
  3. Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
  4. Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  5. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  6. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  7. Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
  8. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  9. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  10. Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
  11. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
  12. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
  13. Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337(2017).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurodegeneracja u C. elegansnekroza kanałów jonowychneurotoksyczność agregatów białkowychprzesiewy genetyczneprzesiewy farmakologicznemikroskopia fluorescencyjnamikroskopia DICprekondycjonowanie szokiem termicznymagregaty alfa-synukleinyśmierć neuronów dopaminergicznych
Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.