Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

David  N. Awde; Tatum  E. Fowler; Fernan Pérez-Gálvez; Mark  J. Garcia; Nicholas M. Teets

doi:10.3791/61186

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe testy krytycznych limitów termicznych u owadów

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61186

⸱

15 czerwca 2020

David N. Awde¹ , Tatum E. Fowler¹ , Fernan Pérez-Gálvez¹ , Mark J. Garcia¹ , Nicholas M. Teets¹

¹Department of Entomology, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Limity termiczne mogą przewidywać środowisko, które organizmy tolerują, co jest cenną informacją w obliczu gwałtownych zmian klimatycznych. Opisano tutaj wysokoprzepustowe protokoły do oceny krytycznych minimów termicznych i czasu wykańczania ciepła u owadów. Oba protokoły maksymalizują przepustowość i minimalizują koszt testów.

Streszczenie

Górne i dolne limity termiczne roślin i zwierząt są ważnymi predyktorami ich wydajności, przetrwania i rozmieszczenia geograficznego, a także są niezbędne do przewidywania reakcji na zmiany klimatu. W niniejszej pracy opisano dwa wysokoprzepustowe protokoły pomiaru limitów termicznych owadów: jeden do oceny krytycznych minimów termicznych (CT_min), a drugi do oceny czasu wyłączenia cieplnego (KDT) w odpowiedzi na statyczny stresor cieplny. W teście CT_min osoby są umieszczane w kolumnie z płaszczem akrylowym, poddawane zmniejszającej się rampie temperatury i liczone, gdy spadają z żerdzi za pomocą czujnika podczerwieni. W teście cieplnym KDT osoby są umieszczane w 96-dołkowej płytce, umieszczane w inkubatorze ustawionym na stresującą, wysoką temperaturę i nagrywane wideo w celu określenia czasu, w którym nie mogą już pozostać w pozycji pionowej i się poruszać. Protokoły te mają przewagę nad powszechnie stosowanymi technikami. Oba testy są tanie i można je wykonać stosunkowo szybko (~2 h). Test_{CT min} zmniejsza błąd eksperymentatora i może mierzyć dużą liczbę osób jednocześnie. Protokół ciepła KDT generuje zapis wideo każdego testu, eliminując w ten sposób stronniczość eksperymentatora i potrzebę ciągłego monitorowania osób w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Limity termiczne owadów
Zmienność warunków środowiskowych, w tym temperatury, jest głównym czynnikiem wpływającym na wydajność, przydatność, przetrwanie i rozmieszczenie geograficzne organizmów¹^,². Górne i dolne limity termiczne określają teoretyczny zakres środowisk, które organizm może tolerować, a zatem limity te są ważnymi predyktorami rozmieszczenia roślin i zwierząt, zwłaszcza w obliczu zmian klimatycznych³^,⁴. Dlatego protokoły do dokładnego pomiaru limitów termicznych są ważnymi narzędziami między innymi dla ekologów, fizjologów, biologów ewolucyjnych i biologów zajmujących się ochroną przyrody.

Jako najliczniejsze i najbardziej różnorodne zwierzęta lądowe, owady są często używane do pomiarów limitów termicznych. Krytyczne maksima termiczne (CT_max) i krytyczne minima termiczne (CT_min) są powszechnie używane do oceny wewnątrz- i międzygatunkowej zmienności tolerancji termicznej⁵^,⁶^,⁷. Podczas gdy CT_max i CT_min mogą być mierzone dla wielu fenotypów, w tym wzrostu, wydajności reprodukcyjnej i zachowania, najczęściej stosuje się je do funkcji lokomotorycznych⁵^,⁶^,⁷. Tak więc_{CT max} (zwana również temperaturą powalenia cieplnego) i CT_min są często definiowane jako wysokie i niskie temperatury, w których owady tracą funkcje motoryczne i nie są w stanie utrzymać się w pozycji pionowej⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. _{CT min} zbiega się z początkiem śpiączki chłodnej, odwracalnego paraliżu spowodowanego niskimi temperaturami⁶. Podczas gdy paraliż na granicach termicznych jest często odwracalny, ciągłe narażenie na te temperatury prowadzi do śmierci ekologicznej⁵.

Popularne metody pomiaru granic termicznych
Do pomiaru granic termicznych użyto różnych aparatów (podsumowanych w Sinclair i wsp.)⁶. Krótko mówiąc, owady są ogrzewane lub chłodzone w inkubatorach¹²^,¹³, pojemniki zanurzone w kąpielach płynnych¹¹^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, aluminiowe bloki¹⁰^,¹⁷, lub kontenery z płaszczem¹⁸i monitorowane do momentu ustania lokomocji. Najpopularniejszą metodą monitorowania owadów podczas testu jest obserwacja bezpośrednia, w której poszczególne osoby są stale monitorowane w czasie rzeczywistym lub retrospektywnie za pomocą nagranego wideo⁶^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹⁵^,¹⁷. Chociaż metody obserwacji bezpośredniej mają minimalne wymagania sprzętowe, są pracochłonne i ograniczają przepustowość. Alternatywnie, owady można obserwować pośrednio, zbierając osobniki w dyskretnych momentach, gdy spadają z grzęd⁶^,¹⁹^,²⁰^,²¹ lub za pomocą monitorów aktywności¹³.

Pośrednie metody pomiaru limitów termicznych są zazwyczaj bardziej wydajne i potencjalnie mniej podatne na błędy niż metody bezpośredniej obserwacji. Najpopularniejsza metoda monitorowania pośredniego wykorzystuje kolumnę z płaszczem kontrolowanym temperaturą⁶^,⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Owady umieszcza się wewnątrz kolumny z grzędami, a temperatura wewnętrznej komory jest kontrolowana przez pompowanie płynu z kąpieli płynowej o kontrolowanej temperaturze przez osłonę kolumny. Osobniki, które osiągną limit termiczny, spadają z grzędy i są zbierane w dyskretnych temperaturach lub odstępach czasu. Chociaż ta metoda działa dobrze w przypadku CT_min, stwierdzono, że nie jest odpowiednia dla CT_max, ponieważ muchy dobrowolnie wychodzą z dna kolumny, gdy temperatura wzrasta. Opisana tutaj nowa metoda pozwala obejść ten problem poprzez indywidualne uwzględnianie much podczas pomiarów automatycznych.

Oprócz metody obserwacji, dwa rodzaje reżimów temperaturowych są powszechnie używane do oceny górnych granic termicznych. Testy dynamiczne polegają na stopniowym zwiększaniu temperatury, aż do utraty funkcji motorycznej; ta temperatura to dynamiczny CT_max⁷^,⁸^,⁹^,¹³. W przeciwieństwie do tego, testy statyczne polegają na stałej stresującej temperaturze, aż do utraty funkcji motorycznej; ten punkt czasowy to czas knockdown heat (heat KDT), zwany również statycznym CT_max (sCT_max) w niedawnym artykule Jørgensen et al.⁷^,⁸^,⁹^,¹⁶^,²². Chociaż testy CT_max i knockdown heat (testy ciepła KD) dają metryki o różnych jednostkach, modelowanie matematyczne tych dwóch cech wskazuje, że dostarczają one porównywalnych informacji na temat tolerancji ciepła i są oba są istotne ekologicznie⁸^,⁹. Testy dynamiczne dają temperaturę, którą można porównać z warunkami środowiskowymi i są preferowane, gdy występują duże różnice w tolerancji ciepła, takie jak porównania między gatunkami o bardzo różnych niszach termicznych. Jednak ze względu na wysoki poziom koenzymu Q10 dla akumulacji obrażeń cieplnych, test statyczny może być preferowany do wykrywania małych rozmiarów efektów, takich jak wewnątrzgatunkowa zmienność tolerancji ciepła⁹. Ponadto, praktycznie rzecz biorąc, test statyczny wymaga mniej wyrafinowanego sprzętu niż test dynamiczny.

Obiektywny
Celem niniejszej pracy jest sformalizowanie metod oznaczania_min CT i ciepła KD, które mogą być wykorzystane w przyszłych badaniach do oceny granic termicznych ruchliwych owadów. Protokoły są dostosowane do wcześniej ustalonych metodologii i są zaprojektowane tak, aby były wysokowydajne, zautomatyzowane i opłacalne. Oba testy można wykonać w krótkim czasie (~2 h), co oznacza, że w ciągu jednego dnia można przeprowadzić wiele eksperymentów, uzyskując duże ilości danych bez poświęcania powtarzalności i dokładności. Dzięki tej konfiguracji tolerancja cieplna 96 much może być mierzona jednocześnie, podczas gdy kolumna dla CT_min może pomieścić ponad 100 much, pod warunkiem, że jest odpowiednia powierzchnia do siedzenia.

Wysokoprzepustowa metoda obserwacji_{CT min} modyfikuje powszechną metodologię kolumn z płaszczem poprzez dodanie czujnika podczerwieni do automatycznego liczenia much. Zastosowanie czujnika podczerwieni do liczenia zostało po raz pierwszy zaproponowane przez Shumana i in. w 1996 roku²³, ale nie zostało powszechnie przyjęte. Dodanie czujnika podczerwieni pozwala na generowanie danych w sposób ciągły, a nie gromadzenie danych w dyskretnych odstępach czasu. Protokół ten minimalizuje również błąd eksperymentatora, eliminując ręczne wprowadzanie danych i konieczność ręcznego przełączania probówek zbiorczych poniżej podnośnika kolumny w dyskretnych punktach czasowych.

Wysokoprzepustowa metoda rejestracji ciepła KDT jest zmodyfikowana w stosunku do dwóch poprzednich badań nad tolerancją ciepła u owadów¹⁰^,¹². Pojedyncze muchy są przechowywane na 96-dołkowej płytce w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze, a wideo jest nagrywane. Protokół ten minimalizuje stronniczość eksperymentatora w określaniu ciepła KDT, ponieważ eksperymenty mogą być przeglądane i weryfikowane poprzez odtwarzanie nagrania. Protokół ten zapewnia również zestaw niestandardowych skryptów języka Python, których można użyć do przyspieszenia analizy wideo. Użycie indywidualnych studni eliminuje zakłócenia, które mogą wystąpić, gdy inne osoby poruszają się lub przewracają, co może stanowić problem, gdy grupy osób są obserwowane na tej samej arenie¹⁰^,¹⁷. Co więcej, inkubator z kontrolowaną temperaturą zapewnia stabilną temperaturę we wszystkich 96 dołkach, w przeciwieństwie do gradientu temperatury obserwowanego czasami w bloku aluminiowym o kontrolowanej temperaturze¹⁰. Należy również pamiętać, że metoda nagrywania 96 dołków może być dostosowana do pomiaru dynamicznego_maksimum CT i potencjalnie_{CT min} (patrz Dyskusja).

Aby zademonstrować każdy protokół, porównano limity termiczne dorosłych samic Drosophila melanogaster z wybranych linii Genetycznego Panelu Referencyjnego Drosophila melanogaster (DGRP)²⁴. Linie te zostały wybrane, ponieważ wstępne eksperymenty wykazały znaczące różnice w tolerancji termicznej. Testy te okazały się solidnymi metodami rozróżniania różnic w tolerancji termicznej. Poniższe dwa protokoły, wysokoprzepustowy test CT_min (sekcja 1) i wysokoprzepustowy test ciepła KD (sekcja 2), opisują niezbędne działania w celu uzyskania_{danych CT min} i ciepła KDT dla dowolnego stadium życia ruchliwych owadów, które mogą zmieścić się w aparatach, takich jak dorosły Drosophila. W przypadku tomografii komputerowej_{ważne jest również}, aby owad mógł przysiąść. Tutaj każdy test jest demonstrowany na dorosłych Drosophila melanogaster. Jednak modyfikacje mogą być wymagane dla innych taksonów lub etapów życia⁶. Drobne zmiany mogą obejmować użycie materiału do siedzenia z większymi otworami, aby pomieścić większe próbki w teście CT_min lub użycie kamery wyższej jakości do rozpoznania subtelnego KDT wolno poruszającego się owada lub etapu życia w teście ciepła KD. Protokół ten nie opisuje metod przygotowania much, ale ważne jest ujednolicenie protokołów hodowlanych, aby zapewnić powtarzalność²⁵ (zobacz Garcia and Teets²⁶ oraz Teets and Hahn²⁷). Dostarczone protokoły zawierają informacje o tym, jak zbudować i ustawić aparaty, jak rejestrować pomiary oraz krótki opis analizy danych.