Artykuł metodologiczny

Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61252

⸱

9 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, Boston College, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering and Kathryn W. Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory, University of Maine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Poliploidyzacja wywołana raną to zachowana strategia naprawy tkanek, w której komórki rosną zamiast dzielić, aby zrekompensować utratę komórek. Oto szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać muszkę owocową jako model do pomiaru ploidalności i jej regulacji genetycznej w naprawie ran nabłonkowych.

Streszczenie

Poliploidia jest częstym zjawiskiem, którego wpływ na zdrowie organizmu i choroby jest nadal słabo poznany. Komórka jest definiowana jako poliploidalna, jeśli zawiera więcej niż diploidalną kopię swoich chromosomów, co jest wynikiem endoreplikacji lub fuzji komórek. Stwierdzono, że w naprawie tkanek poliplooidyzacja indukowana ranami (WIP) jest konserwatywną strategią gojenia od muszek owocowych do kręgowców. WIP ma kilka zalet w stosunku do proliferacji komórek, w tym odporność na wzrost onkogenny i stres genotoksyczny. Wyzwaniem było określenie, dlaczego powstają komórki poliploidalne i jak funkcjonują te unikalne komórki. Dostarczono szczegółowy protokół do badania WIP w nabłonku dorosłej muszki owocowej, w którym komórki poliploidalne są generowane w ciągu 2 dni po ranie kłutej. Korzystając z obszernego zestawu narzędzi genetycznych D. melanogaster, zaczęto identyfikować geny niezbędne do inicjowania i regulowania WIP, w tym Myc. Dalsze badania z wykorzystaniem tej metody mogą ujawnić, w jaki sposób inne zmienne genetyczne i fizjologiczne, w tym płeć, dieta i wiek, regulują i wpływają na funkcję WIP.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster to atrakcyjny system modelowy do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów naprawy ran nabłonkowych. Podobnie jak u ssaków, stosowane mechanizmy naprawy tkanek zależą zarówno od tkanki, jak i jej etapu rozwoju. Bezbliznowe gojenie się ran zachodzi w zarodku muszki owocowej, gdzie na krawędzi czołowej nabłonka tworzy się "sznurek torebki" aktomiozyny, umożliwiając płynne zamknięcie rany1,2. Gojenie się ran po zarodku u larw, poczwarek i dorosłych muszek owocowych powoduje przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, tworzenie blizn melaniny i wzrost komórek nabłonkowych3,4,5,6. Komórki nabłonkowe zwiększają swój rozmiar w wyniku fuzji komórek i endocyklu, niepełnego cyklu komórkowego, który omija mitozę3,4,7,8. W rezultacie utrata komórek jest kompensowana przez wzrost komórek poliploidalnych, a nie przez podział komórek. Dorosły osobnik tylny, jelito środkowe i nabłonek mieszków włosowych również polegają na wzroście komórek poliploidalnych, aby skompensować utratę komórek po uszkodzeniu tkanki9,10,11.

Poliploidia jest dobrze znanym aspektem rozwoju organizmów u roślin i owadów, ale w ciągu ostatnich kilku lat stało się bardziej oczywiste, że poliploidia jest konserwatywną strategią naprawy tkanek u kręgowców12. Danio pręgowany, który ma zdolność regeneracji serca, polega na wzroście komórek poliploidalnych, aby leczyć uszkodzone nasierdzie13. Poliploidalność przyczynia się również do regeneracji wątroby ssaków i naprawy nabłonka kanalików nerkowych po ostrym urazie14,15. W tych przykładach komórki poliploidalne są generowane przez endoreplikację poprzez endocykl lub endomitozę, co skutkuje komórką dwujądrową z powodu blokady cytokinezy12. Zagadką jest, dlaczego komórki poliploidalne powstają podczas gojenia się ran i jak poliploidalność wpływa na funkcję tkanek. Ostatnie badania dostarczyły nowych informacji na pytanie, czy poliploidalność ma zaletę czy wadę leczniczą. W episierdziu danio pręgowanego poliploidalność zwiększała szybkość gojenia się ran13. Stwierdzono, że u D. melanogaster w jelicie tylnym i wątrobie ssaków poliploidalność chroni przed wzrostem onkogennym11,14. W nabłonku dorosłej muchy stwierdzono niedawno, że poliploidalność umożliwia gojenie się ran w obecności stresu genotoksycznego16. Endoreplikacja jest odporna na uszkodzenia DNA, co pozwala na gojenie się ran, gdy proliferacja komórek byłaby zagrożona17. Jednak w przypadku kardiomiocytów w sercach myszy i danio pręgowanego poliploidalność spowalnia gojenie, co skutkuje zwiększonym tworzeniem blizn18,19. Dlatego, w zależności od narządu i/lub typu komórki, poliploidalność może być korzystną lub szkodliwą strategią naprawy tkanek. Dostępność genetyki D. melanogaster w połączeniu z analizą odpowiedzi na poliploidyzację indukowaną raną (WIP) sprawia, że jest to idealny system modelowy do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i komórkowych, które kierują tą strategią gojenia się ran.

Tutaj prezentujemy protokół analizy WIP w nabłonku dorosłego D. melanogaster. Dołączone są instrukcje dotyczące uszkadzania muszek owocowych, preparowania, barwienia immunologicznego, montowania, obrazowania i analizy ponownego nabłonkowania, fuzji komórek i endoreplikacji (ploidalności). Obrazowanie i analizę ploidalną można również dostosować do innych modeli w celu sprawdzenia, czy występuje WIP. Należy zauważyć, że wraz ze wzrostem zawartości jądrowego DNA często następuje odpowiedni wzrost wielkości jądra. Istnieje jednak wiele przykładów w biologii, gdzie rozmiar jądra nie odzwierciedla odpowiedniej zmiany w ploidy20. Jeszcze większą ostrożność należy zachować przy interpretacji wielkości jądra w kontekście środowiska rany, w którym komórki często rozprzestrzeniają się lub rozciągają, aby pokryć miejsce rany. Dlatego jedynym ostatecznym dowodem zmiany w ploidalności jest zmierzenie zawartości DNA tą metodą (lub innymi, takimi jak sekwencjonowanie całego genomu)21. Metoda ta zwiększa przydatność dorosłego nabłonka brzusznego D. melanogaster jako modelu do badania roli i regulacji poliploidalności w gojeniu się ran.

Protokół

1. Inscenizacja i ranienie dorosłych muszek owocowych

  1. Wybierz wybrany szczep D. melanogaster (tj. szczep epi-Gal4/ UAS, patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: W tym przypadku system Gal4/UAS jest używany do umożliwienia ekspresji genu specyficznego dla nabłonka (epi-Gal4) genu lub RNAi kodowanego za UAS. W badaniu wykorzystano fluorescencyjne białko błonowe (UAS-Cd8.mRFP), induktor mitotyczny (UAS-fzrRNAi, UAS-stg) i inhibitor WIP (UAS-E2F1RNAi; UAS-RacDN).
  2. Zebrać dwie fiolki po 10-15 nowo zamkniętych samic muszki owocowej i dojrzewać na fiolkach ze świeżą żywnością w temperaturze 25 °C do 3-5 dnia życia. Jedna fiolka będzie służyć jako nieuszkodzona kontrola, a druga fiolka zostanie zraniona, jak opisano poniżej. Samice much powinny być utrzymywane z samcami (~5/fiolkę).
  3. Aby nawinąć muchy, zmontuj kilka uchwytów na szpilki, każdy z pojedynczym kołkiem ze stali nierdzewnej 0,10 mm. Upewnij się, że ostry koniec kołka jest skierowany na zewnątrz. Szpilki mogą się łatwo wygiąć lub odprysnąć po przebiciu rozporka, a haczykowate lub uszkodzone szpilki należy wyrzucić.
  4. Znieczulenie starych samic muszek owocowych na podkładce CO2-fly pod mikroskopem stereoskopowym i wyrównanie ich w rzędzie za pomocą pędzla. Nosząc okulary ochronne, trzymając uchwyt na szpilkę w jednej ręce i kleszcze w drugiej, użyj kleszczy, aby ustawić muchę z brzusznym brzuchem skierowanym do góry.
  5. Nakłuć dorosłą samicę muchy w obszarze opłucnej nabłonka tergitu A4 po obu stronach sternitów brzusznej linii środkowej (Ryc. 1A). Nakłucie tego obszaru brzusznego zapewnia optymalną przestrzeń z dala od miejsc rozwarstwienia, w których krawędzie tkanek zostaną rozerwane przez obróbkę mechaniczną.
  6. Zwróć ranne muchy do fiolki z jedzeniem i wiek do pożądanego dnia po urazie (dpi). Gojenie się ran nabłonkowych rozpoczyna się od 1 dpi, a kończy po 3 dpi. Endoreplikacja osiąga szczyt przy 2 dpi, co jest idealne dla testu EdU (sekcja 4, Rysunek 2).

2. Sekcja brzucha muchy

UWAGA: Podczas tego kroku ważne jest, aby unikać dotykania brzusznej tkanki brzusznej narzędziami do preparowania, ponieważ naruszy to integralność nabłonka.

  1. Zaopatrz się we wszystkie materiały potrzebne do sekcji: roztwór Grace, kleszcze, nożyczki sprężynowe Vanny, szpilki 0,10 mm, płytki preparacyjne, 9-dołkowe szklane naczynie preparacyjne, roztwór utrwalający (4% paraformaldehydu w 1x PBS), 1x PBS, chusteczki, pipety i końcówki do 30 μm oraz rękawiczki (patrz Tabela materiałów).
  2. Potwierdź, że muchy zostały skutecznie zranione, znieczulając ranne muchy na podkładce CO2-fly pod mikroskopem stereoskopowym i sprawdzając obecność blizny po ranie (tj. plamki melaniny na brzuchu, patrz Rysunek 1B). Odrzuć wszystkie muchy z grupy eksperymentalnej, które nie zostały skutecznie zranione.
  3. Aby rozpocząć sekcję, napełnij jedną studzienkę z 9-dołkowego szklanego naczynia do sekcji roztworem Grace. Użyj kleszczy, aby chwycić ranną samicę muchy za grzbietową stronę klatki piersiowej i zanurz muchę w studzience zawierającej roztwór Grace.
  4. Używając kleszczy w przeciwnej ręce, nie zwalniając klatki piersiowej, nakłuj naskórek grzbietowy poniżej tergitu A6 i oderwij naskórek od tylnego końca muszki owocowej. Narządy wewnętrzne (jajnik i jelito) zwykle wychodzą na tym etapie. Jeśli nie, delikatnie popchnij kleszczami grzbietową stronę brzucha, aby wycisnąć pozostałe narządy i wyrzucić do pustej studzienki.
  5. Oderwij cały brzuch na skrzyżowaniu klatki piersiowej powyżej tergitu A2 za pomocą kleszczy i przenieś brzuch do pustej studzienki zawierającej ~100 μl roztworu Grace.
  6. Powtarzaj kroki 2.3-2.5, aż wszystkie odwłoki much zostaną wycięte.
  7. Zmniejsz objętość roztworu Grace do 30 μl w studzience zawierającej połączone, rozcięte odwłoki.
  8. Otwórz brzuchy, ustawiając brzuch po stronie grzbietowej z kleszczami w jednej ręce, a następnie drugą ręką wkładając dolne ostrze nożyczek sprężynowych Vanny do jamy brzusznej. Cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej, aż brzuch zostanie całkowicie otwarty, co może wymagać do trzech cięć (Rysunek 1C, 1D).
  9. Ustaw suchą płytkę preparacyjną z czterema kołkami 0,10 mm na obszar montażu jamy brzusznej. Każda płyta preparcyjna 35 mm może pomieścić do siedmiu obszarów montażowych. Odpipetować 30 μl roztworu Grace na każdy obszar mocowania i przenieść jeden filetowany brzuch do każdej kropli.
  10. Przypnij filetowane brzuchy do naczynia w czterech rogach grzbietowych (Rysunek 1E). Upewnij się, że tkanka leży płasko bez rozdzierania lub nadmiernego rozciągania tkanki brzusznej.
  11. Aby utrwalić tkankę, odpipetuj roztwór Grace i dodaj 30 μl roztworu utrwalającego do przygwożdżonego brzucha.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z roztworem fix należy nosić rękawice, ponieważ paraformaldehyd jest toksyczny.
  12. Powtarzaj kroki 2.10-2.11, aż wszystkie filetowane odwłoki zostaną przypięte do płytki preparcyjnej.
  13. Umieść etykietę z taśmą na dnie każdej potrawy, aby oznaczyć każdą grupę kontrolną i eksperymentalną. Utrwalaj próbki przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  14. Zmyć roztwór utrwalający, pipetując 1,5 ml 1x PBS na każdą płytkę. Roztwór fix i tworzywa sztuczne należy utylizować w odpowiednich pojemnikach na płynne lub suche odpady chemiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  15. Umyj płytki 2x 1,5 ml 1x PBS i przechowuj utrwaloną chusteczkę pokrytą 1,5 ml 1x PBS w plastikowym pojemniku z pokrywką. Na dno pojemnika nałożyć warstwę wilgotnego ręcznika papierowego i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do barwienia immunologicznego w ciągu 1 tygodnia od sekcji.

3. Immunofluorescencja

  1. Świeżo przygotowane odczynniki (patrz Tabela Materiałów): roztwór buforowy do przemywania (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA w 1x PBS). Resztki bufora do mycia można zachować w temperaturze 4 °C i wykorzystać przez czas trwania 2-dniowego protokołu barwienia. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na test (Rysunek 2) przy użyciu Anti-FasIII (1:50 mysi anty-Fasciclin-III) w buforze do przemywania z anty-Grh (1:300 powinowactwo oczyszczone królicze anty-Grainyhead8) lub anty-RFP (1:1,000 anty-RFP królika). Roztwory przeciwciał pierwotnych można przechowywać w temperaturze 4 °C i wielokrotnie wykorzystywać, aż do znacznego zmniejszenia sygnału.
  2. Przepuszczalność tkanek poprzez pipetowanie 1x PBS, dodanie 1,5 ml buforu do przemywania i inkubację przez co najmniej 30 minut na wytrząsarce orbitalnej (80 obr./min) w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć bufor płuczący i zabarwić tkankę na noc 1,5 ml roztworu przeciwciała pierwotnego, inkubując na wytrząsarce orbitalnej (80 obr./min) w temperaturze 4 °C. Zebrać roztwór przeciwciała pierwotnego i zachować w probówce w temperaturze 4 °C do przyszłych eksperymentów.
  4. Najpierw szybko przepłukać próbkę 1x PBS, a następnie przepłukać 3x 1,5 ml buforu do mycia. Przy każdym płukaniu próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 30 minut.
  5. Podczas końcowego płukania przygotuj wtórny roztwór przeciwciał: 1:1,000 anty-królika Alexa 488 lub 568 i 1:1,000 kozy anty-myszy Alexa 488 lub 568 (lub fluorofory do wyboru) w buforze do mycia.
  6. Usunąć bufor do płukania i zabarwić tkanki 1,5 ml roztworu przeciwciał wtórnych. Przykryć próbki folią aluminiową i inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Alternatywnie, próbki można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
  7. Przemyć próbki, najpierw odrzucając wtórny roztwór przeciwciała, a następnie szybko przepłukać próbkę 1x PBS, a następnie trzykrotnie przepłukać 1,5 ml buforu do przemywania wodą. Przy każdym płukaniu próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 30 minut.
  8. Przygotować roztwór DAPI, rozcieńczając DAPI do 10 μg/ml w buforze do mycia. Po ostatnim myciu próbki należy wybarwić 1,5 ml roztworu DAPI w inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  9. Wyrzuć roztwór DAPI i przepłucz próbki 2x w 1,5 ml 1x PBS. Przechowywać zabarwioną chusteczkę w 1,5 ml 1x PBS w ciemności, przykrytą folią aluminiową, w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do zamontowania na szkiełku podstawowym z szkiełkiem nakrywkowym. Etap montażu należy wykonać w ciągu 1 tygodnia.

4. Aktywność cyklu komórkowego (test EdU)

  1. Uzupełnić 10 mM roztwór podstawowy EdU z zestawu Click-iT (patrz tabela materiałów), rozpuszczając proszek EdU w dH20 i mieszając przez ~15 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór podstawowy można podatkować (250 μl na probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Nakarm muchy EdU, najpierw rozcieńczając bulion EdU do 5 mM w dH2O. Dodaj suche drożdże, aż roztwór będzie mętny i krótko wiruj, aby wymieszać. Odetnij nakrętkę probówki o pojemności 0,5 ml i umieść ją na dnie fiolki z pokarmem dla much. Wciśnij nakrętkę w żywność, aby była stabilna.
  3. Znieczulić muchy i przenieść 3-5 dniowe muchy do fiolki. Przyłóż muchy do jednej krawędzi, aby żadna nie utknęła w nasadce.
  4. Odpipetować 75 μl roztworu drożdży-EdU do nakrętki. Muchy powinny być karmione świeżym roztworem drożdży-EdU codziennie i przenoszone do fiolki ze świeżą żywnością z nakrętką co drugi dzień, aby upewnić się, że muchy nie utkną na dnie fiolki.
  5. Aby przenieść muchy, przełóż do nowej fiolki z nakrętką, uśpij muchy, postukaj muchy na bok i dodaj świeży roztwór drożdży-EdU.
  6. Trzeciego dnia zranić muchy i kontynuować karmienie drożdży-EdU aż do rozbioru w 2 dpi (Rysunek 4A). Patrz sekcja 2 protokołu, aby zapoznać się z metodami preparacji i utrwalania.
  7. Przygotować odczynniki do barwienia EdU: bufor do przemywania (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA w 1x PBS), bufor do permeabilizacji (0,5% Triton X 100 w 1x PBS), bufor blokujący (3% BSA w 1x PBS) i przygotować odczynniki z zestawu do oznaczania EdU (patrz tabela materiałów), w tym 1x bufor reakcyjny i 1x dodatek buforu reakcyjnego zgodnie z zaleceniami producenta.
  8. Przemywać próbki przez 1 godzinę, mieszając w temperaturze pokojowej w 1,5 ml buforu do płukania.
  9. Dodać 1,5 ml buforu do permeabilizacji i inkubować próbki przez 20 min.
    UWAGA: Rozmrozić i przygotować roztwór koktajlu reakcyjnego o objętości 500 μl/talerz.
  10. Przemyć próbki 1x szybko za pomocą 1x PBS, a następnie 3x szybko za pomocą 1 ml buforu blokującego.
  11. Odpipetować cały pozostały bufor blokujący i dodać 500 μl roztworu koktajlu reakcyjnego na płytkę. Zakręć płytki, aby upewnić się, że tkanki są całkowicie pokryte. Inkubować w szufladzie w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  12. Przemyj próbki 1x szybko za pomocą 1,5 ml buforu blokującego.
  13. Zabarwić 1,5 ml roztworu DAPI w stosunku 1:5 000 w buforze do płukania przez 30 minut.
  14. Umyj szybko 2x z 1x PBS, zawiń w folię i przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do zamontowania próbek w ciągu 3 dni.

5. Zamontuj poplamioną tkankę

  1. Zaopatrz się we wszystkie potrzebne materiały do montażu: szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, bezbarwny lakier do paznokci, media montażowe, kleszczyki i chusteczki.
  2. Aby zamontować poplamioną tkankę muchy, odpiąć odwłoki od płytki preparacyjnej za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś tkankę do ~30 μl podłoża montażowego na szklanym szkiełku nakrywkowym, delikatnie chwytając tkankę kleszczami za jej grzbietowe boki, uważając, aby nie dotykać kleszczami obszaru brzusznego.
  3. Pod mikroskopem stereoskopowym zorientuj tkankę brzuszną tak, aby wnętrze było skierowane w dół w kierunku szkiełka nakrywkowego (tj. zewnętrzny naskórek/włosie są skierowane do góry). Pociągnij zorientowane brzuchy do krawędzi kropli pożywki za pomocą kleszczy. Napięcie powierzchniowe pomoże utrzymać tkankę płaską (Rysunek 1F).
    UWAGA: W przypadku obrazowania pomocne jest uporządkowanie brzucha w kolumnie lub rzędzie na tym etapie.
  4. Oznacz szkiełko szklane (tj. kontrolne lub eksperymentalne) i podnieś szkiełko nakrywkowe, powoli zbliżając szkiełko nakrywkowe. Odwróć suwak i delikatnie osusz chusteczką, aby usunąć nadmiar nośnika montażowego.
  5. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i powtórz dla wszystkich pozostałych grup eksperymentalnych. Preparaty należy przechowywać w pudełku na preparaty w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do obrazowania.

6. Obrazowanie i przetwarzanie

  1. Zobrazuj obszar rany brzusznej muchy, najpierw lokalizując bliznę melaniny za pomocą mikroskopu konfokalnego (Ryc. 1B), skanera punktowego lub oświetlenia strukturalnego (ApoTome) za pomocą 40-krotnego oleju lub suchego obiektywu.
  2. Sprawdź ekspozycję na każdym kanale, upewniając się, że sygnał jest poniżej nasycenia. Ustawienia obrazowania powinny być oparte na najjaśniejszej grupie próbek. Jest to szczególnie ważne w przypadku analizy ploidalnej, ponieważ kanał DAPI musi pozostać w zakresie liniowym, aby dokładnie zmierzyć zawartość DNA.
  3. Wykonaj pełny obraz stosu z we wszystkich trzech kanałach z optymalną odległością co najmniej 0,50 μm między warstwami. Zapisz przechwycone obrazy i otwórz plik w programie do analizy obrazów Fiji (znanym również jako ImageJ).
  4. Dla każdego obrazu utwórz projekcję stosu z, korzystając z opcji sumy plasterków dla wszystkich kanałów.
  5. W razie potrzeby obróć obrazy, aby upewnić się, że jądra są ułożone poziomo na obrazach (Rysunek 3A i Rysunek 4E).
  6. Przytnij wszystkie obrazy do prostokątnego zaznaczenia o wymiarach 300 μm x 300 μm wyśrodkowanego wokół miejsca rany lub środka nieuszkodzonej kontroli. Zidentyfikuj obszar, rysując prostokąt i wybierając Edytuj | Selekcja | Określ. Sprawdź, czy skalowane jednostki są w mikronach, aby upewnić się, że dla wszystkich analizowanych obrazów używane jest pole o tym samym rozmiarze.

7. Analiza endoreplikacji (ploidalności)

  1. Korzystając z Fidżi, wybierz okno kanału Grh i zduplikuj obraz. Następnie użyj narzędzia próg, aby utworzyć maskę. Ręcznie dostosuj próg, przesuwając górny pasek, aby zminimalizować tło bez powodowania drastycznego kurczenia się jąder (Rysunek 4D).
  2. Jeśli jakiekolwiek jądra w kanale Grh stykają się na obrazie progowym, użyj narzędzia pędzel (szerokość 2 pikseli) w tym samym kolorze co tło, aby narysować linię między jądrami. Kliknij, aby zastosować 1x po zakończeniu, aby wygenerować ostateczną maskę.
  3. Wygeneruj mapę obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą funkcji Analizuj cząstki: ustaw rozmiar na 5 μm-60 μm, aby uchwycić większość jąder bez uwzględniania tła.
  4. Ręcznie dostosuj mapę ROI zgodnie z potrzebami w menedżerze ROI. Usuń wszystkie wybory, które nie są jądrami i dodaj do listy wszystkie jądra, które nie zostały zidentyfikowane, obrysowując jądro za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego i dodając je do menedżera ROI (Rysunek 4D).
  5. Wybierz kanał DAPI, a następnie kliknij przycisk Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby zastosować wygenerowaną mapę ROI w kanale Grh do kanału DAPI.
  6. Usuń wszystkie wybory, w których kontur jąder nabłonka nakłada się na jądra nienabłonkowe (np. jądra z mięśni lub tłuszczu) z mapy ROI. Grainyhead barwi tylko jądra nabłonkowe, podczas gdy DAPI barwi wszystkie jądra. Sprawdź, czy każde zaznaczenie zawiera tylko jedno jądro i usuń lub edytuj wszystkie zaznaczenia zawierające więcej niż jedno jądro. Zapisz edytowaną listę ROI.
  7. Zmierz obszar i zintegrowaną gęstość każdego jądra nabłonka na mapie ROI za pomocą narzędzi analitycznych na Fidżi. Wyeksportuj wartości do programu arkusza kalkulacyjnego.
  8. Zmierz średnie tło obrazu za pomocą narzędzia do zaznaczania kołowego. Narysuj trzy okręgi, które nie zachodzą na żadne jądra w różnych obszarach obrazu DAPI. Dodaj obszar i zintegrowaną gęstość każdego z okręgów do programu arkusza kalkulacyjnego, aby ustalić jasność obrazu tła.
  9. Zacznij od obliczenia średniej liczby tła na jednostkę obszaru dla każdego obrazu, dzieląc każdą wartość gęstości zintegrowanego tła przez odpowiadający jej obszar. Następnie uśrednij trzy zintegrowane pomiary gęstości na obszar dla obrazu, aby uzyskać średnie tło na jednostkę obszaru.
  10. Następnie oblicz całkowite tło każdego jądra DAPI, mnożąc powierzchnię jądra przez średnie tło na jednostkę powierzchni. Znormalizowaną intensywność DAPI dla każdego mierzonego jądra można następnie obliczyć, odejmując całkowite tło każdego jądra od jego zmierzonej gęstości zintegrowanej.
  11. Uśrednić wszystkie znormalizowane wartości intensywności DAPI z kontroli nieuszkodzonego nabłonka. Nieuszkodzone jądra nabłonkowe zostały wcześniej obliczone jako mające wartość ploidalności 2C i mogą służyć jako odniesienie do obliczania ploidalności w jądrach nabłonka na podstawie warunków eksperymentalnych8.
  12. Oblicz ploidalność każdego jądra, dzieląc znormalizowaną intensywność DAPI każdego jądra przez znormalizowaną wartość z referencyjnej kontroli nieuszkodzonego nabłonka (2C), a następnie pomnóż wartość przez 2, aby zrównać się znormalizowanej ploidalności (wartość C):
    (Zintegrowana gęstość jądrowa - Zintegrowana gęstość jądrowa tła)/Średnia zintegrowana gęstość jądrowa (nieuszkodzone jądra nabłonkowe = 2C) x 2 = ploidalność jądra nabłonka (C)
  13. Wykres jąder z wartościami ploidalności jako wykres punktowy, histogram lub odpowiednio zgrupowany w wykres słupkowy (tj. 2C [0,6-2,9C], 4C [3,0-5,9C], 8C [6,0-12,9C], 16C [13,0-24,9C] i >32C [>25,0C] (Rysunek 3F).

Wyniki

Przedstawiono szczegółowy protokół wykorzystania D. melanogaster jako modelu do badania poliploidyzacji indukowanej zranieniem (WIP). Ten model gojenia ran oferuje wiele zalet w porównaniu z ssakami oraz innymi modelami much w badaniach nad WIP. Poliploidię łatwo było wywołać poprzez mechaniczne nakłucie szpilką entomologiczną, a komórki poliploidalne powstawały w krótkim czasie (2-3 dpi) (Rycina 1A, 1B)4. Głównym wyzwaniem jest wypreparowanie nienaruszonej tkanki brzusznej bez zakłócania struktury nabłonka. Nabłonek D. melanogaster jest podatny na przypadkowe uderzenia lub zadrapania ostrymi narzędziami preparacyjnymi. Dlatego przed przystąpieniem do analizy należy przećwiczyć poszczególne kroki niniejszego protokołu.

W pierwszej kolejności uraz ograniczono do brzusznej strony odwłoka samicy, która zapewnia duży, płaski i nieprzezroczysty obszar tkanki, idealny do obrazowania. Rany kłute zadano w nabłonku pleurytów, znajdującym się po obu stronach brzusznych sternitów linii środkowej, celując pomiędzy segmentami tergitów (T) T4-T5 (Rysunek 1A-C). Takie rozmieszczenie ran zapewnia duży widoczny obszar, który nie zostaje naruszony podczas sekcji. Trudne etapy obejmują cięcie odwłoka nożyczkami sprężynowymi oraz przypinanie (Rysunek 1D, 1E). Cięcie nożyczkami sprężynowymi przebiegało najskuteczniej, gdy odwłoki przecinano w niewielkiej objętości roztworu Grace'a (~30 µL), aby ograniczyć ruch tkanki. Konieczne było wykonanie precyzyjnego cięcia wzdłuż grzbietowej linii środkowej, aby zapewnić wystarczającą powierzchnię płatów grzbietowych odwłoka do ich przypięcia w pozycji otwartej na płytce sekcyjnej (Rysunek 1C). Odwłok należy delikatnie przypiąć w czterech narożnikach, nie używając nadmiernej siły (Rysunek 1E). Zbyt mocne dociśnięcie szpilką spowoduje zniekształcenie tkanki odwłoka, a nawet jej wciśnięcie w płytkę sekcyjną. W takim przypadku tkankę należy odrzucić. Po utrwaleniu tkanki odwłoka pozostawała ona na płytce sekcyjnej aż do zakończenia barwienia immunofluorescencyjnego i zamontowania odwłoków na szkiełku podstawowym w celu obrazowania (Rysunek 1F).

Gojenie ran wymaga utworzenia ciągłej warstwy nabłonka, co jest zależne od endoreplikacji i fuzji komórek4,16. Białko złączeń septalnych FasIII, służące do znakowania złączeń międzykomórkowych, stanowiło wskaźnik pozwalający ocenić, czy podczas przygotowania wystąpiły jakiekolwiek zaburzenia procesowe (Rysunek 1G, 1H). Odwłoki z dużymi zadrapaniami (obszary niezbarwione), które zaburzają obszar rany, muszą zostać odrzucone i nie były wykorzystywane do dalszych analiz (Rysunek 1H).

Kolejnym krokiem była analiza nienaruszonych próbek pod kątem wszelkich defektów w procesie WIP. Niniejszy protokół obejmuje oddzielne testy służące do wykrywania różnych aspektów odpowiedzi WIP (Rysunek 2). Naprawa rany została uznana za zakończoną, gdy centralna, duża, wielojądrowa komórka pokryła strup rany (Rysunek 3A). Fuzję komórek wykryto poprzez barwienie na FasIII/Grh i kwantyfikację liczby jąder nabłonkowych Grh+ objętych obszarem wyznaczonym przez FasIII4. Defekty w zamykaniu rany lub reepitelializacji stwierdzano w przypadku zaobserwowania przerw o szerokości >10 µm w płacie nabłonka (Rysunek 3B, czerwona strzałka). Miało to miejsce na przykład wtedy, gdy WIP został zahamowany poprzez aktywację cyklu mitotycznego za pomocą ekspresji stg, fzrRNAi, co zgłoszono w niedawnych doniesieniach16. W tym wariancie genetycznym 52% ran nie było w stanie utworzyć ciągłego płata nabłonka nad strupem rany (Rysunek 3B, 3C).

Inną metodą pomiaru naprawy rany w tym modelu była wizualizacja błony nabłonkowej za pomocą ekspresji UAS-mCD8-ChRFP pod kontrolą epi-Gal44 (Rysunek 2, Rysunek 3D). W grupie kontrolnej 91% ran nabłonkowych zamknęło się całkowicie do 3 dpi, natomiast jednoczesne hamowanie WIP poprzez blokowanie endoreplikacji (E2f1RNAi) i fuzji komórek (RacDN), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, spowodowało, że 92% ran nabłonkowych pozostało całkowicie otwartych (Rysunek 3D, 3E)8,16. Aktywacja mitotycznego cyklu komórkowego poprzez ekspresję stg, fzrRNAi również doprowadziła do defektu zamknięcia rany nabłonkowej. Jednakże dzięki wizualizacji błony komórkowej nabłonka można było określić stopień defektu reepitelializacji. Rany much mutantów WIP (E2f1RNAi, RacDN) były bardziej otwarte niż rany stg, fzrRNAi (Rysunek 3D, przerywany czerwony obrys)16. Ten test gojenia rany w oparciu o obrazowanie błony dostarczył więcej informacji na temat zakresu defektu naprawy rany. W rezultacie defekty reepitelializacji można było podzielić na rany całkowicie otwarte, częściowo zamknięte (tj. szczeliny >10 µm) lub całkowicie zamknięte (Rysunek 3D, 3E).

Oprócz fuzji komórek, komórki nabłonka zwiększają swoje rozmiary poprzez endoreplikację, czyli niepełny cykl komórkowy, który podwaja zawartość DNA w jądrze. Endoreplikację analizowano zarówno poprzez badanie aktywności cyklu komórkowego, jak i bezpośrednie pomiary ploidalności DNA jądrowego (Rysunek 2 oraz Rysunek 4). W tym przypadku aktywność cyklu komórkowego wykryto poprzez włączenie analogu tymidyny, EdU (Rysunek 4A, 4B). Stwierdzono, że komórki nabłonka D. melanogaster wchodzą w endocykl, czyli niepełny cykl komórkowy, który oscyluje między fazami S i G bez intervening fazy M4,12. Dietę dorosłych D. melanogaster uzupełniono o pokarm z EdU+ przed wystąpieniem urazu, a muchy utrzymywano na diecie EdU+ aż do momentu sekcji w 2 dpi (Rysunek 4A). Następnie EdU wykryto przy użyciu protokołu Click-iT producenta. Analiza EdU została wykorzystana do określenia, gdzie, kiedy i ile jąder zostało pobudzonych do wejścia w fazę S w odpowiedzi na ranę. Wykorzystując system Gal4/ UAS, niedawno odkryto, że specyficzna dla nabłonka ekspresja genu myc może albo blokować (mycRNAi), albo nasilać (nadekspresja Myc) zdolność komórek nabłonka do wejścia w fazę S. W rezultacie wykazano, że Myc jest wystarczający do indukcji endoreplikacji w komórkach postmitotycznych, nawet bez urazu16,22.

Następnie ploidię nabłonka określono poprzez bezpośredni pomiar zawartości DNA w jądrach komórkowych. Jądra komórek nabłonka zidentyfikowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego markerem specyficznym dla nabłonka, Grh (Rycyna 4D). W oprogramowaniu do obrazowania Fiji systematycznie zidentyfikowano jądra nabłonka, a następnie zastosowano progowanie na podstawie barwienia jądrowego Grh. Następnie jądra rozdzielono, a obszary zainteresowania (ROI) nałożono na obraz sumy stosów DAPI (Rycyna 4D, zielona strzałka). Wszelkie nakładające się jądra usunięto ręcznie przed pomiarem gęstości zintegrowanej (Integrated Density) wybranych jąder (Rycyna 4D, czerwone strzałki). Ta półautomatyczna metoda pozwala na ilościowe określenie rozkładu i ploidii większości jąder w nieuszkodzonym i zregenerowanym nabłonku brzusznym muchy8. Jak niedawno zgłoszono, jądra nabłonka otaczające ranę w 3 dpi składały się w 44% z jąder poliploidalnych o zawartości DNA powyżej 3C (Rycyna 4E, 4F)16. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z rezultatów EdU, wyciszenie genu myc doprowadziło do znaczącej blokady endoreplikacji, gdyż tylko 9% jąder nabłonka było poliploidalnych, podczas gdy nadekspresja Myc spowodowała, że 100% jąder nabłonka wokół miejsca rany było poliploidalnych (Rycyna 4F)16. Rozmiar jąder nabłonka był również widocznie zależny od ekspresji myc, co objawiało się występowaniem jąder pomniejszonych lub powiększonych. Jednakże pole powierzchni jądra nie jest dokładną miarą ploidii i efektów fizjologicznych, ponieważ czynniki takie jak rozciąganie komórek mogą również wpływać na rozmiar jądra bez zmiany zawartości DNA w jądrze20.

Genetyka segmentacji Drosophila; układ eksperymentalny i obrazy mikroskopowe; wyniki analizy genów.
Rysunek 1: Powodowanie ran brzucha, sekcja i montaż tkanek dorosłej muszki owocówki. (A) Schemat testu powodowania ran brzucha u osobników dorosłych. Muchy powinny zostać zranione po obu stronach odwłoka na poziomie 4. tergitu (T4). (B) Dorosła samica muszki owocówki 3 dpi z melanchinistycznym strupem powstałym w wyniku gojenia rany (biała ramka). Pasek skali = 50 µm. (C) Sekcja brzucha dorosłego osobnika, widok grzbietowy, z oznaczonymi tergitami. Brzuchy zostały rozcięte wzdłuż linii środkowej strony grzbietowej (biała przerywana linia). Pasek skali = 50 µm. (D) Zsekcjonowane i rozcięte brzuchy dorosłych osobników przed przypięciem. Pasek skali = 50 µm. (E) Przypięty brzuch dorosłego osobnika na płytce sekcyjnej. Szpilkę umieszczono w każdym z czterech rogów brzucha od strony grzbietowej. Tkankę delikatnie otwarto, ale nie rozciągano jej, aby uniknąć rozerwania. (F) Brzuchy dorosłych osobników zostały zamontowane i umieszczone na szkiełku nakrywkowym wewnętrzną stroną brzucha skierowaną w dół, ku szkiełku nakrywkowe, a kutykulą w stronę szkiełka przedmiotowego. (G) Barwienie FasIII nienaruszonego obszaru rany bez zakłóceń podczas obróbki oraz centralny syncytium (żółta przerywana linia). Pasek skali = 50 µm. (H) Obraz zadrapanego obszaru rany (*) z nieobarwionym regionem FasIII, który przerywa syncytium. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu immunofluorescencyjnego u muszki owocowej; epi-Gal4/UAS-X, podawanie EdU, wizualizacja połączeń komórkowych.
Rycina 2: Schemat analizy WIP. Przepływ działań przedstawia trzy testy opisane w niniejszym badaniu oraz wspólne i odrębne etapy służące wykrywaniu i pomiarowi odpowiedzi WIP. Test EdU mierzy aktywność cyklu komórkowego (niebieskie pola), ploidię i reepitelializację wykrywa się za pomocą immunostainingu Grh/FasIII (zielone pola), a ekspresja membranowego RFP umożliwia pomiar zakresu zamknięcia rany nabłonkowej (różowe pola). Wspólne etapy znajdują się w szarych polach, a genotypy szczepów D. melanogaster wymieniono powyżej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza gojenia rany, obrazy mikroskopowe i wykres słupkowy przedstawiające zmienność reepitelializacji w próbkach.
Rycina 3: Metody wykrywania reepitelializacji podczas WIP. Reepitelializacja została zaburzona w przypadku genetycznego zahamowania WIP. Obrazy immunofluorescencyjne grupy kontrolnej (A) oraz stg, fzrRNAi (B) w 3 dpi. Jądra komórek nabłonkowych i złącza smugowe zostały zabarwione odpowiednio Grh (zielony) i FasIII (magenta). (A' i B') Samo zabarwienie FasIII wykazało, że reepitelializacja była upośledzona (czerwona strzałka) w nabłonku stg, fzrRNAi. Pasek skali = 50 µm. (C) Ilościowe określenie defektów reepitelializacji (%) w 3 dpi (szary): kontrola (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). Słupki błędu oznaczają błąd standardowy; istotność statystyczną zmierzono za pomocą testu t Studenta, **P < 0.01. Reepitelializację podczas naprawy rany można było również wykryć poprzez ekspresję związanego z błoną białka RFP przy użyciu epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Obrazy immunofluorescencyjne kontroli, E2F1RNAi, RacDN oraz stg, fzrRNAi w 3 dpi. Pasek skali = 20 µm. Strup rany (żółty obrys) i obszar otwartej rany nabłonkowej (czerwony obrys). (E) Ilościowe określenie zamknięcia rany w ctrl (n = 11), E2F1RNAi, RacDN (n = 13) oraz stg, fzrRNAi (n = 13). Adaptowano z Grendler et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie regeneracji nabłonka muchy; znakowanie EdU, efekt mycRNAi, histogram, analiza jąder, mikroskopia.
Rysunek 4: Metody wykrywania endoreplikacji podczas WIP. (A) Harmonogram testu EdU: dorosłe Drosophila były karmione 75 µL 5 mM drożdży-EdU każdego dnia przez 2 dni przed uszkodzeniem, a następnie do 2 dpi. (B) Obrazy immunofluorescencyjne znakowania EdU w szczepach much wykazujących ekspresję systemu epi-Gal4/ UAS w 2 dpi. Strup rany (W). Pasek skali = 50 µm. (C) Średnia liczba jąder nabłonka EdU+ na muchę w 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi#1 (n = 10) oraz Myc (n = 8). Słupki błędu oznaczają błąd standardowy; istotność statystyczną określono za pomocą testu t-Studenta, *P < 0.05, **P < 0.01. (D) Schemat wykrywania i pomiaru ploidalności jąder nabłonka. Jądra nabłonka zostały zidentyfikowane i poddane progowaniu za pomocą barwienia przeciw-Grh w programie Fiji. Nakładające się jądra nabłonka zostały rozdzielone (zielone groty strzałek) lub usunięte (czerwone groty strzałek), jeśli były przesłonięte przez jądra nienabłonkowe. Zmierzono gęstość zintegrowaną oraz pole powierzchni jądra na odpowiadającym im obrazie jąder barwionych DAPI. (E) Wielkość jąder nabłonka (Grh) uległa zmianie pod wpływem ekspresji myc w 3 dpi. (F) Ploidalność jąder nabłonka (%) w 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi#1 (n = 6) oraz Myc (n = 3). Adaptowano z Grendler et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiono szczegółowy protokół dotyczący preparowania i wykorzystania nabłonka brzusznego dorosłego D. melanogaster do zbadania, w jaki sposób geny regulują WIP poprzez zmianę reepitelializacji i endoreplikacji podczas gojenia się ran16. Korzystając z tej metody, protoonkogen Myc został niedawno zidentyfikowany jako kluczowy regulator WIP. Myc jest wymagany, aby komórki nabłonkowe mogły się replikować po urazie i jest wystarczający do endocyklu komórek nabłonka w stanie spoczynku zarówno w nabłonku dorosłej muchy, jak i gruczołach dodatkowych16,22. Stwierdzono również, że przełączanie komórek nabłonka na mitotyczny cykl komórkowy przez ekspresję stg, fzrRNAi jest szkodliwe dla gojenia się ran. Kontynuowane badania z wykorzystaniem tej metody zidentyfikują inne geny wymagane do regulacji reepitelializacji i endoreplikacji podczas WIP, ujawniając zarówno podobieństwa, jak i różnice w sposobie regulacji i funkcjonowania poliploidii w różnych tkankach.

Ten model i metoda oferują wyjątkowe zalety, w tym łatwą indukcję poliploidalności za pomocą mechanicznego nakłucia oraz fakt, że komórki poliploidalne są generowane w ciągu kilku dni4. Protokoły preparacji i przygotowania tkanek opierają się na technikach preparacji larw23, ale odwłok dorosłej muchy jest sztywniejszy i dlatego łatwo ulega zaburzeniom. W rezultacie, protokół ten wymaga praktyki i precyzji, aby wyizolować nienaruszoną tkankę do badania WIP. Jednak po wypreparowaniu nabłonek jest wyraźnie widoczny i łatwy do zobrazowania, co daje obraz procesu gojenia się ran. Metoda ta dostarcza wielu informacji na temat organizacji nabłonka dorosłej muchy, wielkości komórek i syncytium oraz ploidalności komórek i poszczególnych jąder. Chociaż obrazowanie na żywo w nienaruszonej muszce owocowej nie jest jeszcze możliwe ze względu na jej nieprzezroczysty naskórek, protokół ten można dostosować tak, aby uwzględniał obecnie dostępne warunki hodowli ex vivo stosowane u D. melanogaster w celu przeprowadzenia krótkoterminowych badań obrazowania na żywo24.

W przyszłości model ten będzie idealny do badania przesłuchów międzykomórkowych i udziału innych typów komórek w WIP poprzez regulację ekspresji genów za pomocą systemu Gal4/UAS w innych typach komórek będących przedmiotem zainteresowania. Na podobne pytania można również odpowiedzieć, korzystając z różnych środowisk genetycznych i zmutowanych. Wypreparowany odwłok dorosłej muchy zawiera różne typy komórek, które można łatwo zobrazować za pomocą tej metody, w tym ciało tłuszczowe i enocyty, boczne włókna mięśniowe, neurony czuciowe, tchawica i hemocyty podobne do makrofagów. Ponadto model ten pozwoli naukowcom zbadać, w jaki sposób zmienne fizjologiczne wpływają na WIP, w tym płeć, dieta, infekcje, wiek i stresory środowiskowe. Podczas gdy w protokole wykorzystuje się dorosłą samicę muchy ze względu na jej większy rozmiar, WIP występuje również u samców muszki owocowej (Gjelsvik i Losick, niepublikowane). Stwierdzono, że komórki poliploidalne powstają podczas starzenia się i chorób związanych z wiekiem w wątrobie, mózgu, oku i sercu ssaków12. Model muszki owocowej umożliwi naukowcom badanie poliploidyzacji w kontekście fizjologicznym i chorobowym, ponieważ geny związane z chorobami ludzkimi są wysoce konserwatywne.

Podziękowania

W Boston College chcielibyśmy podziękować Dr. Ericowi Folkerowi za korzystanie z kamery i mikroskopu stereoskopowego w jego laboratorium do obrazowania oraz Bretowi Judsonowi z Boston College Imaging Core za infrastrukturę i wsparcie. Chcielibyśmy również podziękować zasobom społeczności muchowej: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center i TRiP Center at Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) za dostarczenie transgenicznych zapasów wykorzystanych w tym badaniu. Mysie przeciwciało FasIII uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank wspieranego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer R35GM124691. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki Petriego 35 mmFisher ScientificFB0875713Do tworzenia płytek do preparacji w
stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 mlFisher Scientific14-432-22Do przygotowania odczynników barwiących w
AxioImager M2 z ApotomeZeissNADo obrazowania próbek
Dmuchawka miniGenesee Scientific54-104MDo znieczulania D. melanogaster szczepy
Albumina surowicy bydlęcej, 30%SigmaA7284-500MLDo barwienia immuostainowego
Zbiornik na dwutlenek węglaróżne dystrybutoryNie dotyczyDo znieczulania szczepów D. melanogaster
Zestaw Click-iT EdU 594 ThermofisherC10339Do testu EdU
Szkiełka nakrywkoweThermofisher3406Do montażu
DAPISigmaD9542-10MGDo barwienia immuostainingu
płytek preparacyjnych (użyj zestawu Sylgard 184 Sil Elastic Kit)Kleje Ellsworth184SILDo tworzenia płytek do preparacji. Wymieszaj żywicę epoksydową zgodnie z zaleceniami, pozostaw do wyschnięcia na noc
Przeciwciało drugorzędowe anty-królikowe IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 488ThermofisherA21206Do wtórnego barwienia immuostainicznego
Przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 568ThermofisherA10042Do wtórnego barwienia immuostainu
Rurki i złączki DrosophilaGenesee Scientific59-124C, 59-123, 59-140Do znieczulania szczepów D. melanogaster
Dumont #5 KleszczeNarzędzia do nauki11252-20Do preparowania
epi-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center (b)b38793Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFPBloomington Drosophila Stock Center (b)b38793, b27392Losick et al. Current Biology, 2013
ExcelMicrosoftDo wykonywania obliczeń ploidalnych
Fidżi/ImageJ (oprogramowanie do analizy obrazu)NIHa href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ijDo analizy obrazu
Pokarm dla muchArchon ScientificN/ASyrop kukurydziany/pokarm sojowy
Flystuff FlypadGenesee Scientific59-114Do znieczulania D. szczepy melanogaster
Szklana miska preparcyjnaFisher Scientific13-748BDo wykonywania sekcji w
szkiełkach szklanychFisher Scientific12-518-104CDo montażu
koziego przeciwciała anty-mysiego IgG (H + L), koniugat Alexa Fluor 488ThermofisherA11001Do wtórnego barwienia immuotyka
Kozioł anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Drugorzędowe, Alexa Fluor 568 koniugatThermofisherA11031Do wtórnego barwienia immunologicznego
Grace's Insects Medium, niesuplementowanyThermofisher11595030Do preparowania w
Szpilki do owadówFine Science Tools26002-10Do ranienia i przypinania płaskich odwłoków much
Mysz anty-Fasciclin III (Drosophila) Pierwotne przeciwciałoBadania rozwojowe Hybridoma Bank7G10Do barwienia immunologicznego połączeń komórka-komórka nabłonkowa
Pożywki do barwieniaVector LaboratoriesH-1000Antyblakowy nośnik montażowy zapobiegający wybielaniu zdjęć podczas obrazowania
Lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences72180Do uszczelniania szkiełek
Wytrząsarka ortibalFisher Scientific02-217-988Do barwienia immuostainu
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, PH 7.4SigmaP3813-10PAKDo barwienia
uchwytów na szpilkiFine Science Tools91606-07Do ranienia
pierwotnego przeciwciała przeciwziarnistego królikaNiedotyczyDo barwienia immunologicznego jąder nabłonkowych. Protokół wytwarzania przeciwciała można znaleźć (Ref. # 4 i 8)
Królicze przeciwciało pierwotne anty-RFPMBLPM005Do barwienia immunologicznego nabłonka muchy mCD8-RFP
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZ51Do preparowania i montażu tkanki muchy
Triton X-100Sigma10789704001Do barwienia immuostainu
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDNVDRC (v) i Bloomington Drosophila Stock Center (b)v108837, b6292Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-StgVDRC (v) i Bloomington Drosophila Stock Center (b)v25550, b56562Grendler et al. Rozwój, 2019
UAS-MycBloomington Drosophila Stock Center (b)b9674Grendler i wsp. Rozwój, 2019
UAS-myc RNAiBloomington Drosophila Stock Center (b)b36123Grendler i wsp. Rozwój, 2019
Vannas Spring ScissorsNarzędzia do nauki15000-00Do preparacji
< Nie dotyczy

Bibliografia

  1. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Liu, R., Watts, J. J., Parkhurst, S. M. Drosophila embryos close epithelial wounds using a combination of cellular protrusions and an actomyosin purse string. Journal of Cell Science. 125 (Pt 24), 5984-5997 (2012).
  2. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  3. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biology. 2 (8), E239(2004).
  4. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  5. Wang, Y., et al. Integrin Adhesions Suppress Syncytium Formation in the Drosophila Larval Epidermis. Current Biology. 25 (17), 2215-2227 (2015).
  6. Ramos-Lewis, W., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. A scar-like lesion is apparent in basement membrane after wound repair in vivo. Matrix Biology. 74, 101-120 (2018).
  7. Lee, C. W., Kwon, Y. C., Lee, Y., Park, M. Y., Choe, K. M. cdc37 is essential for JNK pathway activation and wound closure in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 30 (21), 2651-2658 (2019).
  8. Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals. PLoS One. 11 (3), e0151251(2016).
  9. Tamori, Y., Deng, W. M. Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia. Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).
  10. Xiang, J., et al. EGFR-dependent TOR-independent endocycles support Drosophila gut epithelial regeneration. Nature Communications. 8, 15125(2017).
  11. Cohen, E., Allen, S. R., Sawyer, J. K., Fox, D. T. Fizzy-Related dictates A cell cycle switch during organ repair and tissue growth responses in the Drosophila hindgut. Elife. 7, e38327(2018).
  12. Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. Solving the Polyploid Mystery in Health and Disease. Trends in genetics: TIG. 35 (1), 6-14 (2019).
  13. Cao, J., et al. Tension Creates an Endoreplication Wavefront that Leads Regeneration of Epicardial Tissue. Developmental Cell. 42 (6), 600-615 (2017).
  14. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  15. Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344(2018).
  16. Grendler, J., Lowgren, S., Mills, M., Losick, V. P. Wound-induced polyploidization is driven by Myc and supports tissue repair in the presence of DNA damage. Development. 146 (15), 173005(2019).
  17. Mehrotra, S., Maqbool, S. B., Kolpakas, A., Murnen, K., Calvi, B. R. Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress. Genes & Development. 22 (22), 3158-3171 (2008).
  18. Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
  19. Gonzalez-Rosa, J. M., et al. Myocardial Polyploidization Creates a Barrier to Heart Regeneration in Zebrafish. Developmental Cell. 44 (4), 433-446 (2018).
  20. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. Journal of Cell Science. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  21. Knouse, K. A., Lopez, K. E., Bachofner, M., Amon, A. Chromosome Segregation Fidelity in Epithelia Requires Tissue Architecture. Cell. 175 (1), 200-211 (2018).
  22. Box, A. M., et al. Endocycles support tissue growth and regeneration of the adult Drosophila accessory gland. bioRxiv. , 719013(2019).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. Journal of Visualized Experiments. (57), e3111(2011).
  24. Dai, W., Montell, D. J. Live Imaging of Border Cell Migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ploidalność komórek nabłonkowychtest rany kłutejzranienie brzucharoztwór Grace'abiałko złączy przegrodowychzawartość DNA jądrowegowbudowywanie EdUdefekt gojenia rany
Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.