Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena szybkości syntezy białek de novo w Caenorhabditis elegans

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61170

⸱

12 września 2020

 ,  , 
1Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, Greece, 2Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, Heraklion, 70013, Crete, Greece

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy i opisujemy nieradioaktywną i nieinwazyjną metodę oceny syntezy białek de novo in vivo, wykorzystując nicienie Caenorhabditis elegans i odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Metodę tę można połączyć z genetycznymi i/lub farmakologicznymi badaniami przesiewowymi w celu zidentyfikowania nowych modulatorów syntezy białek.

Streszczenie

Utrzymanie zdrowego proteomu jest niezbędne dla homeostazy komórek i organizmów. Zaburzenie równowagi między kontrolą translacji a degradacją białek wywołuje wiele chorób związanych z wiekiem. Pogorszenie mechanizmów kontroli jakości proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się. Metody biochemiczne wykrywania syntezy białek de novo są nadal ograniczone, mają kilka wad i nie mogą być stosowane na żywych komórkach lub zwierzętach. Caenorhabditis elegans, będąc przezroczystym i łatwo modyfikowalnym genetycznie, jest doskonałym modelem do monitorowania tempa syntezy białek za pomocą technik obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy i opisujemy metodę pomiaru syntezy białek de novo in vivo z wykorzystaniem odzysku fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Zwierzęta transgeniczne wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych komórkach lub tkankach są napromieniowywane przez silne źródło światła, co powoduje fotowybielanie fluorescencyjne. Z kolei ocena odzysku fluorescencji oznacza syntezę nowych białek w komórkach i/lub tkankach będących przedmiotem zainteresowania. W związku z tym połączenie nicieni transgenicznych, interwencji genetycznych i/lub farmakologicznych wraz z obrazowaniem na żywo tempa syntezy białek może rzucić światło na mechanizmy pośredniczące w zależnym od wieku załamaniu proteostazy.

Wprowadzenie

Synteza i degradacja białek jest niezbędna dla homeostazy organizmu. Wiele chorób związanych z wiekiem jest wywoływanych przez wadliwą produkcję białek1,2. Aby zmierzyć globalne tempo translacji białek, istnieją techniki biochemiczne, takie jak profilowanie rybosomalne, które obejmuje głębokie sekwencjonowanie fragmentów mRNA chronionych przez rybosomy w celu monitorowania ekspresji, a także syntezę nowych białek3. Ta metoda, oprócz tego, że jest pośrednim odczytem szybkości translacji, ponieważ zwiększona asocjacja RNA z rybosomami niekoniecznie oznacza zwiększoną translację, ma wady techniczne, takie jak wysokie koszty i zapotrzebowanie na dużą ilość materiału wyjściowego. Z drugiej strony, metody oparte na proteomice pozwalają na bezpośrednią kwantyfikację białek poprzez impulsowe profilowanie metaboliczne, a następnie analizę spektrometrii mas4,5. Jest to jednak podejście półilościowe o ograniczonej rozdzielczości czasowej, którego nie można łatwo zastosować in vivo. Co więcej, znakowanie białka może być nierównomiernie rozłożone w badanym zwierzęciu/tkance. Co ważne, obie te metody mogą ukryć specyficzne dla tkanek lub komórek różnice w szybkości translacji białek odpowiednio w całych zwierzętach lub tkankach.

Caenorhabditis elegans to łatwy w użyciu organizm modelowy, który może być uprawiany w dużych ilościach6. Dodatkowo, jego genetyczna łagodność i przezroczystość pozwalają na obrazowanie na żywo in vivo. Protokół ten opisuje metodologię wykrywania szybkości syntezy białek za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Wykorzystujemy transgeniczną ekspresję białek fluorescencyjnych, zarówno w całym organizmie, jak i w określonych tkankach/komórkach. Zwierzęta transgeniczne mogą wyrażać GFP za pomocą promotora genu, który ulega szerokiej/globalnej ekspresji, lub promotora specyficznego dla tkanki do celowania w określone typy komórek. Technikę tę można rozszerzyć na określony promotor w celu zbadania szybkości syntezy określonego białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Zarówno transkrypcyjne, jak i translacyjne fuzje z fluoroforami mogą być wykorzystane do oceny translacji białek de novo w kilku tkankach. Szybkość syntezy białek można ocenić dla wielu rodzin białek, które lokalizują się w różnych przedziałach komórkowych, w tym w cytoplazmie, mitochondriach i jądrze7. Następujące szczepy są używane do monitorowania globalnego i neuronalnego tempa syntezy białek, N2; Np. [p ife-2GFP, pRF4], ife-2(ok306); Np.[p ife-2GFP, pRF4], N2; Np. [punc-119GFP, pRF4], edc-3(ok1427); Np. [punc-119GFP, pRF4], N2; Np. [psod-3GFP; pRF4]

1. Utrzymanie, synchronizacja i przygotowanie transgenicznych nicieni do monitorowania syntezy białek de novo

  1. Użyj stereomikroskopu preparacyjnego, aby ocenić etapy rozwoju i wzrost nicieni typu dzikiego (wt) i zmutowanych nicieni transgenicznych.
  2. Dzień 1: Użyj kilofa, aby wybrać i przenieść 10 larw L4 wt i zmutowanych zwierząt transgenicznych przenoszących pożądany fluorescencyjny reporter na płytki pożywki wzrostu nicieni (NGM) wysiane Escherichia coli (OP50) (Tabela 1).
    1. Wykonaj wytrych, wkładając platynowy drut do stożkowego końca szklanej pipety Pasteura, topiąc szkło w miejscu kontaktu na palniku Bunsena. Następnie spłaszcz koniec drutu platynowego w kształt szpatułki za pomocą dowolnego narzędzia (np. szczypiec lub młotka lekkiego).
    2. Zaszczepić pojedynczą kolonię bakterii E. coli (OP50) w kolbie zawierającej 50 ml płynnego podłoża Luria-Bertani (LB) i hodować przez 10 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min; Tabela 1). Następnie wysiewaj płytki NGM z 200 μl kultury bakteryjnej. Inkubuj wysiewane talerze w temperaturze pokojowej przez noc, aby umożliwić wzrost bakteryjnego trawnika.
  3. Inkubować i hodować nicienie w standardowej temperaturze 20 °C.
  4. Dzień 5: Płytki zawierają mieszaną populację transgenicznych robaków. Wybierz i przenieś 15 larw L4 z każdego szczepu na świeżo wysiane płytki OP50-NGM.
  5. Dzień 6: Wykonaj test FRAP i monitoruj szybkość syntezy białek w 1. dniu dorosłości.
  6. Przygotować i użyć płytek zawierających cykloheksymid NGM jako kontrolę pozytywną:
    UWAGA: Przygotować roztwór podstawowy cykloheksymidu, rozcieńczając go w wodzie do stężenia 10 mg/ml. Roztwór podstawowy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    1. Zabij bakterie, wystawiając płytki NGM na 15 minut światła UV (intensywność 222 μW/cm2).
    2. Dodać cykloheksymid na wierzch płytek z nasionami bakteryjnymi do końcowego stężenia 500 μg/ml w objętości agaru.
    3. Pozostaw talerze do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 30 minut.
    4. Przenieść nicienie transgeniczne wykazujące ekspresję psod-3GFP na nośnik i płytki zawierające cykloheksymid.
    5. Inkubować zwierzęta przez 2 godziny w standardowej temperaturze 20 °C.

2. Test FRAP z wykorzystaniem zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję reporterów tkanek somatycznych pife-2GFP i psod-3GFP

UWAGA: Monitoruj globalne tempo syntezy białek w całym ciele zwierzęcia. Te reportery transkrypcyjne prezentują różne poziomy ekspresji i są wszechobecne w wielu tkankach somatycznych, w tym w jelitach, gardłach i mięśniach ściany ciała.

  1. Zbierz i przenieś dorosłe 1-dniowe zwierzęta transgeniczne na indywidualne płytki NGM wysiane kroplą OP50 o pojemności 20 μl w środku.
  2. Zdejmij pokrywkę i umieść każdą płytkę pod soczewką obiektywową mikroskopu epifluorescencyjnego o powiększeniu 20x.
  3. Ustaw ostrość i uchwyć obraz referencyjny przed fotowybielaniem (przed wybielaniem).
  4. Wybielaj fotobiologicznie każdą próbkę przez 10 minut.
    UWAGA: Przerwij fotowybielanie, gdy sygnał fluorescencyjny zostanie wygaszony do intensywności 30 – 50% w stosunku do obrazu przed wybielaniem. Natężenie światła i czas trwania okresu bielenia powinny być odpowiednio dostosowane do konkretnego fluoroforu, stadium zwierzęcego oraz badanej komórki lub tkanki. Odpowiedni czas trwania napromieniania wymagany do osiągnięcia odpowiedniego stopnia fotowybielania dla różnych próbek powinien zostać określony doświadczalnie.
  5. Uchwyć obraz po fotowybielaniu (wybielaniu).
  6. Trzymaj zwierzęta na indywidualnych płytkach NGM i pozwól im dojść do siebie.
  7. Obrazować i rejestrować odzysk każdego reportera fluorescencyjnego co 1 godzinę przez co najmniej 6 godzin pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.
  8. Alternatywnie można przeprowadzić ocenę odzysku fluorescencji za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (np. AxioImager Z2).
  9. Dokładnie oceń stan zdrowia każdego zwierzęcia, monitorując jego lokomocję, wrażliwość na dotyk, zdolność rozrodczą i przeżywalność w ciągu najbliższych 3 dni. Nicienie wykazujące oznaki uszkodzeń po fotowybielaniu zostały wyłączone z dalszej analizy.

3. Montowanie próbek i przeprowadzanie testu FRAP przy użyciu transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję panneuronalnie cytoplazmatycznego GFP, punc-119GFP

UWAGA: Monitoruj syntezę białek panneuronalnych poprzez celowane fotowybielanie w obszarze głowy, gdzie znajduje się pierścień nerwowy.

  1. Przygotuj 2% płatki agarozowe.
  2. Dodać 10 μl kropli buforu M9 na środek podkładki z agarozy.
  3. Przenieś 5 transgenicznych nicieni eksprymujących panneuronalnie cytoplazmatyczny GFP do kropli buforu M9.
  4. Użyj rzęsy, aby rozprowadzić płyn.
    UWAGA: Zwierzęta wykazują zmniejszone ruchy w ciągu 2 minut z powodu absorancji M9 w agarze.
  5. Zmień pozycję nicienia, aby uniknąć nakładania się, używając szpikulca do "rzęs".
  6. Umieść próbkę pod soczewką obiektywową 40x mikroskopu epifluorescencyjnego.
    UWAGA: Nie używaj szkiełka nakrywkowego.
  7. Ustaw ostrość i uchwyć obraz referencyjny (przed wybielaniem).
  8. Fotowybielaj wybrany obszar zainteresowania przez 90 sekund.
    UWAGA: Przerwij fotowybielanie, gdy sygnał fluorescencyjny zostanie wygaszony do intensywności 30 – 50% w stosunku do obrazu przed wybielaniem. Natężenie światła i czas trwania okresu bielenia powinny być odpowiednio dostosowane do konkretnego fluoroforu, stadium zwierzęcego oraz badanej komórki lub tkanki. Odpowiedni czas trwania napromieniania wymagany do osiągnięcia odpowiedniego stopnia fotowybielania dla różnych próbek powinien zostać określony doświadczalnie.
  9. Uchwyć obraz po fotowybielaniu (wybielaniu).
  10. Dodać 10 μl kropli buforu M9 na nicienie wybielane
    11. foto.
  11. Pozwól zwierzętom dojść do siebie przez 5 minut.
  12. Za pomocą szpikulca "do rzęs" lub pipety przenieś nicienie na poszczególne płytki NGM wysiane 20 μl kropli OP50 w środku.
  13. Rejestruj obraz każdej próbki co 1 godzinę pod stereoskopowym mikroskopem epifluorescencyjnym.
    UWAGA: Policz t=0 dla czasu rekonwalescencji po fotowybielaniu.

4. Analiza danych z obrazów przechwyconych podczas testu FRAP

  1. Analizuj uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania (np. Fidżi).
  2. Otwórz obrazy za pomocą oprogramowania.
  3. Wybierz polecenie Podziel kanały za pomocą menu rozwijanego Obraz i kolor.
    UWAGA: Zachowaj zielony obraz kanału.
  4. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby ręcznie ustawić obszar zainteresowania fluorescencyjny (np. całe ciało, głowa, jelito).
  5. Wybierz polecenie Pomiar z menu rozwijanego Analizuj, aby zmierzyć średnią intensywność pikseli obszaru zainteresowania dla każdego punktu czasowego.
    UWAGA: Procent odzysku fluorescencji jest obliczany na podstawie obrazów referencyjnych wykonanych po fotowybielaniu.

5. Analiza statystyczna raportu

  1. Użyj co najmniej 20 – 25 nicieni każdego szczepu i/lub stanu.
    UWAGA: Należy przeprowadzić trzy kontrpróby biologiczne.
  2. Wykonaj test t-Studenta (porównanie między dwiema grupami) lub ANOVA (porównanie między wieloma grupami) do analizy statystycznej z P < 0,05 jako istotnym za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, do oceny szybkości syntezy białek zgodnie z odpowiednimi protokołami wykorzystano nicienie typu dzikiego oraz transgeniczne mutanty wykazujące następujące reportery somatyczne: pife-2GFP, psod-3GFP oraz punc-119GFP. W szczególności porównano robaki typu dzikiego oraz mutanty ife-2 wykazujące cytoplazmatyczne GFP w tkankach somatycznych z wykorzystaniem promotora ife-2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modulacja syntezy białek jest niezbędna dla homeostazy organizmu. Podczas starzenia się dochodzi zarówno do globalnej, jak i swoistej syntezy białek. Ostatnie badania ujawniają fakt, że równowaga translacji białek bezpośrednio kontroluje starzenie się, a starzenie się nie jest jedynie produktem ubocznym procesu starzenia. W szczególności podstawowe składniki maszynerii translacyjnej, takie jak eukariotyczny czynnik inicjacji 4E (eIF4E), który ułatwia capping mRNA podczas inicjacji translacji, a tym samym szybkość transla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Chaniotakis M. i Kounakis K. za nagranie i edycję wideo. K.P. jest finansowany z grantu Greckiej Fundacji Badań i Innowacji (HFRI) oraz Sekretariatu Generalnego ds. Badań i Technologii (GSRT). N.T. jest finansowany z grantów Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC – GA695190 – MANNA), Programów Ramowych Komisji Europejskiej, oraz greckie Ministerstwo Edukacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarSigma-Aldrich5040
AgarozaBiozym8,40,004
Płatki agarozowe 2%
Chlorek wapnia odwodniony (CaCl2?2H2O)Sigma-AldrichC5080
CholesterolSERVA Elektroforeza17101.01
cykloheksymidSigma-AldrichC-7698
Preparacyjny mikroskop stereoskopowyNikon CorporationSMZ645
edc-3(ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4]TavernarakisUtrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 ° C
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissAxio Imager Z2
Escherichia coli Szczep OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Stereomikroskop preparacyjny fluorescencyjnyZeissSteREO Lumar V12
Greiner Petri (60 x 15 mm)Sigma-AldrichP5237
ife-2(ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4]TavernarakisUtrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; Oprogramowanie do
analizy obrazuFidżihttps://fiji.sc
KH2PO4EMD Milipory1,37,010
K2HPO4EMD Millipore1,04,873
LB płynny
nośnik
bufor M9Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Szkiełka mikroskopowe (75 x 25 x 1 mm)Marienfeld, Lauda-Koenigshofen10 006 12
Pakiet oprogramowania Microsoft Office 2011 ExcelMicrosoft Corporation, Redmond, USA
em>N2; Ex[pife-2GFP; pRF4]TavernarakisUtrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; C
N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]TavernarakisUtrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; C
N2; Ex[punc-119GFP; pRF4]TavernarakisUtrzymuj zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; C
Na2HPO4EMD Milipory1,06,586
Pożywka wzrostowa nicieni (NGM) Płytki agarowe
podstawowy nystatynySigma-AldrichN3503
PeptonBD, Bacto211677
Bufor
Chlorek sodu (NaCl)EMD Millipore1,06,40,41,000
Standardowe wyposażenie do przygotowania płytek agarowych (autoklaw, szalki Petriego itp.)
Standardowe wyposażenie do konserwacji ślimaków (wytrychy z drutu platynowego, inkubatory itp.).
oprogramowanie do analizy statystycznejGraphPad Software Inc., San Diego, Stany ZjednoczonePakiet oprogramowania GraphPad Prism
StreptomycinSigma-AldrichS6501
UV CrosslinkerVilber Lourmat BIO-LINK BLX 254
Ślimakowy pick
Laboratorium Laboratorium C <Laboratorium Laboratorium Laboratorium Roztwór fosforanowy

Bibliografia

  1. Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
  2. Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).
  3. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  4. Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
  5. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  7. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547(2009).
  8. Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
  9. Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
  10. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
  11. Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).
  12. Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).
  13. Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Szybkość syntezy białekodzyskiwanie fluorescencji po fotoblaknięciunicienie transgenicznetest FRAPkontrola cykloheksymidowamikroskopia epifluorescencyjnatranslacja mRNAstarzenie się proteostazyneuronalna ekspresja GFP
Ocena szybkości syntezy białek de novo w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.