Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu stresu na elastyczność poznawczą przy użyciu paradygmatu zmiany strategii instrumentalnej

DOI:

10.3791/61228

⸱

4 maja 2020

 ,  , 
1Department of Psychology, Bryn Mawr College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stresujące wydarzenia życiowe upośledzają funkcje poznawcze, zwiększając ryzyko zaburzeń psychicznych. Protokół ten ilustruje, w jaki sposób stres wpływa na elastyczność poznawczą przy użyciu paradygmatu automatycznej zmiany strategii operacyjnej u samców i samic szczurów Sprague Dawley. Omówiono konkretne obszary mózgu leżące u podstaw określonych zachowań i zbadano znaczenie translacyjne wyników.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stres wpływa na funkcje poznawcze. To, czy stres wzmacnia, czy upośledza funkcje poznawcze, zależy od kilku czynników, w tym: 1) rodzaju, intensywności i czasu trwania stresora; 2) rodzaj badanej funkcji poznawczej; oraz 3) czas wystąpienia stresora w odniesieniu do uczenia się lub wykonywania zadania poznawczego. Co więcej, różnice między płciami w zakresie wpływu stresu na funkcje poznawcze zostały szeroko udokumentowane. Opisano tutaj adaptację paradygmatu automatycznej zmiany strategii operacyjnej w celu oceny, w jaki sposób zmiany stresu wpływają na elastyczność poznawczą u samców i samic szczurów Sprague Dawley. W szczególności stres związany z powściągliwością jest stosowany przed lub po treningu w tym zadaniu opartym na instrumentach, aby zbadać, jak stres wpływa na wydajność poznawczą u obu płci. Poszczególne obszary mózgu związane z każdym zadaniem w tym zautomatyzowanym paradygmacie zostały dobrze ugruntowane (tj. przyśrodkowa kora przedczołowa i kora oczodołowo-czołowa). Pozwala to na ukierunkowane manipulacje podczas eksperymentu lub ocenę poszczególnych genów i białek w tych regionach po zakończeniu paradygmatu. Paradygmat ten pozwala również na wykrywanie różnego rodzaju błędów wydajności, które pojawiają się po stresie, z których każdy ma zdefiniowane substraty neuronalne. Zidentyfikowano również wyraźne różnice między płciami w błędach perseweratywnych po powtarzającym się paradygmacie stresu powściągliwości. Zastosowanie tych technik w modelu przedklinicznym może ujawnić, w jaki sposób stres wpływa na mózg i upośledza funkcje poznawcze w zaburzeniach psychicznych, takich jak zespół stresu pourazowego (PTSD) i duże zaburzenie depresyjne (MDD), które wykazują wyraźne różnice w rozpowszechnieniu między płciami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U ludzi stresujące wydarzenia życiowe mogą upośledzać funkcje poznawcze (tj. elastyczność poznawczą1), co oznacza zdolność do adaptacji strategii przetwarzania poznawczego do stawienia czoła nowym warunkom w środowisku2. Upośledzenie funkcji poznawczych przyspiesza i zaostrza wiele zaburzeń psychicznych, takich jak zespół stresu pourazowego (PTSD) i duże zaburzenie depresyjne (MDD)3,4. Zaburzenia te występują dwa razy częściej u kobiet5,6,7,8, jednak biologiczne podstawy tej rozbieżności pozostają nieznane. Aspekty funkcjonowania wykonawczego u ludzi można ocenić za pomocą Wisconsin Card Sorting Task, demonstracji elastyczności poznawczej2. Wydajność w tym zadaniu jest upośledzona u pacjentów z PTSD9 i MDD10, ale neuronalne podstawy tej zmiany można zbadać tylko za pomocą obrazowania mózgu11.

Postępy w zrozumieniu, jak stres wpływa na mózg, zostały osiągnięte dzięki wykorzystaniu modeli zwierzęcych, szczególnie gryzoni. Ponieważ elastyczność poznawcza jest zaburzona w chorobach związanych ze stresem, jest to wyjątkowo istotny fenotyp do zbadania u gryzoni. Do tej pory większość literatury dotyczącej neurobiologii stresu używała alternatywnego paradygmatu elastyczności poznawczej (czasami określanego jako zadanie kopania)12,13,14,15. Chociaż zadanie to zostało dokładnie sprawdzone, szkolenie gryzoni wymaga więcej czasu i wysiłku ze strony eksperymentatora. Zaadaptowany i opisany tutaj jest dobrze znany protokół automatycznego przełączania zestawów16 do oceny elastyczności poznawczej u samców i samic szczurów Sprague Dawley przy użyciu różnych modeli stresu17,18. Procedura wymaga minimalnego nadzoru ze strony eksperymentatora i pozwala na jednoczesne testowanie wielu szczurów. Ponadto, w przeciwieństwie do innych wersji tego zautomatyzowanego task19, adaptacja tego paradygmatu wymaga tylko 3 dni szkolenia i obejmuje wydajną zaprogramowaną analizę danych.

To, czy stres wzmacnia czy upośledza funkcje poznawcze, zależy od rodzaju, intensywności i czasu trwania stresora, a także od czasu wystąpienia stresora w odniesieniu do uczenia się lub wykonywania zadania poznawczego20,21. W związku z tym protokół obejmuje procedury stresu zarówno przed, jak i po szkoleniu operacyjnym. Przeanalizowano w nim również reprezentatywne wyniki badań warunków skrajnych. Ponadto dobrze ugruntowane zostały obszary mózgu leżące u podstaw poszczególnych aspektów zmiany zestawu2,16,22; W związku z tym raport opisuje również, w jaki sposób celować i oceniać poszczególne regiony mózgu w trakcie lub po procedurach stresu i zmiany strategii.

Przeprowadzono ograniczone badania nad bezpośrednim badaniem różnic płci w elastyczności poznawczej18,23. Protokół opisuje, jak 1) włączyć zarówno samce, jak i samice szczurów do paradygmatu eksperymentalnego, a następnie 2) śledzić cykle rujowe przed i podczas zabiegów u swobodnie jeżdżących na rowerze samic. Wcześniejsze badania wykazały, że stres przed treningiem instrumentalnym może prowadzić do specyficznych dla płci deficytów elastyczności poznawczej u szczurów17. W szczególności samice szczurów wykazują zaburzenia elastyczności poznawczej po stresie, podczas gdy elastyczność poznawcza poprawia się u samców szczurów po stresie17. Co ciekawe, główną cechą charakterystyczną zaburzeń psychicznych związanych ze stresem, które u ludzi występują ze względu na płeć, jest brak elastyczności poznawczej. Wyniki te sugerują, że kobiety mogą być bardziej podatne na tego typu zaburzenia poznawcze niż mężczyźni. Zastosowanie tych technik w modelach zwierzęcych rzuci światło na wpływ stresu na mózg i sposób, w jaki upośledza on funkcje poznawcze w zaburzeniach psychicznych u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Bryn Mawr College. Uzyskaj zgodę IACUC lub innego organu regulacyjnego przed zamówieniem zwierząt laboratoryjnych i rozpoczęciem eksperymentów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Zdobądź dorosłe samce i samice szczurów Sprague Dawley.
    UWAGA: Szczury mogą być dostarczane przed 65 dniem życia, ale nie należy rozpoczynać procedur przed upływem tego momentu, aby upewnić się, że zarówno samce, jak i samice są w pełni dojrzałe.
  2. Szczury tej samej płci należy trzymać w parach tak długo, jak to możliwe, ponieważ długotrwała izolacja jest czynnikiem stresogennym24. W celu ograniczenia pożywienia, pojedynczo szczury domowe tuż przed protokołem zmiany strategii operacyjnej.
  3. Po 1 tygodniu aklimatyzacji delikatnie zacznij obchodzić się ze szczurami przez 3-5 minut dziennie. Zbierz masę ciała każdego szczura. Dodatkowo, jeśli jesteś zainteresowany oceną, w jaki sposób hormony gonadalne mogą wpływać na wyniki, pobierz płukanie pochwy dla samic szczurów (opisane w punkcie 2).
  4. Ogranicz (z jedzenia) zwierzęta, które będą prowadzone w paradygmacie zmiany strategii operacyjnej co najmniej 3 dni przed rozpoczęciem treningu, aby skutecznie nauczyły się zadania. Upewnij się, że woda jest zawsze swobodnie dostępna. Dla każdego zwierzęcia należy prowadzić pisemne zapisy w celu udokumentowania dziennego spożycia pokarmu i płynów, stanu nawodnienia oraz wszelkich zmian behawioralnych i klinicznych stosowanych jako kryteria czasowego lub trwałego usunięcia zwierzęcia z protokołu (Morton 2000; NRC 2003b).
    1. Jeśli stosujesz procedurę stresu przez więcej niż 3 dni przed treningiem, dostosuj ograniczenie żywieniowe do liczby dni stresu (np. 5 dni powściągliwości plus ograniczenie jedzenia25).
    2. Każdego dnia dostarczaj 80% normalnego dziennego spożycia pokarmu (tj. 4 g jedzenia na 100 g masy ciała)26. Skorzystaj z dziennej kolekcji wagi szczura, aby obliczyć, ile jedzenia należy podawać każdego dnia.
    3. Kontynuuj ograniczanie jedzenia przez dni treningowe i testowe. Nie umieszczaj jednak jedzenia w klatce domowej, dopóki szczur nie zakończy treningu lub testów na dany dzień, w przeciwnym razie nie będzie zmotywowany do wykonywania zadań w celu uzyskania nagrody w postaci granulek pokarmu. Upewnij się, że czas dostarczenia pokarmu szczurom po zakończeniu zadania jest dość nieprzewidywalny, ponieważ pomaga to uniknąć zmniejszonej motywacji do działania w komorze operacyjnej (na rzecz późniejszego czekania na jedzenie w klatce domowej).
      UWAGA: Zwierzęta poddawane paradygmatowi stresu związanego z ograniczeniami nie wykazują istotnie większej utraty masy ciała niż osoby z grupy kontrolnej, niezestresowane. Jednak różne procedury stresowe mogą same w sobie powodować utratę wagi, co powoduje, że szczury otrzymują mniej pokarmu niż ich niezestresowane odpowiedniki podczas ograniczania pokarmu na podstawie masy ciała. Może to stanowić dodatkowy, mylący stresor. Jeśli wydaje się, że tak jest, alternatywnie użyj ustalonej ilości jedzenia podawanej każdemu badanemu, niezależnie od wagi27.

2. Płukanie pochwy

UWAGA: Wiadomo, że hormony gonad (tj. estrogen i progesteron) wpływają na reakcję na stres i funkcje poznawcze28,29,30. Hormony te zmieniają się w cyklu rujowym samic szczurów31. Jeśli jesteś zainteresowany śledzeniem cyklu rujowego swobodnie poruszających się samic gryzoni w celu skorelowania z danymi dotyczącymi stresu lub elastyczności poznawczej, zbierz płukanie pochwy zgodnie z poniższym opisem. Nie podano reprezentatywnych danych dotyczących etapu cyklu rujowego.

  1. Aby uzyskać próbki płukania pochwy od samic, zbierz ciepłą wodę w czystej zlewce, szklanym zakraplaczu, szkiełku "do płukania" (szkiełko mikroskopowe z kółkami z farbą akrylową do przechowywania próbki płukania) i jednej pustej zlewki.
  2. Napełnij zakraplacz niewielką ilością ciepłej wody (~0,5 ml), a następnie włóż końcówkę do pochwy samicy szczura (podnosząc za ogon). Wyrzuć sterylną wodę 2x–3x i wyrzuć zebrany płyn na szkiełko mikroskopowe. Nie przelewaj koła suwaka do płukania.
  3. Nadmiar płynu należy wylać do pustej zlewki. Oznacz szkiełko płuczkowe numerami szczurów i umieść próbki od każdego szczura w tej kolejności, aby było jasne, która próbka należy do każdego szczura.
  4. Dokładnie wypłukać zakraplacz, pipetując czystą, ciepłą wodę i kilkakrotnie dozując ją do zlewki z "nadmiarem" przed napełnieniem zakraplacza w celu pobrania próbki od następnego szczura.
  5. Ostrożnie przenieś szkiełko do mikroskopu jasnego pola, aby zobrazować próbkę płukania i sklasyfikować dzień w cyklu rujowym, jak opisano w Becker et al31.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby płukanie było wykonywane przez kilka tygodni, aby prawidłowo śledzić cykl samicy i powinno być wykonywane o bardzo podobnej porze każdego dnia, aby kontrolować rytmy okołodobowe. Najlepiej, aby ta procedura była wykonywana przed procedurami stresu i zmiany strategii operacyjnej. Użycie wacików bawełnianych i sterylnego roztworu soli fizjologicznej może być również stosowane jako alternatywa dla tej techniki zakraplacza. Dane dotyczące samic szczurów mogą być analizowane post hoc zgodnie z dniem cyklu rujowego (należy wziąć pod uwagę dni cyklu, w których wykonywany jest stres i/lub dzień cyklu, w którym przeprowadza się test).

3. Sprzęt i oprogramowanie

  1. Używaj komór narzędziowych do treningu behawioralnego i testowania.
    1. Upewnij się, że komory zawierają co najmniej dwie wysuwane dźwignie z dwoma lampkami stymulacyjnymi powyżej, oświetleniem domu i dozownikiem wzmacniającym te zadania.
    2. Sprawdź, czy dźwignie znajdują się po obu stronach środkowego obszaru dostarczania wzmocnienia, a nad każdą dźwignią znajduje się jedna lampka stymulacyjna.
    3. Użyj światła w domu, aby oświetlić komorę bez zakłócania wykrywania bodźca świetlnego (najlepiej, jeśli światło domu znajduje się na tylnej ścianie komory, naprzeciwko dźwigni i świateł stymulacyjnych).
  2. Używaj bezpyłowych granulek spożywczych (tutaj stosuje się granulki 45 mg: 18,7% białka, 5,6% tłuszczu i 4,7% błonnika) do wzmocnienia szczurów z ograniczeniami pokarmowymi. Nie używaj granulek o wysokiej zawartości sacharozy lub tłuszczu (chyba że istnieje zainteresowanie tym, jak stres wpływa na spożycie smacznych pokarmów).
  3. Kontroluj prezentację bodźców, działanie dźwigni i zbieranie danych z komputera za pomocą oprogramowania zdolnego do obsługi komory (Tabela materiałów).
    UWAGA: Aby uzyskać informacje związane z kodowaniem programów korzystających z tego oprogramowania, skontaktuj się z autorami. Skrypty MED-PC są dołączane jako pliki uzupełniające. To oprogramowanie zbiera informacje o reakcjach zwierzęcia dla każdej próby (która dźwignia jest naciskana, czy jest poprawna/nieprawidłowa/brak odpowiedzi i opóźnienie w dokonaniu wyboru). Na podstawie tych informacji użytkownicy mogą obliczać różne miary w paradygmacie behawioralnym, zgodnie z opisem w sekcji analizy behawioralnej.
  4. Wykonuj treningi/testy o tej samej porze każdego dnia, aby kontrolować rytm okołodobowy hormonów stresu32 (i inne odpowiednie miary).
  5. Napełnij dolną tacę każdego pojemnika operacyjnego świeżą ściółką, aby zebrać kał/odpady. Po każdej sesji wyrzuć każdą tacę, wyczyść tace i wnętrze komory chusteczkami nasączonymi alkoholem lub środkiem dezynfekującym zatwierdzonym przez IACUC i zastąp świeżą ściółką przed umieszczeniem nowego zwierzęcia w komorze.

4. Procedury stresu

  1. Zdecyduj, czy procedura stresu powinna być wykonywana przed, w trakcie i/lub po szkoleniu w zakresie paradygmatu zmiany strategii operacyjnej (np. 5 dni stresu związanego z unieruchomieniem przed 3 dniami szkolenia instrumentalnego vs. 3 dni treningu operacyjnego, po którym następuje pojedyncze unieruchomienie i testy).
  2. Wykonuj procedurę stresu o tej samej porze codziennie w odniesieniu do treningu operacyjnego. (np. 30-minutowy stres związany z unieruchomieniem, rozpoczynający się o godzinie 9 rano, a następnie umieszczenie w komorze operacyjnej).
  3. Wykonuj procedury stresu w oddzielnym pomieszczeniu od pokoju kolonii i pomieszczeń paradygmatu zmiany strategii (aby upewnić się, że nie ma czynników zakłócających związanych ze stresem świadka)33. Krótko mówiąc, umieść szczura w przezroczystej rurce przytrzymującej w stylu Broome'a i uszczelnij otwór, uważając, aby nie uszczypnąć kończyn ani ogona. Pomiędzy każdym badaniem użyj zatwierdzonego przez IACUC środka dezynfekującego do czyszczenia rurki w stylu Broome. Niewłaściwa dezynfekcja może pozostawić feromony, które mogą niekorzystnie wpłynąć na protokół testowy.
    UWAGA: Oszacuj, ile czasu pierwsza grupa szczurów spędzi w komorach operacyjnych. Będzie się to różnić w zależności od dnia treningu i dnia testu; Jednak po uruchomieniu kilku kohort można obliczyć średni czas wykonania każdego zadania w celu oszacowania przyszłych zadań.
  4. W zależności od tego, ile komór operantowych jest dostępnych, rozłoż procedurę stresu dla badanych. Na przykład cztery szczury są poddawane stresowi krępującemu i umieszczane w czterech komorach operacyjnych. Godzinę później cztery kolejne zwierzęta poddawane są procedurom stresu, które są następnie przeprowadzane w komorze operacyjnej.

5. Szkolenie

UWAGA: Ten paradygmat jest zmodyfikowany w stosunku do procedury operantowej zmiany zestawu opracowanej przez Floresco et al. tak, że można go ukończyć w 3 dni19. Procedury treningowe dla szczurów wymagają 3 dni (1 dzień na nauczenie się każdego zadania opisanego poniżej). Rzadko zdarza się, aby szczur nie uczył się tych zadań. Jeśli szczur nie nauczy się każdego zadania, powinien zostać wykluczony z końcowego badania. Zobacz Rysunek 1A, aby zobaczyć wizualne przedstawienie paradygmatu treningowego opisanego poniżej.

  1. Przed umieszczeniem szczura w komorze upewnij się, że w dozowniku jest wystarczająca ilość granulek pokarmu i że pudełka operacyjne działają prawidłowo. Aby to osiągnąć, załaduj i zainicjuj program dnia szkoleniowego lub testowego w pustej komorze, ręcznie sprawdzając, czy właściwa dźwignia odpowiednio dostarcza jedną nagrodę na naciśnięcie dźwigni.
  2. Szkolenie szczura do naciskania każdej dźwigni
    1. Przed umieszczeniem szczura w pudełku na pierwszy dzień treningu, ręcznie ustaw jedną nagrodę w postaci granulek pokarmowych na odpowiedniej dźwigni, zgodnie z przeznaczeniem podczas ładowania procedury treningowej w każdej komorze.
    2. Trenuj szczura przy użyciu harmonogramu o stałym współczynniku (FR-1), tak aby każde prawidłowe naciśnięcie dźwigni było nagradzane jednym wzmocnieniem. Zrównoważ właściwą dźwignię dziennie w różnych obiektach i/lub warunkach eksperymentalnych (kształtując tylko jedną dźwignię na raz), wyznaczając właściwą dźwignię po załadowaniu procedury treningowej na komputer obsługujący komory.
    3. Pozwól szczurowi naciskać dźwignię, aż osiągnie kryterium, naciskając odpowiednią dźwignię 50 razy, zwykle kończąc zadanie między 30 a 45 minutami.
    4. Następnego dnia zmuś szczura do wykonania tego zadania na przeciwległej dźwigni za pomocą tego samego programu, co pierwszego dnia treningu, ale oznacz przeciwną dźwignię jako właściwą. W tym dniu treningu nie ma potrzeby "formowania" dźwigni za pomocą granulatu pokarmowego. Zazwyczaj to kryterium jest szybko nabywane po tym, jak szczury nauczą się naciskać pierwszą dźwignię.
  3. Szkolenie szczura, aby reagował na sygnał świetlny
    1. Trzeciego dnia treningu zapal światło nad obiema dźwigniami na 15-sekundowe próby, podczas których szczur może nacisnąć jedną z dźwigni, aby potencjalnie otrzymać nagrodę w postaci granulek pokarmowych. Podczas zadania lekkiej dyskryminacji program ten losowo wybierze, która dźwignia jest prawidłowa na zasadzie próba po próbie.
    2. Jeśli szczur naciśnie odpowiednią dźwignię, upewnij się, że światła pozostają zapalone przez 3 sekundy i nagroda zostanie dostarczona, po czym następuje okres 5 sekund, podczas którego światła są wyłączane przed następną próbą. Jeśli szczur naciśnie niewłaściwą dźwignię, upewnij się, że nie zostanie dostarczona żadna nagroda i że światła są wyłączone na 10 sekund przed następną próbą.
    3. Po tym ostatnim dniu treningu oblicz "odchylenie boczne", aby określić, czy szczur preferuje lewą czy prawą dźwignię, dzieląc liczbę naciśnięć jednej dźwigni przez całkowitą liczbę naciśnięć dźwigni. W dniu testu szczur zacznie od najmniej preferowanej strony, aby upewnić się, że uczy się określonej ewentualności reakcji-nagrody, a nie reaguje na preferowaną dźwignię.

6. Testowanie

UWAGA: Zobacz Rysunek 1B, aby zobaczyć wizualne przedstawienie paradygmatu testowania opisanego poniżej.

  1. W dniu 4 (dzień testu) umieść szczura w komorze operacyjnej zgodnie z procedurami stresu i przetestuj go seryjnie w zadaniach dyskryminacji bocznej, odwrócenia bocznego i dyskryminacji światła. Upewnij się, że zadanie dyskryminacji światła oświetla tylko światło powyżej "właściwej" dźwigni. W każdym zadaniu szczury muszą wykonać kolejno osiem poprawnych prób, aby ukończyć każdą dyskryminację bez naciskania nienagradzanej, niewłaściwej dźwigni. Nieprawidłowe naciśnięcie dźwigni spowoduje zresetowanie tego łańcucha prób.
    1. Przetestuj szczury za pomocą zadania dyskryminacji bocznej. Korzystając z programu dyskryminacji bocznej, nagradzaj szczura za naciśnięcie dźwigni po najmniej preferowanej stronie, zgodnie z ustaleniami od trzeciego dnia treningu, niezależnie od sygnału świetlnego. Zadanie kończy się po naciśnięciu odpowiedniej dźwigni 8 razy z rzędu (z wyłączeniem pominięć).
    2. Wykonaj test odwrócenia bocznego, uruchamiając szczury ponownie za pomocą programu dyskryminacji bocznej, ale tym razem oznaczając dźwignię przeciwną do właściwej z zadania dyskryminacji bocznej jako prawidłową. Upewnij się, że szczur jest nagradzany za naciśnięcie tej dźwigni, niezależnie od sygnału świetlnego. Zadanie kończy się po naciśnięciu odpowiedniej dźwigni 8 razy z rzędu (z wyłączeniem pominięć).
    3. Wykonaj zadanie dyskryminacji światła, które nagradza szczura za naciśnięcie dźwigni przy świetle zapalonym powyżej. Każdy test operacyjny jest zakończony po naciśnięciu odpowiedniej dźwigni 8 razy z rzędu (z wyłączeniem pominięć).
      UWAGA: Na podstawie wcześniejszych badań, zadania te kodują co najmniej 30 prób, niezależnie od kolejnych naciśnięć, aby zapewnić, że szczury mają wystarczająco dużo czasu na nauczenie się zasad każdego zadania18. Tak więc, jeśli szczur wykona kolejno osiem prawidłowych prób przed wykonaniem 30 prób, zadanie pozostanie zaangażowane do momentu zakończenia 30 prób.

7. Analiza behawioralna

UWAGA: Dane pozyskane dla każdego zwierzęcia w dniu testu są automatycznie rejestrowane i zapisywane przez komputer, o ile skrypt MED-PC dla każdego zadania został zainicjowany i dopuszczony do wykonania (zobacz materiały uzupełniające do skryptów MED-PC).

  1. Otwórz dane dla każdego zadania z dnia testowego (dyskryminacja boczna, odwrócenie strony i dyskryminacja lekka) za pomocą programu komputerowego. Głównymi miarami rejestrowanymi przez program są próby do kryterium, błędy w kryterium i czas do kryterium. Środki te zostały szczegółowo opisane poniżej.
    UWAGA: Autorzy wygenerowali skrypt MATLAB, który pozwala na automatyzację procesu analizy, a także analizę błędów perseweracyjnych i regresywnych (skontaktuj się z autorami w celu uzyskania informacji o kodzie, aby usprawnić analizę danych).
    1. Użyj prób do kryterium (które odnosi się do całkowitej liczby prób [bez uwzględnienia pominięć] niezbędnych do tego, aby szczur ukończył kolejno osiem prawidłowych prób, w tym te osiem prób) jako główny wskaźnik dokładności. Dane te znajdują się w pierwszej kolumnie w tablicy B w pliku danych wygenerowanym przez skrypt MED-PC dla dowolnego zadania w dniu testu.
    2. Zbadaj łączną liczbę błędów popełnionych podczas każdego zadania. Dane te znajdują się w trzeciej kolumnie tablicy B w pliku danych wygenerowanym przez skrypt MED-PC dla dowolnego zadania w dniu testu. Błędy te są również klasyfikowane jako błędy perseweratywne lub regresywne. Błędy perseweratywne są popełniane, gdy szczur kontynuuje przestrzeganie wcześniejszej reguły z poprzedniego zadania. Błędy regresywne są popełniane po odłączeniu się od poprzedniej reguły, ale kontynuują próbę przejęcia nowej reguły (więcej szczegółów na temat sposobu obliczania tego typu błędów można znaleźć w opublikowanej metodzie18).
    3. Jeśli szczur nie zareagował na sygnał świetlny w ciągu 15 sekund, próba jest klasyfikowana jako pominięcie i nie będzie wliczana do całkowitej liczby prób do oceny. Oblicz to, najpierw dodając do siebie liczbę poprawnych odpowiedzi (znajdujących się w drugiej kolumnie tablicy B w pliku danych) i liczbę błędów (znajdujących się w trzeciej kolumnie tablicy B w pliku danych). Następnie odejmij tę liczbę od całkowitej liczby prób do kryterium (jest to ostatnia liczba w pierwszej kolumnie tablicy B w pliku danych, inna niż próba do kryterium).
    4. Użyj czasu rozpoczęcia i zakończenia zarejestrowanego przez program (znajdującego się w górnej części pliku danych wygenerowanego przez skrypt MED-PC dla dowolnego zadania w dniu testu), aby obliczyć czas do kryterium. Opóźnienie do pierwszego naciśnięcia dźwigni można również obliczyć na podstawie pliku danych, odejmując zmienną K (czas, jaki upłynął w sekundach od pierwszego naciśnięcia dźwigni) od czasu do kryterium.
    5. Uśrednić dane dla każdej miary behawioralnej dla szczurów w tej samej grupie leczenia. Wykonaj odpowiednie analizy statystyczne (w zależności od tego, ile zmiennych jest badanych).

8. Substraty mózgowe

  1. Określ interesujący obszar mózgu i/lub aspekt elastyczności poznawczej. Na przykład, jeśli stres zwiększa błędy persewerywne w zadaniu odwrócenia bocznego, kora oczodołowo-czołowa (OFC) może być szczególnie interesująca, ponieważ poprzednie badania nad zmianami chorobowymi wykazały, że ten obszar mózgu odgrywa rolę w wielu formach uczenia się odwróconego (tj. odwrócenie przestrzenne testowane w zadaniu odwrócenia bocznego)34,35,36. W tym przykładzie należy złożyć ofiary ze szczurów po zakończeniu paradygmatu zmiany strategii i zbadać c-fos (miara aktywacji neuronalnej37) w OFC przy użyciu opisanych metod immunohistochemicznych25 i opisanych pokrótce tutaj.
    1. Najpierw wyekstrahuj mózgi zwierząt i pokrój w plastry o grubości 40 μm.
    2. Przemyć tkankę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 4x przez 5 minut, a następnie inkubować w 0,3% nadtlenku wodoru przez 10 minut w celu wygaszenia endogennych peroksydaz.
    3. Umyj tkankę w PBS 2x przez 5 minut, a następnie inkubuj w mysim pierwotnym przeciwciałie anty-c-fos (1:500), 3% normalnej surowicy osła (NDS) i 0,3% Triton X przez noc.
    4. Następnego dnia umyj tkankę w PBS 3x przez 5 minut, a następnie inkubuj w sprzężonym z biotyną SP przeciwciałie anty-mysim osła (1:500) przez 2 godziny.
    5. Umyj tkankę w PBS 3x przez 5 minut, a następnie inkubuj w kompleksie awidyna-streptawidyna AB przez 1 godzinę.
    6. Myj tkankę w PBS 3x przez 5 minut, a następnie inkubuj w roztworze DAB przez maksymalnie 10 minut, gdy tkanka ulega reakcji chromogennej utleniania.
    7. Umyj chusteczkę w PBS 3x przez 5 minut każda, a następnie zamontuj plastry mózgu na szklanych szkiełkach mikroskopowych.
    8. Nasunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego na bazie toluenu i zobrazować za pomocą mikroskopu jasnego pola.
      UWAGA: Tutaj, jak odzwierciedlono w reprezentatywnych wynikach, szczury są poświęcane 30 minut po zakończeniu paradygmatu zmiany strategii, około 60-90 minut po zakończeniu zadania odwrócenia (w zależności od wydajności każdego szczura w zadaniu świetlnym). Powinno to reprezentować optymalny czas dla c-fos expression38, odzwierciedlając wydajność w zadaniu odwrócenia.
  2. Alternatywnie, kaniuluj określony obszar mózgu do wstrzyknięcia leku lub wstrzyknięcia wirusa przed wykonaniem stresu lub paradygmatu zmiany strategii instrumentalnej.
    UWAGA: Naukowcy mogą chcieć zbadać, w jaki sposób manipulowanie substratami neuronalnymi zmienia wpływ stresu na elastyczność poznawczą. Na przykład naukowcy mogą zablokować określony receptor neuroprzekaźnika w korze przedczołowej przed badaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej zaadaptowany paradygmat automatycznej zmiany strategii operacyjnej został wykorzystany do określenia, czy powtarzający się stres związany z ograniczeniami wpływa na funkcje poznawcze u samców i samic szczurów Sprague Dawley. Reprezentatywne dane behawioralne są opisane w Rysunek 2 poniżej. Krótko mówiąc, kontrolne i wielokrotnie skrępowane szczury wykonywały ten operacyjny test zmiany strategii, który składał się z serii zadań: dyskryminacja boczna, odwrócenie boczne i lekka dyskrymina...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pokazuje, jak mierzyć wpływ stresu na funkcje poznawcze. W szczególności u gryzoni stosuje się zmodyfikowany paradygmat zmiany strategii operacyjnej, który mierzy elastyczność poznawczą (analogicznie do zadania sortowania kart w Wisconsin u ludzi)1. Elastyczność poznawcza oznacza zdolność do adaptacji strategii przetwarzania poznawczego do stawienia czoła nowym warunkom w środowisku i ma kluczowe znaczenie dla normalnego codziennego funkcjonowania2. Ponieważ badani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Hannah Zamore, Emily Saks i Joshowi Searle'owi za pomoc w ustanowieniu tego paradygmatu zmiany strategii operacyjnej w laboratorium Grafe. Chcieliby również podziękować Kevinowi Snyderowi za jego pomoc w tworzeniu kodu MATLAB do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-calowe szklane pipety zakraplacze do oczuAmazon4306-30-012LCDo płukania pochwy
Chusteczki nasączone alkoholemVWR15648-990Do czyszczenia tac w zestawach pudełek do przesuwania między szczurami
AffiniPure sprzężony z biotyną-SP Osioł Anti-Mouse lgG (H + L), minimalna reakcja krzyżowa na bydło, kurczaka, kozę, świnkę morską, chomika, konia, człowieka, królika, owcę białka surowicyJackson ImmunoResearch715-065-150Wszystkie inne materiały barwiące protokół DAB są standardowymi/DAB i nie są tutaj określone, ponieważ nie jest to głównym celem metod papier
C-fos mysie monoklonalne przeciwciało pierwotneAbCamab208942Aby zabarwić aktywację neuronalną w obszarach mózgu po ustawieniu przesunięcia
Bezpyłowe granulki spożywczeBio ServF0021Do zestawów pudełek z przesuwną (dozownik do nagrody)
GraphPad PrismUżywany do analizy danych
Mikroskop Leica DM4 B i powiązane oprogramowanie do obrazowaniaLeicaWiele różnych części do mikroskopu i stacji roboczej, do obrazowania płukania i/lub cfos
Oprogramowanie MatLab; kod pomagający analizować dane dotyczące zmian zestawów, dostępny na żądanie.
Pakiet oprogramowania Med-PCMed AssociatesSOF-736Oprogramowanie; wykorzystuje kody do obsługi komór operacyjnych
Komory operacyjne MedPCMED-008-B2Wiele różnych części do konfiguracji komory i oprogramowania do pracy z nią; napisaliśmy również osobny kod do zmiany zestawu, dostępny na życzenie.
Ściółka dla szczurówEnvigoT.7097
Rat ChowEnvigoT.2014.15
Urządzenia ograniczająceBryn Mawr CollegeWykonane przez nasz sklep Doekspozycji na stres; specyfikacje dostępne na życzenie.
Bazgroły Farba do tkanin 3DAmazon54139Do płukania pochwy
Sprague Dawley RatsEnvigoCo najmniej D65 Samce i samice
VWR Superfrost Plus Micro SlideVWR48311-703Do płukania pochwy i/lub plastrów mózgu/barwienia dla c-fos

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hurtubise, J. L., Howland, J. G. Effects of stress on behavioral flexibility in rodents. Neuroscience. 345, 176-192 (2016).
  2. Bissonette, G. B., Powell, E. M., Roesch, M. R. Neural structures underlying set-shifting: Roles of medial prefrontal cortex and anterior cingulate cortex. Behavioural Brain Research. 250, 91-101 (2013).
  3. Vasterling, J. J., Brailey, K., Constans, J. I., Sutker, P. B. Attention and memory dysfunction in posttraumatic stress disorder. Neuropsychology. 12 (1), 125-133 (1998).
  4. Bangasser, D. A., Kawasumi, Y. Cognitive disruptions in stress-related psychiatric disorders: A role for corticotropin releasing factor (CRF). Hormones and Behavior. 76, 125-135 (2015).
  5. Nestler, E. J., et al. Neurobiology of depression. Neuron. 34 (1), 13-25 (2002).
  6. Keane, T. M., Marshall, A. D., Taft, C. T. Posttraumatic stress disorder: etiology, epidemiology, and treatment outcome. Annual Review of Clinical Psychology. 2, 161(2006).
  7. Seeman, M. V. Psychopathology in women and men: focus on female hormones. The American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1641-1647 (1997).
  8. Hodes, G. E., Epperson, C. N. Sex Differences in Vulnerability and Resilience to Stress Across the Life Span. Biological Psychiatry. 86 (6), 421-432 (2019).
  9. Monika, T. -B., Antoni, F., Piotr, G., Marian, M., Krzysztof, Z. Wisconsin Card Sorting Test in psychological examination of patients with psychiatric disorders. Polski merkuriusz lekarski: organ Polskiego Towarzystwa Lekarskiego. 25, Suppl 1 51-52 (2008).
  10. Merriam, E. P., Thase, M. E., Haas, G. L., Keshavan, M. S., Sweeney, J. A. Prefrontal cortical dysfunction in depression determined by Wisconsin Card Sorting Test performance. The American Journal of Psychiatry. 156 (5), 780-782 (1999).
  11. Monchi, O., Petrides, M., Petre, V., Worsley, K., Dagher, A. Wisconsin Card Sorting revisited: distinct neural circuits participating in different stages of the task identified by event-related functional magnetic resonance imaging. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (19), 7733-7741 (2001).
  12. Bulin, S. E., Hohl, K. M., Paredes, D., Silva, J. D., Morilak, D. A. Bidirectional optogenetically-induced plasticity of evoked responses in the rat medial prefrontal cortex can impair or enhance cognitive set-shifting. eNeuro. 7 (1), 0363(2019).
  13. Chaby, L. E., Karavidha, K., Lisieski, M. J., Perrine, S. A., Liberzon, I. Cognitive Flexibility Training Improves Extinction Retention Memory and Enhances Cortical Dopamine With and Without Traumatic Stress Exposure. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 24(2019).
  14. Drozd, R., Rojek-Sito, K., Rygula, R. The trait 'pessimism' does not interact with cognitive flexibility but makes rats more vulnerable to stress-induced motivational deficits: Results from the attentional set-shifting task. Behavioural Brain Research. 335, 199-207 (2017).
  15. Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set-shifting in the rat. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (11), 4320-4324 (2000).
  16. Floresco, S. B., Block, A. E., Tse, M. T. L. Inactivation of the medial prefrontal cortex of the rat impairs strategy set-shifting, but not reversal learning, using a novel, automated procedure. Behavioural Brain Research. 190 (1), 85-96 (2008).
  17. Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
  18. Snyder, K. P., Barry, M., Valentino, R. J. Cognitive impact of social stress and coping strategy throughout development. Psychopharmacology. 232 (1), 185-189 (2014).
  19. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant procedures for assessing behavioral flexibility in rats. Journal of Visualized Experiments. (96), e52387(2015).
  20. Sandi, C., Pinelo-Nava, M. T. Stress and Memory: Behavioral Effects and Neurobiological Mechanisms. Neural Plasticity. , 1-20 (2007).
  21. Shansky, R. M., Lipps, J. Stress-induced cognitive dysfunction: hormone-neurotransmitter interactions in the prefrontal cortex. Frontiers in Human Neuroscience. 7, 123(2013).
  22. Ragozzino, M. E., Detrick, S., Kesner, R. P. Involvement of the prelimbic-infralimbic areas of the rodent prefrontal cortex in behavioral flexibility for place and response learning. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 19 (11), 4585-4594 (1999).
  23. Liston, C., et al. Stress-induced alterations in prefrontal cortical dendritic morphology predict selective impairments in perceptual attentional set-shifting. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26 (30), 7870-7874 (2006).
  24. Hatch, A., Wiberg, G. S., Balazs, T., Grice, H. C. Long-Term Isolation Stress in Rats. Science. 142 (3591), 507(1963).
  25. Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
  26. Animal Care and Use Committee, T. J. H. U. Species Specific Information: Rat. , Available from: http://web.jhu.edu/animalcare/procedures/rat.html (2020).
  27. Lapiz-Bluhm, M. D. S., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. Journal of Neuroendocrinology. 20 (10), 1115-1137 (2008).
  28. McEwen, B. S. Permanence of brain sex differences and structural plasticity of the adult brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (13), 7128-7130 (1999).
  29. Manber, R., Armitage, R. Sex, steroids, and sleep: a review. Sleep. 22 (5), 540-555 (1999).
  30. Sherwin, B. B. Estrogen and Cognitive Functioning in Women. Endocrine Reviews. 24 (2), 133-151 (2003).
  31. Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146 (4), 1650-1673 (2005).
  32. Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
  33. Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
  34. McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set-shifting in the rat. Behavioural Brain Research. 146 (1-2), 97-103 (2003).
  35. Schoenbaum, G., Saddoris, M. P., Stalnaker, T. A. Reconciling the roles of orbitofrontal cortex in reversal learning and the encoding of outcome expectancies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1121 (1), 320-335 (2007).
  36. Meunier, M. Effects of orbital frontal and anterior cingulate lesions on object and spatial memory in rhesus monkeys. Neuropsychologia. 35 (7), 999-1015 (1997).
  37. Zappulla, R. A., Wang, W., Friedrich, V. L., Grabel, J., Nieves, J. CNS activation patterns underlying motor evoked potentials as demonstrated by c-fos immunoreactivity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 43, 155-169 (1991).
  38. Schoenenberger, P., Gerosa, D., Oertner, T. G. Temporal Control of Immediate Early Gene Induction by Light. PLoS ONE. 4 (12), 8185(2009).
  39. Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. The European Journal of Neuroscience. 36 (3), 2368-2375 (2012).
  40. Hancock, P. A., Warm, J. S. A dynamic model of stress and sustained attention. Human Performance in Extreme Environments. 7 (1), 15-28 (2003).
  41. Johnson, P. L., Molosh, A., Fitz, S. D., Truitt, W. A., Shekhar, A. Orexin, stress, and anxiety/panic states. Progress in Brain Research. 198, 133-161 (2012).
  42. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  43. Holmes, A., Wellman, C. L. Stress-induced prefrontal reorganization and executive dysfunction in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (6), 773-783 (2009).
  44. Placek, K., Dippel, W. C., Jones, S., Brady, A. M. Impairments in set-shifting but not reversal learning in the neonatal ventral hippocampal lesion model of schizophrenia: further evidence for medial prefrontal deficits. Behavioural Brain Research. 256, 405-413 (2013).
  45. Nikiforuk, A., Popik, P. Long-lasting cognitive deficit induced by stress is alleviated by acute administration of antidepressants. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 28-39 (2011).
  46. Bondi, C. O., Rodriguez, G., Gould, G. G., Frazer, A., Morilak, D. A. Chronic unpredictable stress induces a cognitive deficit and anxiety-like behavior in rats that is prevented by chronic antidepressant drug treatment. Neuropsychopharmacology. 33 (2), 320-331 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stres zwi zany z unieruchomieniemszczury Sprague Dawleyprzy rodkowa kora przedczo owakora orbitofrontalnab dy perwerwacyjnezadanie odwr cenia stronyzadanie dyskryminacji wiat ar nice mi dzy p ciami

Powiązane artykuły