Artykuł metodologiczny

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61231

⸱

14 maja 2020

 ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Streszczenie

Wtórne modyfikacje zasad na RNA, takie jak m5C, wpływają na strukturę i funkcję zmodyfikowanych cząsteczek RNA. Immunoprecypitacja i sekwencjonowanie metylowanego RNA (MeRIP-seq) to metoda, która ma na celu wzbogacenie metylowanego RNA i ostatecznie identyfikację zmodyfikowanych transkryptów. Krótko mówiąc, sonikowane RNA jest inkubowane z przeciwciałem dla 5-metylowanych cytozyn i wytrącane za pomocą kulek białka G. Wzbogacone fragmenty są następnie sekwencjonowane, a potencjalne miejsca metylacji są mapowane na podstawie rozkładu odczytów i wykrywania pików. MeRIP może być stosowany do każdego organizmu, ponieważ nie wymaga żadnej wcześniejszej wiedzy na temat sekwencji ani modyfikacji enzymów. Ponadto, poza fragmentacją, RNA nie jest poddawane żadnej innej obróbce chemicznej ani temperaturowej. Jednak MeRIP-seq nie zapewnia przewidywania miejsca metylacji na podstawie pojedynczego nukleotydu, jak robią to inne metody, chociaż obszar metylacji można zawęzić do kilku nukleotydów. Zastosowanie różnych przeciwciał specyficznych dla modyfikacji pozwala na dostosowanie MeRIP do różnych modyfikacji zasad obecnych na RNA, co rozszerza możliwe zastosowania tej metody.

Wprowadzenie

We wszystkich trzech królestwach życia, gatunki RNA przechodzą modyfikacje potranskrypcyjne, a badania nad tymi funkcjonalnie istotnymi modyfikacjami biochemicznymi nazywa się "epitranskryptomiką". Epitranskryptomika to rozwijająca się dziedzina, w której opracowywane są różne metody badania i mapowania modyfikacji cząsteczek RNA (recenzja w1,2). Znaleziono ponad sto modyfikacji RNA, wykrytych w rRNA, tRNA, innych ncRNA, a także mRNAs3,4. Chociaż obecność i funkcja chemicznie zróżnicowanych modyfikacji potranskrypcyjnych w tRNA i rRNA są szeroko badane5,6,7,8, dopiero niedawno scharakteryzowano modyfikacje mRNA. W roślinach do tej pory zidentyfikowano wiele modyfikacji mRNA, w tym m7G w strukturze czape9, m1A10, hm5C11,12 oraz uridylation13. Jednak tylko m6A10,14,15, m5C11,16,17 i pseudourydyna18 zostały zmapowane transkryptomem w Arabidopsis. Potranskrypcyjne modyfikacje zasady mRNA są zaangażowane w kilka procesów rozwojowych19,20.

Jednym z najczęściej stosowanych podejść w epitranskryptomice jest immunoprecypitacja metylowanego RNA połączona z głębokim sekwencjonowaniem (MeRIP-seq). MeRIP-seq został opracowany w 2012 roku do badania m6A w komórkach ssaków21,22. Wymaga użycia przeciwciała do pożądanej modyfikacji i ma na celu wzbogacenie o fragmenty RNA przenoszące zmodyfikowany nukleotyd (nukleotydy). Zwykle po nim następuje głębokie sekwencjonowanie w celu identyfikacji i mapowania wzbogaconych fragmentów lub ilościowy PCR w celu weryfikacji określonych celów RNA. Dokładność MeRIP opiera się na swoistości przeciwciała w rozpoznawaniu zmodyfikowanego nukleotydu w porównaniu z podobnymi modyfikacjami (np. m5C i hm5C11,23). Oprócz m6A, MeRIP-seq został również zastosowany do badania m1A i m5C metylacji RNA w kilku organizmach11,17,23,24,25.

Metylacja cytozyny w piątej pozycji węgla (m5C) jest najbardziej rozpowszechnioną modyfikacją DNA26,27 i jedną z najczęstszych modyfikacji RNA3,4. Podczas gdy m5C wykryto w eukariotycznych mRNA w 1975 roku28, dopiero niedawno badania skupiły się na mapowaniu modyfikacji transkryptomu w całym transkryptomie, w kodujących i niekodujących RNA11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Alternatywne metody stosowane w badaniach m5C RNA obejmują chemiczną konwersję niemetylowanych cytozyn w uracyle (sekwencjonowanie dwusiarczynowe) oraz testy immunoprecypitacji oparte na nieodwracalnym wiązaniu znanej metylotransferazy cytozyny RNA z jej celami RNA (miCLIP, aza-IP). Krótko mówiąc, sekwencjonowanie wodorosiarczynów wykorzystuje cechę 5-metylowanej cytozyny, która jest odporna na leczenie wodorosiarczynem sodu, które deaminuje niezmodyfikowane cytozyny do uracylu. Metoda została po raz pierwszy opracowana dla DNA, ale dostosowana również do RNA, a wiele badań wybrało to podejście do wykrywania miejsc m5C w RNA16,23,29,32,34,35. Zarówno miCLIP, jak i aza-IP wymagają wcześniejszej wiedzy na temat metylotransferazy cytozyny RNA i zastosowania odpowiedniego przeciwciała. W przypadku miCLIP (methylation individual-nucleotide-resolution crosslinking and immunoprecipitation) metylotransferaza przenosi pojedynczą mutację aminokwasową, dzięki czemu wiąże się z substratem RNA, ale nie może zostać uwolniona30. W aza-IP (immunoprecypitacja RNA za pośrednictwem 5-azacytydyny) nieodwracalne wiązanie powstaje między nukleozydem 5-azaC a metylotransferazą cytozyny RNA, gdy egzogennie dostarczony 5-azaC jest włączany przez polimerazy RNA do docelowej cząsteczki RNA31.

Główną zaletą tych trzech metod jest to, że pozwalają one na mapowanie rozdzielczości pojedynczego nukleotydu m5C. Ponadto miCLIP i aza-IP dostarczają informacji o specyficznych celach wybranej metylotransferazy cytozyny RNA, rozszyfrowując głębiej mechanizm i rolę potranskrypcyjnych modyfikacji RNA. Jednak podejście MeRIP-seq może zidentyfikować regiony m5Cobejmujące cały transkryptom bez konieczności posiadania wcześniejszej wiedzy i pozwala uniknąć trudnych warunków chemicznych i temperaturowych, takich jak traktowanie wodorosiarczynem lub inkubacja z 5-azaC. Zarówno sekwencjonowanie MeRIP, jak i wodorosiarczynu może być hamowane przez drugorzędowe struktury RNA36. Etap fragmentacji, który jest zawarty w teście MeRIP przed immunoprecypitacją, ma na celu ułatwienie wiązania przeciwciał i zwiększenie rozdzielczości identyfikacji m5C.

Inną metodą, o której warto wspomnieć, jest spektrometria mas (MS) nukleozydów RNA. Stwardnienie rozsiane może wykryć i odróżnić każdy rodzaj modyfikacji zarówno DNA, jak i RNA. Krótko mówiąc, RNA jest ekstrahowane i trawione przez DNazę, a następnie odsalane i trawione do pojedynczych nukleozydów. Nukleozydy RNA są analizowane za pomocą spektrometru mas. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania poziomów każdej modyfikacji i nie opiera się na przeciwciałie ani konwersji chemicznej. Jednak główną wadą jest to, że dostarcza dużych ilości informacji o obecności modyfikacji RNA. Aby zmapować modyfikacje, MS musi być połączony z informacjami o trawieniu i sekwencjonowaniu RNazy o określonych cząsteczkach RNA, tak jak w przypadku ludzkiego tRNALeu(CAA)37.

Tutaj opisujemy i omawiamy test MeRIP używany do badania metylacji m5C RNA u Arabidopsis17.

Protokół

1. Przygotowanie RNA

  1. Zmiel 200 mg tkanki roślinnej na proszek w ciekłym azocie, upewniając się, że tkanka pozostaje zamrożona przez cały zabieg.
  2. Ekstrahuj RNA z pożądanej tkanki roślinnej zgodnie z protokołem ekstrakcji kwasowym tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem. Aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia RNA DNA podczas separacji faz, zamiast chloroformu należy użyć 1-bromo-3-chloropropanu.
    1. Dodać 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA zawierającego tiocyjanian guanidyny i kwaśny fenol do rozdrobnionej tkanki roślinnej (500 μl na 100 mg tkanki). Dobrze wymieszaj, odwracając i upewnij się, że cała tkanka jest mokra. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu dysocjacji kompleksów rybonukleoproteinowych.
    2. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 200 μl 1-bromo-3-chloropropanu (100 μl na 500 μl odczynnika do ekstrakcji RNA) i energicznie wirować.
    4. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść górną fazę wodną (ok. 500 μl) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    5. Dodać 1 objętość izopropanolu (500 μl) i 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,5 (50 μl), dobrze wymieszać przez odwrócenie i wytrącić przez 10 minut w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie octanu sodu (NaOAc) w celu zwiększenia wytrącania RNA. W tym momencie protokół można wstrzymać, przedłużając wytrącanie się RNA na kilka godzin lub nawet na noc.
    6. Wirować przez 30 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    7. Przepłukać osad dwukrotnie 500 μl 80% EtOH, odwirować przez 5 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C i wyrzucić.
    8. Przepłukać osad jednorazowo 500 μl 99% EtOH, odwirować przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C i wyrzucić.
    9. Suszyć granulki przez 5-10 minut i rozpuścić w 30 μl wolnego od RNaz H2O.
      UWAGA: Zamiast tego należy użyć dowolnego wybranego protokołu ekstrakcji RNA (np. systemu opartego na kolumnach). Jeśli w protokole zawarto mineralizację DNazy, pomiń ją w następnym kroku (krok 1.3).
  3. Zmierzyć stężenie RNA (np. za pomocą spektrofotometru) i strawić 20 μg RNA za pomocą DNazy.
    UWAGA: DNA jest bogate wm5C, a przeciwciało nie rozróżnia DNA i RNA.
    1. W typowej reakcji DNazy należy potraktować 10 μg RNA w reakcji 50 μl. Wymieszać następujące składniki i inkubować reakcję (reakcje) w temperaturze 37 °C przez 30 min:
      10 μg RNA x μL
      10x bufor DNazy 5 μL
      DNaza 1 μL (2 jednostki)
      Wolne od RNazH2Odo 50 μL
    2. Usunąć enzym albo przez dodanie odpowiedniej objętości odczynnika do inaktywacji DNazy (jeśli jest on zawarty w zestawie DNazy i zgodnie z instrukcjami producenta), albo przez wykonanie etapu czyszczenia (np. Oczyszczanie kolumny lub ekstrakcja fenolem/chloroformem).
  4. Sprawdź jakość i czystość wyizolowanego RNA za pomocą elektroforezy kapilarnej i kontynuuj, jeśli liczba integralności RNA (RIN) jest wyższa niż 7, aby upewnić się, że próbki są dobrej jakości.
  5. OPCJONALNIE: Usuń rybosomalny RNA, aby wzbogacić próbki w zawartość mRNA za pomocą zestawu do usuwania rRNA i zgodnie z protokołem producenta.
    1. Użyj RNA traktowanego DNazą z poprzedniego kroku do reakcji zubożenia rRNA. Wykonaj wiele reakcji, jeśli ilość całkowitego RNA jest większa niż maksymalna ilość sugerowana dla reakcji.
    2. Należy pamiętać, że tylko 5-10% ilości wejściowej zostanie odzyskane po wyczerpaniu rRNA. Postępuj ze zubożonym RNA rRNA (równa ilość dla wszystkich próbek) i zignoruj ilości wymienione w poniższych krokach, ponieważ odnoszą się one do całkowitego RNA.
      UWAGA: Porównanie i opis dostępnych metod defikacji rRNA można znaleźć w bibliografii 38,39,40. rRNA jest główną częścią całkowitego RNA i jest metylowane m5C w wielu organizmach.
  6. Przygotować z wyprzedzeniem transkrypty in vitro (IVT), które mają być wykorzystane jako kontrolne sekwencje RNA, i dodać je do próbek.
    1. Wytwórz dwa odrębne IVT przy użyciu zestawu do transkrypcji in vitro, jeden z niemetylowanymi nukleozydami, a drugi, w którym rCTP jest zastąpiony przez 5-metylo-rCTP, aby służyły odpowiednio jako kontrole negatywne i pozytywne w MeRIP. Sporządzono transkrypcje EGFP i Renilla luciferase.
      UWAGA: IVT nie powinny występować w transkryptomie organizmu, który analizujesz. Jeżeli IVT pochodzą z tego samego szablonu (np. oba EGFP), należy dodać kontrolę dodatnią i ujemną w dwóch różnych próbkach. Jeśli ich sekwencja jest inna (np. EGFP i Renilla), można je dodać do tej samej próbki.
    2. Skok w każdej próbce 0,1 ng IVT na 3 μg RNA, jako kontrole.
  7. Sonizacja RNA do około 100 nt fragmentów.
    UWAGA: Warunki ścinania RNA muszą być dostosowane z wyprzedzeniem i różnią się dla każdego sonikatora. Dla zastosowanego tutaj modelu sonikacja jest wykonywana w następujących warunkach: Moc szczytowa 174, Współczynnik wypełnienia 10, Cykle/impuls 200, 17 min.
    1. Sonikować taką samą ilość RNA dla wszystkich próbek, co najmniej 12 μg RNA na próbkę w 80 μl całkowitej objętości (min. 60 μL, maks. 100 μL), wypełnioną H2O wolnym od RNaz.
  8. Potwierdź skuteczność sonikacji i stężenie próbek RNA za pomocą elektroforezy kapilarnej. Średnia wielkość rozdrobnionego RNA powinna wynosić około 100 nt.

2. Immunoprecypitacja metylowanego RNA (MeRIP)

  1. W probówkach o niskim poziomie wiązania dodać 9 μg sonikowanego RNA i H2Owolnego od RNaz do 60 μL (lub więcej, w zależności od stężenia).
  2. Oddzielić struktury drugorzędowe poprzez ogrzewanie RNA w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej przez 10 minut i schładzanie przez dodatkowe 10 minut w mieszaninie lodu i wody.
  3. Podzielić próbkę na trzy części: jedną trzecią (20 μl, jeśli w kroku 2.1 pobrano 60 μl) zapisuje się w osobnej probówce w temperaturze -80 °C jako próbkę wejściową. Pozostałe 40 μl napełnij H2O bez RNaz do 860 μL, a następnie podziel na dwie probówki o niskim stopniu wiązania: jedną dla IP i jedną dla kontroli Mock (430 μl każda).
  4. Dodaj do obu tub:
    50 μL 10x bufor MeRIP
    10 μl inhibitora RNazy
    10 μl przeciwciała α-m5C (10 μg) w próbce IP na 10 μlH2Ow próbce próbnej
    UWAGA: Stosowany wcześniej klon przeciwciała nie jest już dostępny na rynku. Jednak każde przeciwciało monoklonalne anty-5-metylocytozyny powinno działać podobnie. Przeciwciała powinny zostać przetestowane pod kątem swoistości przed użyciem dla MeRIP11,23.
  5. Uszczelnić probówki parafilmem i inkubować przez 12-14 godzin w temperaturze 4 °C, obracając się nad głową.
  6. Następnego dnia przygotuj kulki magnetyczne białka G do wiązania.
    1. Do każdej probówki (kontrola IP lub Mock) użyj 40 μl kulek. Dodaj całkowitą ilość kulek (# probówek x 40 μL, np. dla 2 IP i 2 próbek Mock potrzebne jest 160 μL kulek) do probówki o pojemności 15 ml i przemyć trzykrotnie 800 μl 1x buforu MeRIP na próbkę (# probówek x 800 μL buforu, np. 3,2 ml dla 2 IP i 2 próbek Mock).
    2. Wykonuj pranie w temperaturze pokojowej przez 5 minut z obrotem nad głową, zbierz kulki za pomocą stojaka magnetycznego i wyrzuć bufor myjący. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić kulki w tej samej objętości 1x buforu MeRIP, co początkowa objętość pobranych kulek (# probówek x 40 μL, np. 160 μL 1x buforu MeRIP dla 2 próbek IP i 2 próbek Mock).
      UWAGA: Ilość użytych kulek białka G zależy od zdolności wiązania kulek dla określonego typu przeciwciała i ilości użytego przeciwciała. W tym przypadku kulki mają zdolność wiązania ok. 8 μg mysiej IgG na mg kulek i stężenie 30 mg/ml. Zatem 40 μl wystarcza do związania ok. 9,6 μg przeciwciała.
  7. Dodać 40 μl zawieszonych kulek do każdego IP, próbnej próbki i inkubować przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 4 °C, obracając się nad głową.
  8. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę i wyrzuć supernatant lub zachowaj go jako kontrolę (niezwiązana próbka RNA).
  9. Umyj kulki 5 razy, ponownie zawieszając je w 700 μl 1x bufora MeRIP dostarczonego z 0,01% Tween 20 i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej z obrotem nad głową.
  10. Ponownie zawiesić umyte kulki w 200 μl buforu do wytrawiania proteinazy K i dodać 3,5 μl proteinazy K. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 50 °C, wstrząsając z prędkością 800 obr./min. Od czasu do czasu należy ręcznie przesunąć dno probówki, jeśli podczas inkubacji tworzy się osad z kulek.
  11. Ekstrahować RNA przez dodanie 800 μl odczynnika do ekstrakcji RNA i postępując zgodnie z protokołem ekstrakcji kwasowym tiocyjanianem guanidyny, fenolem i chloroformem, a następnie postępować jak w kroku 1.2. Aby zwiększyć widoczność osadu RNA, na etapie wytrącania można dodać kolorowy współprecypitent do izopropanolu. Zawiesić osad w 20 μl H2O bez RNaz (lub równej objętości wejściowej podanej w kroku 2.3).

3. Dalsza analiza

  1. Prześlij próbki danych wejściowych i IP do sekwencjonowania pojedynczego końca z długością odczytu 50 baz (SE50).
  2. Przytnij adaptery końcowe 3' za pomocą cutadapt41 i odrzuć odczyty, które są krótsze niż 48 nt.
  3. Mapa przycięta odczytuje genom Arabidopsis (adnotacja TAIR10) przy użyciu STAR42 z punktem odcięcia 6% dla niezgodności i maksymalnym rozmiarem intronu 10 kb. Zachowaj unikatowe zmapowane odczyty do dalszej analizy.
  4. Zidentyfikuj wzbogacone fragmenty RNA w próbkach IP w porównaniu z danymi wejściowymi przy użyciu dwóch różnych metod i rozważ te, które są znacznie wzbogacone przez oba.
    1. Najpierw wykryj szczyty MeRIP-seq za pomocą MACS2 peak caller43 na łączonych adresach IP i wejściu.
    2. Po drugie, postępuj zgodnie z analizą dla wywołania piku MeRIP-seq zgodnie z opisem w Meyer et al.22 i Yang et al.17.
      1. Korzystając z niestandardowych skryptów R, podziel genom na odrębne okna 25 nt i policz liczbę unikalnie zmapowanych odczytów dla każdego okna na podstawie pozycji ostatniego zmapowanego nukleotydu (ponieważ odczyty pochodzą z fragmentów 100 nt RNA).
      2. Oblicz znacznie wzbogacone okna w próbkach IP w porównaniu z danymi wejściowymi za pomocą dokładnego testu Fishera. Użyj procedury Benjaminiego-Hochberga, aby skorygować wielokrotne testy.
      3. Zachowaj znacznie wzbogacone szczyty, które rozciągają się na co najmniej dwa kolejne okna, i odrzuć szczyty, które obejmują tylko jedno okno.
  5. Zidentyfikuj oznaczone regiony genomu (transkrypty) ze znacznie wzbogaconymi pikami znalezionymi za pomocą obu metod.
  6. Alternatywnie lub komplementarnie, należy przetestować specyficzne cele RNA w celu ich wzbogacenia w próbkach IP.
    1. Odwrotna transkrypcja RNA (ta sama objętość próbek wejściowych, IP i próbek) za pomocą losowych heksamerów.
    2. Wykonaj ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym na wybranych obiektach, porównując dane wejściowe, IP i makietę za pomocą metody ΔΔCt.
      UWAGA: Wygenerowany produkt nie powinien być dłuższy niż 100 pz, ponieważ jest to średnia wielkość fragmentacji.

Wyniki

Schemat metody przedstawiono na Rysunku 1. Pierwszymi krytycznymi etapami protokołu są uzyskanie RNA dobrej jakości (RIN ≥ 7) oraz jego sonikacja do fragmentów o długości około 100 nt. Efektywność obu etapów jest badana za pomocą urządzenia do kapilarnej elektroforezy chipowej. Na Rysunku 2A pokazano reprezentatywny przebieg analizy dobrej próbki RNA. Próbkę rozcieńczono 1:10 przed nałożeniem na chip, aby uzyskać stężenie mieszczące się w zakresie detekcji użytego zestawu (5-500 ng/µL). Tę samą próbkę poddano analizie po sonikacji, co przedstawiono na Rysunku 2B. Zauważalna jest obecność jednego jednolitego piku przesuniętego w lewo na wykresie, przy wielkości około 100 nukleotydów. Niższe stężenie wynika zarówno z utraty RNA podczas fragmentacji, jak i ze zwiększonej objętości próbek (60-100 µL, krok 1.7.1).

Jakość próbek IP i Mock można ocenić za pomocą qRT-PCR. W tym celu zastosowano dodane IVT jako kontrole pozytywne i negatywne: oczekuje się, że zmetylowane IVT, w którym wszystkie pozycje cytozyny zawierają m5C, będzie silnie wzbogacone w próbce IP; przeciwnie, w przypadku niezmetylowanego IVT nie powinno być różnicy między próbką IP a Mock. Primery użyte w analizie qRT-PCR dla dwóch kontrolnych IVT (EGFP i lucyferazy Renilla) wymieniono w Tabeli 1. Rzeczywiście, jak pokazano na Rysunku 3, około 80% zmetylowanego IVT odzyskano w próbce IP, a jedynie około 2% w próbce Mock. Dla kontroli niezmetylowanej odzysk wynosił poniżej 1% w obu próbkach, IP i Mock. Potwierdza to wydajność MeRIP w zakresie wytrącania i wzbogacania zmetylowanych fragmentów RNA i stanowi dobry wskaźnik tego, że próbki mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Ponadto krotność wzbogacenia niezmetylowanego IVT (stosunek IP do Mock) może służyć jako próg do oceny istotności wzbogacenia w analizach qRT-PCR.

Po dopasowaniu odczytów do genomu (Rycina 4), algorytmy wyznaczania szczytów (peak calling) opisane w krokach 3.4.1 i 3.4.2 są stosowane w celu zidentyfikowania statystycznie istotnych okien, wzbogaconych w próbkach IP w porównaniu do próbek Input. Sekwencje odpowiadające tym oknom mogą być wykorzystane w dalszych analizach, na przykład do poszukiwania konserwowanych motywów związanych z metylacją11,17.

Schemat procesu izolacji RNA z dodatkiem IVT spike-in, kulek magnetycznych, trawienia i qRT-PCR.
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja protokołu MeRIP-seq.
Próbki RNA inkubuje się z przeciwciałem przeciwko 5-metylowanym cytyzynom, a kompleksy są wyprecypitowane za pomocą magnetycznych kulek z białkiem G, które wychwytują przeciwciała wraz z wiązanym RNA. Eluowane próbki RNA są analizowane za pomocą sekwencjonowania głębokiego oraz qRT-PCR. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza jakości RNA, elektroferogram, stężenie RNA, wartości RIN, wykres, wynik eksperymentalny.
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki analizy jakości próbek RNA.
(A) Reprezentatywny profil zakwalifikowanej próbki całkowitego RNA roślinnego. (B) Reprezentatywny profil próbki RNA po sonikacji do fragmentów o długości 100 nt. Pliki wynikowe z oprogramowania do elektroforezy kapilarnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy % odzysku wejściowego w zmetylowanych IVT w porównaniu do niezmetylowanych IVT; analiza ekspresji genów.
Rysunek 3: Analiza qRT-PCR kontrolnych IVT.
Zmetylowane i niezmetylowane transkrypty in vitro zostały użyte odpowiednio jako kontrole dodatnia i ujemna w analizie MeRIP. Po immunoprecypitacji zmetylowany IVT jest silnie wzbogacony w próbce IP (kolor zielony), ale nie w próbce Mock (bez przeciwciała anty-m5C; kolor fioletowy). W przypadku niezmetylowanego IVT nie stwierdzono wzbogacenia ani różnic pomiędzy próbką IP a Mock. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat immunoprecypitacji chromatyny; piki sekwencjonowania DNA; analiza sekwencji genetycznej.
Rycina 4: Dopasowanie odczytów przed i po MeRIP wokół reprezentatywnego transkryptu.
Odczyty dopasowane do konkretnego transkryptu w próbce wejściowej (Input, górny rząd) oraz w dwóch powtórzeniach IP (środkowy i dolny rząd). Czarny prostokąt wskazuje zidentyfikowane wzbogacone okno o długości 50 nt na podstawie analiz wyznaczania pików MACS243 oraz MeRIP-seq22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

CelPara starterówSekwencja produktuDługość produktu
EGFPFor: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG
GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG
GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC		72 bp
Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'
Renilla luciferaseFor: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC
ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA
AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC		75 bp
Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'

Tabela 1: Informacje o starterach i produktach otrzymanych w analizie qRT-PCR.

Przepisy na bufory.  Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

RNA przenosi ponad sto różnych modyfikacji zasad4, które tworzą epitranskryptom44. Modyfikacje te dodają dodatkową warstwę regulacji translacji i sygnalizacji (omówione w 5,6,8,20,45,46). Wczesne badania były w stanie wykryć obecność modyfikacji potranskrypcyjnych na RNA28,47, ale specyficzne zmodyfikowane RNA muszą zostać zidentyfikowane, aby zrozumieć rolę epitranskryptomiki. MeRIP został zaprojektowany jako metoda mapowania miejsc metylacji RNA w całym transkryptomie21,22. Można go dostosować do dowolnej modyfikacji, jeśli dostępne jest specyficzne przeciwciało.

Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest stosunkowo prosty, bezpieczny dla RNA i użytkownika (np. 5-azaC jest wysoce toksyczny dla roślin i ludzi) i nie wymaga sekwencji ani modyfikacji informacji o enzymach. Co więcej, wzbogacanie metylowanych RNA przez IP zwiększa szanse na wykrycie mRNA o niskiej obfitości, w przeciwieństwie do sekwencjonowania wodorosiarczynowego, które nie zawiera etapu wzbogacania. Kiedy wykonywane są dwie seryjne rundy MeRIP, wzbogacenie we fragmenty RNA zawierające miejsca metylacji wzrasta o kolejne22. Jednym z ograniczeń MeRIP, zwłaszcza w przypadku zastosowania do badań metylacji mRNA, jest duża ilość RNA wymagana jako dane wejściowe do testu. Etap rybodeplecji – lub wzbogacenia poli(A) – zmniejszy tło spowodowane przez silnie zmodyfikowany rybosomalny RNA, ale usunie ponad 90% całkowitego RNA. DNA musi również zostać całkowicie usunięte, ponieważ jest bogate w 5-metylowane cytozyny. Kolejną wadą jest niższa rozdzielczość dokładnej pozycji metylacji. Sonikacja RNA przed inkubacją z przeciwciałem pomaga w tym kierunku, zawężając region zawierający modyfikację do 100-200 nukleotydów. Gdy MeRIP jest połączony z głębokim sekwencjonowaniem, rozdzielczość przewidywania miejsca m5C wzrasta, ponieważ odczyty sekwencjonowania tworzą rozkład Gaussa wokół potencjalnego miejsca metylacji. Dodatkowo, specyficzność przeciwciała musi zostać potwierdzona przed testem (np. za pomocą testów kropk blot RNA, przeprowadzonych z oligonukleotydami zsyntetyzowanymi ze zmodyfikowanymi nukleotydami), jednak to, w jakim stopniu przeciwciało może faktycznie rozróżnić blisko spokrewnione modyfikacje (np. m6A i m6Am), jest kwestią sporną w polu48, Lokal mieszkalny 49. Co więcej, wysoce ustrukturyzowane RNA mogą zakłócać interakcję przeciwciało-antygen, co jest kolejnym ograniczeniem, które jest najczęściej rozwiązywane za pomocą fragmentacji i denaturacji RNA przed IP. Wręcz przeciwnie, sekwencjonowanie wodorosiarczynów, na które wpływają również struktury drugorzędowe, nie obejmuje etapu fragmentacji, co może być jednym z powodów, które powodują rozbieżność między miejscami m5C a mRNA przewidywanymi przez sekwencjonowanie wodorosiarczynów16 i MeRIP-seq11,17. Inne modyfikacje cytozyny (np. hm5C) są również odporne na deaminację za pośrednictwem wodorosiarczynów35.

Modyfikacje MeRIP-seq obejmują etap sieciowania, albo z wprowadzeniem fotoaktywowanego rybonukleozydu (wspomagany fotolinkowaniem m6A-seq, PA-m6A-seq 50), albo z wykorzystaniem światła UV do tworzenia wiązacji krzyżowych przeciwciało-RNA po IP (miCLIP49, inna metoda niż miCLIP opisana we wstępie30, ale także z rozdzielczością poszczególnych nukleotydów). W przyszłości, wraz z gromadzeniem wiedzy na temat metylacji RNA, preferowane mogą być bardziej ukierunkowane podejścia, oparte na enzymach modyfikujących i/lub sekwencjach konsensusu, w których pojawia się metylacja. Identyfikacja białek czytnikowych ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcji molekularnej i sygnalizacyjnej modyfikacji potranskrypcyjnych. Technologia sekwencjonowania nanoporowego pozwala już na bezpośrednią identyfikację zmodyfikowanych nukleotydów bez uprzedniej obróbki RNA17 , ale wciąż istnieje możliwość poprawy w tej dziedzinie pod względem głębokości sekwencji i analizy bioinformatycznej. Ogólnie rzecz biorąc, MeRIP-seq jest obecnie uznanym, wiarygodnym i bezstronnym podejściem do identyfikacji metylowanych transkryptów RNA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez stypendium doktoranckie IMPRS dla E.S., długoterminowe stypendium EMBO dla V.P. oraz wewnętrzne fundusze MPI-MPP dla F.K. Część tej pracy została również sfinansowana przez PLAMORF, projekt, który otrzymał finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 810131). Autorzy pragną podziękować Federico Apeltowi za analizę bioinformatyczną i komentarze do manuskryptu oraz Mathieu Bahinowi i Amirze Kramdi za analizę bioinformatyczną. Prace w laboratorium Colot są wspierane przez Investissements d'Avenir ANR-10-LABX-54 MEMO LIFE, 506 ANR-11-IDEX-0001-02 PSL* Research University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało anty-m5CZymoResearchA3001 (wycofane), dostępne A3002Klon 10G4 (wycofany), dostępny 7D21
Chip i odczynniki do elektroforezy kapilarnejAgilent5067-1511RNA 6000 Zestaw Nano
DnaseAmbionAM1907TURBO Zestaw bez DNA
Współstrącacz kwasów nukleinowychAmbionAM9515Glycoblue, 15 mg/ml
Zestaw do transkrypcji In vitroPromegaP1300T7 RiboMAX System produkcji RNA na dużą skalę
Probówki reakcyjne o niskim poziomie wiązaniaKisker BiotechG0171,7 ml Mikrowirówki
Białko G Kulki magnetyczneInvitrogen10003DDynabeads Białko G
Proteinaza KAmbionAM254620mg/ml roztwór podstawowy, klasa
Inhibitor RNazyPromegaN2615RNasin Plus 40 U/μ l
Zestaw do usuwania rRNAEpicentreRZPL11016Zestaw do usuwania rRNA Ribo-Zero (liść roślinny)
Rurki sonikacyjneCovaris520045mikrorurka AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap Odczynnik
ekstrakcji RNAOdczynnik TRIzolAmbion
15596018 Sprzęt< / strong>
Maszyna do elektroforezy kapilarnejSystem bioanalizatora AgilentG2939BA2100
Stojak magnetycznyInvitrogen12321DDynaMag-2
MikrowirówkaEppendorfwycofanyz produkcji Model 5417R
RotatorBenchmarkR4040RotoBot Mini
SonicatorCovaris500217S220 Skoncentrowany
spektrofotometrultradźwiękowyThermoFisher ScientificND-ONEC-WNanoDrop Kąpiel wodna OneC
GFL10121012 Kąpiel inkubacyjna
RNA do 6x16mm

Bibliografia

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559(2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630(2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089(2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421(2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602(2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199(2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114(2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20(2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137(2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175(2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 5/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Tagi

MeRIP seqanaliza metylacji RNAwykrywanie modyfikacji m5Cfragmentacja RNAimmunoprecypitacja z u yciem przeciwciakulki z bia kiem Gekstrakcja RNAprotok sonikacjiilo ciowy RT PCR

Powiązane artykuły