Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Podsumowanie

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Streszczenie

organoidy jelitowe pochodzące z hiPSC to struktury nabłonkowe, które samoorganizują się ze zróżnicowanych komórek w złożone struktury 3D, reprezentatywne dla ludzkiego nabłonka jelitowego, w których wykazują struktury podobne do krypt/kosmków. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC poprzez stopniowe różnicowanie hiPSC w ostateczną endodermę, która jest następnie tylizowana w celu utworzenia nabłonka jelita tylnego przed przeniesieniem do warunków hodowli 3D. Środowisko hodowli 3D składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (np. Matrigel lub innego kompatybilnego ECM) uzupełnionej o SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 i CHIR99021. Organoidy przechodzą pasażowanie co 7 dni, gdzie są mechanicznie przerywane przed przeniesieniem do świeżej macierzy zewnątrzkomórkowej i pozwalają im się rozwijać. QPCR i immunocytochemia potwierdzają, że organoidy jelitowe pochodzące z hiPSC zawierają dojrzałe typy komórek nabłonka jelitowego, w tym komórki kubkowe, komórki Panetha i enterocyty. Dodatkowo organoidy wykazują dowody na polaryzację przez ekspresję villiny zlokalizowanej na wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonkowych.

Powstałe organoidy mogą być używane do modelowania rozwoju ludzkich jelit, jak również licznych chorób jelit, w tym nieswoistych zapaleń jelit. Aby modelować zapalenie jelit, organoidy mogą być wystawione na mediatory stanu zapalnego, takie jak TNF-α, TGF-β i bakteryjny LPS. Organoidy wystawione na działanie cytokin prozapalnych wykazują w odpowiedzi fenotyp zapalny i zwłóknieniowy. Zestawienie zdrowych i hiPSC pochodzących od pacjentów z IBD może być przydatne w zrozumieniu mechanizmów napędzających IBD. Może to pozwolić na odkrycie nowych celów terapeutycznych i nowych biomarkerów, które pomogą we wczesnej diagnozie choroby.

Wprowadzenie

Właściwości pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), takie jak samoodnawianie się i zdolność do różnicowania się do dowolnego typu komórek ludzkiego ciała, czynią je cennymi narzędziami w badaniach nad rozwojem, patologią chorób i testami leków¹. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są szczególnie przydatne w badaniach modelowania choroby, ponieważ mogą pochodzić od pacjentów, bezpośrednio rejestrując genom odpowiedzialny za fenotyp choroby^2,3. Takie hiPSC mogą być różnicowane w zależności od typu komórki dotkniętej wadą genetyczną, co pozwala na dokładne zbadanie molekularnego mechanizmu choroby⁴.

Protokoły różnicowania dla ludzkich PSC mają na celu ukierunkowanie różnicowania komórek poprzez główne etapy rozwoju poprzez aktywację lub hamowanie specyficznych szlaków sygnałowych regulujących zaangażowanie i specyfikację linii. Utrzymanie hiPSC w stanie pluripotencjalnym wymaga umiarkowanego poziomu sygnalizacji aktywiny A (Act-A), podczas gdy wysoka dawka Act-A przez 3 dni zobowiązuje hiPSC do ostatecznego losu endodermy (DE)^5,6. Szlaki Act-A i Wnt kierują tożsamością przednio-tylną DE. Sygnalizacja przez Act-A indukuje markery jelita przedniego (FG), takie jak HHEX, HNF4α i GATA4, jednocześnie blokując ekspresję genów jelita tylnego (HG), takich jak CDX2. Sygnalizacja Wnt indukuje posterioryzację DE, która następnie przyjmuje profil ekspresji genu HG^7,8. Po ustaleniu tożsamości komórek HG różnicowanie można przenieść z 2D do 3D i skierować w kierunku tworzenia organoidów jelitowych.

Organoidy jelitowe są zazwyczaj hodowane w systemie hodowli opartym na matrycy zewnątrzkomórkowej 3D (np. Matrigel lub innych kompatybilnych ECM)⁹, składającym się z lamininy, kolagenu IV i entaktyny oraz wzbogaconym o czynniki wzrostu, takie jak EGF, FGF, PDGF i IGF-1, aby przyczynić się do przetrwania i proliferacji. Organoidy są hodowane w określonym pożywce zawierającej gastrynę, nogginę i CHIR w celu stymulowania i wspierania wzrostu i proliferacji jelitowych komórek macierzystych podczas długotrwałej hodowli.

Po tym, jak komórki nabłonka jelitowego zostaną osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej, krypty jelitowe zaczynają się formować i rozszerzać, ostatecznie tworząc sferoidy. Dojrzewają one do struktur organoidowych, które naśladują fizjologiczne funkcjonowanie nabłonka jelitowego. Organoidy można zazwyczaj hodować przez ponad 1 rok bez znaczącej utraty profili funkcjonalnych i ekspresji genów. Pasażowanie jest wymagane co tydzień z wykorzystaniem enzymatycznego trawienia organoidów na mniejsze fragmenty, które następnie samoczynnie łączą się w kompletne organoidy.

Uznane linie organoidowe mogą być używane jako wiarygodny model wielu zaburzeń związanych z jelitami, w tym choroby Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego i raka jelita grubego^10,11,12,13. Jest to model preferowany przez komórki zwierzęce, ponieważ wyrażają one ludzkie geny związane z tymi zaburzeniami i reagują na bodźce zewnętrzne bardziej przypominające te, które występują w tkance ludzkiej in vivo.

Protokół

UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą tkanek opisane poniżej powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II.

1. Indukowane przez człowieka różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do endodermy jelita tylnego

1. Aby pokryć kolbę do hodowli komórkowych macierzą zewnątrzkomórkową, najpierw oblicz potrzebną ilość matrycy. Oto przykład płytki 12-dołkowej pokrytej Matrigelem. Oblicz wymaganą ilość macierzy zewnątrzkomórkowej do pokrycia płytki 12-dołkowej. Użyj następującej formuły:
   
   UWAGA: Pokryj szalki z hodowli komórkowych wybraną macierzą zewnątrzkomórkową. W przypadku stosowania Matrigel, w celu różnicowania należy użyć stężenia 0,035 mg/cm² 24 godziny przed siewem. Sprawdź stężenie partii macierzy zewnątrzkomórkowej na karcie produktu i przygotuj mniejsze porcje przed eksperymentami zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Rozcieńczyć wymaganą ilość macierzy zewnątrzkomórkowej w zimnym podłożu DMEM za pomocą pipety p1000.
3. Dobrze wymieszaj za pomocą paski o pojemności 5 ml.
4. Dodaj 500 μl rozcieńczonej matrycy do każdej płytki dołka. Delikatnie wstrząsnąć płytką w celu równomiernego rozprowadzenia rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C.
5. Przed wysianiem komórek na płytkę należy przemyć każdą studzienkę 500 μl PBS w celu usunięcia nadmiaru macierzy zewnątrzkomórkowej. Zapobiegnie to odklejaniu się komórek podczas różnicowania.
6. Pozostaw ostatnie mycie w studzienkach, aż będą gotowe do wysiewu, aby zapobiec wysuszeniu macierzy zewnątrzkomórkowej.
7. Aby wysiać nasiona różnicowania hiPSC w kierunku ostatecznej endodermy (DE) lub jelita grubego (HG), należy pobrać kolbę hiPSC wyhodowaną w wybranej pożywce podtrzymującej (np. pożywce essential 8) i odessać pożywkę. (Tutaj wysiewamy komórki w ilości 25 000 komórek/cm²).
   UWAGA: Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego różnicowania i musi być zoptymalizowana dla każdej pojedynczej linii komórkowej hiPSC.
8. Przemyć komórki w kolbie 5 ml PBS. Zassać PBS.
9. Dodać 2,5 ml roztworu do dysocjacji komórek (np. TrypLE) i pozostawić w temperaturze pokojowej na 4 minuty. Zassać roztwór do dysocjacji komórek i delikatnie postukać w kolbę, aby odłączyć komórki.
10. Przemyć kolbę 5 ml pożywki DMEM ogrzanej do temperatury 37 °C i zebrać wszystkie komórki do probówki o pojemności 15 ml.
11. Weź 10 μl zawieszonego roztworu komórek i zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru.
12. Weź wystarczającą ilość zawiesiny komórek, aby zebrać 1,05 x 10⁶ komórek i umieść w probówce o pojemności 15 ml.
13. Wirować z prędkością 160 x g przez 3 min. Podczas wirowania komórek odessać PBS z 12-dołkowej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową.
14. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 ml pożywki konserwacyjnej z inhibitorem ROCK (10 μM).
15. Za pomocą pipety p1000 dodaj 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Ponownie zawieś komórki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie między studzienkami.
16. Delikatnie potrząśnij płytką, aby rozprowadzić komórki w dołkach płytki, ale unikaj wirowania pożywki, ponieważ spowoduje to zagęszczenie komórek w środku dołków.
17. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
18. Zmień pożywkę na pożywkę pielęgnacyjną (np. pożywkę Essential 8) tylko (bez inhibitora ROCK) 24 godziny po wysiewie.
19. Aby rozpocząć różnicowanie do DE, należy przygotować podłoże podstawowe endodermy zgodnie z tabelą 1.
    UWAGA: Na początku różnicowania komórki powinny znajdować się w przedziale 60-80% konfluencji.
20. Przygotować 12 ml pożywki DE, dodając aktywinę A (100 ng/ml) i Wnt3 (50 ng/ml) do podłoża podstawowego endodermy.
21. Rozgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
22. Odessać pożywkę z każdego dołka płytki lub kolby do hodowli tkankowej.
23. Rozpocznij różnicowanie DE od dodania 1 ml pożywki DE do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
24. Po 24 godzinach od rozpoczęcia różnicowania DE (D1 DE) należy przygotować świeże pożywki DE i przeprowadzić wymianę pożywki.
25. Powtórzyć krok 1.24 po 48 godzinach (D2 DE). Jeśli na tym etapie występuje duża śmierć komórki, przemyj wszystkie studzienki 500 μl PBS przed zmianą pożywki.
    UWAGA: Aby potwierdzić pomyślne różnicowanie endodermy, należy wykonać cytometrię przepływową w celu oceny ekspresji SOX17. Zwykle oczekujemy, że >80% komórek będzie dodatnich pod względem SOX17 przez D3 DE. Jeśli ekspresja SOX17 jest nieoptymalna, należy zoptymalizować gęstość wysiewu komórek, a także stężenia Act-A.
26. Różniczkowanie HG należy rozpocząć w tym momencie, tj. 72 godziny po rozpoczęciu różniczkowania DE. Przygotować 12 ml pożywki HG, dodając CHIR99021 (3 μM) i RA (1 μM) do podłoża podstawowego endodermy (Tabela 1).
    UWAGA: W D3 DE ogniwo powinno utworzyć jednolitą monowarstwę. Optymalne różnicowanie DE ma kluczowe znaczenie dla dalszych etapów różnicowania.
27. Zassać pożywkę DE.
28. Rozpocznij różnicowanie HG od dodania 1 ml pożywki HG do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
29. Kontynuuj różnicowanie przez 4 dni z codzienną wymianą pożywki.
    UWAGA: Aby określić powodzenie posterioryzacji DE, należy wykonać cytometrię przepływową w celu oceny ekspresji CDX2. Przez D4 różnicowania HG zwykle oczekujemy, że >80% komórek będzie CDX2 dodatnich. Jeśli posterioryzacja jest nieoptymalna, należy zoptymalizować stężenie CHIR99021.
30. Aby pobrać próbkę do ekstrakcji RNA, należy odessać pożywkę różnicującą i przemyć studzienkę 500 ul PBS.
31. Odessać PBS i dodać odpowiednią objętość buforu do lizy komórek z zestawu do ekstrakcji RNA.
32. Za pomocą pipety p1000 zeskrob dno studzienki, aby zapewnić lizę wszystkich komórek.
33. Odessać lizat komórkowy i umieścić w czystej probówce.
34. Przystąpić do ekstrakcji RNA lub zamrozić lizat w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowy do ekstrakcji RNA.
35. Do barwienia immunologicznego należy odessać pożywkę różnicującą i przepłukać studzienki 500 μl PBS.
36. Odessać PBS i dodać 500 μl 4% PFA.
    UWAGA: PFA jest toksyczny. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i postępuj zgodnie z lokalnymi procedurami laboratoryjnymi dotyczącymi utylizacji PFA.
37. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
38. Usunąć PFA i trzykrotnie umyć studzienki 500 μl PBS.
39. Pozostaw ostatnie płukanie PBS na komórkach, aż będzie gotowe do przeprowadzenia barwienia immunologicznego.

2. Pasażowanie organoidów jelitowych

1. Przygotować podłoże jelitowe zgodnie z tabelą 2.
2. Aby przenieść się z hodowli komórkowej 2D do 3D, użyj płytki 6-dołkowej, aby wygenerować komórki DE z hiPSCS. Oderwij monowarstwę komórek od płytki 6-komórkowej za pomocą paski o pojemności 5 ml.
3. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 1 minutę, aby uzyskać osad komórkowy.
4. Zawiesić osad komórkowy w pożywce jelitowej zawierającej czynniki wzrostu: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), gastryna (10 nM), Noggin (100 ng/μL), EGF (500 ng/μL), R-Spondin1 (100 ng/ml), CHIR99021 (6 μM), inhibitor ROCK (10 μM).
5. Dodaj odpowiednią objętość macierzy zewnątrzkomórkowej w zależności od liczby studzienek, do których ma być wszczepiona. Można to obliczyć za pomocą poniższych równań.
   [1] Całkowita objętość macierzy zewnątrzkomórkowej/pożywki (μL) = 30 μL * liczba studzienek płytki 48-dołkowej
   [2] Wymagana objętość macierzy zewnątrzkomórkowej (μL) = Odpowiedź z [1] * 2/3
   [3] Wymagana objętość pożywki (μL) = Odpowiedź z [1] * 1/3
6. Dodać 30 μl zawiesiny komórkowej do środka każdego dołka 48-dołkowej płytki.
7. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez co najmniej 5 minut, aby umożliwić zastygnięcie macierzy zewnątrzkomórkowej.
8. Po ustawieniu kopuł macierzy zewnątrzkomórkowej dodaj 300 μl pożywki jelitowej zawierającej wszystkie czynniki wzrostu do każdej studzienki.
9. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂,
   UWAGA: Jeśli po 48 godzinach nie można zaobserwować żadnych organoidów i/lub występuje znaczna śmierć komórki, może być konieczna optymalizacja stężenia ROCKi i NOGGIN.
10. Aby przejść przez organoidy, obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby ocenić gęstość i rozmiar organoidów oraz określić, czy wymagają one pasażowania.
11. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowych lodowatym PBS.
    UWAGA: Kultury organoidów będą wymagały dzielenia mniej więcej co 5-7 dni. Pasażowanie kultur organoidów jelitowych jest wymagane, gdy w świetle organoidu widoczne jest nagromadzenie resztek komórkowych i zażółcenie otaczającej pożywki jelitowej.
12. Mechanicznie odłączyć organoidy i kulę macierzy zewnątrzkomórkowej od płytki za pomocą ruchu skrobania za pomocą paski o pojemności 5 ml.
13. Zebrać organoidy z każdej studzienki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
14. Odwirować zawiesinę organoidów o sile 400 x g przez 1 minutę w celu osadzenia organoidów. Odsysać supernatant aż do osiągnięcia górnej części osadu komórkowego, zachowując ostrożność po dotarciu do widocznej warstwy macierzy zewnątrzkomórkowej.
15. Zawiesić osad w 15 ml lodowatego PBS.
    UWAGA: Ten krok służy do umycia pozostałej macierzy zewnątrzkomórkowej, która nie została usunięta w początkowym wirowaniu.
16. Wirować przy 400 x g przez 1 min. Zassać pożywkę do postaci osadu zawierającego organoidy.
17. Zawiesić w 1 ml lodowatego PBS. Za pomocą pipety p200 ręcznie rozerwać nienaruszone organoidy, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Obserwuj rozmiar organoidów za pomocą mikroskopu świetlnego, aby określić, czy wymagają one dalszej dysocjacji.
18. Dodaj 9 ml pożywki bez czynników wzrostu.
19. Wirować przy 400 x g przez 1 min. Odsysać supernatant do momentu, aż organoidy się osadzą.
20. Oblicz wymaganą ilość macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki, korzystając z poniższych równań:
    [1] Całkowita objętość macierzy zewnątrzkomórkowej/pożywki (μL) = 30 μL * liczba studzienek płytki 48-dołkowej
    [2] Wymagana objętość macierzy zewnątrzkomórkowej (μL) = Odpowiedź z [1] * 2/3
    [3] Wymagana objętość pożywki (μL) = Odpowiedź z [1] * 1/3
21. Zawiesić osad organoidowy w obliczonej objętości pożywki jelitowej z czynnikami wzrostu (w tym inhibitorem Noggin i ROCK).
22. Dodaj wymaganą objętość macierzy zewnątrzkomórkowej do tej zawiesiny komórkowej i ponownie zawieś, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie organoidów.
23. Odpipetować 30 μl tej zawiesiny do środka każdego dołka na płytce 48-dołkowej (najlepiej podgrzanej wstępnie w inkubatorze o temperaturze 37 °C).
24. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut, aż do stężenia macierzy zewnątrzkomórkowej.
25. Przygotuj pożywkę jelitową z czynnikami wzrostu (+ inhibitor ROCK) (około 17 ml na płytkę 48-dołkową).
26. Dodać 300 μl do każdego dołka.
27. Inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
28. Po pasażowaniu należy odsysać pożywkę dla organoidów jelitowych i zastępować ją świeżą pożywką jelitową z czynnikami wzrostu (bez inhibitora Noggin & ROCK) co 2-4 dni.
    UWAGA: Jeśli po 48 godzinach nie można zaobserwować żadnych organoidów i/lub występuje znaczna śmierć komórki, może być konieczna optymalizacja stężenia ROCKi i NOGGIN.
    UWAGA: Organoidy jelitowe reagują na szereg mediatorów stanu zapalnego in vivo. TNFα jest białkiem sygnalizacji komórkowej biorącym udział w kilku procesach zapalnych.
29. Aby wywołać reakcję zapalną w organoidach jelitowych, należy przygotować TNFα w stężeniu 40 ng/ml tylko w pożywce podstawowej.
30. Zassać pożywkę z płytki 48-dołkowej.
31. Dodać 300 μl przygotowanej pożywki podstawowej zawierającej 40 ng/ml TNFα.
32. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, aby odtworzyć środowisko prozapalne.
    UWAGA: Organoidy jelitowe reagują na szereg mediatorów stanu zapalnego in vivo. TNFα jest białkiem sygnalizacji komórkowej biorącym udział w kilku procesach zapalnych.
33. Pozostałe komórki należy usunąć przez aspirację do pułapki próżniowej zawierającej 5% Trigenue.

Wyniki

Schemat protokołu różnicowania jest pokazany w Rysunek 1A. W pierwszym dniu protokołu hiPSC powinny być zwarte i tworzyć małe kolonie o całkowitej konfluencji około 50-60%. 24 godziny po indukcji różnicowania w kierunku DE komórki zaczynają migrować z kolonii komórek macierzystych, tworząc monowarstwę komórek. Trwa to przez następne 3 dni i powinno utworzyć kompletną monowarstwę na D3 różnicowania DE (Rysunek 1). Ekspresja genów powinna być monitorowana w trakcie różnicowania za pomocą markerów pluripotencji (OCT4, NANOG, SOX2) o wysokiej ekspresji na D0 i szybko obniżonej podczas różnicowania DE. Podczas różnicowania DE ekspresja T powinna osiągnąć szczyt na D1, a następnie EOMES i MIXL na D2. Na D2 geny DE (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) powinny zacząć ulegać ekspresji i osiągać szczyt w D3 (Rysunek 2 i Figura 3). Komórki powinny być monowarstwą DE D3, a następnie mogą być tylizowane do endodermy jelita tylnego. Podczas zdarzenia posterioryzacji struktury 3D zaczną się formować już w D2. Czasami jednak zaczną pojawiać się dopiero na D4 lub wcale; nie zawsze wskazuje to na to, czy komórki będą dalej postępować i tworzyć organoidy jelitowe (Ryc. 1). Podczas specyfikacji HG ekspresja CDX2 i HNF4a powinna być indukowana i wzrastać w czasie (Rysunek 3).

Po przeniesieniu arkuszy 2D komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej, przez pierwsze 24 godziny będą obserwowane skupiska komórek 2D. Po 48 godzinach arkusze komórek powinny zacząć automatycznie organizować się w bardziej zwarte sferoidalne struktury 3D, które początkowo są małe ( Rysunek 4A), a następnie stopniowo zwiększają rozmiar i złożoność w ciągu 7-10 dni hodowli ( Rysunek 4B i Rysunek 4C). Organoidy nie powinny być pasażowane, dopóki nie osiągną wyraźnej morfologii organoid/sferoidu z widocznym nabłonkiem ze światłem skierowanym w stronę środka organoidu/sferoidu (Rysunek 4D). Na tym etapie immunocytochemia może być wykorzystana do potwierdzenia ekspresji markerów jelitowych, takich jak villin i CDX2 (Ryc. 5). Nie wszystkie skupiska komórek 2D rozwiną się w organoidy, a w macierzy zewnątrzkomórkowej będą znajdować się martwe komórki zanieczyszczające. Te martwe arkusze komórek należy zignorować, dopóki komórki, które przeżyły, nie utworzą dużych organoidów i nie będą gotowe do przejścia.

Aby modelować stan zapalny, TNFα można dodać do pożywki do hodowli tkankowej na 24-48 godzin. Po inkubacji z cząsteczkami prozapalnymi, organoidy są zbierane przy użyciu tej samej techniki, która jest używana do ich izolacji i pasażowania, a następnie poddawane lizie za pomocą aplikacji kompatybilnej z buforem komórkowym, takiej jak QPCR lub western blotting. Jeśli wymagana jest krótsza ekspozycja, organoidy należy najpierw usunąć z macierzy zewnątrzkomórkowej i wystawić na działanie TNFα w zawiesinie za pomocą probówki o pojemności 1,5 ml. Leczenie organoidów jelitowych TNFα przez 48 godzin zazwyczaj indukuje ekspresję markerów prozapalnych (TNFα, IL1B, IL8, IL23), jednocześnie negatywnie wpływając na ekspresję markerów nabłonka jelitowego (LGR5, VIL) (Ryc. 6).

Endoderma podłoże podstawowe		50 ml
RPMI 1640		48,5 ml
Suplement B27		1 ml
1% NEAA		0,5 ml

Tabela 1: Skład endodermalnych pożywek bazowych dla różnicowania endodermy.

Podłoże podstawowe jelitowe		50 ml
Zaawansowany DMEM/F12		46,5 ml
Bufor HEPES		0,5 ml
GlutaMAX		0,5 ml
Nikotynamid		0,5 ml
Suplement N2		0,5 ml
Suplement B27		1,0 ml
Pióro/Paciorkowiec		0,5 ml

Tabela 2: Skład podłoża jelitowego do hodowli organoidów jelitowych

Rycina 1: Zmiany morfologiczne podczas różnicowania hiPSC przez ostateczną endodermę do linii jelita tylnego.
(A) Schematyczny przegląd protokołu różnicowania jelit. Ta linia komórkowa hiPSC tworzy luźne kolonie małych komórek o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy. W miarę postępu różnicowania komórki ulegają zmianom zgodnym z przejściem od fenotypu nabłonkowego do mezenchymalnego i przez DE D3 tworzą jednolitą monowarstwę. Po dostarczeniu odpowiednich sygnałów, komórki DE wydłużają się i tworzą gęściej upakowaną monowarstwę ze sferoidami 3D pojawiającymi się zaraz po HD D3, ale jest to zależne od użytej linii komórkowej i nie jest wymagane do przejścia do hodowli 3D (B). Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Różnicowanie hiPSC do endodermy HG indukuje ekspresję genów endodermalnych.
Barwienie immunologiczne hiPSC różnicującego się do ostatecznej endodermy wykazuje zmiany w ekspresji TF na poziomie białka. Markery pluripotencji (NANOG i OCT4) są regulowane w dół przez DE D3 (A). Ekspresja markera mezendodermy BRA(T) jest obecna w D1 protokołu (B), a TF SOX17 i FOXA2 specyficzne dla DE pojawiają się na D2 (B i C). Podziałka liniowa: 200 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Zmiany ekspresji genów przez qPCR podczas różnicowania hiPSC do endodermy jelita tylnego (HG).
Geny związane z pluripotencją są regulowane w dół (OCT4, NANOG, SOX2), a następnie następuje przejściowa ekspresja genów mezendodermy (T, EOMES, MIXL1), a na końcu ekspresja genów DE (SOX17, FOXA2, CXCR4) i genów jelita tylnego (CDX2, GATA4, HNF4a). Dane przedstawione jako średnia ±SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Endoderma HG samoorganizuje się, tworząc organoidy jelitowe 3D w hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej 3D.
Endoderma HG jest przenoszona do odpowiedniej hodowli 3D macierzy zewnątrzkomórkowej i początkowo tworzy małe stałe skupiska komórek (A). Grudki endodermy HG rozszerzają się w ciągu 7-10 dni hodowli (B), a następnie stają się asymetryczne i zaczynają tworzyć bardziej złożony nabłonek (C), ostatecznie dając początek organoidom o wyraźnej morfologii nabłonka i powierzchni światła skierowanej w stronę środka organoidu (D). Podziałka = 50 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Ustalone organoidy jelitowe pochodzące z hiPSC wyrażają markery jelitowe.
Immunocytochemia wykazująca ekspresję CDX2 i Villin. Podziałka = 100 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Wpływ TNFα na profil zapalny i ekspresję komórek jelitowych zdrowych organoidów jelitowych.
Profil zapalny zdrowych organoidów okrężnicy po 48-godzinnym leczeniu TNFα (40 ng/ml). Ekspresja markerów prozapalnych (TNFα, IL-8 i IL-23) wzrasta po ekspozycji na TNFα, podczas gdy w tym samym czasie ekspresja markerów nabłonka jelitowego (LGR5, VIL) jest obniżona. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. Dane są wyrażone jako średnia ± SD każdej grupy. *P <,01; **P < 0,001; P < .0001. (n=3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe człowieka. Pokazujemy ich zastosowanie do badania stanu zapalnego; jednak można to zastosować w różnych kontekstach i połączyć z podejściami do edycji genów CRISPR/Cas9¹⁴, na dowolnym tle genetycznym. Po różnicowaniu, zgodnie z naturalną sekwencją różnicowania rozwojowego ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego, powstałe organoidy mogą być w sposób ciągły hodowane i pasażowane przez ponad 12 miesięcy.

Krytycznym aspektem tego protokołu jest początkowa gęstość posiewu niezróżnicowanych komórek macierzystych przed różnicowaniem endodermy. Jeśli nie zostanie to wystarczająco zoptymalizowane, komórki prawdopodobnie umrą podczas początkowego etapu różnicowania DE (jeśli komórki są zbyt rzadkie) lub zmniejszą wydajność różnicowania DE (jeśli komórki są zbyt gęste). Właściwa gęstość początkowa musi być zoptymalizowana dla używanej linii komórkowej, a prawidłowa gęstość powinna wygenerować monowarstwę pod koniec DE D3. Cytometria przepływowa powinna być stosowana do określenia skuteczności specyfikacji DE i zazwyczaj widzimy >80% komórek dodatnich dla SOX17 i / lub CXCR4. Gdy liczba komórek dodatnich SOX17 jest mniejsza niż 60%, wpływa to na skuteczność wzorcowania HG, co skutkuje mniejszą liczbą organoidów tworzących się po przeniesieniu do macierzy zewnątrzkomórkowej. To ostatecznie spowoduje niepowodzenie powstałych kultur organoidów. Aby ustalić, czy wzorzec DE do HG zakończył się sukcesem, oceniamy liczbę komórek CDX2 dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej i zazwyczaj spodziewamy się zobaczyć >80% komórek dodatnich. Ponownie, jeśli liczba komórek CDX2 dodatnich spadnie poniżej 50%, będzie to miało niekorzystny wpływ na liczbę organoidów jelitowych, które są generowane po przeniesieniu do hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej 3D.

Po przeniesieniu monowarstw 2D do hodowli 3D, małe zwarte kule powinny pojawić się 24-48 godzin po przeniesieniu. Mogą pojawić się duże arkusze martwych komórek w zależności od wydajności różnicowania dla użytej linii komórkowej. Zamiast natychmiastowego pasażowania kultur w celu usunięcia tych zanieczyszczeń, pozwalamy organoidom w pełni się uformować i rozwinąć ich bardziej złożoną, pofałdowaną strukturę. Odczekanie 7-10 dni przed próbą pierwszego przejścia zapewnia, że obecna jest wystarczająca ilość dzielących się komórek, aby wytworzyć wiele nowych organoidów jelitowych. Wszelkie zanieczyszczenia, które są nadal obecne w kulturze, można łatwo usunąć podczas procesu pasażowania poprzez powolne obracanie zdysocjowanych mieszanin organoidów/szczątków w probówce z wystarczającą prędkością, aby osadzać organoidy, ale pozostawiać arkusz komórek unoszący się w pożywce. Pożywki i szczątki komórkowe można następnie zassać, tak aby pozostała tylko osadka organoidów.

Ograniczeniem tego podejścia jest to, że typy komórek pochodzących z hiPSC często nie są w pełni dojrzałe pod względem ekspresji genów i profili funkcjonalnych. Aby określić, czy tkanka jelitowa pochodząca z hiPSC jest odpowiednia do określonych zastosowań, organoidy należy scharakteryzować dla różnych typów komórek, w tym enterocytów (VIL), komórek enteroendokrynnych (neurog3), komórek kubkowych (MUC2), przejściowych komórek amplifikujących (CD133), komórek petha (FZD5) i komórek macierzystych LGR5⁺ (LGR5) w celu określenia składu komórkowego organoidów.

Ogólnie rzecz biorąc, główną zaletą tego protokołu w porównaniu z wieloma innymi protokołami różnicowania organoidów jest to, że ta platforma hodowlana jest bardzo opłacalna ze względu na zastąpienie kilku rekombinowanych białek i kondycjonowanych preparatów pożywek małymi cząsteczkami^15,16. Różnicowanie do HG jest bardzo proste i szybkie i może być stosowane zarówno do ludzkich embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z identycznymi wynikami. Przy rygorystycznym przestrzeganiu i optymalizacji pod kątem wykorzystywanych linii komórkowych zapewnia stosunkowo prostą platformę modelową wolną od zanieczyszczających komórek mezenchymalnych, którą można następnie zastosować do badania nabłonka jelitowego w różnych kontekstach, w tym stanu zapalnego, interakcji patogenów gospodarza⁷. Modelowanie zwłóknienia jelit można zbadać, dostarczając bodźców pro-fibrotycznych, a następnie oceniając ekspresję białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, laminina i fibronektyna, za pomocą QPCR, western blot i ELISA. Wykorzystanie technik edycji genów CRISPR/Cas9 na niezróżnicowanych liniach komórek macierzystych przed różnicowaniem pozwala na tworzenie organoidów nokautujących genów lub nadekspresji białek, które można wykorzystać do tworzenia organoidów specyficznych dla choroby i bardziej złożonych modeli chorób 14,17,18.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A83-01	Tocris	2939
Activin A R	& D	338-AC
Zaawansowane technologie DMEM/F12 (1X)	Life	12654-010
B27 Suplement	Gibco	17504044
CHIR99021	Sigma	SML1046-5MG
Naskórkowy czynnik wzrostu	R& D Systems	236-EG-01M
Gastrin	Sigma Aldrich	G9145
GlutaMAX (100X)	Life Technologies	15630-056
Obniżony współczynnik wzrostu Roztwór buforowy Matrigel	BD
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
Suplement N2 (100X)	Gibco	17502-048
N-acetylo-cysteina	Sigma Aldrich	A7250
Nikotynamid	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	R& D Systems	6057-NG
Aminokwasy endogenne	Gibco	11140-050
Paraformaldehyd	VWR	9713.5
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Gibco	14190-094
Kwas retinowy	Sigma	302-79-4
Inhibitor ROCK	Tocris	1254/1
Inhibitor ROCK Y-27632	Tocris	1254
RPMI	Sigma	R8758-500ml
R-Spondin-1	Peprotech	120-38
SB202190	Tocris	1264
TrypLe Express	Gibco	12604-021
Wnt 3a	R& D	5036-WN