Artykuł metodologiczny

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61224

⸱

14 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1San Diego State University Heart Institute and the Department of Biology, San Diego State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Streszczenie

Izolacja i hodowla miocytów serca od myszy była niezbędna do dalszego zrozumienia fizjologii i patofizjologii serca. Podczas gdy izolowanie miocytów z serc noworodków myszy jest stosunkowo proste, preferowane są miocyty z dorosłego serca myszy mysiego. Dzieje się tak, ponieważ w porównaniu z komórkami noworodka, dorosłe miocyty dokładniej podsumowują funkcję komórki, tak jak dzieje się to w dorosłym sercu in vivo. Jednak technicznie trudno jest wyizolować dorosłe mysze miocyty serca w niezbędnych ilościach i żywotności, co przyczynia się do impasu eksperymentalnego. Ponadto opublikowane procedury są specyficzne dla izolacji miocytów przedsionkowych lub komorowych kosztem komórek niemiocytowych przedsionków i komór. Opisano tutaj szczegółową metodę jednoczesnego izolowania zarówno przedsionkowych, jak i komorowych miocytów serca, a także przedsionków i komór nie-miocytów, z jednego serca myszy. Podano również szczegóły dotyczące optymalnych metod hodowli specyficznych dla komórek, które poprawiają żywotność i funkcję komórek. Protokół ten ma na celu nie tylko przyspieszenie procesu izolacji dorosłych mysich komórek serca, ale także zwiększenie wydajności i żywotności komórek do badań komórek przedsionkowych i komorowych serca.

Wprowadzenie

Pierwotna hodowla komórkowa jest integralnym zasobem, który oferuje kontrolowane środowisko do szczegółowych badań mechanistycznych funkcji miocytów serca. Ze względu na ich trwalszą naturę i łatwość izolacji, noworodkowe miocyty przedsionkowe i komorowe szczurów są powszechnym źródłem takich hodowli komórkowych1. Jednak dorosłe mysie miocyty przedsionkowe i komorowe (AMAM i AMVM) są wysoce pożądane w badaniach in vitro, ponieważ ich cechy molekularne i funkcjonalne lepiej naśladują dorosłe komórki serca. W związku z tym stały się one istotne dla badań związanych z patologiami serca, z których większość rozwija się u dorosłych2.

Ponadto, dostępność i wykorzystanie modeli transgenicznych i chorobowych myszy zwiększa użyteczność izolowanych dorosłych miocytów sercowych. Protokoły izolacji i hodowli mysich AMVM do krótko- i długoterminowych badań zostały opisane w wielu wcześniejszych publikacjach2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Dla porównania, opisano niewiele protokołów izolacji AMAM. Co więcej, te, które są opisane, są przede wszystkim zoptymalizowane pod kątem ostrych badań świeżo wyizolowanych komórek, bez opisanego do tej pory długoterminowego protokołu hodowli11,12,13. W związku z tym protokoły izolacji AMAM nie zostały zaprojektowane tak, aby zapewnić użyteczność i wszechstronność opublikowanych protokołów izolacji i kultury AMVM. Ponadto, podczas gdy pionierskie badania nad izolacją AMAM i AMVM okazały się pomysłowe, nie ma protokołów zapewniających optymalną jednoczesną izolację i hodowlę zarówno AMAM, jak i AMVM, co skutkuje efektywnym wykorzystaniem całego serca dla każdego preparatu.

Do tej pory opublikowane protokoły izolacji AMAM i AMVM nie były zaprojektowane do jednoczesnej izolacji obu typów komórek, ponieważ większość badań nad funkcjonowaniem przedsionków i komór koncentruje się na specyficznych komorach. Na przykład AMAM są używane głównie do badania elektrofizjologii miocytów przedsionków, częściowo ze względu na zainteresowanie migotaniem przedsionków (AF), najczęstszą arytmią serca w USA. Jednak migotanie przedsionków nie jest chorobą, która atakuje przedsionki w izolacji i sugeruje się, że odgrywa przyczynową rolę w łagodnej lub ciężkiej dysfunkcji lewej komory14. Ponadto elektrokardiogramy pobrane od pacjentów z niewydolnością serca z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF) wykazały, że rozmiar lewego przedsionka jest jednym z najsilniejszych czynników prognostykujących podatność na niewydolność serca15.

Oprócz swojej roli w elektrofizjologii i kurczliwości, przedsionek jest również organem endokrynnym, wydzielającym kardiokiny (tj. przedsionkowy peptyd natriuretyczny [ANP]), które homeostatycznie regulują ciśnienie i objętość krwi16,17. Co więcej, ANP (przypuszczalnie z miocytów przedsionkowych) pełni znaczącą rolę ochronną i przeciwprzerostową w miocytach komorowych16,17. Chociaż istnieje silna implikacja komunikacji neurohormonalnej między przedsionkami a komorami w różnych stanach chorobowych, mechanizmy leżące u podstaw tej komunikacji nie zostały w pełni zbadane. Kolejnym przykładem tego punktu jest gwałtowny wzrost liczby badań koncentrujących się na: 1) roli nie-miocytów (w szczególności fibroblastów serca i komórek odpornościowych) w chorym sercu oraz 2) tym, jak przebudowa serca jako funkcja choroby bezpośrednio wpływa na żywotność miocytów serca i globalną czynność serca18,19,20,21,22. Dlatego badanie komórek serca zarówno z przedsionków, jak i komór jest niezbędnym podejściem, aby uzyskać pełniejszy obraz ich roli w patofizjologii serca.

Poniższy protokół opisuje jednoczesną izolację miocytów przedsionkowych i komorowych oraz nie-miocytów z pojedynczego serca myszy w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Ponadto metoda ta jest pierwszą, która opisuje optymalne warunki niezbędne do utrzymania kultur miocytów serca przedsionkowego, ponieważ warunki utrzymania kultur miocytów komorowych zostały już opublikowane.

Protokół

Wszystkie badania przeprowadzone na myszach opisane w tym artykule zostały sprawdzone i zatwierdzone przez SDSU Institutional Animal Care and Use Committee i są zgodne z Przewodnikiem dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych opublikowanym przez National Research Council.

1. Przygotowanie pożywki izolacyjnej i hodowlanej oraz posiewu

  1. Przed użyciem należy przygotować 1 l pożywki do perfuzji serca, dodając zmodyfikowaną pożywkę Joklik do 1 litra sterylnej wody. Doprowadzić pH do 7,36 za pomocą 10 N NaOH, a następnie przefiltrować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
    UWAGA: Joklik MMEM składa się ze 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 9 mM NaH2PO4 i 11,1 mM D-glukozy. Uzupełnieniem jest 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM tauryny (3,75 g/L), 2 mM D-l-karnityny (0,4 g/L), 2 mM kreatyny i 10 mM monoksymu butanodionu (1,01 g/L).
  2. Przygotuj bufor do trawienia tuż przed perfuzją w następujący sposób: uzupełnij 50 ml pożywki do perfuzji serca 6,25 μl 100 mM CaCl2 (patrz krok 1.3) i kolagenazą typu 2 (aktywność enzymatyczna ~310–320 U/mg dw).
    UWAGA: Zważ zwierzę przed złożeniem ofiary. Ilość kolagenazy typu 2 uzupełnionej do buforu trawiennego jest podyktowana masą ciała zwierzęcia (2,25 mg kolagenazy typu 2 na 1 g masy ciała).
  3. Aby przygotować 100 mM CaCl2, dodaj 1,47 g CaCl2 do 100 ml wody klasy biologii molekularnej. Mieszaj do rozpuszczenia, a następnie przepuść przez filtr 0,2 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.
  4. Przygotować bufor zatrzymujący miocyty 1, uzupełniając 90 ml buforu perfuzyjnego serca 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 125 μl 100 mM CaCl2. Przepuścić przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  5. Przygotuj bufor zatrzymujący miocyty 2, uzupełniając 114 ml buforu perfuzyjnego serca 6 ml FBS i 150 μl 10 mM CaCl2. Przepuścić przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  6. Przygotuj pożywkę do posiewu miocytów przedsionkowych tuż przed perfuzją, uzupełniając 95 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 4 ml FBS, 1 ml 100x wstrzykiwacza/paciorkowca-glutaminy, 1 ml 100x insulina-transferyna-selen i 1 ml 10 μM deksametazonu. Przepuścić przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu posiewu.
  7. Przygotować pożywkę do posiewu miocytów komorowych, uzupełniając 95 ml minimalnej niezbędnej pożywki (MEM) 4 ml FBS, 1 ml 100x wstrzykiwacza/paciorkowca-glutaminy, 10 ml 1 M roztworu HEPES, 1 ml 100 x insuliny-transferyny-selenu i 0,1 g monoksymu butanodionu. Przepuścić przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  8. Przygotuj pożywkę utrzymującą miocyty komorowe, uzupełniając 99 ml MEM 1 ml 100x insulina-transferyna-selen, 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 10 ml 1 M roztworu HEPES i 1 ml 100x długopis/paciorkowca-glutamina. Przepuścić przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  9. Aby przygotować płytki i szkiełka doświadczalne pokryte lamininą, rozmrozić roztwór podstawowy lamininy myszy (1,19 mg/ml). Dodać 10 μl roztworu podstawowego lamininy na każdy 1 ml DMEM i wymieszać. Równomiernie pokryć płytki i szkiełka doświadczalne i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę przed perfuzją, aby umożliwić zrównoważenie.
    UWAGA: Powlekane płytki i szkiełka doświadczalne można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 dni.

2. Aparatura izolacyjna

  1. Przed każdą izolacją należy oczyścić rurki i inne elementy systemu trzema pełnymi płukaniami 70% EtOH, napełniając pułapkę bąbelkową do góry (zamknij dolny kran i pozostaw otwarty górny kran odcinający).
  2. Przepłukać cały system 3 razy sterylnymH2O, napełniając pułapkę bąbelkową do góry (zamknij dolny kran i pozostaw otwarty górny kran).
  3. Wypłucz cały system za pomocą buforu perfuzyjnego serca i napełnij pułapkę bąbelkową do połowy pożywką.
  4. Ustawić obiegową łaźnię wodną na 37 °C.
  5. Ustawić łaźnię wodną na media na 37 °C.
  6. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki pompy perystaltycznej.
  7. Dostosuj natężenie przepływu pompy perystaltycznej do 3 ml/min.

3. Zabieg chirurgiczny (nieprzeżycie)

  1. Moczyć narzędzia chirurgiczne w 70% EtOH przez co najmniej 5 minut.
  2. Umieścić pożywkę perfuzyjną serca, zatrzymujące miocyty i bufor trawienia w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  3. Pożywkę do posiania miocytów przedsionkowych, pożywkę do posiania miocytów komorowych i pożywkę do utrzymywania miocytów komorowych należy umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 1 godzinę przed użyciem i poluzować nasadki, aby umożliwić równowagę.
  4. Wstrzyknąć 10-tygodniowym samcom lub samicom myszy C57b6/j dootrzewnowo (i.p.) 0,35 ml heparyny, rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do 100 j.m./ml. Pozostawić lek na działanie przez około 10 minut.
    UWAGA: Jeśli dwie serca mają zostać poddane tej procedurze izolacji, druga mysz może zostać znieczulona i podana heparyna na tym etapie pierwszej procedury. Aby zminimalizować stres zwierzęcia, lekkie znieczulenie można podać przy użyciu 2% mieszaniny izofluranu i tlenu w hermetycznie zamkniętej komorze indukcyjnej.
  5. Znieczulić zwierzę 2% mieszaniną izofluranu i tlenu i wstrzyknąć ip pentobarbitalem (0,3 ml z 10 mg / ml bulionu), a następnie przygotować klatkę piersiową, pobierając wymaz z 70% EtOH.
  6. Przygotuj zawiązany jedwabny szew 5-0, aby być gotowym do podwiązania serca do kaniuli perfuzyjnej. Zamontuj kaniulę tuż obok mikroskopu operacyjnego.
  7. Szybko otwórz klatkę piersiową, najpierw wykonując nacięcie skóry w linii środkowej, od połowy brzucha do szczęki, a następnie wchodząc do otrzewnej dużymi nożyczkami, usuwając przeponę przez rozwarstwienie. Następnie odetnij klatkę piersiową za pomocą nożyczek z nacięciami ściany klatki piersiowej po bocznej stronie obu stron.
  8. Odetnij włókniste połączenia między sercem a ścianą klatki piersiowej (w tym grasicę). Następnie odetnij całą klatkę piersiową. Za pomocą małych kleszczy i nożyczek delikatnie unieś serce za wierzchołek i odsłoń tylną część serca.
  9. Płuczkę należy wyciąć bezpośrednio poniżej tętnicy bezimiennej na aorcie wstępującej i natychmiast umieścić serce w lodowatym PBS lub zimnym pożywce perfuzyjnej serca. Następnie szybko wypreparuj pozostałą tkankę z eksplantowanego serca w lodowato zimnym pożywce perfuzyjnej serca, odsłaniając aortę wstępującą.
    UWAGA: Przydatne jest wysadzenie serca z nienaruszoną grasicą, aby wykorzystać je jako anatomiczny punkt orientacyjny.
  10. Oczyść obszar otaczający aortę z nadmiaru tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek do mikropreparacji. Umieść aortę na kaniuli za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i zabezpiecz jedwabnym szwem 5-0.
    UWAGA: Najlepsze umiejscowienie następuje zwykle z aortą rozciągającą się około 2 mm w górę na kaniuli.
  11. Perfuzja kaniulowanego serca za pomocą pożywki do perfuzji serca z szybkością przepływu 3 ml/min przez 4 minuty. Następnie przełącz pożywkę z pożywki perfuzyjnej serca na bufor trawienny na 15,0−17,5 minuty perfuzji (Rysunek 1A).
    UWAGA: Szybkość przepływu wieńcowego prawdopodobnie wzrośnie, co wskazuje na efektywne trawienie tkanek (tj. blade, spuchnięte serce).
  12. Zebrać 8 ml przepływającego buforu wytrawiającego w ostatnich minutach perfuzji do późniejszego wykorzystania w kroku 5.4.
  13. Wyjmij serce z kaniuli i umieść je na plastikowym naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm. Usuń nadmiar tkanki (np. aortę, żyły) i zanurz serce w 2,5 ml buforu trawiennego, przygotowując się do mechanicznej separacji.
    UWAGA: W tym momencie przedsionki są wycinane i jeden eksperymentator powinien przeprowadzić protokół izolacji komórek przedsionkowych, podczas gdy drugi eksperymentator powinien przeprowadzić izolację komórek komorowych.

4. Izolacja i hodowla komórek przedsionkowych

  1. Wypreparuj przedsionki z dala od serca i umieść je w plastikowym naczyniu hodowlanym o średnicy 30 mm. Zanurz go w 0,75 ml buforu wytrawiającego w celu mechanicznego oddzielenia. Trzymaj komory w naczyniu 60 mm (krok 3.12) i jednocześnie przeprowadzaj oddzielne metody izolacji (sekcja 5, Rysunek 1B).
    UWAGA: W tym momencie przedsionki i komory mogą ulec dalszemu oddzieleniu, jeśli zajdzie potrzeba wyizolowania komórek po lewej i prawej stronie.
  2. Zacznij mielić i rozdzierać przedsionki, początkowo nożyczkami chirurgicznymi z cienką końcówką, a następnie cienkimi kleszczami do dalszego mielenia. Unikaj potrząsania tkanką i nie rozrywaj gwałtownie włókien mięśniowych.
  3. Używając sterylnej końcówki pipety transferowej, kontynuuj delikatne mieszanie i dysocjację tkanki przez 15 minut. Co 5 minut obserwuj dysocjację miocytów przedsionków od tkanki pod mikroskopem 10x jasnego pola. W miarę dalszego trawienia tkanki kontynuuj delikatne mieszanie i dysocjację tkanki za pomocą sterylnej końcówki pipety transferowej o mniejszym rozmiarze porów.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Przepłukać płytkę o średnicy 30 mm 0,75 ml buforu zatrzymującego miocyty 1 o temperaturze 37 °C i połączyć z zawiesiną komórkową (objętość końcowa = 1,5 ml).
  5. Pozwól miocytom przedsionkowym na osadzanie się grawitacyjnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie porusz zawiesinę komórkową, aby miocyty osiadły na dnie stożkowej rurki, tworząc widoczną osadówkę.
  6. Odwirowywać zawiesinę komórek przez 5 minut przy 20 x g. Ostrożnie usunąć supernatant, który zawiera nie-miocyty, i przenieść do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej końcówki pipety, nie naruszając osadu miocytów przedsionkowych.
  7. Odwirowywać frakcję niemiocytową przez 5 minut przy 20 000 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad niezwiązany z miocytami w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą cielęcą (FCS).
  8. Policz nie-miocyty za pomocą hemocytometru lub innej metody, a następnie płytkę zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi lub dalej izoluj w poszczególnych określonych populacjach komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (Rysunek 1C).
  9. Zawiesić osad wyizolowanych miocytów przedsionków z etapu 4.6 w 1 ml pożywki do posiania miocytów przedsionków i nanieść 10 μl tej zawiesiny na hemocytometr. Wykonaj zliczanie komórek miocytów w kształcie pręcików na pole.
  10. Odessać lamininę z wstępnie powlekanych płytek/szkiełek doświadczalnych i ponownie zawiesić izolowane miocyty przedsionków w odpowiedniej objętości pożywki do posiania miocytów przedsionkowych uzupełnionej 25 μM blebbistatyną. Płytka o żądanej gęstości zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi (Rysunek 1C).
    UWAGA: Typowa gęstość posiewu dla opisanej tutaj długotrwałej hodowli wynosi 5 x 105 komórek/komorę na czterokomorowych (1,7 cm2) szkiełkach podstawowych.

5. Izolacja i hodowla komórek komorowych

  1. Zacznij mielić i rozdzierać tkankę komorową serca, najpierw nożyczkami chirurgicznymi z cienką końcówką, a następnie cienkimi kleszczami do dalszego mielenia (Ryc. 1B). Unikaj potrząsania tkanką poprzez szybkie rozsuwanie włókien mięśniowych.
  2. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml. Przepłukać płytkę 2,5 ml buforu zatrzymującego miocyty 1 o temperaturze 37 °C i połączyć z zawiesiną komórkową (objętość końcowa = 5 ml).
  3. Używając sterylnej końcówki pipety transferowej, kontynuuj delikatne mieszanie i dysocjację tkanki przez 4 minuty. Nałóż 10 μl tej zawiesiny komórek na szkiełko i zwizualizuj obecność miocytów w kształcie pręcików, aby zapewnić jakość izolacji.
  4. Przepuść zawiesinę komórek przez sterylny filtr nylonowy o wielkości 100 μm do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Użyj 2 ml buforu wytrawiającego zebranego w kroku 3.12, aby zmyć wszelkie pozostałe komórki ze sterylnego filtra nylonowego.
  5. Pozwól miocytom komorowym osadzać się grawitacyjnie przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszaj przefiltrowaną zawiesinę komórkową, aby umożliwić miocytom osadzenie się na dnie stożka, tworząc widoczną osadówkę.
  6. Nie naruszając osadu miocytów komorowych, ostrożnie usunąć supernatant (nie-miocyty) i przenieść do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej końcówki do pipety. Odwirowywać frakcję niemiocytową przez 5 minut przy 20 000 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad niezwiązany z miocytami w 10 ml DMEM uzupełnionym 10% FCS.
  7. Policz niemiocyty za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości DMEM uzupełnionej 10% FCS. Następnie, zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi, lub dalej izolować do poszczególnych określonych populacji komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (Rysunek 1C).
  8. Ponownie zawiesić izolowane miocyty komorowe w 2 ml buforu zatrzymującego miocyty 2 i nanieść 10 μl zawiesiny komórkowej na hemocytometr. Wykonaj zliczanie komórek miocytów w kształcie pręcików na pole.
  9. Ponowne wprowadzenie Ca2+ przy użyciu paradygmatu krokowego
    UWAGA: Etapy reintrodukcji wapnia są specyficzne dla miocytów komorowych i nie powinny być wykonywane w przypadku miocytów przedsionkowych, ponieważ spowoduje to śmierć komórki.
    1. Dodać 50 μl 10 mM CaCl2 do zawiesiny komórek miocytów komorowych. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Dodać dodatkowe 50 μl 10 mM CaCl2 do zawiesiny komórek miocytów komorowych. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać dodatkowe 100 μl 10 mM CaCl2 do zawiesiny komórek miocytów komorowych. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Dodać 80 μl 100 mM CaCl2 do zawiesiny komórek miocytów komorowych. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  10. Usunąć powłokę lamininy z płytek lub szkiełek i ponownie zawiesić izolowane miocyty komorowe w odpowiedniej objętości pożywki do powlekania miocytów komorowych zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi (Rysunek 1C).
    UWAGA: Typowa gęstość posiewu dla opisanej tutaj długotrwałej hodowli wynosi 5 x 105 komórek/komorę na czterokomorowych (1,7 cm2) szkiełkach podstawowych. Unikaj posiewu o gęstości większej niż 75% zgrywania, ponieważ nadmierne zagęszczenie komórek sprzyja zlepianiu się komórek, hamując w ten sposób przyczepianie się do płytki. Co więcej, duża liczba komórek zostanie utracona podczas pierwszej zmiany podłoża. Płytki komórkowe szybko po izolacji, ponieważ zewnątrzkomórkowy Ca2 + sprzyja hiperskurczowi i utracie żywotnych miocytów.
  11. Pozwól miocytom komorowym osiąść i przylegać przez co najmniej 1 godzinę. Następnie zmień pożywkę na pożywkę utrzymującą miocyty komorowe uzupełnioną 25 μM blebbistatyną.
    UWAGA: Miocyty komorowe można hodować do 96 godzin po posianiu w μM blebbistatynie. Doświadczenia należy przeprowadzać na pożywce podtrzymującej miocyty komorowe przy braku bróbstatyny.

Wyniki

Serce 10-tygodniowej myszy szczepu C57b6/j typu dzikiego zazwyczaj dostarcza od 75 000 do 150 000 miocytów przedsionkowych oraz 1,0−1,5 x 106 miocytów komorowych, co odpowiada przybliżonej wydajności na poziomie 30%−50% dla miocytów przedsionkowych i komorowych18,19. Podczas i bezpośrednio po izolacji żywe miocyty serca powinny mieć kształt pręcikowy i nie wykazywać skurczów. Większość izolowanych miocytów serca powinna posiadać taką morfologię, co świadczy o skutecznej perfuzji. Morfologia pręcikowata może być również wskaźnikiem żywotności komórek. Celem niniejszego protokołu jest zwiększenie wydajności i żywotności miocytów oraz komórek niemiocytowych izolowanych z chorego serca myszy. Ponadto metoda została przetestowana w modelu niewydolności serca wywołanej przeciążeniem ciśnieniowym (dane nie pokazano).

Aby potwierdzić prawidłową i powtarzalną izolację miocytów oraz komórek niemiocytowych z tkanki przedsionków i komór, komórki obserwowano i fotografowano w różnych dniach hodowli (Rysunek 2). Dodatkowo przeprowadzono ilościową reakcję polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) w celu pomiaru poziomów transkryptów specyficznych dla danego typu komórek. Troponina T mięśnia sercowego (Tnnt2) jest markerem miocytów serca i była silnie wyrażana zarówno w hodowlach miocytów przedsionkowych, jak i komorowych (Rysunek 3A). Z kolei peptyd natriuretyczny przedsiądkowy (Nppa, który w warunkach fizjologicznych jest zazwyczaj wyrażany wyłącznie w dorosłych miocytach przedsionkowych) oraz lekki łańcuch miozyny 2 (Myl2, który jest genem specyficznym dla miocytów komorowych) były silnie i specyficznie wyrażane odpowiednio w hodowlach miocytów przedsionkowych i komorowych (Rysunek 3B,C).

Markery fibroblastów, czynnik transkrypcyjny 21 (Tcf21), receptor A czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (Pdgfra) oraz marker komórek pochodzenia monocytarnego z grupy różnicowania 68 (Cd68) były ekskluzywnie ekspresjonowane w kulturach niemiocytarnych wyizolowanych zarówno z przedsionków, jak i komór serca (Rysunek 3D−F). Szacuje się, że niemiocyty stanowią ~65% wszystkich komórek serca i że większość z nich pochodzi z linii fibroblastów lub monocytów18,19,23,24. Z tego względu wybrano markery dla tych dwóch linii jako reprezentatywne, biorąc pod uwagę zainteresowanie tymi populacjami komórkowymi w badaniach nad różnymi modelami i etiologiami patologii serca.

Immunobarwienie AMAM i AMVM na marker cewek T – dihydropirydynę (DHPR, będącą napięciozależnym kanałem wapniowym typu L) oraz receptor rjanodynowy (RYR2) wykazało obecność nienaruszonych cewek T podczas izolacji oraz długoterminowej hodowli (Rycina 4A,B). Obfitość DHPR oraz lokalizacja charakterystyczna i unikalna dla miocytów przedsionkowych i komorowych wskazywały na obecność cewek T. Co więcej, kolokalizacja DHPR z immunobarwieniem RYR2 była wskaźnikiem nienaruszonych struktur diady. Immunobarwienie białka sarkomerowego alfa-aktyniny w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych dało oczekiwany prążkowany wzór sarkomerowy. Prążkowany wzór sarkomerowy został wykorzystany do oceny czystości i żywotności izolowanych kardiomiocytów w połączeniu z prętowatym kształtem morfologicznym i barwieniem jąder TOPRO-3 (Rycina 4C,D; fioletowy i czerwony). Zgodnie z oczekiwaniami, kardiomiocyty komorowe były duże, osiągając średnią długość ~150 mm, podczas gdy kardiomiocyty przedsionkowe średnio ~75 mm. Ponadto, w analizie immunobarwień, kardiomiocyty przedsionkowe (ale nie komorowe) wykazały silną ekspresję przedsionkowego peptyd natriuretycznego (ANP) we wzorze barwienia charakterystycznym dla lokalizacji w retikulum endoplazmatycznym i ziarnistościach wydzielniczych (Rycina 4C,D; zielony).

Charakterystyczną cechą kardiomiocytów przedsionkowych jest ich klasyfikacja jako komórek endokrynnych oprócz funkcji komórek kurczliwych. Podczas gdy miocyty przedsionkowe wydzielają ANP w warunkach bazalnych, sekrecja ta wzrasta w odpowiedzi na sekretagogi (np. agonistę alfa-adrenergicznego, fenylefrynę [PE]). Ponadto kardiomiocyty przedsionkowe wydzielają ANP i w procesie współwydzielania przetwarzają część hormonu z jego stanu prekursorowego (Pro-ANP, 15 kD) do peptydu produktowego (ANP 3kD)16,17. Zdolność sekrecyjną tę można ilościowo określić za pomocą detekcji ANP metodą immunoblottingu w pożywce izolowanych kardiomiocytów przedsionkowych w odpowiedzi na ostre traktowanie PE (Rysunek 4E). Stwierdzono, że ta zdolność sekrecyjna i przetwórcza kardiomiocytów przedsionkowych jest wrażliwa na warunki hodowli. Dlatego niezbędne jest, aby pożywka do wysiewu miocytów przedsionkowych była uzupełniona o deksametazon, insulinę, transferynę i selen.

Schemat zestawu i procesu perfuzji serca; metody trawienia tkanek, separacji i izolacji komórek.
Rycina 1: Schematyczny przegląd retrogradejnej perfuzji serca, trawienia i izolacji komórek. Przedstawiono główne etapy izolacji komórek jednocześnie z przedsionków i komór z jednego serca myszy. (A) Pojedyncze serce myszy jest szybko kaniulowane przez aortę wstępującą i perfundowane w sposób retrogradejny. (B) Serce zostaje podzielone na tkankę przedsionkową i komorową w celu dalszego trawienia i separacji fizycznej. (C) Po odpowiednim trawieniu komórki są rozdzielane poprzez filtrację grawitacyjną na łącznie cztery frakcje komórkowe, które są hodowane do późniejszych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe AMAMs, AMANMs, AMVMs, AMVNMs; wzrost komórek w kolejnych dniach, pasek skali 10 µm.
Rysunek 2: Analiza morfologiczna izolowanych kardiomiocytów i nie-miocytów przedsionków i komór serca w kulturze. (A) Izolowane miocyty przedsionków dorosłej myszy (AMAMs), (B) nie-miocyty przedsionków dorosłej myszy (AMANMs), (C) miocyty komór dorosłej myszy (AMVMs) lub (D) nie-miocyty komór dorosłej myszy (AMVNMs) zostały wysiane w zagęszczeniu 5 x 105 komórek/komorę na czterokomorowych (1,7 cm2) szkiełkach przedmiotowych w odpowiednich pożywkach do wysiewu. Obrazy w kontraście fazowym uzyskano we wskazanych dniach hodowli przy użyciu obiektywu 10x pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy analizy ekspresji genów; Tnnt2, Nppa, Myl2, Tcf21, Pdgfra, Cd68 w typach miocytów.
Rycina 3: Reprezentatywna analiza qRT-PCR hodowli wyizolowanych komórek. RNA wyekstrahowano ze świeżo wyizolowanych miocytów serca oraz komórek niemiocytarnych, a poziomy mRNA dla specyficznych markerów genowych komórek określono za pomocą qRT-PCR4. (A) Tnnt2, troponina T mięśnia sercowego (marker miocytów serca); (B) Nppa, natriuretyczny peptyd przedsiatkowy (marker miocytów przedsionków); (C) Myl2, lekki łańcuch miozyny 2 (marker miocytów komór serca); (D) Tcf21, czynnik transkrypcyjny 21 (marker fibroblastów); (E) Pdgfra, receptor A czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (marker fibroblastów); (F) Cd68, klastra różnicowania 68 (marker komórek pochodzenia monocytarnego). Dane reprezentują średnią ± SEM (*p ≤ 0.05 różnica względem wszystkich pozostałych wartości, określona za pomocą analizy ANOVA, a następnie testu post-hoc Newmana-Keula). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia tkanki serca z oznakowanymi białkami (DHPR, RYR2, ANP), wyniki analizy Western blot.
Rycina 4: Reprezentatywna analiza morfologiczna i funkcjonalna wyizolowanych kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych. (A) AMAMs lub (B) AMVMs wysiano w zagęszczeniu 5 x 105 komórek/komorę na czterokomorowych szkiełkach (1,7 cm2) w odpowiednich mediach do wysiewu na 1 h w celu umożliwienia adhezji. Następnie ponownie podano media do wysiewu miocytów przedsionkowych lub zmieniono je na media do utrzymania miocytów komorowych uzupełnione blebbistatyną na kolejne 16 h. Kultury następnie utrwalono, a potem poddano immunobarwieniu na RYR2 (fioletowy), DHPR (zielony) oraz barwieniu jąder TOPRO-3 (czerwony). (C) AMAMs lub (D) AMVMs wyizolowano i wysiano, a następnie poddano immunobarwieniu na α-aktyninę (fioletowy), ANP (zielony) i TOPRO-3 (czerwony). Przedstawiono dwa reprezentatywne obrazy dla każdego typu komórek. (E) AMAMs wysiano w zagęszczeniu 5 x 105 komórek/dołek na 12-dołkowej płytce hodowlanej przez 16 h w mediach do wysiewu miocytów przedsionkowych. AMAMs następnie traktowano przez 0,5 h nośnikiem lub sekretagogiem ANP (fenylefryna, 50 mM) przed zebraniem mediów i poddaniem ich analizie immunoblot dla ANP. Przed analizą immunoblot próbki mediów wirowano przy 500 x g przez 5 min, aby usunąć szczątki komórkowe i upewnić się, że obserwowany ANP był wynikiem aktywnej sekrecji z AMAMs. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Jakość komórek wyizolowanych przy użyciu opisanej tutaj procedury, określona na podstawie wydajności komórek i ogólnego stanu zdrowia komórek w hodowli, zależy od wielu czynników, które można kontrolować. Począwszy od samej myszy, udokumentowano, że stres nałożony na zwierzę może negatywnie wpływać na wydajność i żywotność komórek w hodowli, prawdopodobnie z powodu nadmiaru kortyzolu ogólnoustrojowego, katecholamin i stanu hiperkurczliwości tkanki serca 2,5,7. Z tych powodów należy podjąć środki w celu uniknięcia niepokojenia zwierzęcia przed uśmierceniem. Środki te obejmują przykrycie klatki zwierzęcia i ograniczenie czasu spędzanego poza wiwarium przed złożeniem ofiary. Heparyna i wiele barbituranów powszechnie stosowanych w eutanazji może wpływać na szlaki sygnałowe; W związku z tym optymalna metoda eutanazji powinna być odpowiednio dostosowana. Wiek zwierzęcia ma znaczący wpływ na jakość i żywotność izolowanych komórek, najprawdopodobniej ze względu na postępującą akumulację zwłóknienia śródmiąższowego występującego równocześnie z procesem starzenia, co może wpływać na trawienie tkanek25. W danych, które nie zostały tutaj przedstawione, podczas gdy opisana powyżej metoda działa u myszy w wieku do 78 tygodni, jakość komórek była niższa u tych starszych zwierząt.

Najbardziej krytycznym etapem opisanego procesu izolacji, a także innych protokołów z aparatem Langendorffa do perfuzji wstecznej, jest kaniulacja i początkowa perfuzja serca. Dla uzyskania optymalnych rezultatów czas od eksplantacji serca do kaniulacji aorty wstępującej i rozpoczęcia perfuzji nie powinien trwać dłużej niż 90 s. Oprócz czasu, dwa dodatkowe ważne czynniki to głębokość kaniuli oraz możliwość wprowadzenia zatoru powietrznego z aparatu perfuzyjnego. W związku z tym kaniulę należy wsunąć do aorty wstępującej, aby nie dostała się do korzenia aorty i nie zatkała zastawki aortalnej, co utrudniłoby perfuzję naczyń wieńcowych.

Podczas procesu trawienia ważne jest, aby regularnie testować sztywność serca, aby uniknąć długotrwałej ekspozycji na enzym trawienny kolagenazę, który zmniejsza tolerancję wapnia mięśni serca. Opisany powyżej protokół ponownego wprowadzenia wapnia do izolowanych kultur miocytów komorowych został opracowany w celu ograniczenia śmierci miocytów serca poprzez niewłaściwy napływ wapnia przez kanały wapniowe obsługiwane przez magazyn. Należy zauważyć, że stopniowa reintrodukcja wapnia nie powinna być wykonywana w przypadku izolowanych kultur miocytów przedsionków, ponieważ będzie to sprzyjać śmierci komórki podczas hodowli krótko- i długoterminowej12. Dla dalszych środków ostrożności, zastosowane tutaj perfuzji i trawienia obejmują inhibitor skurczu mięśnia sercowego monoksymus butanodionu (BDM), aby uniknąć nadmiernego skurczu izolowanych miocytów, a także paradoks wapniowy, z których oba wpływają na żywotność miocytów26. Należy jednak zwrócić uwagę na przejście z BDM na blebbistatynę, ponieważ jest to preferowany środek przeciwskurczowy w pożywkach utrzymujących izolowane miocyty serca. W danych, które nie zostały przedstawione, blebbistatyna zapewnia większą żywotność w długotrwałym posiewie izolowanych miocytów serca.

Bezpośrednio po izolacji ważne jest, aby rozważyć konsekwencje długotrwałej hodowli komórek serca, zwłaszcza miocytów. Opisany tutaj protokół izolacji i hodowli komórek innych niż miocyty serca opiera się na powszechnych metodach, które wykorzystują różne gęstości i właściwości adhezyjne różnych komórek serca. Zaletą nie-miocytów jest ich wysoki potencjał ekspansji w hodowli; Tak więc, w przeciwieństwie do miocytów serca, są podatne na pasażowanie w celu utrwalenia. Wiadomo jednak, że warunki hodowli, w tym suplementacja pożywką FBS, mogą wpływać na funkcjonalność miocytów serca27. Opisane tutaj pożywki hodowlane zostały zaprojektowane w celu optymalizacji żywotności i ograniczenia zaburzeń funkcjonalnych, szczególnie w przypadku izolowanych miocytów przedsionkowych. Chociaż nie zaobserwowano jawnie upośledzonej zdolności kurczliwej w izolowanych miocytach serca po hodowli przy braku suplementacji blebbistatyną, badania koncentrujące się na elektrofizjologii, kurczliwości i innych jednokomórkowych sygnałach molekularnych in vivo powinny być przeprowadzone wkrótce po izolacji, gdy struktura sarkomeryczna i sygnatura molekularna nadal naśladują strukturę nienaruszonego serca.

Charakterystyczną cechą miocytów przedsionkowych jest ich zdolność do pracy jako komórki endokrynnej o ogromnej zdolności wydzielniczej, oprócz funkcji skurczowej. W warunkach fizjologicznych miocyty przedsionkowe wytwarzają duże ilości ANP, który jest przechowywany w retikulum endoplazmatycznym i w dużych granulkach wydzielniczych o gęstym rdzeniu, gotowych do regulacji egzocytozy po otrzymaniu bodźca16,17. Podczas gdy wiele badań izolowanych miocytów przedsionków koncentruje się na ich unikalnych właściwościach elektrofizjologicznych, jest to pierwsze badanie, w którym zaprojektowano pożywkę hodowlaną. Pozwala to na długoterminową żywotność, a także promowanie utrzymania funkcji właściwości endokrynnych i kurczliwych miocytów przedsionków. Ta nowatorska metoda hodowli, a także jednoczesna izolacja wszystkich typów komórek z komór przedsionkowych i komorowych z jednego serca myszy, będzie przydatna i skuteczna w badaniach nad fizjologicznymi i patofizjologicznymi właściwościami miocytów zarówno przedsionkowych, jak i komorowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

E.A.B. był wspierany przez National Institutes of Health (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter, i jest fundacją Rees-Stealy Research Foundation Phillips Gausewitz, M.D. Scholar z SDSU Heart Institute. E.A.B. i A.S.B. były wspierane przez Fundację Inamori. CCG przez (NIH) przyznaje R01 HL135893, R01 HL141463 i HL149931.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(-)-BlebbistatinSigma-AldrichB0560
1 litrowy zbiornik z płaszczem wodnymRadnoti120142-1
2,3-butanodionu monoksymusSigma-AldrichB0753
5-0 Nić do szwów jedwabnychFine Science Tools18020-50
AdenozynaSigma-AldrichA9251
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA6003
Komora zgodności pułapki bąbelkowejRadnoti130149
Bezwodny chlorek wapniaFisher ScientificC614-500
Chlorowodorek karnitynySigma-AldrichC9500
Kolagenaza typu 2Worthington Biochemical CorporationLS004176
KreatynaSigma-AldrichC0780
DeksametazonSigma-AldrichD2915
DMEM/F12 (1:1; 1X)Gibco11330-032
Dumont #7 - Cienkie kleszczeFine Science Tools11274-20
Mikropscpe epifluorescencyjneOlympus X70IX70
Płodowa surowica bydlęca (inaktywowana termicznie)Omega ScientificFB-12Lot#
206018 Drobne nożyczki - SharpFine Science Tools14060-09
Graefe KleszczeFine Science Tools11051-10
Lupy z pałąkiemna głowę Fine Science Tools28030-04
Hemacytometr (jasna linia)Hausser Scientific1475
HEPES (1M)Gibco15630-080
InozynaSigma-AldrichI4125
Insulina-Transferyna-Selen-XGibco51500-056
Isotemp 105 Kąpiel wodnaFisher ScientificNC0858659
Isotemp 3006Fisher Scientific13-874-182
Joklik Zmodyfikowane minimum niezbędne podłożaSigma-AldrichM-0518
Laminin ( Naturalny, mysz)Gibco1795024Lot# 1735572
L-GlutaminaSigma-AldrichG8540
Masterflex C/L Jednokanałowa kompaktowa pompa o zmiennej prędkościCole-PalmerEW-77122-24
Minimum Essential Medium (MEM 1X)Gibco12350-039
Biologia molekularna Klasa WodaCorning46-000-CM
Pióro Paciorkowiec Glutamina (100X)Gibco10378-016
Nożyczki sprężynowe - 6mm Krawędź tnącaFine Science Tools15020-15
TaurynaSigma-AldrichT-8691

Bibliografia

  1. Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
  2. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
  3. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  4. Jin, J. K., et al. ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart. Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).
  5. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (114), e54012(2016).
  6. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357(2014).
  7. O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).
  9. Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).
  10. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).
  11. Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).
  12. Jansen, H. J., Rose, R. A. Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice. Journal of Visualized Experiments. (149), e59588(2019).
  13. Yao, C., et al. Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
  14. Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle. Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).
  15. Issa, O., et al. Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction. Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).
  16. de Bold, A. J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 230 (4727), 767-770 (1985).
  17. McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. The endocrine function of the heart. Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).
  18. Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. Cardiovascular phenotyping in mice. Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).
  19. Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse. American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).
  20. Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108, 1395-1403 (2003).
  21. Omatsu-Kanbe, M., et al. Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death. Scientific Reports. , 7(2017).
  22. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  23. Limana, F., et al. bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).
  24. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).
  25. Chen, W., Frangogiannis, N. G. The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging. Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).
  26. Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).
  27. Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja serca myszymetody hodowli kom rkowejywotno kom rek kardiomiocyt wkanulacja perfuzyjnabufor trawiennyp ytki powlekane lamininponowne wprowadzenie wapnia
Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.