Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Podsumowanie

Poliploidyzacja wywołana raną to zachowana strategia naprawy tkanek, w której komórki rosną zamiast dzielić, aby zrekompensować utratę komórek. Oto szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać muszkę owocową jako model do pomiaru ploidalności i jej regulacji genetycznej w naprawie ran nabłonkowych.

Streszczenie

Poliploidia jest częstym zjawiskiem, którego wpływ na zdrowie organizmu i choroby jest nadal słabo poznany. Komórka jest definiowana jako poliploidalna, jeśli zawiera więcej niż diploidalną kopię swoich chromosomów, co jest wynikiem endoreplikacji lub fuzji komórek. Stwierdzono, że w naprawie tkanek poliplooidyzacja indukowana ranami (WIP) jest konserwatywną strategią gojenia od muszek owocowych do kręgowców. WIP ma kilka zalet w stosunku do proliferacji komórek, w tym odporność na wzrost onkogenny i stres genotoksyczny. Wyzwaniem było określenie, dlaczego powstają komórki poliploidalne i jak funkcjonują te unikalne komórki. Dostarczono szczegółowy protokół do badania WIP w nabłonku dorosłej muszki owocowej, w którym komórki poliploidalne są generowane w ciągu 2 dni po ranie kłutej. Korzystając z obszernego zestawu narzędzi genetycznych D. melanogaster, zaczęto identyfikować geny niezbędne do inicjowania i regulowania WIP, w tym Myc. Dalsze badania z wykorzystaniem tej metody mogą ujawnić, w jaki sposób inne zmienne genetyczne i fizjologiczne, w tym płeć, dieta i wiek, regulują i wpływają na funkcję WIP.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster to atrakcyjny system modelowy do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów naprawy ran nabłonkowych. Podobnie jak u ssaków, stosowane mechanizmy naprawy tkanek zależą zarówno od tkanki, jak i jej etapu rozwoju. Bezbliznowe gojenie się ran zachodzi w zarodku muszki owocowej, gdzie na krawędzi czołowej nabłonka tworzy się "sznurek torebki" aktomiozyny, umożliwiając płynne zamknięcie rany^1,2. Gojenie się ran po zarodku u larw, poczwarek i dorosłych muszek owocowych powoduje przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, tworzenie blizn melaniny i wzrost komórek nabłonkowych^3,4,5,6. Komórki nabłonkowe zwiększają swój rozmiar w wyniku fuzji komórek i endocyklu, niepełnego cyklu komórkowego, który omija mitozę^3,4,7,8. W rezultacie utrata komórek jest kompensowana przez wzrost komórek poliploidalnych, a nie przez podział komórek. Dorosły osobnik tylny, jelito środkowe i nabłonek mieszków włosowych również polegają na wzroście komórek poliploidalnych, aby skompensować utratę komórek po uszkodzeniu tkanki^9,10,11.

Poliploidia jest dobrze znanym aspektem rozwoju organizmów u roślin i owadów, ale w ciągu ostatnich kilku lat stało się bardziej oczywiste, że poliploidia jest konserwatywną strategią naprawy tkanek u kręgowców¹². Danio pręgowany, który ma zdolność regeneracji serca, polega na wzroście komórek poliploidalnych, aby leczyć uszkodzone nasierdzie¹³. Poliploidalność przyczynia się również do regeneracji wątroby ssaków i naprawy nabłonka kanalików nerkowych po ostrym urazie^14,15. W tych przykładach komórki poliploidalne są generowane przez endoreplikację poprzez endocykl lub endomitozę, co skutkuje komórką dwujądrową z powodu blokady cytokinezy¹². Zagadką jest, dlaczego komórki poliploidalne powstają podczas gojenia się ran i jak poliploidalność wpływa na funkcję tkanek. Ostatnie badania dostarczyły nowych informacji na pytanie, czy poliploidalność ma zaletę czy wadę leczniczą. W episierdziu danio pręgowanego poliploidalność zwiększała szybkość gojenia się ran¹³. Stwierdzono, że u D. melanogaster w jelicie tylnym i wątrobie ssaków poliploidalność chroni przed wzrostem onkogennym^11,14. W nabłonku dorosłej muchy stwierdzono niedawno, że poliploidalność umożliwia gojenie się ran w obecności stresu genotoksycznego¹⁶. Endoreplikacja jest odporna na uszkodzenia DNA, co pozwala na gojenie się ran, gdy proliferacja komórek byłaby zagrożona¹⁷. Jednak w przypadku kardiomiocytów w sercach myszy i danio pręgowanego poliploidalność spowalnia gojenie, co skutkuje zwiększonym tworzeniem blizn^18,19. Dlatego, w zależności od narządu i/lub typu komórki, poliploidalność może być korzystną lub szkodliwą strategią naprawy tkanek. Dostępność genetyki D. melanogaster w połączeniu z analizą odpowiedzi na poliploidyzację indukowaną raną (WIP) sprawia, że jest to idealny system modelowy do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i komórkowych, które kierują tą strategią gojenia się ran.

Tutaj prezentujemy protokół analizy WIP w nabłonku dorosłego D. melanogaster. Dołączone są instrukcje dotyczące uszkadzania muszek owocowych, preparowania, barwienia immunologicznego, montowania, obrazowania i analizy ponownego nabłonkowania, fuzji komórek i endoreplikacji (ploidalności). Obrazowanie i analizę ploidalną można również dostosować do innych modeli w celu sprawdzenia, czy występuje WIP. Należy zauważyć, że wraz ze wzrostem zawartości jądrowego DNA często następuje odpowiedni wzrost wielkości jądra. Istnieje jednak wiele przykładów w biologii, gdzie rozmiar jądra nie odzwierciedla odpowiedniej zmiany w ploidy²⁰. Jeszcze większą ostrożność należy zachować przy interpretacji wielkości jądra w kontekście środowiska rany, w którym komórki często rozprzestrzeniają się lub rozciągają, aby pokryć miejsce rany. Dlatego jedynym ostatecznym dowodem zmiany w ploidalności jest zmierzenie zawartości DNA tą metodą (lub innymi, takimi jak sekwencjonowanie całego genomu)²¹. Metoda ta zwiększa przydatność dorosłego nabłonka brzusznego D. melanogaster jako modelu do badania roli i regulacji poliploidalności w gojeniu się ran.

Protokół

1. Inscenizacja i ranienie dorosłych muszek owocowych

1. Wybierz wybrany szczep D. melanogaster (tj. szczep epi-Gal4/ UAS, patrz Tabela Materiałów).
   UWAGA: W tym przypadku system Gal4/UAS jest używany do umożliwienia ekspresji genu specyficznego dla nabłonka (epi-Gal4) genu lub RNAi kodowanego za UAS. W badaniu wykorzystano fluorescencyjne białko błonowe (UAS-Cd8.mRFP), induktor mitotyczny (UAS-fzr^RNAi, UAS-stg) i inhibitor WIP (UAS-E2F1^RNAi; UAS-Rac^DN).
2. Zebrać dwie fiolki po 10-15 nowo zamkniętych samic muszki owocowej i dojrzewać na fiolkach ze świeżą żywnością w temperaturze 25 °C do 3-5 dnia życia. Jedna fiolka będzie służyć jako nieuszkodzona kontrola, a druga fiolka zostanie zraniona, jak opisano poniżej. Samice much powinny być utrzymywane z samcami (~5/fiolkę).
3. Aby nawinąć muchy, zmontuj kilka uchwytów na szpilki, każdy z pojedynczym kołkiem ze stali nierdzewnej 0,10 mm. Upewnij się, że ostry koniec kołka jest skierowany na zewnątrz. Szpilki mogą się łatwo wygiąć lub odprysnąć po przebiciu rozporka, a haczykowate lub uszkodzone szpilki należy wyrzucić.
4. Znieczulenie starych samic muszek owocowych na podkładce CO_2-fly pod mikroskopem stereoskopowym i wyrównanie ich w rzędzie za pomocą pędzla. Nosząc okulary ochronne, trzymając uchwyt na szpilkę w jednej ręce i kleszcze w drugiej, użyj kleszczy, aby ustawić muchę z brzusznym brzuchem skierowanym do góry.
5. Nakłuć dorosłą samicę muchy w obszarze opłucnej nabłonka tergitu A4 po obu stronach sternitów brzusznej linii środkowej (Ryc. 1A). Nakłucie tego obszaru brzusznego zapewnia optymalną przestrzeń z dala od miejsc rozwarstwienia, w których krawędzie tkanek zostaną rozerwane przez obróbkę mechaniczną.
6. Zwróć ranne muchy do fiolki z jedzeniem i wiek do pożądanego dnia po urazie (dpi). Gojenie się ran nabłonkowych rozpoczyna się od 1 dpi, a kończy po 3 dpi. Endoreplikacja osiąga szczyt przy 2 dpi, co jest idealne dla testu EdU (sekcja 4, Rysunek 2).

2. Sekcja brzucha muchy

UWAGA: Podczas tego kroku ważne jest, aby unikać dotykania brzusznej tkanki brzusznej narzędziami do preparowania, ponieważ naruszy to integralność nabłonka.

1. Zaopatrz się we wszystkie materiały potrzebne do sekcji: roztwór Grace, kleszcze, nożyczki sprężynowe Vanny, szpilki 0,10 mm, płytki preparacyjne, 9-dołkowe szklane naczynie preparacyjne, roztwór utrwalający (4% paraformaldehydu w 1x PBS), 1x PBS, chusteczki, pipety i końcówki do 30 μm oraz rękawiczki (patrz Tabela materiałów).
2. Potwierdź, że muchy zostały skutecznie zranione, znieczulając ranne muchy na podkładce CO_2-fly pod mikroskopem stereoskopowym i sprawdzając obecność blizny po ranie (tj. plamki melaniny na brzuchu, patrz Rysunek 1B). Odrzuć wszystkie muchy z grupy eksperymentalnej, które nie zostały skutecznie zranione.
3. Aby rozpocząć sekcję, napełnij jedną studzienkę z 9-dołkowego szklanego naczynia do sekcji roztworem Grace. Użyj kleszczy, aby chwycić ranną samicę muchy za grzbietową stronę klatki piersiowej i zanurz muchę w studzience zawierającej roztwór Grace.
4. Używając kleszczy w przeciwnej ręce, nie zwalniając klatki piersiowej, nakłuj naskórek grzbietowy poniżej tergitu A6 i oderwij naskórek od tylnego końca muszki owocowej. Narządy wewnętrzne (jajnik i jelito) zwykle wychodzą na tym etapie. Jeśli nie, delikatnie popchnij kleszczami grzbietową stronę brzucha, aby wycisnąć pozostałe narządy i wyrzucić do pustej studzienki.
5. Oderwij cały brzuch na skrzyżowaniu klatki piersiowej powyżej tergitu A2 za pomocą kleszczy i przenieś brzuch do pustej studzienki zawierającej ~100 μl roztworu Grace.
6. Powtarzaj kroki 2.3-2.5, aż wszystkie odwłoki much zostaną wycięte.
7. Zmniejsz objętość roztworu Grace do 30 μl w studzience zawierającej połączone, rozcięte odwłoki.
8. Otwórz brzuchy, ustawiając brzuch po stronie grzbietowej z kleszczami w jednej ręce, a następnie drugą ręką wkładając dolne ostrze nożyczek sprężynowych Vanny do jamy brzusznej. Cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej, aż brzuch zostanie całkowicie otwarty, co może wymagać do trzech cięć (Rysunek 1C, 1D).
9. Ustaw suchą płytkę preparacyjną z czterema kołkami 0,10 mm na obszar montażu jamy brzusznej. Każda płyta preparcyjna 35 mm może pomieścić do siedmiu obszarów montażowych. Odpipetować 30 μl roztworu Grace na każdy obszar mocowania i przenieść jeden filetowany brzuch do każdej kropli.
10. Przypnij filetowane brzuchy do naczynia w czterech rogach grzbietowych (Rysunek 1E). Upewnij się, że tkanka leży płasko bez rozdzierania lub nadmiernego rozciągania tkanki brzusznej.
11. Aby utrwalić tkankę, odpipetuj roztwór Grace i dodaj 30 μl roztworu utrwalającego do przygwożdżonego brzucha.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z roztworem fix należy nosić rękawice, ponieważ paraformaldehyd jest toksyczny.
12. Powtarzaj kroki 2.10-2.11, aż wszystkie filetowane odwłoki zostaną przypięte do płytki preparcyjnej.
13. Umieść etykietę z taśmą na dnie każdej potrawy, aby oznaczyć każdą grupę kontrolną i eksperymentalną. Utrwalaj próbki przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej (RT).
14. Zmyć roztwór utrwalający, pipetując 1,5 ml 1x PBS na każdą płytkę. Roztwór fix i tworzywa sztuczne należy utylizować w odpowiednich pojemnikach na płynne lub suche odpady chemiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
15. Umyj płytki 2x 1,5 ml 1x PBS i przechowuj utrwaloną chusteczkę pokrytą 1,5 ml 1x PBS w plastikowym pojemniku z pokrywką. Na dno pojemnika nałożyć warstwę wilgotnego ręcznika papierowego i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do barwienia immunologicznego w ciągu 1 tygodnia od sekcji.

3. Immunofluorescencja

1. Świeżo przygotowane odczynniki (patrz Tabela Materiałów): roztwór buforowy do przemywania (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA w 1x PBS). Resztki bufora do mycia można zachować w temperaturze 4 °C i wykorzystać przez czas trwania 2-dniowego protokołu barwienia. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na test (Rysunek 2) przy użyciu Anti-FasIII (1:50 mysi anty-Fasciclin-III) w buforze do przemywania z anty-Grh (1:300 powinowactwo oczyszczone królicze anty-Grainyhead⁸) lub anty-RFP (1:1,000 anty-RFP królika). Roztwory przeciwciał pierwotnych można przechowywać w temperaturze 4 °C i wielokrotnie wykorzystywać, aż do znacznego zmniejszenia sygnału.
2. Przepuszczalność tkanek poprzez pipetowanie 1x PBS, dodanie 1,5 ml buforu do przemywania i inkubację przez co najmniej 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (80 obr./min) w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć bufor płuczący i zabarwić tkankę na noc 1,5 ml roztworu przeciwciała pierwotnego, inkubując na wytrząsarce orbitalnej (80 obr./min) w temperaturze 4 °C. Zebrać roztwór przeciwciała pierwotnego i zachować w probówce w temperaturze 4 °C do przyszłych eksperymentów.
4. Najpierw szybko przepłukać próbkę 1x PBS, a następnie przepłukać 3x 1,5 ml buforu do mycia. Przy każdym płukaniu próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 30 minut.
5. Podczas końcowego płukania przygotuj wtórny roztwór przeciwciał: 1:1,000 anty-królika Alexa 488 lub 568 i 1:1,000 kozy anty-myszy Alexa 488 lub 568 (lub fluorofory do wyboru) w buforze do mycia.
6. Usunąć bufor do płukania i zabarwić tkanki 1,5 ml roztworu przeciwciał wtórnych. Przykryć próbki folią aluminiową i inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Alternatywnie, próbki można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
7. Przemyć próbki, najpierw odrzucając wtórny roztwór przeciwciała, a następnie szybko przepłukać próbkę 1x PBS, a następnie trzykrotnie przepłukać 1,5 ml buforu do przemywania wodą. Przy każdym płukaniu próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 30 minut.
8. Przygotować roztwór DAPI, rozcieńczając DAPI do 10 μg/ml w buforze do mycia. Po ostatnim myciu próbki należy wybarwić 1,5 ml roztworu DAPI w inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
9. Wyrzuć roztwór DAPI i przepłucz próbki 2x w 1,5 ml 1x PBS. Przechowywać zabarwioną chusteczkę w 1,5 ml 1x PBS w ciemności, przykrytą folią aluminiową, w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do zamontowania na szkiełku podstawowym z szkiełkiem nakrywkowym. Etap montażu należy wykonać w ciągu 1 tygodnia.

4. Aktywność cyklu komórkowego (test EdU)

1. Uzupełnić 10 mM roztwór podstawowy EdU z zestawu Click-iT (patrz tabela materiałów), rozpuszczając proszek EdU w dH₂0 i mieszając przez ~15 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór podstawowy można podatkować (250 μl na probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Nakarm muchy EdU, najpierw rozcieńczając bulion EdU do 5 mM w dH₂O. Dodaj suche drożdże, aż roztwór będzie mętny i krótko wiruj, aby wymieszać. Odetnij nakrętkę probówki o pojemności 0,5 ml i umieść ją na dnie fiolki z pokarmem dla much. Wciśnij nakrętkę w żywność, aby była stabilna.
3. Znieczulić muchy i przenieść 3-5 dniowe muchy do fiolki. Przyłóż muchy do jednej krawędzi, aby żadna nie utknęła w nasadce.
4. Odpipetować 75 μl roztworu drożdży-EdU do nakrętki. Muchy powinny być karmione świeżym roztworem drożdży-EdU codziennie i przenoszone do fiolki ze świeżą żywnością z nakrętką co drugi dzień, aby upewnić się, że muchy nie utkną na dnie fiolki.
5. Aby przenieść muchy, przełóż do nowej fiolki z nakrętką, uśpij muchy, postukaj muchy na bok i dodaj świeży roztwór drożdży-EdU.
6. Trzeciego dnia zranić muchy i kontynuować karmienie drożdży-EdU aż do rozbioru w 2 dpi (Rysunek 4A). Patrz sekcja 2 protokołu, aby zapoznać się z metodami preparacji i utrwalania.
7. Przygotować odczynniki do barwienia EdU: bufor do przemywania (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA w 1x PBS), bufor do permeabilizacji (0,5% Triton X 100 w 1x PBS), bufor blokujący (3% BSA w 1x PBS) i przygotować odczynniki z zestawu do oznaczania EdU (patrz tabela materiałów), w tym 1x bufor reakcyjny i 1x dodatek buforu reakcyjnego zgodnie z zaleceniami producenta.
8. Przemywać próbki przez 1 godzinę, mieszając w temperaturze pokojowej w 1,5 ml buforu do płukania.
9. Dodać 1,5 ml buforu do permeabilizacji i inkubować próbki przez 20 min.
   UWAGA: Rozmrozić i przygotować roztwór koktajlu reakcyjnego o objętości 500 μl/talerz.
10. Przemyć próbki 1x szybko za pomocą 1x PBS, a następnie 3x szybko za pomocą 1 ml buforu blokującego.
11. Odpipetować cały pozostały bufor blokujący i dodać 500 μl roztworu koktajlu reakcyjnego na płytkę. Zakręć płytki, aby upewnić się, że tkanki są całkowicie pokryte. Inkubować w szufladzie w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
12. Przemyj próbki 1x szybko za pomocą 1,5 ml buforu blokującego.
13. Zabarwić 1,5 ml roztworu DAPI w stosunku 1:5 000 w buforze do płukania przez 30 minut.
14. Umyj szybko 2x z 1x PBS, zawiń w folię i przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do zamontowania próbek w ciągu 3 dni.

5. Zamontuj poplamioną tkankę

1. Zaopatrz się we wszystkie potrzebne materiały do montażu: szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, bezbarwny lakier do paznokci, media montażowe, kleszczyki i chusteczki.
2. Aby zamontować poplamioną tkankę muchy, odpiąć odwłoki od płytki preparacyjnej za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś tkankę do ~30 μl podłoża montażowego na szklanym szkiełku nakrywkowym, delikatnie chwytając tkankę kleszczami za jej grzbietowe boki, uważając, aby nie dotykać kleszczami obszaru brzusznego.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym zorientuj tkankę brzuszną tak, aby wnętrze było skierowane w dół w kierunku szkiełka nakrywkowego (tj. zewnętrzny naskórek/włosie są skierowane do góry). Pociągnij zorientowane brzuchy do krawędzi kropli pożywki za pomocą kleszczy. Napięcie powierzchniowe pomoże utrzymać tkankę płaską (Rysunek 1F).
   UWAGA: W przypadku obrazowania pomocne jest uporządkowanie brzucha w kolumnie lub rzędzie na tym etapie.
4. Oznacz szkiełko szklane (tj. kontrolne lub eksperymentalne) i podnieś szkiełko nakrywkowe, powoli zbliżając szkiełko nakrywkowe. Odwróć suwak i delikatnie osusz chusteczką, aby usunąć nadmiar nośnika montażowego.
5. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i powtórz dla wszystkich pozostałych grup eksperymentalnych. Preparaty należy przechowywać w pudełku na preparaty w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do obrazowania.

6. Obrazowanie i przetwarzanie

1. Zobrazuj obszar rany brzusznej muchy, najpierw lokalizując bliznę melaniny za pomocą mikroskopu konfokalnego (Ryc. 1B), skanera punktowego lub oświetlenia strukturalnego (ApoTome) za pomocą 40-krotnego oleju lub suchego obiektywu.
2. Sprawdź ekspozycję na każdym kanale, upewniając się, że sygnał jest poniżej nasycenia. Ustawienia obrazowania powinny być oparte na najjaśniejszej grupie próbek. Jest to szczególnie ważne w przypadku analizy ploidalnej, ponieważ kanał DAPI musi pozostać w zakresie liniowym, aby dokładnie zmierzyć zawartość DNA.
3. Wykonaj pełny obraz stosu z we wszystkich trzech kanałach z optymalną odległością co najmniej 0,50 μm między warstwami. Zapisz przechwycone obrazy i otwórz plik w programie do analizy obrazów Fiji (znanym również jako ImageJ).
4. Dla każdego obrazu utwórz projekcję stosu z, korzystając z opcji sumy plasterków dla wszystkich kanałów.
5. W razie potrzeby obróć obrazy, aby upewnić się, że jądra są ułożone poziomo na obrazach (Rysunek 3A i Rysunek 4E).
6. Przytnij wszystkie obrazy do prostokątnego zaznaczenia o wymiarach 300 μm x 300 μm wyśrodkowanego wokół miejsca rany lub środka nieuszkodzonej kontroli. Zidentyfikuj obszar, rysując prostokąt i wybierając Edytuj | Selekcja | Określ. Sprawdź, czy skalowane jednostki są w mikronach, aby upewnić się, że dla wszystkich analizowanych obrazów używane jest pole o tym samym rozmiarze.

7. Analiza endoreplikacji (ploidalności)

1. Korzystając z Fidżi, wybierz okno kanału Grh i zduplikuj obraz. Następnie użyj narzędzia próg, aby utworzyć maskę. Ręcznie dostosuj próg, przesuwając górny pasek, aby zminimalizować tło bez powodowania drastycznego kurczenia się jąder (Rysunek 4D).
2. Jeśli jakiekolwiek jądra w kanale Grh stykają się na obrazie progowym, użyj narzędzia pędzel (szerokość 2 pikseli) w tym samym kolorze co tło, aby narysować linię między jądrami. Kliknij, aby zastosować 1x po zakończeniu, aby wygenerować ostateczną maskę.
3. Wygeneruj mapę obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą funkcji Analizuj cząstki: ustaw rozmiar na 5 μm-60 μm, aby uchwycić większość jąder bez uwzględniania tła.
4. Ręcznie dostosuj mapę ROI zgodnie z potrzebami w menedżerze ROI. Usuń wszystkie wybory, które nie są jądrami i dodaj do listy wszystkie jądra, które nie zostały zidentyfikowane, obrysowując jądro za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i dodając je do menedżera ROI (Rysunek 4D).
5. Wybierz kanał DAPI, a następnie kliknij przycisk Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby zastosować wygenerowaną mapę ROI w kanale Grh do kanału DAPI.
6. Usuń wszystkie wybory, w których kontur jąder nabłonka nakłada się na jądra nienabłonkowe (np. jądra z mięśni lub tłuszczu) z mapy ROI. Grainyhead barwi tylko jądra nabłonkowe, podczas gdy DAPI barwi wszystkie jądra. Sprawdź, czy każde zaznaczenie zawiera tylko jedno jądro i usuń lub edytuj wszystkie zaznaczenia zawierające więcej niż jedno jądro. Zapisz edytowaną listę ROI.
7. Zmierz obszar i zintegrowaną gęstość każdego jądra nabłonka na mapie ROI za pomocą narzędzi analitycznych na Fidżi. Wyeksportuj wartości do programu arkusza kalkulacyjnego.
8. Zmierz średnie tło obrazu za pomocą narzędzia do zaznaczania kołowego. Narysuj trzy okręgi, które nie zachodzą na żadne jądra w różnych obszarach obrazu DAPI. Dodaj obszar i zintegrowaną gęstość każdego z okręgów do programu arkusza kalkulacyjnego, aby ustalić jasność obrazu tła.
9. Zacznij od obliczenia średniej liczby tła na jednostkę obszaru dla każdego obrazu, dzieląc każdą wartość gęstości zintegrowanego tła przez odpowiadający jej obszar. Następnie uśrednij trzy zintegrowane pomiary gęstości na obszar dla obrazu, aby uzyskać średnie tło na jednostkę obszaru.
10. Następnie oblicz całkowite tło każdego jądra DAPI, mnożąc powierzchnię jądra przez średnie tło na jednostkę powierzchni. Znormalizowaną intensywność DAPI dla każdego mierzonego jądra można następnie obliczyć, odejmując całkowite tło każdego jądra od jego zmierzonej gęstości zintegrowanej.
11. Uśrednić wszystkie znormalizowane wartości intensywności DAPI z kontroli nieuszkodzonego nabłonka. Nieuszkodzone jądra nabłonkowe zostały wcześniej obliczone jako mające wartość ploidalności 2C i mogą służyć jako odniesienie do obliczania ploidalności w jądrach nabłonka na podstawie warunków eksperymentalnych⁸.
12. Oblicz ploidalność każdego jądra, dzieląc znormalizowaną intensywność DAPI każdego jądra przez znormalizowaną wartość z referencyjnej kontroli nieuszkodzonego nabłonka (2C), a następnie pomnóż wartość przez 2, aby zrównać się znormalizowanej ploidalności (wartość C):
    (Zintegrowana gęstość jądrowa - Zintegrowana gęstość jądrowa tła)/Średnia zintegrowana gęstość jądrowa (nieuszkodzone jądra nabłonkowe = 2C) x 2 = ploidalność jądra nabłonka (C)
13. Wykres jąder z wartościami ploidalności jako wykres punktowy, histogram lub odpowiednio zgrupowany w wykres słupkowy (tj. 2C [0,6-2,9C], 4C [3,0-5,9C], 8C [6,0-12,9C], 16C [13,0-24,9C] i >32C [>25,0C] (Rysunek 3F).

Wyniki

Dostarczono szczegółowy protokół wykorzystania D. melanogaster jako modelu do badania poliploidyzacji wywołanej raną (WIP). Ten model gojenia się ran ma wiele zalet w porównaniu z modelami WIP ssaków i innych much. Poliploidalność była łatwo indukowana przez mechaniczne nakłucie szpilką owada, a komórki poliploidalne zostały wygenerowane w krótkim czasie (2-3 dpi) (Rysunek 1A, 1B)⁴. Dużym wyzwaniem jest wypreparowanie nienaruszonej tkanki brzusznej bez żadnych zaburzeń nabłonka. Nabłonek D. melanogaster łatwo ulega przypadkowemu uderzeniu lub zadrapaniu ostrymi narzędziami do preparowania. Dlatego kroki tego protokołu powinny być przećwiczone przed użyciem i analizą.

Po pierwsze, uraz został ograniczony do brzusznego brzucha kobiety, który zapewnia duży, płaski, nieprzezroczysty obszar tkanki idealny do obrazowania. Rany kłute zostały zadane w nabłonku opłucnej, który leży po obu stronach sternitów brzusznej linii środkowej i były ukierunkowane między segmentami tergitu (T) T4-T5 (Ryc. 1 A-C). To umieszczenie rany zapewnia duży widoczny obszar, który nie jest zakłócany przez rozwarstwienie. Trudne kroki obejmują cięcie nożycami sprężyny brzusznej i kroki przypinania (Rysunek 1D, 1E). Etap cięcia sprężynowego działał najlepiej, gdy brzuchy były cięte w zmniejszonej objętości roztworu Grace (~30 μL) w celu zmniejszenia ruchu tkanek. Dobrze wyśrodkowane cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej było konieczne, aby zapewnić wystarczającą powierzchnię na klapach grzbietowych brzucha, aby otworzyć się na płycie preparacyjnej (Rysunek 1C). Brzuch musi być delikatnie przyciśnięty do czterech rogów bez użycia nadmiernej siły (Rysunek 1E). Zbyt mocne wciśnięcie szpilki zniekształci tkankę brzuszną, a nawet może wepchnąć tkankę do płytki preparcyjnej. Jeśli tak się stanie, tkankę należy wyrzucić. Po utrwaleniu tkanki brzusznej pozostawała ona na płytce preparacyjnej do momentu zakończenia barwienia immunofluorescencyjnego, a brzuchy zostały zamontowane na szklanym szkiełku nakrywkowym do obrazowania (Ryc. 1F).

Gojenie się ran wymaga ciągłego tworzenia się warstwy nabłonka, która jest zależna od endoreplikacji i fuzji komórek^4,16. Białko połączenia przegrodowego FasIII, które oznacza połączenia komórka-komórka, dostarczyło wskaźnika określającego, czy podczas przygotowania wystąpiły jakiekolwiek zakłócenia przetwarzania (Rysunek 1G, 1H). Brzuchy z dużymi rysami (obszar niezabarwiony), które zakłócają obszar rany, muszą zostać odrzucone i nie były używane do dalszej analizy (Rysunek 1H).

Następnym krokiem było przeanalizowanie nienaruszonych próbek pod kątem ewentualnych wad WIP. Protokół ten zawiera odrębne testy do wykrywania różnych aspektów odpowiedzi WIP (Rysunek 2). Gojenie się rany było zakończone, gdy centralna, duża, wielojądrowa komórka pokryła strup rany (Ryc. 3A). W tym przypadku fuzję komórek wykryto poprzez barwienie pod kątem FasIII/Grh i ilościowe określenie liczby jąder nabłonka Grh⁺ zawartych w obszarze zarysowanym przez FasIII⁴. Wady w zamykaniu ran lub reepitelializacji wykryto, gdy zaobserwowano przerwy >10 μm w arkuszu nabłonka (Ryc. 3B, czerwona strzałka). Tak było na przykład w przypadku, gdy WIP został zahamowany przez aktywację cyklu mitotycznego poprzez ekspresję stg, fzr^RNAi, jak niedawno doniesiono¹⁶. W tej chorobie genetycznej 52% ran nie było w stanie utworzyć ciągłej warstwy nabłonka na strupie rany (Ryc. 3B, 3C).

Inną metodą pomiaru gojenia ran w tym modelu była wizualizacja błony nabłonkowej za pomocą epi-Gal4 ekspresji UAS-mCD8-ChRFP4 (Rysunek 2, Rysunek 3D). W grupie kontrolnej 91% ran nabłonkowych zamknęło się całkowicie o 3 dpi, ale hamowanie WIP poprzez blokowanie endoreplikacji (E2f1^RNAi) i fuzji komórek (RacDN) jednocześnie, jak wcześniej informowano, spowodowało, że 92% ran nabłonkowych pozostało całkowicie otwartych (Rysunek 3D, 3E)^8,16. Aktywacja mitotycznego cyklu komórkowego przez ekspresję stg, fzr^RNAi spowodowała również defekt zamykania ran nabłonkowych. Jednak poprzez wizualizację błony komórkowej nabłonka można określić zakres defektu reepitelializacji. Rany muchy z mutacją WIP (E2f1^RNAi, RacDN) były bardziej otwarte niż rany rany^RNAi stg, fzr (Rysunek 3D, przerywany czerwony kontur)¹⁶. Ten test gojenia się ran błonowych dostarczył więcej informacji na temat zakresu defektu gojenia się rany. W rezultacie, defekty reepitelializacji można pogrupować jako całkowicie otwarte, częściowo zamknięte (tj. przerwy >10 μm) lub całkowicie zamknięte (Rysunek 3D, 3E).

Oprócz fuzji komórek, komórki nabłonkowe powiększają się poprzez endoreplikację, niepełny cykl komórkowy, który podwaja zawartość jądrowego DNA. Endoreplikację oznaczono zarówno za pomocą aktywności cyklu komórkowego, jak i bezpośrednich pomiarów ploidalności jądrowego DNA ( Rysunek 2 i Figura 4). W tym przypadku aktywność cyklu komórkowego wykryto poprzez włączenie analogu tymidyny, EdU (Rysunek 4A, 4B). Stwierdzono, że komórki nabłonkowe D. melanogaster wchodzą w endocykl, niekompletny cykl komórkowy, który oscyluje między fazami S i G bez interweniującej fazy M^4,12. Dieta dorosłego D. melanogaster była uzupełniana pokarmem EdU⁺ przed urazem, a muchy były utrzymywane na diecie EdU⁺ do czasu rozbioru w temperaturze 2 dpi (Ryc. 4A). EdU został następnie wykryty za pomocą protokołu Click-iT producenta. Ten test EdU został wykorzystany do określenia, gdzie, kiedy i ile jąder zostało pobudzonych do wejścia w fazę S w odpowiedzi na ranę. Korzystając z systemu Gal4 / UAS, odkryto niedawno, że specyficzna dla nabłonka ekspresja myc może blokować (myc^RNAi) lub nasilać (nadekspresja Myc) kompetencji komórek nabłonkowych do wejścia w fazę S. W rezultacie wykazano, że Myc jest wystarczający do indukowania endoreplikacji w komórkach postmitotycznych, nawet bez uszkodzenia^16,22.

Następnie, ploidalność nabłonka została określona poprzez bezpośredni pomiar zawartości jądrowego DNA. Jądra nabłonkowe zidentyfikowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla markera specyficznego dla nabłonka, Grh (Figura 4D). W oprogramowaniu do obrazowania na Fidżi jądra nabłonkowe zostały systemowo zidentyfikowane, a następnie progowane za pomocą barwienia jądrowego Grh. Jądra zostały następnie rozdzielone, a ROI nałożone na obraz DAPI sumy stosów (Rysunek 4D, zielona strzałka). Wszelkie nakładające się jądra zostały ręcznie usunięte przed zmierzeniem zintegrowanej gęstości wybranych jąder (Rysunek 4D, czerwone strzałki). Ta półautomatyczna metoda pozwala na ilościowe określenie rozmieszczenia i ploidalności większości jąder w nieuszkodzonym i naprawionym nabłonku brzusznym muchy⁸. Jak niedawno informowaliśmy, jądra nabłonkowe otaczające ranę składały się w 44% z jąder poliploidalnych o zawartości DNA większej niż 3C w temperaturze 3 dpi (Ryc. 4E, 4F)16. Zgodnie z oczekiwaniami na podstawie wyników EdU, knockdown myc doprowadził do znacznego bloku w endoreplikacji, ponieważ tylko 9% jąder nabłonkowych było poliploidalnych, podczas gdy nadekspresja Myc spowodowała 100% poliploidalne jądra nabłonkowe wokół miejsca rany (Rysunek 4F)¹⁶. Na wielkość jądra nabłonka miała również widoczny wpływ ekspresja myc ze zmniejszonymi lub powiększonymi jądrami. Jednak obszar jądra nie jest dokładną miarą ploidalności i efektów fizjologicznych, ponieważ czynniki takie jak rozciąganie komórek mogą również wpływać na rozmiar jądra bez wpływu na zawartość jądrowego DNA²⁰.

Rycina 1: Zranienie brzucha dorosłej muszki owocowej, sekcja i montaż tkanek. (A) Schemat testu na zranienia jamy brzusznej osoby dorosłej. Muchy powinny być zranione po obu stronach brzucha w tergicie 4 (T4). (B) Dorosła samica muszki owocowej 3 dpi ze strupem melaniny powstałym w wyniku gojenia się ran (biała skrzynka). Pasek skali = 50 μm. (C) Wypreparowany odwłok dorosłego osobnika, widok grzbietowy, z oznaczonymi tergitami. Odwłoki były filetowane wzdłuż linii środkowej strony grzbietowej (biała przerywana linia). Pasek skali = 50 μm. (D) Wypreparowane i wyfiletowane dorosłe odwłoki przed przypinaniem. Podziałka = 50 μm. (E) Przypięty brzuch dorosłego człowieka do płytki preparcyjnej. W każdym z czterech rogów brzucha po stronie grzbietowej umieszczono szpilkę. Tkanka została delikatnie otwarta, ale nie rozciągnięta, aby uniknąć rozerwania. (F) Dorosłe odwłoki zostały zamontowane i umieszczone na szklanym szkiełku nakrywkowym z wnętrzem brzucha skierowanym w dół w kierunku szkiełka nakrywkowego i naskórkiem skierowanym w stronę szkiełka podstawowego. (G) Zabarwienie FasIII nienaruszonego obszaru rany bez zaburzeń przetwarzania i centralnym syncytium (przerywana żółta linia). Pasek skali = 50 μm. (H) Obraz zarysowanego obszaru rany (*) z niebarwionym obszarem FasIII, który zakłóca syncytium. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Proces roboczy analizy PWT. Schemat blokowy przedstawia trzy testy opisane w tym badaniu oraz nakładające się i odrębne kroki w celu wykrycia i zmierzenia odpowiedzi PWT. Test EdU mierzy aktywność cyklu komórkowego (niebieskie pola), ploidalność i reepitelializację są wykrywane przez barwienie immunologiczne Grh/FasIII (zielone pola), a ekspresja błonowego RFP umożliwia pomiar stopnia zamknięcia rany nabłonkowej (różowe pola). Typowe kroki znajdują się w szarych polach, a genotypy szczepu D. melanogaster są wymienione powyżej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Metody wykrywania reepitelializacji podczas WIP. Reepitelializacja była zaburzona, gdy WIP był genetycznie hamowany. Obrazy immunofluorescencyjne kontroli (A) i stg, fzr^RNAi (B) przy 3 dpi. Jądra nabłonkowe i połączenia przegrodowe zabarwiono odpowiednio Grh (zielony) i FasIII (magenta). (A' i B') Samo barwienie FasIII wykazało, że reepitelializacja była upośledzona (czerwona strzałka) w nabłonku stg, fzr^RNAi. Podziałka = 50 μm. (C) Kwantyfikacja wad reepitelializacji (%) przy 3 dpi (szary): kontrola (n = 8), stg, fzr^RNAi (n = 6). Słupki błędów wskazują błąd standardowy; istotność statystyczną mierzono za pomocą testu T Studenta, **P < 0,01. Reepitelializację podczas gojenia się ran można również wykryć poprzez ekspresję RFP połączonego z błoną za pomocą epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Immunofluorescencyjne obrazy kontrolne, E2F1^RNAi, RacDN i stg, fzr^RNAi przy 3 dpi. Podziałka = 20 μm. Strup rany (żółty kontur) i otwarty obszar rany nabłonkowej (czerwony kontur). (E) Kwantyfikacja zamknięcia rany w ctrl (n = 11), E2F1^RNAi, RacDN (n = 13) i stg, fzr^RNAi (n = 13). Na podstawie Grendler et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Metody wykrywania endoreplikacji podczas pracy w toku. (A) Oś czasu testu EdU: dorosłe Drosophila były karmione 75 μl 5 mM drożdży-EdU codziennie 2 dni przed urazem i kontynuowały do 2 dpi. (B) Obrazy immunofluorescencyjne znakowania EdU w szczepach much wyrażonych za pomocą systemu epi-Gal4 / UAS w temperaturze 2 dpi. Strup rany (W). Podziałka = 50 μm. (C) Średnia liczba jąder nabłonkowych EdU+ na muchę przy 2 dpi: ctrl (n = 37), myc^RNAi#1 (n = 10) i Myc (n = 8). Słupki błędów wskazują błąd standardowy; istotność statystyczną mierzono za pomocą testu T-Studenta, *P < 0,05, **P < 0,01. (D) Schemat wykrywania i pomiaru ploidalności jądrowej nabłonka. Jądra nabłonkowe zostały zidentyfikowane i progowane przez barwienie anty-Grh na Fidżi. Nakładające się na siebie jądra nabłonkowe były oddzielane (zielone groty strzałek) lub usuwane (czerwone groty strzałek), jeśli nałożyły się na nie jądra nienabłonkowe. Zmierzono zintegrowaną gęstość i obszar jądrowy odpowiadającego obrazowi jąder barwionych DAPI. (E) Rozmiar jądra nabłonka (Grh) został zmieniony przez ekspresję myc w 3 dpi. (F) Nabłonkowa ploidalność jądrowa (%) przy 3 dpi: ctrl (n = 4), myc^RNAi#1 (n = 6) i Myc (n = 3). Na podstawie Grendler et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiono szczegółowy protokół dotyczący preparowania i wykorzystania nabłonka brzusznego dorosłego D. melanogaster do zbadania, w jaki sposób geny regulują WIP poprzez zmianę reepitelializacji i endoreplikacji podczas gojenia się ran¹⁶. Korzystając z tej metody, protoonkogen Myc został niedawno zidentyfikowany jako kluczowy regulator WIP. Myc jest wymagany, aby komórki nabłonkowe mogły się replikować po urazie i jest wystarczający do endocyklu komórek nabłonka w stanie spoczynku zarówno w nabłonku dorosłej muchy, jak i gruczołach dodatkowych^16,22. Stwierdzono również, że przełączanie komórek nabłonka na mitotyczny cykl komórkowy przez ekspresję stg, fzr^RNAi jest szkodliwe dla gojenia się ran. Kontynuowane badania z wykorzystaniem tej metody zidentyfikują inne geny wymagane do regulacji reepitelializacji i endoreplikacji podczas WIP, ujawniając zarówno podobieństwa, jak i różnice w sposobie regulacji i funkcjonowania poliploidii w różnych tkankach.

Ten model i metoda oferują wyjątkowe zalety, w tym łatwą indukcję poliploidalności za pomocą mechanicznego nakłucia oraz fakt, że komórki poliploidalne są generowane w ciągu kilku dni⁴. Protokoły preparacji i przygotowania tkanek opierają się na technikach preparacji larw²³, ale odwłok dorosłej muchy jest sztywniejszy i dlatego łatwo ulega zaburzeniom. W rezultacie, protokół ten wymaga praktyki i precyzji, aby wyizolować nienaruszoną tkankę do badania WIP. Jednak po wypreparowaniu nabłonek jest wyraźnie widoczny i łatwy do zobrazowania, co daje obraz procesu gojenia się ran. Metoda ta dostarcza wielu informacji na temat organizacji nabłonka dorosłej muchy, wielkości komórek i syncytium oraz ploidalności komórek i poszczególnych jąder. Chociaż obrazowanie na żywo w nienaruszonej muszce owocowej nie jest jeszcze możliwe ze względu na jej nieprzezroczysty naskórek, protokół ten można dostosować tak, aby uwzględniał obecnie dostępne warunki hodowli ex vivo stosowane u D. melanogaster w celu przeprowadzenia krótkoterminowych badań obrazowania na żywo²⁴.

W przyszłości model ten będzie idealny do badania przesłuchów międzykomórkowych i udziału innych typów komórek w WIP poprzez regulację ekspresji genów za pomocą systemu Gal4/UAS w innych typach komórek będących przedmiotem zainteresowania. Na podobne pytania można również odpowiedzieć, korzystając z różnych środowisk genetycznych i zmutowanych. Wypreparowany odwłok dorosłej muchy zawiera różne typy komórek, które można łatwo zobrazować za pomocą tej metody, w tym ciało tłuszczowe i enocyty, boczne włókna mięśniowe, neurony czuciowe, tchawica i hemocyty podobne do makrofagów. Ponadto model ten pozwoli naukowcom zbadać, w jaki sposób zmienne fizjologiczne wpływają na WIP, w tym płeć, dieta, infekcje, wiek i stresory środowiskowe. Podczas gdy w protokole wykorzystuje się dorosłą samicę muchy ze względu na jej większy rozmiar, WIP występuje również u samców muszki owocowej (Gjelsvik i Losick, niepublikowane). Stwierdzono, że komórki poliploidalne powstają podczas starzenia się i chorób związanych z wiekiem w wątrobie, mózgu, oku i sercu ssaków¹². Model muszki owocowej umożliwi naukowcom badanie poliploidyzacji w kontekście fizjologicznym i chorobowym, ponieważ geny związane z chorobami ludzkimi są wysoce konserwatywne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego 35 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Do tworzenia płytek do preparacji w
stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22	Do przygotowania odczynników barwiących w
AxioImager M2 z Apotome	Zeiss	NA	Do obrazowania próbek
Dmuchawka mini	Genesee Scientific	54-104M	Do znieczulania D. melanogaster szczepy
Albumina surowicy bydlęcej, 30%	Sigma	A7284-500ML	Do barwienia immuostainowego
Zbiornik na dwutlenek węgla	różne dystrybutory	Nie dotyczy	Do znieczulania szczepów D. melanogaster
Zestaw Click-iT EdU 594 Thermofisher		C10339	Do testu EdU
Szkiełka nakrywkowe	Thermofisher	3406	Do montażu
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Do barwienia immuostainingu
płytek preparacyjnych (użyj zestawu Sylgard 184 Sil Elastic Kit)	Kleje Ellsworth	184SIL	Do tworzenia płytek do preparacji. Wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z zaleceniami, pozostaw do wyschnięcia na noc
Przeciwciało drugorzędowe anty-królikowe IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 488	Thermofisher	A21206	Do wtórnego barwienia immuostainicznego
Przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 568	Thermofisher	A10042	Do wtórnego barwienia immuostainu
Rurki i złączki Drosophila	Genesee Scientific	59-124C, 59-123, 59-140	Do znieczulania szczepów D. melanogaster
Dumont #5 Kleszcze	Narzędzia do nauki	11252-20	Do preparowania
epi-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b38793	Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b38793, b27392	Losick et al. Current Biology, 2013
Excel	Microsoft		Do wykonywania obliczeń ploidalnych
Fidżi/ImageJ (oprogramowanie do analizy obrazu)	NIH	a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij	Do analizy obrazu
Pokarm dla much	Archon Scientific	N/A	Syrop kukurydziany/pokarm sojowy
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	Do znieczulania D. szczepy melanogaster
Szklana miska preparcyjna	Fisher Scientific	13-748B	Do wykonywania sekcji w
szkiełkach szklanych	Fisher Scientific	12-518-104C	Do montażu
koziego przeciwciała anty-mysiego IgG (H + L), koniugat Alexa Fluor 488	Thermofisher	A11001	Do wtórnego barwienia immuotyka
Kozioł anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Drugorzędowe, Alexa Fluor 568 koniugat	Thermofisher	A11031	Do wtórnego barwienia immunologicznego
Grace's Insects Medium, niesuplementowany	Thermofisher	11595030	Do preparowania w
Szpilki do owadów	Fine Science Tools	26002-10	Do ranienia i przypinania płaskich odwłoków much
Mysz anty-Fasciclin III (Drosophila) Pierwotne przeciwciało	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	7G10	Do barwienia immunologicznego połączeń komórka-komórka nabłonkowa
Pożywki do barwienia	Vector Laboratories	H-1000	Antyblakowy nośnik montażowy zapobiegający wybielaniu zdjęć podczas obrazowania
Lakier do paznokci	Mikroskopia elektronowa Sciences	72180	Do uszczelniania szkiełek
Wytrząsarka ortibal	Fisher Scientific	02-217-988	Do barwienia immuostainu
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, PH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	Do barwienia
uchwytów na szpilki	Fine Science Tools	91606-07	Do ranienia
pierwotnego przeciwciała przeciwziarnistego królika	Niedotyczy		Do barwienia immunologicznego jąder nabłonkowych. Protokół wytwarzania przeciwciała można znaleźć (Ref. # 4 i 8)
Królicze przeciwciało pierwotne anty-RFP	MBL	PM005	Do barwienia immunologicznego nabłonka muchy mCD8-RFP
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ51	Do preparowania i montażu tkanki muchy
Triton X-100	Sigma	10789704001	Do barwienia immuostainu
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN	VDRC (v) i Bloomington Drosophila Stock Center (b)	v108837, b6292	Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg	VDRC (v) i Bloomington Drosophila Stock Center (b)	v25550, b56562	Grendler et al. Rozwój, 2019
UAS-Myc	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b9674	Grendler i wsp. Rozwój, 2019
UAS-myc RNAi	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b36123	Grendler i wsp. Rozwój, 2019
Vannas Spring Scissors	Narzędzia do nauki	15000-00	Do preparacji