Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnego Dendra2

DOI:

10.3791/61196

⸱

13 czerwca 2020

 , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Biology and Chemistry, University of Bremen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół monitorowania degradacji białka huntingtyny połączonego z fotokonwertowalnym fluoroforem Dendra2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka są nieustannie syntetyzowane i degradowane w komórce, aby utrzymać homeostazę. Możliwość monitorowania degradacji białka będącego przedmiotem zainteresowania jest kluczem nie tylko do zrozumienia jego cyklu życiowego, ale także do odkrycia nierównowagi w sieci proteostazy. Metoda ta pokazuje, jak śledzić degradację białka powodującego chorobę huntingtyny. W układzie nerwowym C. elegans ulegają ekspresji dwie wersje huntingtyny połączonej z Dendra2: wersja fizjologiczna lub wersja z rozszerzonym i patogennym odcinkiem glutaminy. Dendra2 jest fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym; po krótkim impulsie promieniowania ultrafioletowego (UV) Dendra2 zmienia swoje widma wzbudzenia/emisji z zielonego na czerwone. Podobnie jak w eksperymencie z pościgiem impulsowym, obrót przekształconego czerwonego-Dendry2 może być monitorowany i określany ilościowo, niezależnie od zakłóceń od nowo zsyntetyzowanej zielonej-Dendry2. Korzystając z mikroskopii opartej na konfokalach i ze względu na przezroczystość optyczną C. elegans, możliwe jest monitorowanie i ilościowe określenie degradacji huntingtyny-Dendry2 w żywym, starzejącym się organizmie. Neuronalna huntingtyna-Dendra2 ulega częściowej degradacji wkrótce po konwersji i z czasem ulega dalszemu usuwaniu. Systemy kontrolujące degradację są niewystarczające w obecności zmutowanej huntingtyny i są dodatkowo osłabione wraz z wiekiem. Podtypy neuronów w obrębie tego samego układu nerwowego wykazują różne zdolności obrotu huntingtyny-Dendry2. Ogólnie rzecz biorąc, monitorowanie dowolnego interesującego białka połączonego z Dendra2 może dostarczyć ważnych informacji nie tylko na temat jego degradacji i zaangażowanych graczy w sieć proteostazy, ale także na temat jego lokalizacji, transportu i transportu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteom żywego organizmu nieustannie się odnawia. Białka są stale degradowane i syntetyzowane zgodnie z fizjologicznym zapotrzebowaniem komórki. Niektóre białka są szybko eliminowane, podczas gdy inne są dłużej żyjące. Monitorowanie dynamiki białek jest prostszym, dokładniejszym i mniej inwazyjnym zadaniem w przypadku stosowania genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych (FP). FP tworzą się autokatalitycznie i mogą być łączone z dowolnym białkiem (POI), ale nie wymagają enzymów do fałdowania lub kofaktorów, z wyjątkiem tlenu1. Nowsza generacja FP została niedawno zaprojektowana tak, aby przełączać kolor po napromieniowaniu impulsem świetlnym o określonej długości fali. Te fotoaktywowane FP (PAFP) pozwalają na etykietowanie i śledzenie punktów POI lub organelli lub komórek, w których się znajdują, oraz na badanie ich parametrów ilościowych i/lub jakościowych2. FP umożliwiają śledzenie ruchu dowolnego punktu POI, kierunkowości, szybkości lokomocji, współczynnika dyfuzji, frakcji ruchomej i nieruchomej, czasu, w którym przebywa w jednym przedziale komórkowym, a także szybkości jego obrotu. Dla określonych organelli można określić lokomocję i transport lub zdarzenia rozszczepienia i fuzji. Dla określonego typu komórki można ustalić położenie komórki, szybkość podziału, objętość i kształt. Co najważniejsze, zastosowanie PAFP umożliwia śledzenie bez ciągłej wizualizacji i bez zakłóceń ze strony nowo zsyntetyzowanej sondy. W badaniach zarówno na komórkach, jak i na całych organizmach z powodzeniem wykorzystano PAFP do rozwiązywania problemów biologicznych in vivo, takich jak rozwój raka i przerzuty, montaż lub demontaż cytoszkieletu oraz interakcje RNA-DNA/białko3. W tym manuskrypcie wykorzystano mikroskopię świetlną i PAFP do odkrycia szybkości obrotu podatnego na agregację białka huntingtyny (HTT) in vivo w modelu choroby neurodegeneracyjnej C. elegans.

Opisany tutaj protokół określa ilościowo stabilność i degradację białka fuzyjnego huntingtyny-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 to monomeryczny PAFP4, który nieodwracalnie zmienia swoje widma emisji/wzbudzenia z zielonego na czerwony w odpowiedzi na UV lub widzialne światło niebieskie, ze wzrostem intensywności nawet 4,000-krotnie5,6. Huntingtyna jest białkiem odpowiedzialnym za wywoływanie choroby Huntingtona (HD), śmiertelnej dziedzicznej choroby neurodegeneracyjnej. Ekson-1 huntingtyny zawiera pewien fragment glutaminy (CAG, Q). Kiedy białko ulega ekspresji z ponad 39Q, nieprawidłowo fałduje się w zmutowane, toksyczne i chorobotwórcze białko. Zmutowany HTT jest podatny na agregację i prowadzi do śmierci i degeneracji komórek neuronalnych, zarówno jako krótkie gatunki oligomeryczne, jak i jako większe, wysoce ustrukturyzowane amyloidy7.

Nicienie są modelowym systemem do badania starzenia się i neurodegeneracji dzięki łatwości manipulacji, izogenicznej naturze, krótkiej żywotności i optycznej przezroczystości8. Aby zbadać stabilność HTT in vivo, w układzie nerwowym C. elegans ulegnięto ekspresji konstruktu fuzyjnego. Transgen HTT-D2 zawierający fizjologiczny odcinek 25Qs (HTTQ25-D2) lub patologiczny odcinek 97Qs (HTTQ97-D2) ulega nadekspresji panneuronalnej przez cały okres życia nicienia9. Poprzez poddanie żywych C. elegans krótkiemu i skupionemu punktowi światła, pojedynczy neuron jest fotoprzełączany, a przekształcony HTT-D2 jest śledzony w czasie. Aby ustalić ilość zdegradowanego HTT-D2, porównuje się różnicę między czerwonym sygnałem świeżo przekształconego HTT-D2 a pozostałym czerwonym sygnałem HTT-D2 po określonym czasie. W związku z tym możliwe staje się zbadanie, w jaki sposób huntingtyna ulega degradacji, gdy znajduje się w swojej rozszerzonej i toksycznej formie, w porównaniu z jej formą fizjologiczną; jak neurony przednie lub tylne reagują inaczej na obecność Q97 w porównaniu z Q25, zwłaszcza w dłuższych okresach czasu; oraz w jaki sposób załamanie się sieci proteostazy (PN) podczas starzenia się przyczynia się do różnic w tempie degradacji. Wyniki te opisują jedynie niewielki zestaw obserwacji dotyczących obrotu HTT-D2. Jednak dzięki temu zastosowaniu in vivo można rozwiązać wiele innych problemów biologicznych związanych zarówno z dziedziną agregacji białek, jak i proteostazy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja C. elegans wyrażającego neuronalne białko fuzyjne huntingtyny i dendry2

  1. Sklonuj gen kodujący POI w wektorze ekspresji nicieni (tj. pPD95_75, Addgene #1494), za pomocą tradycyjnego enzymu restrykcyjnego digest10, Gibson assembly11, lub dowolną wybraną metodą. Wstaw promotor, aby napędzać ekspresję w pożądanej tkance lub na pożądanym etapie rozwoju. Włóż fluorofor Dendra2 na końcu N lub C w ramce z punktem POI.
  2. Generowanie transgenicznych C. elegans wykazujących ekspresję konstruktu fuzyjnego (np. poprzez mikroiniekcję)12.
    UWAGA: Plazmid przenoszący transgen pozostanie jako macierz pozachromosomalna. Integracja konstrukcji nie jest konieczna, ale można ją wykonać w razie potrzeby13. W tym protokole C. elegans poddano mikroiniekcji plazmidu przenoszącego konstrukt fuzyjny eksonu huntingtyny 1-Dendra2 (HTT-D2) pod kontrolą panneuronalnego promotora Prgef-1. Szkielet ekspresji C. elegans uzyskano z Kreis et al.14, ekson huntingtyny 1 z Q25 lub Q97 uzyskano z Juenemann et al.15, a Dendra2 uzyskano z Hamer et al.16.

2. Dopasowanie wiekowe i utrzymanie C. elegans

  1. Dopasuj wiek wszystkich nicieni poprzez synchronizację z alkalicznym roztworem podchlorynu traktowanym 17 lub poprzez składanie jaj przez 4 godziny w temperaturze 20 °C. Do składania jaj umieść 10 grawych dorosłych osobników na świeżo wysianej pożywce z nicieni (NGM) i pozostaw na 4 godziny przed wyjęciem. Jaja złożone w tym czasie dadzą początek zsynchronizowanym nicieniom.
  2. Utrzymuj eksperymentalne C. elegans na płytkach pożywki wzrostowej nicieni (NGM) obsianej bakteryjnym źródłem pożywienia E. coli OP50, zgodnie ze standardową hodowlą nicieni18.
  3. Hodować nicienie w temperaturze 20 °C do pożądanego etapu. Dla tego protokołu wymagany wiek to dzień 4 i 10,
    UWAGA: Młode dorosłe osobniki w 4 dniu można rozpoznać po obecności jaj w ich gonadach i ich dużej ruchliwości. Nicienie w wieku 10 dni są po zapłodnieniu, ulegają degradacji tkanek i pogorszeniu zdolności ruchu19.
  4. W przypadku nicieni w dniu 10 pasaż należy przeprowadzić codziennie po stadium L4 w dniu 3, gdy nicienie są płodne, aby uniknąć populacji mieszanej.

3. Przygotowanie preparatów mikroskopowych do obrazowania

  1. Przygotuj preparaty mikroskopowe w dniu obrazowania. W kuchence mikrofalowej rozpuść agarozę ogólnego gatunku w stężeniu 3% (w/v) w ddH2O. Pozostaw do lekkiego ostygnięcia.
  2. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml i odessaj około 400 μl stopionej agarozy. Delikatnie umieść kilka kropli agarozy na czystym szklanym szkiełku podstawowym i natychmiast umieść na nim kolejne szkiełko, upewniając się, że między nimi utworzy się cienka podkładka agarozy. Pozostaw do wyschnięcia, zanim delikatnie zsuniesz lub podniesiesz górną część zsunięcia.
  3. Umieść szkiełka z agarozy w nawilżonym pojemniku, aby zapobiec ich wysychaniu. Można je zużyć w ciągu 2-3 godz.
    UWAGA: Unikaj tworzenia się małych pęcherzyków w agarozie, ponieważ nicienie mogą zostać w nim uwięzione.

4. Definicja parametrów mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Przed zamontowaniem nicieni i akwizycją danych, zdefiniuj wszystkie ustawienia w oprogramowaniu do akwizycji konfokalnej. Ustawienia można dostosować do wybranego sprzętu i oprogramowania do obrazowania.

  1. Otwórz oprogramowanie konfokalne i zdefiniuj ustawienia obrazowania laserowego. Ustaw ścieżkę światła dla wzbudzenia/emisji dla zielonej Dendry2 na 486-553 nm i dla czerwonej Dendra2 na 580-740 nm. Dostosuj moc i wzmocnienie obu kanałów/laserów w zależności od intensywności fluoroforu. Nie zmieniaj cyfrowego wzmocnienia ani przesunięcia i ustaw otwór jako całkowicie otwarty.
  2. Zdefiniuj konfigurację akwizycji: wybierz sekwencyjny tryb kanału i przełączaj ścieżkę co klatkę. Ustaw tryb skanowania jako klatkę, a rozmiar klatki na 1 024 x 1 024 z krokiem linii równym 1. Ustaw uśrednienie na 2 i uśrednij metodą średnią i trybem linii jednokierunkowej. Ustawia głębię bitową na 8 bitów.
  3. Zdefiniuj ustawienia akwizycji wielowymiarowych dla konwersji Dendra2. Do konwersji i wybielania należy użyć lasera diodowego o długości fali 405 nm o mocy 60% energii. Jeśli to możliwe, aktywuj bezpieczny środek wybielający GaAsP, aby chronić detektory.
  4. Wybierz szereg czasowy składający się z dwóch cykli z interwałem 0,0 ms pomiędzy nimi oraz normalnym początkiem i końcem. Rozpocznij wybielanie po skanie 1 z 2 i powtórz przez 30 iteracji. Przestań wybielać, gdy intensywność spadnie do 50%.
  5. Zdefiniuj szybkość akwizycji/zatrzymania piksela jako szybkość (np. maksymalna = 12) dla konwersji i średnia prędkość (np. średnia = 5) dla przechwytywania obrazu przyciągania.
    UWAGA: Zdefiniowane tutaj parametry wybielania są orientacyjne. W przypadku innych punktów POI oznaczonych Dendra2 ustawienia mocy lasera oraz iteracje i wartości wybielania muszą być ustalone empirycznie.

5. Montaż C. elegans na szkiełkach mikroskopowych

UWAGA: Jeśli to możliwe, umieść montażowy mikroskop stereoskopowy blisko zestawu mikroskopu konfokalnego i zamontuj nicienie tuż przed obrazowaniem.

  1. Na szkiełku na szklanej pokrywie po przeciwnej stronie podkładki agarozowej narysuj okno z czterema kwadratami za pomocą trwałego markera i ponumeruj je.
  2. Odpipetować 15 μl lewamizolu na środku wkładki agarozowej. Stężenie lewamizolu będzie się różnić w zależności od wieku nicienia: Podczas obrazowania nicienie w 4. dniu używają lewamizolu 2 mM; podczas obrazowania w 10. dniu nicienie używają 0,5 mM lewamizolu.
  3. Przenieś cztery nicienie do płynu za pomocą drucianego szpikulca. Za pomocą szpikulca do rzęs delikatnie przesuń każdego nicienia na kwadrat okienny. Obróć rzęsę tak, aby wszelkie ślady E. coli OP50 zostały rozcieńczone, a jej fluorescencyjne tło nie przeszkadzało w akwizycji sygnału.
  4. Poczekaj, aż nicienie prawie przestaną się poruszać i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynu, aby unieruchomić nicienie w warstwie lewamizolu między podkładką agarozową a szkiełkiem nakrywkowym.
  5. Umieść odwrócone szkiełko na stoliku konfokalnym, aby zobrazować nicienie.

6. Konwersja zielonego Dendra2: Akwizycja danych w czasie zero

UWAGA: Eksperymenty z pogonią za pulsem rozpoczynają się od nieodwracalnego przekształcenia białka fuzyjnego Dendra2 z fluoroforu emitującego zielone na czerwone.

  1. Za pomocą okularu mikroskopu zlokalizuj pierwszego nicienia za pomocą obiektywu 20x pod zieloną fluorescencją. Ustaw ostrość na głowie lub ogonie i przełącz się w tryb konfokalny.
  2. Rozpocznij skanowanie laserowe na żywo za pomocą niebieskiego lasera 488 nm, aby zobrazować zieloną Dendrę2 w zielonym kanale EGFP (ex/em = 486-553 nm). Wybierz pojedynczy neuron i ustaw na nim ostrość. Powiększ 3x i zwiększ cel wiązki laserowej4.
    UWAGA: Wybierz jeden neuron na nicienie. Każdy neuron będzie stanowił jedną próbkę lub punkt danych.
  3. Znajdź maksymalną płaszczyznę projekcji i, w zależności od jasności fluoroforu, zwiększ lub zmniejsz wzmocnienie lub moc lasera, aby uzyskać nasycony, ale nie prześwietlony obraz, który można zidentyfikować za pomocą wskaźnika zakresu kolorów. Po zdefiniowaniu tej opcji zatrzymaj skanowanie.
    UWAGA: Nie należy naświetlać próbki zbyt długo lub ze zbyt dużą mocą, ponieważ wzbudzenie widzialnym niebieskim światłem o długości fali 488 nm może również przekształcić Dendra2, choć powoli i mniej wydajnie4.
  4. W oprogramowaniu otwórz kartę, aby wybrać obszary zainteresowania (ROI) i narysować pierwszy ROI wokół wybranego neuronu. Zdefiniuj większy drugi obszar zainteresowania obejmujący głowę nicienia i obejmujący pierwszy zwrot z inwestycji.
  5. W ustawieniach wybielania wybierz pierwszy zwrot z inwestycji, który ma zostać uzyskany, wybielony i przeanalizowany. Wybierz drugi zwrot z inwestycji, który ma zostać uzyskany i przeanalizowany, ale nie wybielony.
  6. Ustaw prędkość skanowania na maksymalną (tj. szybkie zatrzymanie pikseli) i rozpocznij eksperyment w celu konwersji wybranych neuronów Dendra2.
    UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu uzyskany obraz spowoduje powstanie dwóch obrazów: jednego przed i jednego po konwersji. Dla kanału zielonego, pierwszy obraz powinien mieć wyższy sygnał zielony, który słabnie w drugim obrazie z powodu konwersji zielonego Dendra2. W przypadku kanału czerwonego pierwszy obraz powinien być ujemny i nie pokazywać żadnego sygnału, a czerwony sygnał powinien pojawić się na obrazie po konwersji. Jeśli zielony sygnał nie słabnie, konwersja nie nastąpiła, a ustawienia, takie jak moc lasera 405 lub liczba iteracji, powinny zostać zmodyfikowane. Jeśli na pierwszym zdjęciu jest czerwony sygnał, oznacza to, że użyta moc lasera 488 nm była zbyt wysoka i część zielonej Dendry2 została już zamieniona na czerwoną. W takim przypadku należy wybrać nowy neuron/nicień.
  7. Natychmiast po konwersji rozpocznij skanowanie na żywo za pomocą zielonego lasera 561 nm, aby uwidocznić Dendra2 w kanale czerwonym (ex/em = 580-740 nm). Znajdź ostrość i odpowiednią maksymalną projekcję przekształconego neuronu za pomocą wskaźnika koloru zakresu, aby uniknąć prześwietlenia.
  8. Szybko ustaw szybkość skanowania na niższą szybkość zatrzymywania pikseli (np. 5x) i uzyskaj migawkę obrazu obu kanałów w wyższej rozdzielczości. Ten obraz jest zdefiniowany jako punkt czasu zero (T0) po konwersji.
    UWAGA: Szybkość akwizycji przekonwertowanego obrazu może być różna. Jednak po wybraniu tej prędkości musi ona pozostać stała przez cały okres zbierania danych.
  9. Zapisz skan z możliwą do zidentyfikowania nazwą i/lub numerem, a następnie etykietą czasu zerowego (T0).
    UWAGA: Zaleca się również zapisanie obrazu eksperymentu konwersji (krok 6.6), aby zilustrować brak czerwonego sygnału przed konwersją i jego pojawienie się po konwersji.

7. Obrazowanie przekonwertowanego czerwonego Dendra2 w celu akwizycji danych w wybranym drugim punkcie czasowym

  1. Aby śledzić degradację Dendra2 w czasie, zdefiniuj drugi punkt czasowy, aby ponownie zobrazować ten sam nicień/neuron. Wybierz eksperymentalnie drugi punkt czasowy, aby odpowiedzieć na wszelkie istotne pytania biologiczne. W przypadku opisanego tutaj protokołu, Dendra2 jest obrazowana zarówno po 2 godzinach (T2), jak i 24 godzinach (T24) po konwersji.
    1. W wybranym punkcie czasowym znajdź ten sam nicień/neuron za pomocą okularu i czerwonej fluorescencji.
    2. Otwórz obraz T0 odpowiedniego nicienia/neuronu i ponownie załaduj/użyj ponownie ustawień obrazu. Upewnij się, że ustawienia akwizycji migawki są dokładnie takie same podczas uzyskiwania obrazów T0, T2 i T24 h.
    3. Skanując na żywo w kanale czerwonym, zogniskuj przekształcony czerwony neuron. Ponieważ czerwona Dendra2 pogarsza się z czasem, wskaźnik zasięgu będzie pokazywał mniej intensywną projekcję maksymalną. Nie zmieniaj żadnych parametrów akwizycji i uzyskaj migawkę z tą samą prędkością (np. 5x) co pierwszy obraz.
  2. Aby śledzić degradację Dendra2 po 4 godzinach lub dłużej, uratuj nicienie po konwersji.
    1. Wyjmij szkiełko z mikroskopu natychmiast po przekształceniu i zobrazowaniu czterech nicieni. Delikatnie zdejmij szkiełko nakrywkowe i za pomocą drucianego szpikulca wyjmij każdego nicienia z podkładki agarozowej.
    2. Umieść każdego nicienia indywidualnie na odpowiednio oznakowanej i możliwej do zidentyfikowania płytce NGM.
    3. W drugim punkcie czasowym ponownie zamontuj nicienie na świeżej podkładce agarozowej i kontynuuj obrazowanie przekształconej czerwonej Dendry2 zgodnie z instrukcjami w sekcji 6.

8. Analiza obrazu przekonwertowanego Dendra2

UWAGA: Analiza degradacji Dendra2 jest wykonywana za pomocą oprogramowania Fiji/ImageJ20.

  1. Otwórz Fidżi, a następnie przeciągnij i upuść plik .lsm na pasek Fidżi. Otwórz obraz T0 zrobiony tuż po konwersji i obraz tego samego nicienia zrobiony w wybranym punkcie czasu po konwersji (T2 lub T24 h).
    UWAGA: Aby śledzić degradację białka będącego przedmiotem zainteresowania połączonego z Dendra2, należy przeanalizować tylko kanał czerwony.
  2. Ustal parametry pomiarowe z menu: Analizuj | Ustaw wymiary. Wybierz funkcje Obszar i Zintegrowana gęstość.
  3. Wybierz obraz uzyskany za pomocą kanału czerwonego. Wybierz narzędzie Zaznaczanie wielokątów z paska Fidżi.
  4. Zidentyfikuj przekształcony neuron na obrazie T0 i narysuj wokół niego ROI za pomocą narzędzia do zaznaczania.
    1. Aby prawidłowo zidentyfikować kontury neuronu, podświetl progi intensywności, wybierając z paska Obraz | Dostosuj | Próg. Przeciągnij kursor paska, aby wyznaczyć próg i obrysuj ten obszar za pomocą narzędzia wielokąta. Aby wygenerować dokładny zwrot z inwestycji, możliwe jest również wykorzystanie konturu wybranego neuronu z kanału zielonego.
  5. Po dokonaniu wyboru w czerwonym oknie kanału, naciśnij Analizuj | Miara. Pojawi się wyskakujące okienko o nazwie Wyniki i zawierające wartości ROI dla Area, IntDen i RawIntDen.
  6. Wykonaj ten sam proces selekcji i pomiaru dla obrazu drugiego punktu czasowego (T2 lub T24 h).
  7. Uzyskane wartości należy skopiować do arkusza kalkulacyjnego, zwracając uwagę na odpowiednie zapisanie wartości w T0 po konwersji, oraz w T2 lub T24 h po konwersji.

9. Obliczanie współczynnika degradacji Dendra2

  1. Aby obliczyć współczynnik degradacji, najpierw przypisz wartość 1 (lub 100%) do czasu degradacji od punktu zerowego (tj. tuż po konwersji, gdy cała czerwona Dendra2 przekształcona jest nadal obecna). Wynika to z podzielenia wartości IntRawDen T0 przez siebie.
  2. Aby obliczyć redukcję czerwonego sygnału intensywności Dendra2 w czasie i degradację, podziel wartość RawIntDen drugiego punktu czasowego (np. T2 lub T24 h) przez wartość RawIntDen T0. Wynikowa liczba powinna być mniejsza niż 1. Wartości te mogą być również wyrażone w procentach, definiując T0 jako 100%.
  3. Powtórzyć sekcję 7 dla każdego przekształconego nicienia. Aby uzyskać graficzną reprezentację degradacji Dendra2, należy narysować wykres punktowy lub wykres słupkowy z wartościami procentowymi lub stosunkowymi spadku fluorescencji uzyskanymi na osi y. Zastosuj dowolną analizę statystyczną i zilustruj ją na wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa szczepy nicieni wyrażające fragment białka eksonu huntingtyny 1 w ramce z fotokonwertowalnym białkiem Dendra2 uzyskano za pomocą mikroiniekcji, a plazmidy zachowano jako układ pozachromosomalny. Konstrukt fuzji był wyrażany w całym układzie nerwowym C. elegans od rozwoju przez starzenie się. W tym przypadku HTT-D2 zawierał albo fizjologiczny odcinek 25 poliglutaminy (HTTQ25-D2, Rysunek 1A), albo w pełni penetrujące i patogenne powtórzenie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć funkcję białka, ważne jest zrozumienie jego syntezy, lokalizacji i degradacji. Wraz z rozwojem nowatorskich, stabilnych i jasnych FP, wizualizacja i monitorowanie punktów POI stało się łatwiejsze i bardziej wydajne. Genetycznie wyrażone fuzjowe PAFP, takie jak Dendra2, mają wyjątkową pozycję do badania stabilności POI. Po wystawieniu na działanie fioletowo-niebieskiego światła, Dendra2 rozpada się w precyzyjnym miejscu w triadzie konserwatywnych aminokwasów. Fluorofor ulega niewielkiej zmianie strukturalnej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy DFG (KI-1988/5-1 do JK, stypendium doktoranckie NeuroCure od NeuroCure Cluster of Excellence dla MLP) za finansowanie. Dziękujemy również Centralnemu Ośrodku Obrazowania Instytutu Badawczego Farmakologii Molekularnej im. Leibniza w Berlinie (FMP) za dostarczenie zestawu do obrazowania. Ponadto chcielibyśmy podziękować Diogo Feleciano, który stworzył system Dendra2 w laboratorium i udzielił instrukcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2Składnik NGM
Agaroza, Universal GradeBio & Sprzedam GmbHBS20.46.500Element prowadnicy montażowej
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677Komponent NGM
Deckglä ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Szkiełka nakrywkowe
EC Plan-Neufluar 20x/0,50 Ph2 M27Carl Zeiss AGObiektyw
Fidżi/ImageJ 1,52pOprogramowanie analityczneNIH
Chlorowodorek lewamizoluAppliChem GmbHA4341Znieczulenie
LSM710-ConfoCor3Carl Zeiss AGLaserowy skaningowy mikoskop konfokalny
Montaż mikroskopu stereoskopowegoLeica Camera AGMikroskop montażowy
neuronal-HTTQ25-Dendra2ten artykułC. elegans szczep
neuronal-HTTQ97-Dendra2ten artykułC. elegans szczep
OP50 Escherichia coliCENTRUM GENETYKI CAENORHABDITIS (CGC)OP50Źródło pożywienia dla nicieni
Chlorek soduCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2Składnik NGM
Standard-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Szkiełka
ZEN2010 B SP1Carl Zeiss AGOprogramowanie do akwizycji konfokalnej
podstawowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005(2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773(2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105(2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein TurnoverC ElegansDendra2 PhotoconversionConfocal MicroscopyHuntingtin DegradationProteostasis NetworkNeuronal SubtypesLive ImagingFluorescence QuantificationAging Organism

Powiązane artykuły