Artykuł metodologiczny

Aklimatyzacja przed dootrzewnowym testem tolerancji insuliny w celu złagodzenia hiperglikemii wywołanej stresem u przytomnych myszy

DOI:

10.3791/61179

⸱

22 maja 2020

 ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wywołane stresem podwyższenie poziomu glukozy może zakłócić interpretację danych pochodzących ze świadomego dootrzewnowego testu tolerancji insuliny u myszy. W tym artykule opisujemy metodę przyzwyczajania myszy do obsługi, iniekcji i pobierania krwi przed wykonaniem testu tolerancji insuliny w celu ograniczenia hiperglikemii wywołanej stresem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test tolerancji insuliny jest powszechnie stosowany w badaniach metabolicznych do oceny wrażliwości całego organizmu na insulinę u gryzoni. Jest to stosunkowo prosty test, który polega na pomiarze poziomu glukozy we krwi w czasie po pojedynczym dootrzewnowym wstrzyknięciu insuliny. Biorąc pod uwagę, że jest wykonywany w stanie świadomości, a krew jest często pobierana za pomocą obcinacza ogona, może wywołać reakcję stresową u zwierząt z powodu niepokoju związanego z obchodzeniem się i pobieraniem krwi. W związku z tym może dojść do wzrostu stężenia glukozy we krwi wywołanego stresem, co utrudnia wykrycie i interpretację pierwszorzędowego punktu końcowego, a mianowicie obniżenia stężenia glukozy we krwi za pośrednictwem insuliny. Zaobserwowano to w wielu szczepach myszy i jest dość powszechne u myszy z cukrzycą db / db, gdzie poziom glukozy może wzrosnąć, a nie spaść po podaniu insuliny. W tym miejscu opisujemy metodę aklimatyzacji myszy do obsługi, iniekcji i pobierania próbek krwi przed wykonaniem testu tolerancji insuliny. Odkryliśmy, że obniża to hiperglikemię wywołaną stresem i skutkuje danymi, które dokładniej odzwierciedlają wrażliwość całego organizmu na insulinę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy metaboliczne u gryzoni są rutynowo wykonywane w celu oceny różnych parametrów regulujących homeostazę glukozy1. Złotym standardem oceny działania insuliny w całym organizmie in vivo jest klamra hiperinsulinemiczno-euglikemiczna2. Ten test polega na podawaniu insuliny w celu podniesienia poziomu insuliny krążącej, podczas gdy glukoza jest podawana w infuzji w celu utrzymania euglikemii. Szybkość infuzji glukozy wymagana do utrzymania euglikemii wskazuje na działanie insuliny. Chociaż jest to potężne narzędzie w badaniach metabolicznych, technika zaciskania u myszy jest technicznie trudna i pracochłonna, a zatem nie nadaje się dobrze jako wstępne narzędzie przesiewowe do charakteryzowania fenotypu metabolicznego. Z tych powodów często wybiera się prostszy dootrzewnowy test tolerancji insuliny (ITT).

ITT jest wykonywane w stanie świadomości po okresie postu (zazwyczaj 4-6 godzin). Bolus insuliny podaje się dootrzewnowo, po czym poziom glukozy we krwi jest monitorowany przez czas, który zwykle trwa 60 minut. Oczekuje się, że poziom glukozy we krwi spadnie ze względu na zdolność insuliny do ułatwiania wychwytu glukozy do tkanek wrażliwych na insulinę; Stopień, w jakim to się dzieje, wskazuje na działanie insuliny w całym ciele. W niektórych przypadkach wykazano, że poziom glukozy paradoksalnie wzrasta, a nie spada po podaniu insuliny. Zjawisko to jest prawdopodobnie przypisywane reakcji na stres. Obsługa, zastrzyki i pobieranie krwi mogą wywoływać stres3,4,5, powodując aktywację osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA) i autonomicznego układu nerwowego (ANS)6,7,8. Powszechnie wiadomo, że zarówno HPA, jak i ANS przyczyniają się do wzrostu poziomu glukozy we krwi9,10,11. Obecność hiperglikemii wywołanej stresem na początku ITT jest problematyczna, ponieważ wpływa na tempo i wielkość spadku glukozy po podaniu insuliny12. Może to prowadzić do błędnych wniosków dotyczących obecności insulinooporności. W związku z tym, aby złagodzić mylący wpływ stresu na poziom glukozy podczas ITT, opracowaliśmy metodę aklimatyzacji myszy do obsługi, iniekcji i pobierania próbek krwi przed wykonaniem ITT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt VA Puget Sound Health Care System.

UWAGA: Lokalne wymagania dotyczące monitorowania i/lub interwencji zwierząt, które doświadczają hipoglikemii, mogą różnić się od tych opisanych tutaj.

1. Post (t= -210 min)

  1. Po zakończeniu ciemnego cyklu przenieś myszy do nowej klatki z niepożywną ściółką, taką jak ściółka celulozowa lub papierowa (nie ściółka z kolb kukurydzy, która wpłynie na metaboliczne punkty końcowe, jeśli zostanie spożyta przez myszy13). Zapewnij myszom ad libitum dostęp do wody przez cały okres postu. Bądź konsekwentny w kwestii pory dnia i czasu trwania postu w grupach myszy. W przypadku pokazanych danych, żywność została usunięta między godziną 0700 a 0800, czyli 1-2 godziny po zakończeniu ciemnego cyklu.
  2. Przenieś klatkę (klatki) do miejsca, w którym zostanie wykonany ITT. Powinna to być cicha przestrzeń, w której zminimalizowane są czynniki stresogenne, takie jak temperatura, hałas, światło czy ruch.

2. Aklimatyzacja (t= -150 do -60 min)

WAŻNE: Z myszami obchodź się tak delikatnie, jak to tylko możliwe. Jeśli to możliwe, należy unikać używania urządzenia przytrzymującego.

  1. Po -150 min zmierz masę ciała. Zostanie to wykorzystane do obliczenia objętości insuliny, która zostanie podana w ramach ITT.
  2. Delikatnie podnieś mysz za ogon i oprzyj się na płaskiej powierzchni blatu, nadal delikatnie chwytając ogon. Użyj igły 20 G (lub nożyczek chirurgicznych), aby wykonać małe nacięcie na czubku ogona. W tym miejscu powinna zacząć tworzyć się kropla krwi.
  3. Ustaw mysz na gładkiej, twardej powierzchni i delikatnie trzymaj mysz za ogon.
    1. Aby w tym czasie zarejestrować poziom glukozy we krwi, umieść kroplę krwi z końcówki ogona na pasku testowym ręcznego glukometru. W razie potrzeby bardzo delikatnie masuj ogon, aby uzyskać kroplę krwi.
  4. Pobrać 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do strzykawki insulinowej. Podnieś mysz za pomocą delikatnego szortowania i wstrzyknij dootrzewnowo. Zapisać czas wstrzyknięcia soli fizjologicznej.
    1. Jeśli badanych jest wiele myszy, wstrzyknij im sól fizjologiczną w odstępach 1-minutowych, aby dać czas na kolejne kroki poniżej.
  5. Po 15 minutach od wstrzyknięcia soli fizjologicznej delikatnie podnieś mysz za ogon. Użyj gazy, aby delikatnie usunąć skrzep krwi na końcówce ogona.
    1. Opcjonalnie: W tym momencie ponownie zarejestruj stężenie glukozy we krwi, jak opisano w kroku 2.3.
  6. Po 30 minutach od wstrzyknięcia soli fizjologicznej delikatnie podnieś mysz za ogon. W razie potrzeby wykonaj kolejny pomiar stężenia glukozy we krwi zgodnie z opisem w kroku 2.3.
  7. Przywróć mysz do klatki i powtórz tę czynność dla innych myszy, jeśli to konieczne. Pozostaw myszy w spokoju do -90 min.
  8. Po -90 minutach powtórz kroki od 2.3 do 2.6, w razie potrzeby uwzględniając pomiar poziomu glukozy we krwi.
  9. Umieść mysz z powrotem w klatce, w razie potrzeby powtórz dla innych myszy. Pozostaw myszy w spokoju do czasu ITT (dla którego wyjściowy pomiar stężenia glukozy we krwi wykonuje się po -5 minutach).

3. Test tolerancji insuliny (t= -5 do +60 min)

  1. Przygotować roztwór roboczy zwykłej insuliny (UWAGA) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, tak aby żądaną dawkę można było wstrzyknąć w dawce 4 μl/g masy ciała.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z insuliną, ponieważ przypadkowe wstrzyknięcie może spowodować hipoglikemię.
  2. Przygotuj 25% (v/v) roztwór dekstrozy w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby mieć go pod ręką w przypadku, gdy u myszy rozwinie się hipoglikemia wymagająca interwencji.
  3. Po -5 minutach delikatnie podnieś mysz za ogon. Określ w tym czasie wyjściowy poziom glukozy we krwi, umieszczając kroplę krwi z końcówki ogona na pasku testowym ręcznego glukometru. W razie potrzeby bardzo delikatnie masuj ogon, aby uzyskać kroplę krwi.
  4. Do strzykawki insulinowej pobrać roztwór roboczy insuliny (4 μl/g masy ciała, dla typowego zakresu dawek 0,5-2,0 j./kg). Podnieś mysz za pomocą delikatnego szortowania i wstrzyknij dootrzewnowo. Rekordowy czas wstrzyknięcia insuliny.
    1. Jeśli badanych jest wiele myszy, wstrzykuj im insulinę w odstępach 1-minutowych, aby dać czas na późniejsze pobranie krwi i zapisanie danych poniżej.
  5. Po 15 minutach od wstrzyknięcia insuliny delikatnie podnieś mysz za ogon. Użyj gazy, aby delikatnie usunąć skrzep krwi na końcówce ogona. W tym czasie ponownie oznacz poziom glukozy we krwi, jak opisano w kroku 3.3.
  6. Umieść mysz z powrotem w klatce i obserwuj oznaki hipoglikemii (np. nadmierny letarg). Jeśli u myszy wystąpią objawy hipoglikemii, należy zmierzyć poziom glukozy we krwi zgodnie z opisem w kroku 5 i w razie potrzeby podać dekstrozę. Mysz poddana interwencji dekstrozy zostałaby w tym czasie usunięta z protokołu ITT.
  7. Powtórz kroki 3.5 i 3.6 po 30 minutach od wstrzyknięcia insuliny.
  8. Powtórz kroki 3.5 i 3.6 po 45 minutach od wstrzyknięcia insuliny.
  9. Powtórz kroki 3.5 i 3.6 po 60 minutach od wstrzyknięcia insuliny.
  10. Wróć myszy do ich domowej klatki, zawierającej kilka granulek jedzenia na podłodze klatki, aby pomóc w powrocie do zdrowia po ITT. Kontynuuj monitorowanie przez 30 minut, a jeśli myszy nie odzyskały normalnej aktywności/zachowania, postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 3.6.
    UWAGA: Rysunek 1 podsumowuje powyższą procedurę aklimatyzacji i ITT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2A i Rysunek 3A to reprezentatywne dane (odpowiednio dane indywidualne i średnie) pokazujące paradoksalny wzrost poziomu glukozy we krwi u myszy z cukrzycą db/db w ciągu 15 minut po podaniu insuliny, zgodny z hiperglikemią wywołaną stresem. Należy zauważyć, że nie zaobserwowano wzrostu stężenia glukozy we krwi u kontrolnych rodzeństwa z miotu bez cukrzycy (db/+ lub +/+), które poddano tej samej procedurze. Aby ustalić, czy aklimatyzacja do procedury ITT była skute...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klamra hiperinsulinemiczno-euglikemiczna jest uważana za złoty standard oceny działania insuliny in vivo. Modyfikacje metodologii wykonywania zacisku spowodowały, że technika ta została wykonana na świadomych, nieskrępowanych myszach2, które zostały wcześniej cewnikowane przy użyciu systemu dwucewnikowego14, aby umożliwić pobieranie krwi przez tętnicę szyjną i wlewy przez żyłę szyjną. Ogranicza to konieczność dotykania lub krępowania myszy podczas zabiegu, zmniejszając w te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health P30 DK-017047 (University of Washington Diabetes Research Center, Cell Function Analysis Core) oraz Departament Spraw Weteranów Stanów Zjednoczonych, VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). Treść tego manuskryptu nie reprezentuje poglądów Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych ani Rządu Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dekstroza-50Pfizer Injectables00409-6648-16Do stosowania, jeśli mysz doświadcza hipoglikemii.
Płatki z gazyFisher Scientific22037907Do usuwania skrzepu krwi na końcu ogona.
GlukometrAccu-ChekM001_usDo pomiaru stężenia glukozy we krwi.
SkalaDo pomiaru masy ciała.
Insulina (Novolin R)Novo Nordisk0169-1833-11Do wstrzykiwań.
Strzykawki insulinoweVWRBD-329461Do wstrzykiwań.
Minutnik
Sterylna igła 20 GVWRBD-305175Do nożyc ogonowych.
Sterylna sól fizjologicznaLifeshield1261699Do wstrzykiwań.
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14088-10Do nożyc ogona.
Paski testoweAccu-Chek06908217001_usDo pomiaru poziomu glukozy we krwi.
gramowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  2. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
  3. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  4. Tabata, H., Kitamura, T., Nagamatsu, N. Comparison of effects of restraint, cage transportation, anaesthesia and repeated bleeding on plasma glucose levels between mice and rats. Lab Animal. 32 (2), 143-148 (1998).
  5. Olfe, J., Domanska, G., Schuett, C., Kiank, C. Different stress-related phenotypes of BALB/c mice from in-house or vendor: alterations of the sympathetic and HPA axis responsiveness. BMC Physiology. 10, 2(2010).
  6. Ghalami, J., Zardooz, H., Rostamkhani, F., Farrokhi, B., Hedayati, M. Glucose-stimulated insulin secretion: Effects of high-fat diet and acute stress. Journal of Endocrinological Investigation. 36 (10), 835-842 (2013).
  7. Thorens, B. Brain glucose sensing and neural regulation of insulin and glucagon secretion. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13, Suppl 1 82-88 (2011).
  8. Pekow, C. Defining, measuring, and interpreting stress in laboratory animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 41-45 (2005).
  9. Chan, O., Inouye, K., Riddell, M. C., Vranic, M., Matthews, S. G. Diabetes and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis. Minerva Endocrinol. 28 (2), 87-102 (2003).
  10. Rosmond, R. Role of stress in the pathogenesis of the metabolic syndrome. Psychoneuroendocrinology. 30 (1), 1-10 (2005).
  11. Nonogaki, K. New insights into sympathetic regulation of glucose and fat metabolism. Diabetologia. 43 (5), 533-549 (2000).
  12. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
  13. Zahorsky-Reeves, J., LW, C. Housing mice on corncob bedding versus hardwood chip may confound research models. American Association for Laboratory Animal Science. , AALAS Scientific Session (10 October) (2010).
  14. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. Journal of Biological Chemistry. 272 (36), 22570-22575 (1997).
  15. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  16. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  17. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  18. Barrett, A. M., Stockham, M. A. The effect of housing conditions and simple experimental procedures upon the corticosterone level in the plasma of rats. Journal of Endocrinology. 26, 97-105 (1963).
  19. Heinrichs, S. C. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 34 (5), 808-815 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aklimatyzacja myszyiniekcja doprzewnow ocznapomiar glikemiipobieranie pr bek metod naci cia ogonatestowanie myszy w stanie wiadomo ciwra liwo ca ego organizmu na insulinadaptacja do obchodzeniamodel myszy db db
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły