Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61244

⸱

6 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geriatrics Research Education and Clinical Center, Veterans Affairs, 2Division of Gerontology and Geriatric Medicine, University of Washington, 3Department of Neurosurgery, University of Florida, 4Department of Neurosurgery, West Virginia University, 5Division of Pharmaceutical Sciences, University of Cincinnati, 6Central Illinois Neuro Health Sciences, Bloomington, IL, 7Neuro-research, Dallas, TX

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj protokół modelu fali uderzeniowej dla gryzoni w celu zbadania neurobiologicznych i patofizjologicznych skutków łagodnego do umiarkowanego urazowego uszkodzenia mózgu. Stworzyliśmy zasilany gazem, laboratoryjny zestaw wyposażony w czujniki ciśnienia, co pozwala na niezawodne i powtarzalne generowanie łagodnych lub umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem.

Streszczenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) to duży problem zdrowia publicznego. Łagodne TBI jest najbardziej rozpowszechnioną formą neurotraumy i odpowiada za dużą liczbę wizyt lekarskich w Stanach Zjednoczonych. Obecnie nie ma zatwierdzonych przez FDA metod leczenia TBI. Zwiększona częstość występowania TBI wywołanego wybuchami w wojsku jeszcze bardziej uwypukla pilną potrzebę skutecznego leczenia TBI. W związku z tym nowe przedkliniczne modele zwierzęce TBI, które podsumowują aspekty TBI związanego z ludzkimi blastami, znacznie przyspieszą wysiłki badawcze nad procesami neurobiologicznymi i patofizjologicznymi leżącymi u podstaw łagodnego i umiarkowanego TBI, a także opracują nowe strategie terapeutyczne TBI.

Tutaj prezentujemy wiarygodny, powtarzalny model do badania molekularnych, komórkowych i behawioralnych skutków łagodnego do umiarkowanego TBI wywołanego blastem. Opisujemy krok po kroku protokół łagodnego TBI wywołanego wybuchem z zamkniętą głowicą u gryzoni przy użyciu konfiguracji laboratoryjnej składającej się z napędzanej gazem rurki uderzeniowej wyposażonej w piezoelektryczne czujniki ciśnienia w celu zapewnienia spójnych warunków testowych. Korzyści płynące z ustalonej przez nas konfiguracji to jej stosunkowo niski koszt, łatwość instalacji, łatwość obsługi i wysoka przepustowość. Dalsze zalety tego nieinwazyjnego modelu TBI obejmują skalowalność nadciśnienia piku wybuchu i generowanie kontrolowanych, powtarzalnych wyników. Odtwarzalność i znaczenie tego modelu TBI zostało ocenione w wielu dalszych zastosowaniach, w tym w analizach neurobiologicznych, neuropatologicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych, wspierając wykorzystanie tego modelu do charakterystyki procesów leżących u podstaw etiologii łagodnego do umiarkowanego TBI.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) odpowiada za ponad dwa miliony wizyt w szpitalu każdego roku w samych Stanach Zjednoczonych. Łagodne TBI często wynikające z wypadków samochodowych, wydarzeń sportowych lub upadków stanowią około 80% wszystkich przypadków TBI1. Łagodne TBI jest uważane za "cichą chorobę", ponieważ pacjenci często nie doświadczają żadnych widocznych objawów w dniach i miesiącach następujących po początkowym znieważeniu, ale mogą rozwinąć poważne powikłania związane z TBI w późniejszym życiu2. Co więcej, łagodne TBI wywołane wybuchem jest powszechne wśród członków służby wojskowej i jest związane z przewlekłą dysfunkcją OUN3,4,5,6. Ze względu na rosnącą częstość występowania łagodnego TBI7,8, przedkliniczne modelowanie procesów neurobiologicznych i patofizjologicznych związanych z łagodnym TBI stało się zatem przedmiotem zainteresowania przy opracowywaniu nowych interwencji terapeutycznych w TBI.

Historycznie rzecz biorąc, badania nad TBI koncentrowały się głównie na ciężkich formach neurourazów, pomimo stosunkowo mniejszej liczby ciężkich przypadków TBI u ludzi. Opracowano przedkliniczne modele gryzoni dla ciężkiego TBI u ludzi, w tym modele kontrolowanego wpływu korowego (CCI)9,10 i płynne urazy udarowe (FPI)11, które są dobrze ugruntowane, aby dawać wiarygodne efekty patofizjologiczne12,13. Modele te położyły podwaliny pod to, co obecnie wiadomo o zapaleniu nerwów, neurodegeneracji i naprawie neuronów w TBI. Chociaż rozwinięto znaczną wiedzę na temat patofizjologii TBI, obecnie nie ma skutecznych, zatwierdzonych przez FDA metod leczenia TBI.

Ostatnio zakres badań nad TBI został poszerzony o szersze spektrum patologii związanych z TBI, a ostatecznym celem jest opracowanie skutecznych interwencji terapeutycznych. Niemniej jednak stworzono niewiele modeli przedklinicznych łagodnego TBI, które wykazały mierzalne efekty, a tylko niewielka liczba badań dotyczyła łagodnego spektrum TBI2,14,15. Ponieważ łagodne TBI stanowi zdecydowaną większość wszystkich przypadków TBI, pilnie potrzebne są wiarygodne modele łagodnego TBI, aby ułatwić badania nad etiologią i neuropatofizjologią stanu ludzkiego w celu opracowania nowych strategii terapeutycznych.

We współpracy z inżynierami biomedycznymi i fizykami lotniczymi ustaliliśmy skalowalny, zamknięty model fali uderzeniowej dla łagodnego do umiarkowanego TBI. Ten przedkliniczny model gryzoni został specjalnie opracowany w celu zbadania wpływu dynamiki siły, w tym fal uderzeniowych i ruchu przyspieszania/zwalniania, które są związane z łagodnym TBI u ludzi uzyskanym w walce wojskowej, imprezach sportowych, wypadkach samochodowych i upadkach. Ponieważ fale uderzeniowe korelują z dynamiką siły, która powoduje łagodne TBI u ludzi, model ten został zaprojektowany w celu wytworzenia spójnego kształtu fali Friedlandera z impulsem, który jest mierzony w funtach na cal kwadratowy (psi)*milisekunda (ms). Poziom impulsu jest skalowany tak, aby spadł poniżej zdefiniowanych krzywych śmiertelności płuc dla myszy i szczurów w celu przeprowadzenia badań przedklinicznych16,17,18. Ponadto model ten pozwala na badanie obrażeń spowodowanych gwałtownym ruchem sił obrotowych głowy zwierzęcia. Ten rodzaj urazu jest nieodłącznie związany z kilkoma typami klinicznych prezentacji TBI, w tym obserwowanymi zarówno w populacjach wojskowych, jak i cywilnych. Dlatego ten wszechstronny model wpisuje się w potrzebę, która obejmuje wiele klinicznych prezentacji TBI.

Prezentowany tutaj model przedkliniczny daje wiarygodne i powtarzalne zmiany patofizjologiczne związane z klinicznym łagodnym TBI, jak wykazano w wielu wcześniejszych badaniach17,19,20,21,22,23. Badania z tym modelem wykazały, że szczury poddane działaniu fali uderzeniowej o niskiej intensywności wykazywały zapalenie nerwów, uszkodzenie aksonów, uszkodzenie mikronaczyń krwionośnych, zmiany biochemiczne związane z uszkodzeniem neuronów oraz deficyty krótkotrwałej plastyczności i pobudliwości synaptycznej19. Jednak ten łagodny model TBI nie wywołał żadnych makroskopowych zmian neuropatologicznych, w tym uszkodzenia tkanek, krwotoku, krwiaka i stłuczenia19, które były powszechnie obserwowane w badaniach z użyciem umiarkowanych do ciężkich inwazyjnych modeli TBI10,24. Poprzednie badania19,21,22,23 wykazały, że ten model przedkliniczny może być wykorzystany do scharakteryzowania procesów neurobiologicznych i patofizjologicznych leżących u podstaw etiologii łagodnego i umiarkowanego TBI17,19,20,21,22,23. Model ten pozwala również na testowanie nowych związków i strategii terapeutycznych, a także identyfikację nowych, odpowiednich celów dla rozwoju skutecznych interwencji TBI19,21,22,23.

Ten model został opracowany do badania efektów wywołanych przez fale uderzeniowe, jak również szybkie siły rotacji na wyniki molekularne, komórkowe i behawioralne u gryzoni. Analogicznie do przedstawionego tutaj modelu fali uderzeniowej, opracowano szereg modeli przedklinicznych, które próbują podsumować łagodne do umiarkowanego TBI za pomocą fal nadciśnienia napędzanych gazem2,14,17,25,26,27,28. Niektóre z ograniczeń innych modeli obejmują: zwierzę jest przymocowane do noszy z siatki drucianej, a głowa jest unieruchomiona po uderzeniu; Narządy obwodowe są narażone na działanie fali oprócz mózgu, co tworzy zmienne zakłócające poliurazu; a modele są duże i nieruchome, co ogranicza zmianę i dostosowanie krytycznych parametrów do lepszych warunków modelowych przypominających ludzkie TBI.

Korzyści płynące z tej stacjonarnej, napędzanej gazem rury amortyzującej to stosunkowo niski koszt zakupu i kosztów eksploatacji, a także łatwość instalacji i użytkowania. Co więcej, konfiguracja pozwala na wysokowydajną pracę i generowanie kontrolowanych, powtarzalnych fal uderzeniowych oraz wyników in vivo zarówno u myszy, jak i szczurów. W celu kontroli stałych warunków testowych (tj. stałej fali uderzeniowej i nadciśnienia) zestaw jest wyposażony w czujniki ciśnienia. Zaletą tego modelu dla TBI jest skalowalność ciężkości urazu oraz to, że łagodne TBI jest indukowane za pomocą nieinwazyjnej procedury z zamkniętą głową. Szczytowe nadciśnienie i wynikające z niego uszkodzenie mózgu zwiększają się wraz z grubszymi membranami poliestrowymi w spójny, skalowalny sposób17. Możliwość skalowania nasilenia TBI na podstawie grubości błony jest użytecznym narzędziem do określenia poziomu, przy którym określone miary wyników (np. zapalenie nerwów) stają się widoczne. Zapewnienie osłony ochronnej dla narządów obwodowych umożliwia również ukierunkowane badanie łagodnych mechanizmów TBI poprzez unikanie lub zmniejszanie zmiennych zakłócających urazem ogólnoustrojowym, takich jak uszkodzenie płuc lub klatki piersiowej. Co więcej, taka konfiguracja pozwala wybrać kierunek, w którym fala uderzeniowa uderza/przenika w głowę (tj. czołowo, z boku, z góry lub pod spodem), a zatem można badać różne rodzaje zniewag wywołujących TBI. Opisana tutaj standardowa procedura wywoływania łagodnego do umiarkowanego TBI wykorzystuje ekspozycję boczną do oceny skutków uszkodzenia przez falę uderzeniową w połączeniu z urazem typu coup i contrecoup spowodowanym szybkimi siłami obrotowymi. Ponadto, w celu zbadania wyłącznie urazów spowodowanych wybuchem, w tym modelu można zastosować ekspozycję na falę uderzeniową od góry do dołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Cincinnati i Uniwersytetu Zachodniej Wirginii. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) i zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Przewodnika Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych.

1. Instalacja zestawu TBI do obróbki strumieniowo-ściernej

  1. Zaopatrz się we wszystkie części robocze, które są wymagane do konfiguracji, w tym: rurę amortyzującą składającą się ze stalowej sekcji napędzanej i sterownika, membranę poliestrową, zabezpieczające, czujniki ciśnienia, osłonę rury z polichlorku winylu (PVC) chroniącą narządy obwodowe, przewód hydrauliczny wysokiego ciśnienia 9,53 mm i szybkozłączki męskie i żeńskie, reduktor gazu o wysokim przepływie oraz butlę z gazem ze wspornikiem do montażu na ścianie (patrz Rysunek 1A, B i Tabela Materiałów).
    UWAGA: Specyfikacje sekcji napędzanej i sterującej użytej tutaj (patrz Rysunek 2 i Tabela materiałów) zostały ustalone w celu wytworzenia spójnej, krótkotrwałej, skalowanej fali uderzeniowej (patrz Rysunek 3C, D) w celu wywołania łagodnego do umiarkowanego TBI u myszy. W tym celu wybrano krótką sekcję zabieraka o konstrukcji stożkowej (stożek 6°). Długość i średnicę sekcji napędzanej i sterującej można modyfikować w celu zbadania fali uderzeniowej29,30,31,32, compression wave18, lub shock wave dynamics33. W przypadku eksperymentów na szczurach wymiary rurki uderzeniowej muszą być dostosowane tak, aby uzyskać porównywalne siły zgodnie z odpowiednimi parametrami skalowania ciała17 (patrz Tabela materiałów).
  2. Zainstaluj poszczególne części robocze zestawu na stołach przesuwnych maszyny, które są zamocowane na stabilnej, łatwej do czyszczenia powierzchni (najlepiej ze stali nierdzewnej do stosowania u gryzoni) w przestrzeni laboratoryjnej zatwierdzonej do eksperymentów na zwierzętach.
    UWAGA: Eksperymenty z falą uderzeniową wytwarzają znaczny poziom hałasu; Dlatego wybierz miejsce w dźwiękochłonnej przestrzeni laboratoryjnej, w którym hałas nie będzie przeszkadzał innym eksperymentom/grupom laboratoryjnym.
    1. Zamocuj osłonę rury PVC prostopadle do układu rurki uderzeniowej, tak aby ciało gryzonia było całkowicie zakryte i wystawała tylko głowa.
      UWAGA: W przypadku opisanej tutaj standardowej procedury wywoływania łagodnego do umiarkowanego TBI, środek głowy znajduje się 5 cm od końca napędzanej sekcji u myszy.
    2. Butla gazowa do montażu na ścianie w pobliżu konfiguracji zgodnie z OSHA i wszystkimi innymi odpowiednimi przepisami bezpieczeństwa.
      UWAGA: Sprężone powietrze, hel lub azot są powszechnie używane do generowania fal uderzeniowych w modelach rur uderzeniowych gryzoni. Wszystkie przedstawione tutaj dane zostały wygenerowane przy użyciu helu, ponieważ gaz ten wytwarza wyższe nadciśnienie w krótszym czasie34, co pozwala na odpowiednie skalowanie dla badanych myszy.

2. Ocena konfiguracji i właściwości fali uderzeniowej za pomocą nagrań z czujnika ciśnienia.

  1. Przygotuj rurkę uderzeniową.
    1. Ostrożnie przeciąć membranę poliestrową bez zginania i tworzenia pęknięć, aby zapewnić równomierne pękanie.
    2. Włóż membranę między sekcję napędzaną a część sterownika. Zabezpiecz sekcje, dokręcając łączące.
    3. Sprawdź, czy system jest szczelny, a membrana jest szczelnie zamocowana między sekcją sterownika a sekcją napędzaną.
    4. Podłącz zbiornik gazu za pomocą wysokociśnieniowego węża hydraulicznego 9,53 mm i szybkozłączek do rury amortyzatora
      UWAGA: Sekcje napędowe i napędzane są obrabiane z zachowaniem precyzyjnych tolerancji, aby zapewnić pełne uszczelnienie membrany między sekcjami. Pozwala to na brak wycieków gazu i wyklucza stosowanie jakiejkolwiek formy materiału uszczelki/o-ringu oraz pozwala na większą spójność generowanego kształtu fali.
  2. Zainstaluj czujniki ciśnienia do monitorowania fal uderzeniowych (patrz Rysunek 1C).
    1. Umieść jeden czujnik ciśnienia w obszarze umieszczenia głowicy, a trzy czujniki na wyjściu rurki uderzeniowej (patrz Rysunek 1C i 2).
    2. Rozpocznij nagrywanie z czujników ciśnienia, tuż przed wykonaniem fali uderzeniowej. Rejestruj dane dotyczące fal ciśnienia z prędkością 500 000 klatek na sekundę za pomocą kondycjonera sygnału czujnika i karty akwizycji danych (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Nosić nauszniki zatwierdzone przez OHSA, aby zapewnić odpowiednią ochronę słuchu.
    3. Całkowicie otwórz główny zawór zbiornika sprężonego gazu, aby przepływ gazu wytworzył nagły, szybki skok ciśnienia.
      UWAGA: Nadciśnienie gazu rozrywa membranę poliestrową, uwalniając falę uderzeniową, która przechodzi w falę ściskającą w sekcji napędzanej i wychodzi z rurki w kierunku obszaru umieszczenia głowicy.
    4. Natychmiast po zabiegu należy wyłączyć dopływ gazu.
      UWAGA: Zestaw może być wyposażony w zawór ze sprężyną powrotną, który automatycznie i szybko zatrzymuje przepływ gazu.
    5. Analizuj nagrania fal ciśnienia za pomocą niestandardowego napisanego programu komputerowego, aby określić szczytowe nadciśnienie i wykres danych. Dane mogą być przedstawiane na wykresach z każdym czujnikiem osobno lub nakładane na siebie, aby zademonstrować płaskość generowanej fali (patrz Rysunek 3C,D).
      UWAGA: Technicznie rzecz biorąc, analizę można przeprowadzić przy użyciu łatwiej dostępnego oprogramowania, ale ze względu na duże zbiory danych programy te mają duże opóźnienia w generowaniu wykresów.
  3. Ustal warunki eksperymentalne, które są odpowiednie dla celu wyznaczonego badania TBI i potwierdź, że model wytwarza stałą falę uderzeniową o szczytowym nadciśnieniu, czasie trwania i pomiarze impulsu porównywalnym z falą Friedlandera (patrz Rysunek 3). Sprawdź te parametry za pomocą wyżej wymienionego oprogramowania komputerowego.
    1. Skalibruj konfigurację, powtarzając kroki od 2.1.1. do 2.2.5. i użyj zapisów fal ciśnienia, aby określić, czy konfiguracja wymaga regulacji (dla reprezentatywnych danych patrz Rysunek 3).
    2. Zmodyfikuj konfigurację (w razie potrzeby).
      UWAGA: Właściwości fali uderzeniowej można dostosować poprzez drobne modyfikacje konfiguracji. Na przykład odległość głowicy od końca napędzanej sekcji wpływa na siłę fali uderzeniowej na poziomie głowicy. Grubość membrany poliestrowej określa poziom szczytowego nadciśnienia, przy czym grubsze membrany zwiększają poziomy szczytowe (patrz Rysunek 3A,B). Dodatkowo konfiguracja pozwala wybrać kierunek, w którym fala uderzeniowa uderza/przenika do głowy (tj. czołowo, z boku, na górze lub pod spodem), dzięki czemu można badać różne aspekty, takie jak uraz spowodowany samą falą uderzeniową lub w połączeniu z obrażeniami spowodowanymi przez szybkie siły obrotowe.
    3. Powtórz kroki od 2.1.1 do 2.2.4, aby ustalić pożądane właściwości fali uderzeniowej (jeśli jest to konieczne) i kontrolować odtwarzalność.
    4. Powtórz kroki od 2.1.1 do 2.2.4 z membranami poliestrowymi o różnej grubości, aby ocenić skalowalność konfiguracji (dla reprezentatywnych danych patrz Rysunek 3A,B).

3. Przygotowanie zestawu doświadczalnego i indukcja łagodnego TBI u gryzoni

UWAGA: Przenieś gryzonie do obszaru przetrzymywania 30 minut do 1 godziny przed rozpoczęciem eksperymentów TBI, aby się zaaklimatyzować. Wybierz obszar trzymania, na który minimalnie wpływa hałas zabiegu.

  1. Przygotuj wszystkie materiały potrzebne do eksperymentu i sprawdź konfigurację pod kątem prawidłowej instalacji (np. Dostosuj parametry zgodnie z celem badania) (~5 – 10 minut).
    UWAGA: Stopień obrażeń można dostosować, wybierając grubość membrany poliestrowej. Na podstawie naszych badań, grubość membrany od 25,4 do 102 μm jest stosowana do łagodnego do umiarkowanego TBI u myszy35. Wcześniej używaliśmy membran o grubości od 76,2 do 127 μm do wytwarzania łagodnego do umiarkowanego TBI u szczurów19.
    1. Ostrożnie odetnij membranę poliestrową, włóż ją między sekcję napędzaną i napędową i zabezpiecz, dokręcając łączące.
    2. Podłącz zbiornik gazu do rurki amortyzatora za pomocą szybkozłączek. Upewnij się, że membrana jest szczelnie zamocowana między sekcją napędową a napędzaną.
    3. Umieść trzy czujniki ciśnienia na wyjściu rurki uderzeniowej, w odległości 120° od siebie, aby monitorować właściwości fali uderzeniowej podczas indukcji TBI, jak opisano w krokach 2.2.2 i 2.2.5.
    4. Upewnij się, że odległość od końca rurki uderzeniowej jest prawidłowa dla każdego obiektu za pomocą zainstalowanego mikrometru. Utrzymuj stałą pozycję głowy gryzonia (tj. pozycję, odległość) w badaniach, aby umożliwić spójną ocenę urazu.
      UWAGA: Jak stwierdzono w 1.2.1., różne rodzaje urazów można wywołać, wybierając kierunek, w którym fala uderzeniowa uderza w głowę. W opisanej tutaj procedurze wywoływania łagodnego do umiarkowanego TBI, ciało umieszcza się prostopadle do rurki uderzeniowej, w którą fala uderzeniowa uderza w bok głowy. W tym ustawieniu głowa ma swobodę ruchów, a zatem jest wystawiona na działanie fali uderzeniowej i szybkich sił obrotowych, co pozwala na generowanie efektów zamachu i kontrataku.
    5. Zainicjuj rejestrację z czujników ciśnienia za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (GUI) oprogramowania.
  2. Znieczulenie i ułożenie gryzoni w konfiguracji
    1. Przenieś gryzonie z pomieszczenia przetrzymywania i wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu w tlenie i utrzymuj za pomocą 2% izofluranu w tlenie, aby zmniejszyć stres i ból.
      UWAGA: Przed kontynuowaniem upewnij się, że zwierzę nie reaguje na szczypanie palca u nóg lub ogona. Upewnij się, że indukcja znieczulenia jest spójna dla wszystkich zwierząt doświadczalnych, w tym dla pozorowanych grup kontrolnych. Ta procedura wymaga niskiego poziomu i krótkiego czasu znieczulenia.
    2. Umieść w pełni znieczulonego gryzonia w osłonie rury PVC z amortyzacją, aby chronić narządy obwodowe przed falą uderzeniową.
      UWAGA: Osoby kontrolne są znieczulane i umieszczane w pobliżu zestawu, ale nie są bezpośrednio poddawane działaniu fali uderzeniowej. Upewnij się, że elementy sterujące są narażone na hałas generowany przez rurkę uderzeniową.
    3. Umieść głowę gryzonia w obszarze ułożenia głowy i podeprzyj ją od dołu, za pomocą podpory wbudowanej bezpośrednio w aparat ekranujący lub gaziku. Określ ułożenie głowy zgodnie z anatomią każdego gryzonia, z kłykciem potylicznym wyrównanym z krawędzią osłony ochronnej.
      UWAGA: Unikaj kierowania fali ciśnienia bezpośrednio w kierunku pnia mózgu, aby zmniejszyć śmiertelność. Wiadomo, że uraz centrum oddechowego pnia mózgu i rdzenia kręgowego szyjnego przyczynia się do nieprawidłowości oddychania, a nawet śmierci w modelach gryzoni TBI36,37,38.
  3. Narażenie gryzoni na falę uderzeniową.
    1. Szybko otwórz główny zawór zbiornika sprężonego gazu, aby wytworzyć skok ciśnienia, który rozrywa membranę i wytwarza głośną eksplozję, która potwierdza powstanie fali ciśnienia. Membrana zostanie wizualnie pęknięta po usunięciu po eksperymencie.
      UWAGA: Szybka kamera może być użyta do uchwycenia skutków przewrotu i odzysku przyspieszenia obrotowego doświadczanego przez gryzonia w celu dalszej analizy.
    2. Wyłącz dopływ gazu natychmiast po usłyszeniu eksplozji.
  4. Powrót do zdrowia po ekspozycji na falę uderzeniową
    1. Po wystawieniu na działanie fali uderzeniowej wyjmij gryzonia z aparatu i umieść go na płaskiej powierzchni bezpośrednio przylegającej do rurki uderzeniowej po ich boku.
    2. Monitoruj pacjentów, aby określić czas odruchu prostowania (RRT). Użyj stopera, aby zarejestrować czas od ekspozycji na falę uderzeniową, aż odzyskają naturalny odruch prostowania. (patrz Rysunek 4A).
    3. Gdy tylko badani odzyskają odruch prostowania, umieść ich w odpowiedniej klatce domowej, gdzie są monitorowani pod kątem działań niepożądanych (tj. drgawek, trudności w oddychaniu, krwawienia z otworu ciała) przez następne 24 godziny.
    4. Po początkowym okresie monitorowania osoby badane mogą być analizowane przy użyciu różnych testów biochemicznych, neuropatologicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych wybranych przez badacza (patrz poniżej).
  5. Przygotuj konfigurację i miejsce na następny eksperyment.
    1. Wyczyść konfigurację detergentem, aby usunąć nieprzyjemny zapach.

4. Dalsze zastosowania dla gryzoni narażonych na działanie fal uderzeniowych/sił obrotowych i kontroli

UWAGA: W poprzednich badaniach, efekty łagodnego do umiarkowanego TBI w różnych punktach czasowych po ekspozycji na falę uderzeniową i siły rotacji były oceniane u gryzoni za pomocą dalszych zastosowań, w tym analiz biochemicznych, neuropatologicznych, neurofizjologicznych i behawioralnych19.

  1. Analiza biochemiczna
    1. W określonych punktach czasowych eksperymentu (godziny do dni po łagodnym TBI) należy pobrać tkankę (np. mózg, krew) do analizy biochemicznej przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano19.
    2. Wykorzystać tkankę do analizy biochemicznej (tj. immunoblottingu, ELISA itp.), aby ocenić wpływ łagodnego TBI na procesy neurobiologiczne i patofizjologiczne.
  2. Analiza neuropatologiczna
    1. W określonych eksperymentalnych punktach czasowych (godziny do dni po łagodnym TBI) perfuzjuj gryzonie przezsercowo roztworem soli fizjologicznej, a następnie 4% roztworem paraformaldehydu, aby utrwalić tkankę zgodnie z opisem19.
      UWAGA: Niektóre aplikacje nie są kompatybilne z utrwalaniem paraformaldehydu (np. barwienie srebrem, niektóre przeciwciała immunohistochemiczne).
    2. Użyj perfundowanej, utrwalonej tkanki do analiz anatomicznych, histologicznych i molekularnych, aby ocenić zmiany neuropatologiczne związane z łagodnym TBI, w tym zapalenie nerwów, neurodegenerację i zmiany neurochemiczne, jak opisano19.
  3. Analiza neurofizjologiczna w wycinkach mózgu
    1. W określonych punktach czasowych eksperymentu (godziny do dni po łagodnym TBI) złóż w ofierze gryzonie przez ścięcie, usuń mózg i przygotuj plasterki mózgu zgodnie z opisem19.
    2. Wykonaj zapisy elektrofizjologiczne zgodnie z opisem19, aby ocenić wpływ łagodnego TBI na podstawowe właściwości synaptyczne i plastyczność synaptyczną.
  4. Analiza behawioralna
    1. W określonych eksperymentalnych punktach czasowych (godziny do dni po łagodnym TBI) oceń wydajność behawioralną, w tym funkcje motoryczne (np. otwarte pole, rotarod, aktywność lokomotoryczna; zobacz Rysunek 4D) oraz uczenie się i pamięć (np. warunkowanie strachu, labirynt Barnesa, labirynt wodny Morrisa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skalowalność układu fali uderzeniowej została przetestowana przy użyciu trzech różnych grubości membran: 25,4, 50,8 i 76,2 μm. Poziomy ciśnienia szczytowego oceniano w obszarze umieszczenia głowy oraz na wylocie aparatury rury uderzeniowej przy użyciu piezoelektrycznych czujników ciśnienia (patrz Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Ciśnienia szczytowe wzrastały zgodnie z grubością membrany w obu lokalizacjach czujników (Rysunek 3A,B<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj przedkliniczny model łagodnego TBI, który jest opłacalny, łatwy do skonfigurowania i wykonania oraz pozwala na uzyskanie wysokowydajnych, wiarygodnych i powtarzalnych wyników eksperymentalnych. Model ten zapewnia osłonę ochronną narządów obwodowych, aby umożliwić ukierunkowane badanie łagodnych mechanizmów TBI, jednocześnie ograniczając zmienne zakłócające urazy ogólnoustrojowe. Natomiast inne modele wybuchów są znane z tego, że powodują uszkodzenia narządów obwodowych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy R. Gettensowi, N. St. Johnsowi, P. Bennetowi i J. Robsonowi za ich wkład w rozwój modelu TBI. Granty NARSAD dla młodych badaczy z Brain & Behavior Research Foundation (F.P. i M.J.R.), grant badawczy z Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease (F.P.) oraz PhRMA Foundation Award (M.J.R.) wsparły te badania. Praca ta była wspierana przez stypendia przeddoktoranckie Amerykańskiej Fundacji Edukacji Farmaceutycznej (A.F.L i B.P.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wysokociśnieniowy wąż hydrauliczny 3/8 SAEEaton AeroquipR2-6-6-36MDostępne w Grainger
3/8'' Szybkozłączki żeńskie Wtyki żeńskieKarcherKAR 86410440
3/8'' Szybkozłączki męskieKarcherKAR 86410440
ANY-labirynt oprogramowanie do śledzenia wideoStoelting Co.Oprogramowanie ANY-labirynt
Przezroczysta membrana MylarePlastics.comPOLYCLR0.003http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Przezroczysta membrana Mylar sprzedawana jest w różnych grubościach. Wszystkie są sprzedawane przez dostawców wymienionych powyżej.
Złożony stół przesuwny (X2)Grizzly IndustrialG5757
Zawór kulowy do kontroli gazu DeadmanConeraco Inc.71-502-01"Apollo", dostępny w Grainger
Sterownik i sekcja napędzana (mysz)własny projekt/produkcjanie dotyczyW celu uzyskania dalszych informacji prosimy o kontakt z autorami
Sterownik i sekcja napędzana (szczur)własny projekt/produkcjanie dotyczyW celu uzyskania dalszych informacji prosimy o kontakt z
autorami Nauszniki przeciwhałasowe3M37274Dostępne w Grainger
Reduktor gazu - Hi Flow 3500-600-580Harris3003539
Helium GasAirGas HE 300Zbiorniki są dostępne w różnych rozmiarach
System znieczulenia wziewnegoVetEquip901806
Moduł wejściowyNational InstrumentsNI 9223
IsofluraneBaxterNDC 10019-360-40Zamówione przez lekarza weterynarii
Zegar laboratoryjny/stoperFisher Scientific50-550-352
Labview wersja 12.0Oprogramowanie do pozyskiwania danychNational Instruments
Magnetyczny wskaźnik zegarowy/mikrometrGrizzly IndustrialG9849
MATLABMathWorksOprogramowanie do analizy zapisu ciśnienia
Regulator tlenuMedlineHCS8725M
Komputer do przetwarzania danych
- 25,4 mmFORMUFITP001FGP-WH-40x3
Czujniki ciśnieniaPCB Piezotronics102A05
Odbiornik Obudowa USBNational InstrumentsDAQ-9171
Kondycjoner sygnału czujnikaPCB Piezotronics482C
seriesStół montażowy ze stali nierdzewnej NSFGridmannGR06-WT2448
Klucz imbusowy z uchwytem T - 3/16''S& K73310
Rurki z polichlorku winylu Dell

Bibliografia

  1. Bazarian, J. J., et al. Mild traumatic brain injury in the United States, 1998--2000. Brain Injury. 19 (2), 85-91 (2005).
  2. Meabon, J. S., et al. Repetitive blast exposure in mice and combat veterans causes persistent cerebellar dysfunction. Science Translational Medicine. 8 (321), (2016).
  3. Mac Donald, C. L., et al. Detection of blast-related traumatic brain injury in U.S. military personnel. New England Journal of Medicine. 364 (22), 2091-2100 (2011).
  4. Fischer, B. L., et al. Neural activation during response inhibition differentiates blast from mechanical causes of mild to moderate traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (2), 169-179 (2014).
  5. Peskind, E. R., et al. Cerebrocerebellar hypometabolism associated with repetitive blast exposure mild traumatic brain injury in 12 Iraq war Veterans with persistent post-concussive symptoms. Neuroimage. 54, Suppl 1 76-82 (2011).
  6. Jorge, R. E., et al. White matter abnormalities in veterans with mild traumatic brain injury. American Journal of Psychiatry. 169 (12), 1284-1291 (2012).
  7. Hoge, C. W., et al. Mild traumatic brain injury in U.S. Soldiers returning from Iraq. New England Journal of Medicine. 358 (5), 453-463 (2008).
  8. Eskridge, S. L., et al. Injuries from combat explosions in Iraq: injury type, location, and severity. Injury. 43 (10), 1678-1682 (2012).
  9. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. Journal of Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
  10. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
  11. McIntosh, T. K., et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28 (1), 233-244 (1989).
  12. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22 (1), 42-75 (2005).
  13. Osier, N., Dixon, C. E. Mini Review of Controlled Cortical Impact: A Well-Suited Device for Concussion Research. Brain Sciences. 7 (7), (2017).
  14. Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Science Translational Medicine. 4 (134), (2012).
  15. Rodriguez-Grande, B., et al. Gliovascular changes precede white matter damage and long-term disorders in juvenile mild closed head injury. Glia. 66 (8), 1663-1677 (2018).
  16. Bowen, I. G., Fletcher, E. R., Richmond, D. R., Hirsch, F. G., White, C. S. Biophysical mechanisms and scaling procedures applicable in assessing responses of the thorax energized by air-blast overpressures or by nonpenetrating missiles. Annals of the New York Academy of Sciences. 152 (1), 122-146 (1968).
  17. Turner, R. C., et al. Modeling clinically relevant blast parameters based on scaling principles produces functional & histological deficits in rats. Experimental Neurology. , 520-529 (2013).
  18. Lucke-Wold, B. P., et al. Elucidating the role of compression waves and impact duration for generating mild traumatic brain injury in rats. Brain Injury. 31 (1), 98-105 (2017).
  19. Hernandez, A., et al. Exposure to mild blast forces induces neuropathological effects, neurophysiological deficits and biochemical changes. Molecular Brain. 11 (1), 64(2018).
  20. Bittar, A., et al. Neurotoxic tau oligomers after single versus repetitive mild traumatic brain injury. Brain Communications. 1 (1), (2019).
  21. Logsdon, A. F., et al. Salubrinal reduces oxidative stress, neuroinflammation and impulsive-like behavior in a rodent model of traumatic brain injury. Brain Research. 1643, 140-151 (2016).
  22. Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1119-1134 (2015).
  23. Logsdon, A. F., et al. Altering endoplasmic reticulum stress in a model of blast-induced traumatic brain injury controls cellular fate and ameliorates neuropsychiatric symptoms. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 421(2014).
  24. Dixon, C. E., et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. Journal of Neurosurgery. 67 (1), 110-119 (1987).
  25. Long, J. B., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
  26. Budde, M. D., et al. Primary blast traumatic brain injury in the rat: relating diffusion tensor imaging and behavior. Frontiers in Neurology. 4, 154(2013).
  27. Genovese, R. F., et al. Effects of mild TBI from repeated blast overpressure on the expression and extinction of conditioned fear in rats. Neuroscience. 254, 120-129 (2013).
  28. Kuriakose, M., Rama Rao, K. V., Younger, D., Chandra, N. Temporal and Spatial Effects of Blast Overpressure on Blood-Brain Barrier Permeability in Traumatic Brain Injury. Scientific Reports. 8 (1), 8681(2018).
  29. Cernak, I., et al. The pathobiology of blast injuries and blast-induced neurotrauma as identified using a new experimental model of injury in mice. Neurobiology of Disease. 41 (2), 538-551 (2011).
  30. Prima, V., Serebruany, V. L., Svetlov, A., Hayes, R. L., Svetlov, S. I. Impact of moderate blast exposures on thrombin biomarkers assessed by calibrated automated thrombography in rats. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1881-1887 (2013).
  31. Mishra, V., et al. Primary blast causes mild, moderate, severe and lethal TBI with increasing blast overpressures: Experimental rat injury model. Scientific Reports. 6, 26992(2016).
  32. Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit, and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
  33. Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. Public Library of Science One. 11 (9), 0161597(2016).
  34. Panzer, M. B., et al. A Multiscale Approach to Blast Neurotrauma Modeling: Part I - Development of Novel Test Devices for in vivo and in vitro Blast Injury Models. Frontiers in Neurology. 3, 46(2012).
  35. Logsdon, A. F., et al. A mouse Model of Focal Vascular Injury Induces Astrocyte Reactivity, Tau Oligomers, and Aberrant Behavior. Archives of Neuroscience. 4 (2), (2017).
  36. Lee, M. C., Klassen, A. C., Heaney, L. M., Resch, J. A. Respiratory rate and pattern disturbances in acute brain stem infarction. Stroke. 7 (4), 382-385 (1976).
  37. Ikeda, K., et al. The respiratory control mechanisms in the brainstem and spinal cord: integrative views of the neuroanatomy and neurophysiology. Journal of Physiological Sciences. 67 (1), 45-62 (2017).
  38. Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475 (7355), 196-200 (2011).
  39. Logsdon, A. F., et al. Blast exposure elicits blood-brain barrier disruption and repair mediated by tight junction integrity and nitric oxide dependent processes. Scientific Reports. 8 (1), 11344(2018).
  40. Logsdon, A. F., et al. Nitric oxide synthase mediates cerebellar dysfunction in mice exposed to repetitive blast-induced mild traumatic brain injury. Scientific Reports. 10 (1), 9420(2020).
  41. Huber, B. R., et al. Blast exposure causes dynamic microglial/macrophage responses and microdomains of brain microvessel dysfunction. Neuroscience. 319, 206-220 (2016).
  42. Gama Sosa, M. A., et al. Low-level blast exposure disrupts gliovascular and neurovascular connections and induces a chronic vascular pathology in rat brain. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 6(2019).
  43. Abutarboush, R., et al. Exposure to Blast Overpressure Impairs Cerebral Microvascular Responses and Alters Vascular and Astrocytic Structure. Journal of Neurotrauma. 36 (22), 3138-3157 (2019).
  44. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews: Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  45. Petraglia, A. L., et al. Concussion in the absence of head impact: a case in a collegiate hammer thrower. Current Sports Medicine Reports. 14 (1), 11-15 (2015).
  46. Viano, D. C., Casson, I. R., Pellman, E. J. Concussion in professional football: biomechanics of the struck player--part 14. Neurosurgery. 61 (2), 313-327 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urazy TBI z zamkni ciem czaszkimodel TBI u gryzonikonfiguracja rury uderzeniowejmonitorowanie czujnikiem ci nieniaskalowalno ci nienia szczytowegoocena odruchu prostowaniaanaliza neurostanu zapalnegoprotok oceny behawioralnej
Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.