Method Article

Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek

DOI:

10.3791/61180

⸱

June 18th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnątrzkomórkowe DNA (ecDNA) uwalniane podczas śmierci komórki jest prozapalne i przyczynia się do stanu zapalnego. Pomiar ecDNA w miejscu urazu może określić skuteczność leczenia w narządzie docelowym. Protokół ten opisuje wykorzystanie narzędzia uczenia maszynowego do automatyzacji pomiaru ecDNA w tkance nerkowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śmierć komórek kłębuszków nerkowych jest patologiczną cechą zapalenia naczyń krwionośnych związanego z przeciwciałami cytoplazmatycznymi przeciwko neutrofilom (MPO-AAV). Zewnątrzkomórkowy kwas dezoksyrybonukleinowy (ecDNA) jest uwalniany podczas różnych form śmierci komórki, w tym apoptozy, martwicy, nekroptozy, zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i piroptozy. Pomiar tej śmierci komórki jest czasochłonny i wymaga kilku różnych biomarkerów do identyfikacji różnych biochemicznych form śmierci komórki. Pomiar ecDNA jest zwykle przeprowadzany w surowicy i moczu jako substytut uszkodzenia nerek, a nie w rzeczywistym narządzie docelowym, w którym dochodzi do patologicznego urazu. Obecna trudność w badaniu ecDNA w nerkach polega na braku metod dla tkanki zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE), zarówno eksperymentalnie, jak i w archiwalnych biopsjach ludzkich nerek. Protokół ten zawiera podsumowanie kroków wymaganych do barwienia ecDNA w tkance FFPE (zarówno ludzkiej, jak i mysjej), wygaszania autofluorescencji i pomiaru ecDNA w powstałych obrazach za pomocą narzędzia uczenia maszynowego z publicznie dostępnej wtyczki ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, którą można trenować w segmentacji Weka. Możliwa do wytrenowania segmentacja Weka jest stosowana do ecDNA w kłębuszkach nerkowych, gdzie program uczy się klasyfikować ecDNA. Ten klasyfikator jest stosowany do kolejnych pozyskanych obrazów nerek, zmniejszając potrzebę ręcznego dodawania adnotacji do każdego pojedynczego obrazu. Zdolność adaptacyjna możliwej do wytrenowania segmentacji Weka została dodatkowo wykazana w tkance nerkowej z eksperymentalnego mysiego kłębuszkowego zapalenia nerek (GN) przeciwko MPO, w celu identyfikacji NET i ecMPO, powszechnych patologicznych czynników przyczyniających się do anty-MPO GN. Metoda ta zapewnia obiektywną analizę ecDNA w tkance nerkowej, która wyraźnie pokazuje skuteczność, z jaką trenowalny program segmentacji Weka może odróżnić ecDNA od zdrowej, normalnej tkanki nerkowej od chorej tkanki nerkowej. Protokół ten można łatwo dostosować do identyfikacji ecDNA, NET i ecMPO w innych narządach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie naczyń związane z przeciwciałami cytoplazmatycznymi przeciwko mieloperoksydazie (MPO-AAV) jest chorobą autoimmunologiczną, która powoduje niewydolność nerek z powodu patologicznego uszkodzenia kłębuszków nerkowych ze znaczną śmiercią komórki i uwolnieniem kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)1,2. DNA może aktywować układ odpornościowy, działając jako sygnał zagrożenia. W normalnych, zdrowych warunkach lokalizacja jądrowa DNA zapewnia ochronę przed narażeniem na działanie układu odpornościowego. Własne DNA, które jest uwalniane zewnątrzkomórkowo podczas procesów patogennych lub autoimmunizacji, jest postrzegane przez układ odpornościowy jako silne białko molekularne związane z uszkodzeniem prozapalnym (DAMP)3. Pozakomórkowe DNA (ecDNA) jest uwalniane z umierających komórek poprzez kilka odrębnych mechanizmów, które są regulowane przez odrębne szlaki biochemiczne, takie jak apoptoza, nekroptoza, tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), nekroza lub pyroptoza4,5,6,7,8.

Opisujemy tutaj metody barwienia i pomiaru ecDNA uwolnionego z umierających komórek w odcinkach nerek z zatopioną w formalinie parafinie (FFPE) z eksperymentalnych biopsji anty-MPO GN i nerek od pacjentów z MPO-AAV9,10. Istnieje wiele metod wykrywania krążącego dwuniciowego DNA (dsDNA) i kompleksów DNA zarówno z surowicy, jak i moczu oraz z testów in vitro11,12. Metody te, choć dokładne w określaniu ilości ecDNA, nie określają, gdzie ecDNA jest uwalniane anatomicznie. Istnieją metody, które opisują specyficzny pomiar ecDNA, takie jak tunel dla apoptozy i pomiar szczątków komórkowych13,14. Nie ma metody, która opisywałaby pomiar ecDNA wynikającego ze wszystkich form śmierci komórki w nerkach FFPE, w których dochodzi do patologicznego uszkodzenia. Jest to ważne w celu ustalenia, czy eksperymentalne terapie terapeutyczne usuwają ecDNA z miejsc patologicznego uszkodzenia w rzeczywistym narządzie docelowym.

Akwizycja wielu obrazów z próbek nerek tworzy dużą ilość danych, które są zwykle analizowane przez jednego użytkownika. Jest to pracochłonne, czasochłonne i może być przedmiotem niewiarygodnej odtwarzalności przez innych użytkowników ze względu na stronniczość użytkownika. Trainable Weka segmentation to wtyczka oprogramowania typu open source dla ImageJ, która wykorzystuje najnowocześniejsze narzędzia bioinformatyczne do klasyfikowania pikseli za pomocą algorytmów uczenia maszynowego15,16. Ta metoda jest "możliwa do wytrenowania", dzięki czemu uczy się na podstawie klasyfikacji segmentów pikseli użytkownika i stosuje nową wyuczoną klasyfikację do innych obrazów. Metoda ta opiera się na typowych narzędziach analitycznych w programie ImageJ, które są używane do "klasyfikowania" każdego piksela w segmencie jako należącego do określonej "klasy". Gdy program nauczy się "klasyfikatorów", można ich użyć do identyfikacji innych podobnych sklasyfikowanych segmentów na tym samym obrazie. Model ten jest następnie zapisywany i stosowany do innych zestawów obrazów w ramach tego samego eksperymentu.

Obecne przeszkody w określaniu ecDNA in situ w skrawkach nerek to endogenna autofluorescencja wynikająca z utrwalenia w formalinie oraz pracochłonna analiza obrazów. Opisujemy tutaj jak wygasić ową autofluorescencję, wykryć ecDNA, oraz wykorzystać nadzorowane uczenie maszynowe do wysokoprzepustowego pomiaru ecDNA. Wcześniej opublikowaliśmy pomiar NET i zewnątrzkomórkowego MPO (ecMPO) za pomocą makra w ImageJ, teraz demonstrujemy półautomatyzację tych metod przy użyciu nadzorowanego uczenia maszynowego1. Demonstrujemy zdolność adaptacyjną narzędzia uczenia maszynowego w celu sklasyfikowania alternatywnej plamy dla NET i ecMPO w tym samym obrazie. Te opisane tutaj metody barwienia do wykrywania ecDNA, NET i ecMPO można przełożyć na inne narządy stałe i choroby, w których ecDNA, NETS i ecMPO odgrywają rolę w utrwalaniu chorób, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i toczeń17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda umożliwia wykrywanie wszystkich form śmierci komórki w ecDNA. Ta sama metoda i przeciwciała są stosowane do biopsji ludzkiej tkanki nerki (od kroku 4). Wszystkie zwierzęta i ludzie uzyskali aprobatę etyczną Monash University i Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.

1. Barwienie dla ecDNA za pomocą DAPI i β-aktyny

  1. Indukuj 20-dniowy model kłębuszkowego zapalenia nerek anty-mieloperoksydazy (anty-MPO-GN) u 8-10 tygodniowych myszy C57 / Bl6, z kontrolami9.
    1. Eutanazja myszy w sposób humanitarny przy użyciu komory CO2 .
    2. Usuń nerki, wykonując nożyczkami przednie nacięcie w linii środkowej skóry, a następnie ostrożnie odetnij otrzewną i przypnij z powrotem do deski preparcyjnej. Za pomocą kleszczy odsuń na bok przednią powięź nerkową i ciemieniową otrzewną oraz odetnij nerkę, przecinając moczowód i naczynia krwionośne (tętnicę nerkową i żyłę) w miedniczce nerkowej. Usuń kleszczami i przetnij nerki na pół (płaszczyzna strzałkowa) za pomocą skalpela w rozmiarze 22.
    3. Umieść nerkę w utrwalaczu (4% buforowana formalina) na 16 godzin w temperaturze pokojowej (RT). Wyjmij i namocz utrwaloną nerkę w 30% etanolu na 24 godziny przed przetworzeniem.
  2. Przetwarzaj nerki w standardowym cyklu 6-godzinnym:
    70% etanolu przez 15 min
    90% etanolu przez 15 min
    100% etanol przez 15 min
    100% etanol przez 20 min
    100% etanol przez 25 min
    100% etanol przez 30 min
    Ksylen przez 20 min
    Ksylen przez 30 min
    Ksylen przez 40 min
    Wosk przez 30 min
    Wosk przez 35 min
    Wosk przez 40 min
    UWAGA: Jest to ważne, ponieważ nerki nie powinny być poddawane długotrwałej ekspozycji na ciepło zawarte w wosku, ponieważ może to zniszczyć interesujące nas antygeny.
  3. Wytnij odcinki 3 μm na mikrotomie i zamontuj na dostępnych na rynku szklanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych ładunkiem dodatnim. Pozostawić do wyschnięcia na noc.
  4. Szkiełka podstawowe umieścić w stojaku na prowadnice w piekarniku o temperaturze 60 °C na 60 min.
    UWAGA: Kroki 1.3 i 1.4 mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że skrawki nie unoszą się podczas etapu pobierania antygenu.
  5. Zanurzyć szkiełka w dwóch zmianach rozpuszczalnika (ksylenu lub substytutu) na 40 minut każda, w dygestorium.
  6. Nawilżaj szkiełka w 100% etanolu, 100% etanolu, 70% etanolu przez 5 minut każda. Myć przez 5 minut w wodzie z kranu.
  7. Umieść płytę grzejną w dygestoria i wstępnie zagotuj roztwór do odzyskiwania antygenu (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9,0) w szybkowarze. Gdy tylko roztwór do pobierania antygenu zacznie wrzeć, umieść szkiełka w garnku poziomo za pomocą szczypiec i zablokuj pokrywkę. Gotować na wysokim poziomie (co odpowiada 15 psi lub 103 kPa) przez 10 min.
    UWAGA: Ten krok jest kluczowy, ponieważ pobiera interesujący nas antygen poprzez zdemaskowanie epitopu antygenu (usieciowanego poprzez utrwalenie formaliny), aby umożliwić wiązanie specyficzne dla przeciwciała epitopowego, późniejsze barwienie nie będzie działać bez niego.
  8. Zdejmij szybkowar z ognia i natychmiast zdejmij pokrywkę, przekręcając zimny kran na pokrywie w zlewie. Pozostaw szkiełka do równowagi przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu.
  9. Przemyć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w 0,01 M roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) (pH 7,4) na wytrząsarce orbitalnej.
  10. Użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół tkanki nerkowej, uważając, aby w tym czasie żadna tkanka nie wyschła.
  11. Tkankę blokową w 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) przez 30 minut, 60 μl na sekcję. Nie myj po tym etapie, ale ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą pipety o pojemności 60 μl, nie pozwól, aby skrawki wyschły.
  12. Zastosować pierwszorzędowy koktajl przeciwciał dla β-aktyny rozcieńczonej 1/1000 w 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μl na sekcję i inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.
  13. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
  14. Zastosować przeciwciało drugorzędowe, kurczak anty królik 488 (1/200), 60 μL na sekcję rozcieńczone w 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
  16. Zanurz szkiełka w 0,3% Sudan Black w 70% etanolu na 30 minut w słoiku z Coplin.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ wygasza autofluorescencję spowodowaną utrwaleniem formaliny.
  17. Umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć osad, a następnie zanurz w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się osadu Sudan Black.
  18. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na konfokalnych szkiełkach nakrywkowych za pomocą trzech kropli 60 μl roztworu montażowego z DAPI i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, nakładając je na całym obwodzie szkiełka nakrywkowego.
  19. Pozostawić szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (aby umożliwić przenikanie DAPI), a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w chronionym przed światłem.
    UWAGA: Ważne jest, aby przechowywać w ciemności, aby zapobiec blaknięciu sond fluorescencyjnych.
  20. Szkiełka obrazowe za pomocą konfokalnej głowicy skanującej laserowej przymocowanej do mikroskopu. Wzbudzić szkiełka za pomocą lasera 405 dla DAPI i lasera 488 dla Beta Actin. Przechwytuj obrazy w jednej płaszczyźnie o rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli, korzystając z sekwencyjnego przechwytywania liniowego i uśredniania 4-liniowego, co jest niezbędne do wykrywania ecDNA. Używany jest obiektyw olejowy 40x 1.0 NA.
    1. Należy zobrazować co najmniej 20 kłębuszków nerkowych na próbkę. Zapisywanie obrazów jako plików ND2.

2. Analiza DAPI i β-aktyny

  1. Zainstaluj ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Sprawdź, czy możliwa do wytrenowania segmentacja Weka jest dostępna w sekcji Wtyczki | Segmentacja | Skalowalna segmentacja Weka.
  3. Upuść obraz na pasek narzędzi ImageJ. Kliknij Obraz | Kolor | Podziel kanały. Pojawi się jeden obraz z DAPI w niebieskim zabarwieniu wszystkich jąder i pojawi się 1 obraz z β-aktyną w kolorze zielonym, który wyznacza kłębuszki nerkowe.
    1. Utwórz scalony plik z pojedynczych obrazów, aby narysować obszar zainteresowania (ROI) dla kłębuszków nerkowych, klikając Kolor | Scalanie kanałów. Wyskakujące okienko poprosi o przypisanie koloru do każdego kanału. Po przypisaniu każdemu kanałowi koloru zaznacz pola Utwórz kompozyt i Zachowaj obrazy źródłowe, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się scalony obraz kompozytowy.
    2. Używając barwienia β-aktyną jako wskazówkę, narysuj ROI wokół kępki kłębuszków nerkowych. Zachowaj ten obraz na boku, aby użyć zwrotu z inwestycji na końcu tego protokołu.
  4. Wykonaj rozmycie gaussowskie na pojedynczym niebieskim obrazie DAPI. Kliknij opcję Process (Proces) | Filtry | Rozmycie gaussowskie, umieścić w 1-2.00. Obraz będzie teraz wyglądał na nieco rozmyty, ale jądra są teraz gładkie, a tło zmiękczone.
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia szumów w celu oczyszczenia obrazu z artefaktów, które mogą uniemożliwić odpowiednie wykrywanie atrybutów obrazu, które mają być analizowane.
  5. Kliknij Wtyczki | Segmentacja | Skalowalna segmentacja Weka.
  6. Korzystając z narzędzia linii na pasku narzędzi w ImageJ, najpierw obrysuj nienaruszone jądra za pomocą narzędzi wolnej ręki (do wyboru są narzędzia liniowe, okrągłe i kwadratowe), a następnie dodaj do pola Dodaj klasę 1.
  7. Korzystając z narzędzia linii na pasku narzędzi w ImageJ, wyznacz obszary tła do pola klasy 2.
  8. Kliknij na etykietę przycisku Utwórz nową klasę w oknie segmentacji Weka i oznacz etykietę "ecDNA". Użyj narzędzia linii (z paska narzędzi ImageJ), aby nakreślić pozajądrowe DNA barwione przez DAPI.
  9. Kliknij przycisk Train Classifier w menu treningu w oknie segmentacji Weka, które można trenować.
    UWAGA: Przycisk STOP pojawi się w miejscu przycisku Train Classifier i pozostanie do momentu zakończenia treningu. Nie klikaj tego przycisku podczas treningu, ponieważ proces zostanie przerwany.
  10. Kliknij przycisk Utwórz wynik, aby utworzyć obraz ze wszystkimi sklasyfikowanymi składnikami, składającymi się z nienaruszonych jąder, tła i zidentyfikowanego ecDNA.
  11. Kliknij przycisk Uzyskaj prawdopodobieństwo. Przełącz mysz, aby wyświetlić czarno-biały obraz wszystkich klas z obiektem zaznaczenia podświetlonym na biało.
  12. Zduplikuj ten obraz, klikając Obraz | Duplikat.
  13. Przełącz się na ekran za pomocą przycisku myszy, który zawiera ecDNA. Zastosuj próg, aby uzyskać tylko to, co zostało zidentyfikowane jako ecDNA. Kliknij przycisk Zastosuj, gdy próg jest wystarczający.
  14. Jeśli po progowaniu pojawi się więcej obszarów DNA, które nie są ecDNA, wróć do oryginalnego wytrenowanego obrazu, dodaj więcej klasyfikatorów i powtórz kroki 2.1-2.13.
  15. Kliknij Obraz | Regulacja obrazu | Utwórz plik binarny. Skopiuj kłębuszkowy zwrot z inwestycji utworzony w kroku 2.3 i kliknij Ctrl+Shift+E. Aktywuj okno Weka za pomocą punktu menu Opracuj | Selekcje | Przywróć, co powoduje przywrócenie zaznaczenia. Kliknij opcję Analizuj cząstki, która spowoduje pomiar tylko cząstek ecDNA w kłębuszku nerkowym.
    UWAGA: Arkusz wyników jest obliczany na podstawie liczby cząstek, powierzchni, średnich pikseli i procentowej zawartości kłębuszków nerkowych zawierających ecDNA. Wyniki te można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego i zapisać w celu późniejszej analizy statystycznej.
  16. Zapisz klasyfikator jako ecDNA.classifier, klikając Zapisz klasyfikator z menu opcji w aplikacji ImageJ na pulpicie. Następnie kliknij Zapisz dane z menu opcji i zapisz jako ecDNA.arff w folderze ImageJ. Zwrot z inwestycji będzie musiał być dodawany ręcznie za każdym razem, ponieważ rozmiar i kształt kłębuszków nerkowych będzie się zmieniał, jednak program nauczył się, czym jest ecDNA.
  17. Aby ponownie zastosować model do kolejnych obrazów, powtórz kroki 2.1-2.5 z nowym obrazem. Kliknij Załaduj klasyfikator w menu opcji, a następnie ecDNAmodel.classifier w folderze ImageJ z kroku 2.16. Pojawi się menu dziennika i uruchomi model.
  18. Po uruchomieniu modelu kliknij Załaduj dane w menu opcji i wybierz plik ecDNA.arff zapisany w folderze ImageJ z kroku 2.16. Kliknij Utwórz wynik. Jeśli wynikowy obraz nie zdołał zebrać wszystkich jąder, tła lub ecDNA, kliknij na ponowne trenowanie klasyfikatora i dodaj więcej klasyfikatorów i zapisz nowy model. Zakończ proces analizy, powtarzając kroki 2.9-2.16.
    UWAGA: Do wygenerowania końcowego modelu używanego do wykrywania ecDNA można użyć kilku obrazów. Osiąga się to poprzez zastosowanie modelu do kolejnych obrazów, dodanie większej liczby klasyfikatorów oraz zapisanie nowego modelu i danych w folderze ImageJ. Może to być szczególnie ważne, gdy różne próbki mają wyższe tło. Program Weka Segmentation jest również kompatybilny z językiem makr ImageJ, który umożliwia nagrywanie wielu poleceń za pomocą makr w celu zautomatyzowania niektórych kroków.

3. Pomiar pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili i ecMPO

UWAGA: Ta metoda identyfikuje NET poprzez kolokalizację zewnątrzkomórkowego DNA, cytrulinowanych histonów, peptydyloarginazy 4 (PAD4) i MPO.

  1. Indukuj 20-dniowy model kłębuszkowego zapalenia nerek anty-mieloperoksydazy (anty-MPO-GN) u 8-10 tygodniowych myszy C57 / Bl6, z kontrolami9.
    1. Eutanazja myszy w sposób humanitarny przy użyciu komory CO2 .
    2. Usuń nerki, wykonując nożyczkami przednie nacięcie w linii środkowej skóry, a następnie ostrożnie odetnij otrzewną i przypnij z powrotem do deski preparcyjnej. Za pomocą kleszczy odsuń na bok przednią powięź nerkową i ciemieniową otrzewną oraz odetnij nerkę, przecinając moczowód i naczynia krwionośne (tętnicę nerkową i żyłę) w miedniczce nerkowej. Usuń kleszczami i przetnij nerki na pół (płaszczyzna strzałkowa) za pomocą skalpela w rozmiarze 22.
    3. Umieść nerkę w utrwalaczu (4% buforowana formalina) na 16 godzin w temperaturze pokojowej (RT). Wyjmij i namocz utrwaloną nerkę w 30% etanolu na 24 godziny przed przetworzeniem.
  2. Przetwarzaj nerki w standardowym cyklu 6-godzinnym:
    70% etanolu przez 15 min
    90% etanolu przez 15 min
    100% etanol przez 15 min
    100% etanol przez 20 min
    100% etanol przez 25 min
    100% etanol przez 30 min
    Ksylen przez 20 min
    Ksylen przez 30 min
    Ksylen przez 40 min
    Wosk przez 30 min
    Wosk przez 35 min
    Wosk przez 40 min
    UWAGA: Nerki nie powinny być poddawane długotrwałej ekspozycji na ciepło zawarte w wosku, ponieważ może to zniszczyć interesujące nas antygeny.
  3. Wytnij odcinki 3 μm na mikrotomie i zamontuj na dostępnych na rynku szklanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych ładunkiem dodatnim. Pozostawić do wyschnięcia na noc
  4. Szkiełka podstawowe umieścić w stojaku na prowadnice w piekarniku o temperaturze 60 °C na 60 min.
    UWAGA: Kroki 3.3-3.4 są kluczowe, aby upewnić się, że skrawki nie unoszą się podczas etapu pobierania antygenu.
  5. Zanurzyć szkiełka w dwóch zmianach rozpuszczalnika (ksylenu lub substytutu) na 40 minut każda, w dygestorium.
  6. Nawilżaj szkiełka w 100% etanolu, 100% etanolu, 70% etanolu przez 5 minut każda.
  7. Myć przez 5 minut w wodzie z kranu.
  8. Umieść płytę grzejną w dygestorii i wstępnie zagotuj roztwór do odzyskiwania antygenu (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9,0) w szybkowarze. Jak tylko roztwór do pobierania antygenu zacznie wrzeć, umieść szkiełka w garnku poziomo za pomocą szczypiec i zablokuj pokrywkę. Gotować na wysokim poziomie (co odpowiada 15 psi lub 103 kPa) przez 10 min.
    UWAGA: Ten krok polega na pobraniu interesującego antygenu poprzez zdemaskowanie epitopu antygenu (usieciowanego przez utrwalenie formaliny), aby umożliwić wiązanie specyficzne dla przeciwciał epitopowych, a późniejsze barwienie nie będzie działać bez tego kroku.
  9. Zdejmij szybkowar z ognia i natychmiast zdejmij pokrywkę, przekręcając zimny kran na pokrywie w zlewie. Pozostaw szkiełka do równowagi przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu.
  10. Przemyć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
  11. Użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół tkanki nerkowej, uważając, aby w tym czasie żadna tkanka nie wyschła.
  12. Tkankę blokową w 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) przez 30 minut, 60 μl na sekcję. Nie myj po tym etapie, ale ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą pipety o pojemności 60 μl. Nie pozwól, aby sekcje wyschły.
  13. Przygotuj koktajl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) w 1 probówce. Stosować 60 μl na skrawki nerki. Stężenie przeciwciał pierwszorzędowych jest następujące:
    Królik przeciw człowiekowi/myszy H3Cit 1/100
    Mysz przeciw człowiekowi / myszy PAD4 1/50
    Koza anty człowiek/mysz MPO 1/200
  14. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej.
  15. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
  16. Zrób koktajl przeciwciał drugorzędowych w 1 probówce. Przeciwciała drugorzędowe stosuje się w 1% BSA/PBS, 60 μL na sekcję w następujący sposób:
    Kurczak anty królik 488 1/200.
    Kurczak przeciw myszy 647 1/200.
    Kurczak anty koza 594 1/200.
  17. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
  18. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
  19. Zastosować przeciwciało wtórne 1:200 w 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) przez 40 minut przy RT 60 μL na sekcję.
  20. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
  21. Zanurz szkiełka w 0,3% Sudan Black w 70% etanolu na 30 minut.
  22. Umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć osad, a następnie zanurz w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się osadu Sudan Black.
  23. Zamontuj szkiełka na konfokalnych szkiełkach nakrywkowych za pomocą trzech kropli 60 μl roztworu montażowego z DAPI. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, nakładając je na całym obwodzie szkiełka nakrywkowego.
  24. Pozostawić szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (aby umożliwić przenikanie DAPI), a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Przechowywać w ciemności, aby zapobiec blaknięciu sond fluorescencyjnych.
  25. Szkiełka obrazowe za pomocą konfokalnej głowicy skanującej laserowej przymocowanej do mikroskopu. Prowadnice Excite z laserem 405 dla DAPI i laserem 488 dla H3Cit, 561 dla MPO i 647 dla PAD4. Przechwytuj obrazy w jednej płaszczyźnie o rozdzielczości 1024x1024 pikseli, korzystając z sekwencyjnego przechwytywania liniowego i uśredniania 4-liniowego, co jest niezbędne do wykrywania ecDNA. Użyj obiektywu olejowego 40x 1.0 NA. Należy zobrazować co najmniej 20 kłębuszków nerkowych na próbkę. Zapisywanie obrazów jako plików ND2.

4. Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili i analiza ecMPO

  1. Zainstaluj ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Sprawdź, czy możliwa do wytrenowania segmentacja Weka jest dostępna w sekcji Wtyczki | Segmentacja | Skalowalna segmentacja Weka.
  3. Upuść obraz do ImageJ. Kliknij Obraz | Kolor | Podziel kanały. Pojawi się jeden obraz z DAPI w kolorze niebieskim zabarwionym wszystkie jądra, jeden obraz z H3Cit na zielono, jeden obraz z MPO na czerwono i jeden obraz z PAD4 na biało.
    1. Utwórz scalony plik z pojedynczych obrazów, aby narysować ROI dla kłębuszków nerkowych, klikając Kolor | Scalanie kanałów. Wyskakujące okienko poprosi o przypisanie koloru do każdego kanału. Po przypisaniu każdemu kanałowi koloru zaznacz pola Utwórz kompozyt i Zachowaj obrazy źródłowe, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się scalony obraz. W przeciwieństwie do poprzedniego protokołu dla ecDNA, użyjemy obrazu złożonego do wykonania pozostałych kroków.
  4. Wykonaj rozmycie gaussowskie na obrazie kompozytowym. Pozwala to na wygładzenie jąder. Kliknij opcję Process (Proces) | Filtry | Rozmycie gaussowskie, umieścić w 1.00-2.00. Obraz będzie teraz wyglądał na nieco rozmyty, ale jądra są teraz gładkie, a tło zmiękczone.
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia szumów w celu oczyszczenia obrazu z artefaktów, które mogą uniemożliwić odpowiednie wykrywanie atrybutów obrazu, które mają być analizowane.
  5. Kliknij Wtyczki | Segmentacja | Skalowalna segmentacja Weka. Pojawi się zupełnie nowe okno z obrazem do analizy i narzędziami menu specyficznymi dla segmentacji Weka.
  6. Korzystając z narzędzia linii na pasku narzędzi (w ImageJ), najpierw obrysuj nienaruszone jądra, które nie są dodatnie dla wszystkich 4 komponentów NET (MPO, PAD4, DAPI i H3Cit) za pomocą narzędzia wolnej ręki, a następnie dodaj do pola Dodaj klasę 1.
  7. Za pomocą narzędzia Linia na pasku narzędzi ImageJ wyznacz obszary tła do pola Klasa 2.
  8. Kliknij etykietę przycisku Utwórz nową klasę w menu etykiet i oznacz etykietę "NETs". Użyj narzędzia linii, aby wyznaczyć NETS zidentyfikowane jako kolokalizacja DAPI (niebieski), MPO (czerwony), PAD4 (biały) i cytrulinowane histony (zielony).
  9. Kliknij na etykietę przycisku Utwórz nową klasę w menu etykiet i oznacz etykietę "ecMPO". Użyj narzędzia linia, aby wyznaczyć MPO (czerwony), który jest wolny od komórek.
  10. Kliknij przycisk Train Classifier w menu treningu w oknie Trainable Weka Segmentation.
    UWAGA: Przycisk STOP pojawi się w miejscu przycisku Train Classifier i pozostanie do momentu zakończenia treningu. Nie klikaj tego przycisku podczas treningu, ponieważ proces zostanie przerwany.
  11. Kliknij przycisk Utwórz wynik w menu treningowym, a zostanie utworzony obraz ze wszystkimi sklasyfikowanymi komponentami, składającymi się z nienaruszonych jąder, tła i tego, co zostało zidentyfikowane jako ecMPO.
  12. Kliknij przycisk Pobierz prawdopodobieństwo w menu treningu. Przełącz mysz, aby wyświetlić czarno-biały obraz wszystkich klas z obiektem zaznaczenia podświetlonym na biało.
  13. Zduplikuj zarówno prawdopodobieństwo NET, jak i obraz prawdopodobieństwa ecMPO, klikając Obraz | Duplikat.
  14. Przełącz się na ekran za pomocą przycisku myszy, który zawiera sieci NET. Zastosuj próg, aby zapewnić wyróżnienie tylko zidentyfikowanych sieci NET. Na pasku narzędzi menu ImageJ kliknij pozycję Obraz | Dostosuj | Próg. Przesuwaj przesuwane paski przełączania, aż zostaną podświetlone komponenty NET. Kliknij przycisk Zastosuj, gdy próg jest zadowalający. Powtórz te same kroki dla ecMPO.
  15. Jeśli po progowaniu nadal wykrywane są obszary ecMPO lub NET, wróć do oryginalnego wytrenowanego obrazu i dodaj więcej klasyfikatorów, a następnie ponownie zastosuj kroki 4.1-4.14.
  16. Kliknij Obraz | Regulacja obrazu | Utwórz plik binarny. Skopiuj kłębuszkowy zwrot z inwestycji utworzony w kroku 4.3, kliknij Ctrl+Shift+E. Aktywuj okno Weka za pomocą punktu menu Edytuj | Selekcje | Przywróć, co powoduje przywrócenie zaznaczenia. Kliknij opcję Analizuj cząstki, aby zmierzyć tylko cząstki NET w obrębie kłębuszków nerkowych.
  17. Przełącz się na ekran za pomocą przycisku myszy, który zawiera ecMPO. Zastosować próg, aby zapewnić, że uzyskane zostaną tylko zidentyfikowane ecMPO. Kliknij przycisk Zastosuj, gdy próg jest zadowalający. Powtórz krok 4.16 powyżej.
    UWAGA: Arkusz wyników jest obliczany na podstawie liczby cząstek, powierzchni, średnich pikseli i procentu kłębuszków nerkowych zawierających zarówno NET, jak i ecMPO. Wyniki te można następnie umieścić w arkuszu kalkulacyjnym i zapisać do późniejszej analizy statystycznej.
  18. Zapisz klasyfikator jako NETs.classifier, klikając Zapisz klasyfikator w menu opcji i zapisz plik w aplikacji ImageJ na pulpicie (folder ImageJ). Następnie kliknij Zapisz dane z menu opcji i zapisz jako plik NETs.arff. Kłębuszkowy zwrot z inwestycji będzie musiał być dodawany ręcznie za każdym razem, gdy rozmiar i kształt kłębuszków będzie się zmieniał, ale program nauczył się, czym są zarówno NETs, jak i ecMPO.
  19. Aby ponownie zastosować model do kolejnych obrazów, powtórz kroki 4.1–4.5 z nowym obrazem. Kliknij polecenie Załaduj klasyfikator w menu opcji. Kliknij Nets.classifier w folderze ImageJ. Pojawi się menu dziennika i uruchomi model, po uruchomieniu modelu kliknij Załaduj dane w menu opcji i wybierz plik NETs.arff.
    1. Kliknij Utwórz wynik. Jeśli wynikowy obraz nie zdołał zebrać wszystkich jąder, tła lub ecDNA, kliknij na ponowne trenowanie klasyfikatora i dodaj więcej klasyfikatorów i zapisz nowy model. Zakończ proces analizy, powtarzając kroki 4.11-4.19.
      UWAGA: Do wygenerowania końcowego modelu używanego do wykrywania ecDNA, ecMPO i NET można użyć kilku obrazów. Osiąga się to poprzez zastosowanie modelu do kolejnych obrazów, dodanie większej liczby klasyfikatorów oraz zapisanie nowego modelu i danych w folderze ImageJ. Może to być szczególnie ważne, gdy różne próbki mają wyższe tło. Program do segmentacji Weka jest kompatybilny z językiem makr ImageJ, co umożliwia nagrywanie wielu poleceń jako makr w celu zautomatyzowania niektórych kroków.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te obrazy reprezentują wiele kroków wymaganych do skutecznego wykorzystania możliwej do wytrenowania segmentacji Weka w celu zminimalizowania pracochłonnego ręcznego pomiaru ecDNA w fluorescencyjnie barwionej tkance nerki FFPE od myszy z indukowanym anty-MPO GN. Kroki te są podsumowane w Rysunek 1 i Rysunek 2 z obrazami zaczerpniętymi bezpośrednio z programu segmentacji Weka, przedstawiającymi każdy krok w procesie analizy. Pomiary z tej a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele protokołów, które mierzą markery prozapalne w surowicy i moczu zarówno pacjentów, jak i mysich modeli kłębuszkowego zapalenia nerek. Opisany protokół umożliwia analizę produktów śmierci komórki (ecDNA, NET i ecMPO) bezpośrednio w obrębie kłębuszków nerkowych. Najważniejszymi krokami w tym protokole jest przygotowanie tkanek i obrazowanie. Głównym elementem ograniczającym stosowanie metody barwienia fluorescencyjnego do analizy jest autofluorescencja tkanek. Tkanka parafinowa utrwalona w formalinie podlega ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy Monash Micro Imaging za korzystanie z pionowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Nikon C1 oraz platformy Monash Histology do przetwarzania tkanki nerkowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Albumina surowicy bydlęcejSIGMAA2153% i 1% roztwory składa się z PBS, może być wytwarzana luzem i zamrażana - wyrzucana po rozmrożeniu.
Przeciwciało przeciw koziej IgG (H+L) z kurczaka wchłaniane krzyżowo, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał
Przeciwciało przeciwko myszym przeciwciałom IgG (H+L) z kurczaka, Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał
Kurczak anty królik IgG (H+L) Przeciwciało wchłaniane krzyżowo Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441Wirować w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał
Surowice skrywkowe z kurczakaSIGMAC5405Wykonane z 1% BSA/PBS
Szkiełka nakrywkowe 24 x60 mmAzerscientificES0107222#1.5 Nie jest to standardowa grubość - przeznaczona do stosowania w mikroskopii
konfokalnejEDTA 10mMSIGMAE6758Dodaj TRIS i EDTA razem w wodzie destylowanej i pH do 9, w celu odzyskania antygenu, można uzupełnić w 10x roztworze
Etanol 30%, 70% i 100%Chem SupplyUN1170Dostarczany jako 100% niedenaturowany etanol - rozcieńczony do 30% i 70% przy użyciu wody destylowanej
Formaldehyd, 4% (10% neutralna buforowana formalina)TRAJANNBF-500Nerkę umieszcza się w 5 ml probówce zawierającej 3 ml formaliny na 16 godzin w temperaturze pokojowej, formalinę należy stosować w dygestorii
Szklane szkiełka histologiczne - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0mmTRAJANJ3800AM4Niezbędne jest stosowanie dodatnio naładowanych szkiełek powlekanych. Nie zalecamy stosowania poli-L-lizyny do powlekania szkiełek, ponieważ tkanka przemieszcza się ze szkiełek podczas etapu pobierania antygenu
Kozioł przeciwciało przeciwko człowiekowi / myszy MPOR& DAF3667Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08Używany schludny, w pojemnikach do barwienia o pojemności 200 ml, do stosowania w dygestoriach
Długopis hydrofobowyVECTOR LabsH-400Służy do rysowania okręgu wokół tkanki nerkowej
Mysz anty człowiek/mysz Peptydyloarginaza 4 (PAD4)ABCAMab128086Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu
Konfokalna skaningowa głowica laserowa Nikon C1 przymocowana do odwróconego mikroskopu Nikon Ti-ECoherent ScientificAliquot i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSIGMAP381350,01 M PB / 0,09% NaCl Uzupełnij 5L na raz
Szybkowar 6L Tefal secure 5 Neo ze stali nierdzewnejTefalGSA-P2530738Zakupiony w lokalnym sklepie z artykułami gospodarstwa domowego
Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962Nałóż krople bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe
Królik anty ludzkie/mysie przeciwciało beta aktynyABCAMab8227Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu
Królik przeciwciało przeciwko człowiekowi / myszy H3CitABCAMab5103Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu
Stojak do barwienia 24 szkiełkaProScitechH4465Wybrany stojak do barwienia musi być w stanie wytrzymać gotowanie pod ciśnieniem i inkubację w piekarniku o temperaturze 60 stopni
Sudan Black BSIGMA1996640,3% Dodać 3g do butelki 1L w 70% etanolu, przefiltrować i chronić przed światłem stabilnym przez 6 miesięcy w temperaturze pokojowej
Tris 10mMSIGMAT4661Dodaj TRIS i EDTA razem w wodzie destylowanej i pH do 9, do pobierania antygenu, może być sporządzony w 10x roztworze
KsylenTrajanXL005/20Musi być używany w dygestoriach
5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412(2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular DNAGlomerulonephritisTrainable Weka SegmentationFFPE Tissue StainingConfocal MicroscopyImage AnalysisAutofluorescence QuenchingNeutrophil Extracellular TrapsExtracellular MyeloperoxidaseMachine Learning Classification

Related Articles