Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61264

⸱

31 sierpnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Streszczenie

Polimery białek neurofilamentowych poruszają się wzdłuż aksonów w powolnym komponencie transportu aksonalnego ze średnią prędkością ~0,35-3,5 mm/dzień. Do niedawna badanie tego ruchu in situ było możliwe tylko przy użyciu radioizotopowego znakowania impulsami, które pozwala na analizę transportu aksonalnego w całych nerwach z rozdzielczością czasową dni i rozdzielczością przestrzenną milimetrów. Aby zbadać transport neurofilamentów in situ z wyższą rozdzielczością czasową i przestrzenną, opracowaliśmy transgeniczną mysz hThy1-paGFP-NFM, która eksprymuje białko neurofilamentu M oznaczone fotoaktywowalnym GFP w neuronach. Tutaj opisujemy metody fluorescencji, fotoaktywacji, ucieczki impulsów i rozprzestrzeniania impulsów w celu analizy transportu neurofilamentów w pojedynczych mielinowanych aksonach nerwów piszczelowych od tych myszy ex vivo. Izolowane segmenty nerwowe są utrzymywane na stoliku mikroskopowym przez perfuzję z natlenioną solą fizjologiczną i obrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem. Światło fioletowe służy do aktywacji fluorescencji w krótkim oknie aksonalnym. Fluorescencja w obszarach aktywowanych i flankujących jest analizowana w czasie, co pozwala na badanie transportu neurofilamentów z rozdzielczością czasową i przestrzenną odpowiednio rzędu minut i mikronów. Modelowanie matematyczne można wykorzystać do wyodrębnienia parametrów kinetycznych transportu neurofilamentów, w tym prędkości, odchylenia kierunkowego i zachowania pauzy z uzyskanych danych. Metody ucieczki i rozprzestrzeniania się impulsu mogą być również dostosowane do wizualizacji transportu neurofilamentów w innych nerwach. Wraz z rozwojem dodatkowych myszy transgenicznych, metody te mogą być również wykorzystywane do obrazowania i analizowania transportu aksonalnego innych białek cytoszkieletu i cytozolu w aksonach.

Wprowadzenie

Axonalny transport neurofilamentów został po raz pierwszy zademonstrowany w latach siedemdziesiątych przez radioizotopowe znakowanie impulsami1. Podejście to dostarczyło wielu informacji na temat transportu neurofilamentów in vivo, ale ma stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną i czasową, zwykle rzędu milimetrów i dni w najlepszym razie2. Co więcej, znakowanie impulsami radioizotopowymi jest podejściem pośrednim, które wymaga wstrzyknięcia i poświęcenia wielu zwierząt w celu wygenerowania jednego przebiegu czasowego. Wraz z odkryciem białek fluorescencyjnych i postępami w mikroskopii fluorescencyjnej w latach 90., możliwe stało się obrazowanie transportu neurofilamentów bezpośrednio w hodowanych neuronach w skali sekund lub minut i z submikrometrową rozdzielczością przestrzenną, co daje znacznie lepszy wgląd w mechanizm ruchu3. Badania te wykazały, że polimery neurofilamentów w aksonach poruszają się szybko i z przerwami zarówno w kierunku następczym, jak i wstecznym wzdłuż torów mikrotubul, napędzane przez białka motoryczne mikrotubul. Jednak neurofilamenty są strukturami o ograniczonej dyfrakcji o średnicy zaledwie 10 nm, które są zwykle oddalone od swoich sąsiadów o zaledwie kilkadziesiąt nanometrów; W związku z tym polimery mogą być śledzone tylko w hodowanych neuronach, które zawierają słabo rozmieszczone neurofilamenty, dzięki czemu poruszające się polimery mogą być rozdzielone od ich sąsiadów4. W związku z tym obecnie nie jest możliwe śledzenie pojedynczych neurofilamentów w aksonach, które zawierają obfite polimery neurofilamentów, takie jak aksony mielinizowane.

Aby przeanalizować transport aksonalny neurofilamentów w aksonach bogatych w neurofilamenty za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używamy metody ucieczki impulsu fotoaktywacji fluorescencji, którą opracowaliśmy w celu zbadania długoterminowego zachowania neurofilamentów w hodowanych komórkach nerwowych4,5. Neurofilamenty oznaczone fotoaktywowalnym fluorescencyjnym białkiem fuzyjnym neurofilamentu są aktywowane w krótkim segmencie aksonu, a następnie szybkość opuszczania tych włókien z aktywowanego obszaru jest określana ilościowo, mierząc zanik fluorescencji w czasie. Zaletą tego podejścia jest to, że jest to analiza transportu neurofilamentów na poziomie populacji, która może być stosowana w skali czasu minut lub godzin bez konieczności śledzenia ruchu poszczególnych polimerów neurofilamentu. Na przykład użyliśmy tej metody do analizy kinetyki transportu neurofilamentów w kulturach mielinizujących6.

Niedawno opisaliśmy rozwój transgenicznej myszy transgenicznej hThy1-paGFP-NFM, która wykazuje niski poziom białka neurofilamentu M (paGFP-NFM) znakowanego paGFP w neuronach pod kontrolą ludzkiego specyficznego dla neuronów promotora Thy17. Mysz ta umożliwia analizę transportu neurofilamentów in situ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym artykule opisujemy eksperymentalne podejścia do analizy transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach nerwów piszczelowych od tych myszy przy użyciu dwóch podejść. Pierwszym z tych podejść jest opisana powyżej metoda ucieczki impulsów. Metoda ta może generować informacje o zachowaniu neurofilamentów podczas pauzy, ale jest ślepa na kierunek, w którym włókna opuszczają aktywowany obszar, a zatem nie pozwala na pomiar kierunkowości netto i prędkości transportu8. Drugim z tych podejść jest nowa metoda rozpraszania impulsów, w której analizujemy nie tylko utratę fluorescencji z aktywowanego obszaru, ale także przejściowy wzrost fluorescencji w dwóch oknach bocznych, przez które poruszają się włókna fluorescencyjne, opuszczając aktywowany obszar zarówno w kierunku następczym, jak i wstecznym. W obu podejściach parametry transportu neurofilamentów, takie jak średnia prędkość, kierunkowość netto i zachowanie pauzyjne, można uzyskać za pomocą analizy matematycznej i modelowania zmian fluorescencji w oknach pomiarowych. Rysunek 3 ilustruje te dwa podejścia.

Ten protokół demonstruje preparację i przygotowanie nerwu, aktywację i obrazowanie fluorescencji paGFP oraz kwantyfikację transportu neurofilamentów z pozyskanych obrazów przy użyciu pakietu dystrybucyjnego FIJI ImageJ9. Używamy nerwu piszczelowego, ponieważ jest długi (kilka cm) i nie rozgałęzia się; jednak w zasadzie każdy nerw wyrażający paGFP-NFM jest odpowiedni do stosowania w tej technice, jeśli można go wypreparować i usunąć z osłonki bez uszkadzania aksonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Ohio.

1. Przygotowanie roztworu soli nerwowej

  1. Przygotuj 100 ml soli fizjologicznej Breuera 10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glukozy, 23,8 mM NaHCO3 w podwójnie destylowanej wodzie.
  2. Wprowadzić 95% tlenu/5% dwutlenku węgla (karbogen) przez roztwór soli przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Resztki soli fizjologicznej można ponownie wykorzystać w ciągu tygodnia; Należy go jednak ponownie natlenić przed każdym użyciem.
  3. Wlać natlenioną sól fizjologiczną do strzykawki o pojemności 60 ml i upewnić się, że w strzykawce pozostało jak najmniej powietrza.

2. Wstępny montaż komory perfuzyjnej nerwów

  1. Podłącz strzykawkę i rurkę, jak pokazano na Rysunek 1A, umieszczając rurkę odpływową w kolbie na odpady.
  2. Umieść uszczelkę zewnętrzną w obudowie komory perfuzyjnej, upewniając się, że słupki wlotowe i wylotowe przepływu są wyrównane z otworami w uszczelce.
  3. Połóż uszczelkę wewnętrzną (silikon o grubości 100 μm) na okrągłym szkiełku nakrywkowym #1.5 (średnica 40 mm), ostrożnie wygładzając wszelkie zmarszczki w uszczelce, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Aby ułatwić późniejszy montaż, umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelkę na ręczniku papierowym lub chusteczce roboczej uszczelką skierowaną do góry.

3. Sekcja i przygotowanie nerwu piszczelowego myszy

  1. Zwierzę należy złożyć w ofierze przez wdychanie dwutlenku węgla lub inną metodę zatwierdzoną przez instytucję. Uruchom licznik czasu, gdy zwierzę przestanie się poruszać/oddychać, ponieważ eksperymenty mogą być przeprowadzane tylko w ciągu 3 godzin od złożenia ofiary7.
  2. Spryskaj sierść 70% etanolem i usuń jak najwięcej z nóg i grzbietu zwierzęcia za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.
  3. Używając dużych nożyczek do preparacji, wykonaj nacięcie grzbietowe w skórze w pobliżu środka kręgosłupa i kontynuuj cięcie wokół brzusznej części zwierzęcia. Zaczynając od tego cięcia, powoli odbijaj skórę od nóg, delikatnie odciągając ją od mięśnia i przecinając powięź.
  4. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na tacce sekcyjnej i przypnij wszystkie cztery łapy. Opcjonalnie przypnij ogon, aby jeszcze bardziej ograniczyć ruch.
  5. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji wykonaj nacięcie w mięśniach ud w połowie odległości między ogonem a kolanem, aby odsłonić nerw kulszowy. Upewnij się, że nerw, który jest widoczny przez mięsień, nie jest przecięty.
  6. Przedłuż nacięcie grzbietowo i brzusznie, aby usunąć mięsień. Podobnie usuń mięśnie łydki, utrzymując płytkie i krótkie cięcia, aby uniknąć uszkodzenia nerwu.
  7. Usuń mięśnie, aż nerw piszczelowy zostanie całkowicie odsłonięty od punktu, w którym rozgałęzia się od nerwu kulszowego (w kolanie) do pięty (Rysunek 2A).
    UWAGA: We wszystkich etapach, w tym i po rozwarstwieniu nerwu piszczelowego, należy unikać niepotrzebnej ekspozycji na światło otoczenia, aby zminimalizować możliwą przypadkową aktywację paGFP w nerwie.
  8. Chwyć nerw piszczelowy na bliższym końcu kręgosłupa za pomocą kleszczy i przetnij nerw za pomocą nożyczek do mikrodysekcji. Uważając, aby nie napinać nerwu, odsuń go od mięśnia, odcinając wszelkie przyczepy.
  9. Przeciąć dystalny koniec kręgosłupa nerwu piszczelowego i przenieść na małą szalkę Petriego z natlenionym roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej. Od tego momentu procedury zawsze należy pamiętać o śledzeniu bliższych i dalszych końców nerwu.
    UWAGA: Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest oznaczenie dystalnego końca nerwu cięciem pod kątem, tak aby stożek był widoczny.
  10. Zaczynając od bliższego końca nerwu, delikatnie chwyć odsłonięte końce aksonów parą kleszczyków o bardzo cienkich końcówkach.
  11. Drugą parą kleszczy chwyć osłonkę nerwową proksymalnie i powoli pociągnij w kierunku dystalnego końca nerwu. Osłonka nerwowa będzie przesuwać się wzdłuż aksonów z minimalnym oporem. Upewnij się, że podczas tego procesu na nerw nie jest nadmiernie napięty.

4. Końcowy montaż komory perfuzji nerwów

  1. Chwytając proksymalny koniec nerwu, wyjmij go z soli fizjologicznej i powoli połóż na szkiełku nakrywkowym komory perfuzyjnej w prostokątnym otworze wewnętrznej uszczelki, utrzymując delikatne napięcie nerwu podczas kładzenia go tak, aby leżał prosto.
  2. Umieść suwak mikroakweduktu nad nerwem tak, aby rowkowana strona była skierowana w stronę nerwu, a kierunek przepływu był równoległy do nerwu. Odwróć szkiełko nakrywkowe i zespół mikroakweduktu i umieść go w obudowie komory perfuzyjnej ze zjeżdżalnią mikroakweduktu przymocowaną do zewnętrznej uszczelki. Nerw i otaczająca go uszczelka wewnętrzna zostaną teraz umieszczone między szkiełkiem nakrywkowym a zjeżdżalnią mikroakweduktu, które są oddzielone uszczelką, z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym do góry (Rysunek 1B).
  3. Zabezpiecz komorę perfuzyjną, umieszczając ją w metalowej obudowie i obracając pierścień blokujący. Upewnij się, że plastikowa obudowa znajduje się całkowicie pod wszystkimi metalowymi klipsami i dobrze dokręć, aby zapobiec wyciekowi soli fizjologicznej. Zbyt mocne dokręcenie może spowodować pęknięcie zjeżdżalni mikroakweduktu lub szkiełka nakrywkowego. Odwróć komorę tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w dół.
  4. Powoli wciskać tłok strzykawki z solą fizjologiczną, aby napełnić komorę perfuzyjną. Rurki wlotowe i wylotowe, kolba wylotowa i strzykawka powinny być uniesione nad samą komorą przez cały czas podczas ustawiania i obrazowania. Pozwala to uniknąć syfonowania, które może wprowadzać pęcherzyki lub powodować niestabilność ostrości z powodu podciśnienia w komorze.
  5. Przenieś zestaw perfuzyjny do odwróconego stolika mikroskopowego i zamontuj strzykawkę z solą fizjologiczną w pompie strzykawkowej. Uruchom silnik z odpowiednią prędkością dla natężenia przepływu 0,25 ml/min. Następnie podłączyć i włączyć wbudowany podgrzewacz roztworu ustawiony na 37 °C.
  6. Podłączyć grzałkę obiektywu i ustawić na 37 °C, nanieść olej na obiektyw i włożyć komorę perfuzyjną do stage mocowanie.
  7. Nałóż olej na podkładkę grzejną komory i przymocuj do komory perfuzyjnej. Podłącz i włącz grzałkę komory; ustawić na 37 °C.
    UWAGA: Zmiany temperatury mogą powodować tworzenie się pęcherzyków w komorze perfuzyjnej z powodu odgazowania roztworu. Jeśli tworzą się pęcherzyki, na krótko zwiększ natężenie przepływu roztworu o 5-10x, aż pęcherzyki opróżnią komorę.
  8. Zablokuj komorę perfuzyjną w adapterze stage i doprowadź olej do obiektywu do kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym na spodzie komory.
    UWAGA: Zastosowana tutaj komora Bioptechs z adapterem stolika ASI jest przeznaczona do konfiguracji mikroskopu odwróconego.

5. Aktywacja fluorescencji i akwizycja obrazu

  1. Korzystając z oświetlenia w jasnym polu, skup się na warstwie aksonów na dolnej powierzchni nerwu znajdującej się najbliżej powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2B). Mielinizowane aksony (zwykle o średnicy 1-6 μm u dorosłych myszy) można zidentyfikować po obecności osłonki mielinowej, która jest widoczna w świetle przechodzącym w jasnym polu bez wzmocnienia kontrastu. Szczeliny i węzły Schmidta-Lantermana są również łatwo widoczne. Aksony niezmielinizowane są smuklejsze (zwykle o średnicy <1 μm) i są na ogół obecne w wiązkach (wiązkach Remak), gdzie są na ogół zbyt blisko siebie, aby można je było od siebie rozdzielić.
  2. Jeśli jest to dostępne w mikroskopie, aktywuj system automatycznego ustawiania ostrości, aby utrzymać ostrość w trakcie obrazowania poklatkowego.
  3. Uzyskaj obraz referencyjny w jasnym polu. Zapisz orientację nerwu (kolczaste końce bliższe i dystalne) w odniesieniu do obrazów.
  4. Uzyskaj obraz konfokalny za pomocą lasera 488 nm i filtra emisyjnego odpowiedniego dla paGFP (np. 525/50 nm) w celu zarejestrowania autofluorescencji przed wybielaniem. Utrzymuj moc lasera na niskim poziomie, aby zminimalizować fotowybielanie, z odpowiednio dostosowanym czasem ekspozycji, aby wykryć słaby sygnał. Na przykład reprezentatywne dane uzyskano przy 5% mocy lasera i 4 s ekspozycji. Zapisz ustawienia pozyskiwania, aby użyć ich we wszystkich przyszłych eksperymentach.
    UWAGA: Po fotoaktywacji idealne ustawienia obrazowania zapewnią stosunek sygnału do szumu > 8 i fotowybielanie mniejsze niż 25% oryginalnego sygnału w ciągu 20 obrazów. Aksony mogą być również obrazowane za pomocą szerokokątnej mikroskopii epifluorescencyjnej, tak jak to zrobiliśmy pierwotnie7, ale jakość obrazu będzie gorsza ze względu na brak konfokalności.
  5. Ustaw moc lasera na około 5x normalną moc obrazowania i uzyskaj obraz z czasem naświetlania 3-4 minut. Chociaż nie jest to konieczne, ten krok jest zalecany do wybielania autofluorescencji i innych źródeł niepożądanej fluorescencji w celu zmniejszenia sygnału tła, a tym samym maksymalizacji sygnału do szumu fluorescencji aktywowanej fotoaktywem.
  6. Uzyskaj obraz z ustawieniami użytymi w kroku 5.4, aby zarejestrować autofluorescencję przed aktywacją po tym etapie wybielania.
  7. Na obrazie w jasnym polu narysuj linię równoległą do aksonów o długości równej pożądanemu rozmiarowi okna aktywacji. Długość tego okna będzie się różnić w zależności od celu i parametrów eksperymentalnych, ale typowe długości to 5 μm dla paradygmatu ucieczki impulsu i 40 μm dla paradygmatu rozproszenia impulsu.
  8. Używając tej linii jako przewodnika, narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w poprzek pola widzenia prostopadłego do aksonów. Obszar ten musi obejmować wszystkie aksony, które mają być fotoaktywowane.
  9. Określ optymalne ustawienia fotoaktywacji z oświetleniem 405 nm.
    UWAGA: Ten krok i podkroki należy wykonywać tylko przed pierwszą aktywacją eksperymentalną. W trakcie eksperymentu należy użyć tych samych ustawień fotoaktywacji.
    1. Aktywuj obszar zainteresowania wielokrotnie za pomocą linii laserowej 405 nm, niskiej mocy lasera (np. 5%) i czasu przebywania pikseli (np. 40 μs) oraz jednego impulsu, uzyskując obraz aktywowanej fluorescencji GFP po każdej aktywacji. Powtarzaj, aż fluorescencja przestanie się zwiększać, a następnie określ ilościowo fluorescencję w obszarze zainteresowania dla każdego obrazu.
    2. Wykreśl średnią intensywność fluorescencji w funkcji liczby impulsów. Wybierz liczbę impulsów, po których fluorescencja nie wzrasta, jako optymalną liczbę impulsów do aktywacji.
  10. Aktywuj fluorescencję paGFP obszar narysowany w kroku 5.8 przez wzbudzenie wzorzyste światłem 405 nm. Upewnij się, że obraz został uzyskany tuż przed aktywacją i tuż po niej.
    UWAGA: Idealna aktywacja paGFP wytworzy jasno zdefiniowany obszar fluorescencji z ostrymi granicami zawartymi w ROI.
  11. Uruchom 1-minutowy minutnik po zakończeniu aktywacji. Pod koniec 1 minuty rozpocznij pobieranie serii poklatkowej.
    UWAGA: Opóźnienie 1 minuty jest konieczne, aby umożliwić wzrost fluorescencji, który obserwuje się po fotoaktywacji paGFP11. W przypadku metody rozrzutu impulsów 5-10-minutowy okres akwizycji z 30-sekundowymi interwałami timelapse jest wystarczający do pomiaru początkowych nachyleń w oknach środkowych i bocznych w celu zmierzenia prędkości i kierunkowości. W przypadku metody ucieczki impulsów, okres akwizycji wynoszący 30-150 minut z 5 lub 10-minutowymi interwałami poklatkowymi pozwala na analizę długoterminowego zachowania włókien podczas pauzy
  12. Zapisz wszystkie uzyskane obrazy, a także zwrot z inwestycji używany do aktywacji fluorescencji.
  13. Przejdź do nowego obszaru nerwu i powtórz kroki 5.1-5.11. Jeśli nowy region znajduje się wzdłuż tego samego aksonu, musi znajdować się co najmniej 500 μm od poprzednio aktywowanego obszaru, aby uniknąć wykrycia fluorescencyjnych neurofilamentów, które przemieściły się z drugiego aktywowanego obszaru. Zdobycie końcowego timelapse musi zakończyć się przed końcem 3-godzinnego okna.
    UWAGA: Możliwe, że preparat może być skuteczny dłużej niż 3 godziny, ale tego nie potwierdziliśmy. Dzięki umiejętnej analizie i przygotowaniu, w ciągu tych 3 godzin można uzyskać od pięciu do ośmiu 10-minutowych zestawów zdjęć poklatkowych.
  14. Po uzyskaniu końcowej serii zdjęć poklatkowych należy zatrzymać przepływ soli fizjologicznej, odłączyć roztwór i grzałki komory oraz wyjąć aparat perfuzyjny ze stolika mikroskopowego.

6. Akwizycja obrazów w płaskim i ciemnym polu

  1. Przygotować roztwór fluoresceiny, dodając 250 mg fluoresceiny w proszku do 0,5 ml podwójnie destylowanej wody. Mieszaj, aż nie będzie widocznych cząstek i wiruj roztwór przez 30 sekund w wirówce stołowej, aby osadzać nierozpuszczony materiał. Roztwór ten może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, jeśli jest chroniony przed światłem.
  2. Dodaj 8 μl roztworu fluoresceiny do szkiełka podstawowego i nałóż szkiełko nakrywkowe #1,5. Zetrzyj nadmiar płynu, uszczelnij lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia.
    UWAGA: Przy tym wysokim stężeniu silna absorpcja barwnika fluoresceiny gasi wiązkę świecącą w roztworze, wytwarzając cienką płaszczyznę fluorescencji na powierzchni szkiełka nakrywkowego, która jest zarówno jednolita, jak i odporna na fotowybielanie dzięki szybkiej wymianie dyfuzyjnej12.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe z fluoresceiną stroną do dołu na odwróconym stoliku mikroskopowym i wyreguluj ostrość na cienkiej płaszczyźnie fluorescencji na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Poruszaj się po szkiełku, aby znaleźć pole widzenia, które nie zawiera pęcherzyków powietrza (ciemnych punktów) ani dużych cząstek fluoresceiny (jasnych punktów).
  4. Uzyskaj stos z obejmujący 6 μm w odstępach 0,2 μm tak, aby środkowy obraz był oryginalną płaszczyzną ostrości. Użyj krótkiego czasu naświetlania (np. 40 ms), ponieważ fluorescencja będzie bardzo jasna. Ta akwizycja z-stack jest niezbędna do uchwycenia maksymalnej fluorescencji w całym polu widzenia, ponieważ szkiełko nakrywkowe rzadko jest idealnie poziome, a płaszczyzna fluorescencji fluoresceiny jest bardzo wąska. Powtórz tę czynność dla łącznie 25 pól widzenia, przesuwając stolik o co najmniej 20 μm w dowolnym kierunku między polami.
  5. Zamknij wszystkie przesłony ścieżki światła, w tym migawkę aparatu, i ustaw moc lasera oraz czas naświetlania na zero. Uzyskaj stos 100 obrazów z tymi ustawieniami. Obrazy te zostaną uśrednione w celu wygenerowania obrazu ciemnego pola, który zostanie użyty do skorygowania ciemnego prądu i przesunięcia odchylenia na chipie kamery.
    UWAGA: Akwizycja strumieniowa to idealny sposób na uchwycenie tych obrazów.

7. Obrazowanie glikolitycznych hamowanych nerwów w celu korekcji wybielacza

  1. Przygotować i natlenić roztwór soli fizjologicznej, jak w kroku 1, jednak zastąp 2-deoksy-D-glukozę D-glukozą i dodaj 0,5 mM jodooctanu sodu, aby zahamować glikolizę13. Nazywamy to "hamującą solą fizjologiczną".
  2. Powtórz kroki 2-5 przy użyciu hamującej soli fizjologicznej, z 10-30-minutowym obrazem poklatkowym ustawionym w kroku 5.11. Odczekaj 40-50 minut po zastosowaniu hamującej soli fizjologicznej przed obrazowaniem, aby zapewnić całkowite zahamowanie transportu neurofilamentów.
    UWAGA: Hamowanie glikolityczne ostatecznie zabije aksony, więc istnieje wąskie okno czasowe po zahamowaniu, w którym można uzyskać dane, zwykle około 30 minut. Wskaźnikiem poziomu zahamowania metabolizmu jest autofluorescencja flawinowa mitochondriów aksonalnych, którą można wykryć w serii timelapse ze względu na długie ekspozycje, których używamy do obrazowania fluorescencji paGFP14. Zazwyczaj autofluorescencja mitochondriów zwiększa się podczas leczenia solą fizjologiczną hamującą. Jeśli mitochondria zaczną się zaokrąglać lub fragmentować, przerwij obrazowanie.

8. Przetwarzanie i analiza obrazu za pomocą ImageJ

  1. Korekcja płaskiego i ciemnego pola
    1. Otwórz stos obrazów w ciemnym polu i uśrednij obrazy, klikając Obraz | Stosy | Z Project i wybierając opcję Average Intensity (Średnia intensywność) z menu rozwijanego, aby wygenerować obraz ciemnego pola.
    2. Otwórz stosy obrazów z płaskim polem fluoresceiny i utwórz projekcję maksymalnej intensywności każdego z nich (w sumie 25), klikając Obraz | Stosy | Z Project i wybierając opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność) z menu rozwijanego.
    3. Połącz wynikowe maksymalnie 25 obrazów projekcyjnych w jeden stos, klikając Obraz | Stosy | Obrazy do ułożenia w stos. Utwórz projekcję średniej intensywności tego stosu, klikając Obraz | Stosy | Z Project i wybierając opcję Average Intensity (Średnia intensywność) z menu rozwijanego, aby wygenerować obraz płaskiego pola.
    4. Odejmij obraz ciemnego pola od obrazu płaskiego, klikając przycisk Proces | Kalkulator obrazów, wybierając opcję Odejmij jako operację. Upewnij się, że opcja wyniku 32-bitowego (zmiennoprzecinkowego) jest zaznaczona. Rezultatem jest skorygowany obraz w płaskim polu.
    5. Zmierz średnią intensywność pikseli skorygowanego obrazu o płaskim polu, klikając najpierw przycisk Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) i zaznacz pole Średnia wartość szarości, a następnie naciśnij "m".
    6. Podziel poprawiony obraz płaskiego pola przez jego średnią intensywność, klikając przycisk Przetwarzaj | Matematyka | Podziel i wprowadź średnią wartość szarości uzyskaną w kroku 7.1.5. Spowoduje to uzyskanie obrazu o odwrotnym wzmocnieniu.
    7. Otwórz obrazy przed aktywacją i po aktywacji wraz ze stosem obrazów poklatkowych. Połącz obrazy w jeden stos, klikając Obraz | Stosy | Narzędzia | Połącz i wybierz obrazy w kolejności chronologicznej z menu rozwijanych. Upewnij się, że opcja Otwórz jako obraz 4D nie jest zaznaczona. Wynikowy stos jest pełnym zestawem obrazów.
    8. Powtórz krok 8.1.4 na pełnym zestawie obrazów, a następnie podziel wynik przez obraz o odwrotnym wzmocnieniu, klikając przycisk Process (Proces) | Kalkulator obrazów i wybierając opcję Podziel jako operację. W ten sposób powstanie skorygowany pełny zestaw obrazów, w którym każdy obraz został skorygowany pod kątem niejednorodności w polu oświetlenia i na detektorze.
  2. Wyrównanie stosu obrazów
    1. Aby skorygować niewspółosiowość płaszczyzn obrazu w serii timelapse spowodowaną dryfem stolika lub próbki, zainstaluj wtyczkę Wyrównanie według stałego regionu (plik uzupełniający 1), klikając Wtyczki | Zainstaluj wtyczkę, przechodząc do folderu zawierającego plik wtyczki i wybierając wtyczkę. Uruchom ponownie ImageJ po zainstalowaniu wtyczki.
      UWAGA: Ta wtyczka wyrównuje obrazy w oparciu o zasadę "najmniejszych kwadratów krzepnięcia"15.
    2. Narysuj ROI na skorygowanym pełnym zestawie obrazów, który obejmuje kilka aksonów i nie wykracza poza proksymalne i dystalne granice aktywowanej fluorescencji w każdym z aksonów. Geometria regionu nie ma znaczenia, jednak wykluczenie obszarów, w których struktury zmieniają kształt lub rozmiar, poprawi wyrównanie.
    3. Uruchom wtyczkę wyrównania, klikając Wtyczki | Wyrównanie według ustalonego regionu. Wtyczka umieszcza domyślne maksimum 2 pikseli na przemieszczeniu między klatkami, jednak można to dostosować w początkowym oknie pop-up, jeśli występuje znaczny dryf próbki. Wyrównanie może potrwać kilka minut, w zależności od rozmiaru stosu obrazów.
    4. Sprawdź wzrokowo wyrównany stos, aby ocenić jakość wyrównania. Niektóre klatki mogą wymagać ręcznego wyrównania, ponieważ automatyczne wyrównywanie może nie działać dobrze w przypadku dużych wahań fluorescencji między klatkami. Można to zrobić podczas przeglądania ramki, którą należy przesunąć, klikając Obraz | Przekształcanie | Tłumaczenie. Kliknij Nie w następnym wyskakującym okienku z pytaniem, czy cały stos powinien zostać przetłumaczony. W translacji należy używać tylko wartości całkowitych pikseli i upewnij się, że menu interpolacji rozwijanej jest ustawione na Brak, ponieważ ułamkowe przesunięcia pikseli lub interpolacja zmienią dane z powodu ponownego próbkowania intensywności pikseli.
    5. Zapisz to jako wyrównany pełny zestaw obrazów.
  3. Pomiar intensywności fluorescencji
    1. Narysuj ROI za pomocą narzędzia Kąt na pierwszej klatce wyrównanego pełnego zestawu obrazów, z pierwszym ramieniem wzdłuż jednej krawędzi aktywowanego obszaru, prostopadle do aksonów, a drugim ramieniem pionowo. Naciśnij "m", aby zmierzyć kąt, który opisuje orientację aksonów w polu view.
    2. Ustaw skalę obrazów tak, aby wymiary były mierzone w mikronach, klikając przycisk Analizuj | Ustaw Skala i wprowadź odpowiednie wartości.
    3. Otwórz menedżera ROI, klikając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Aby zapoznać się z paradygmatem ucieczki impulsów, przejdź do kroku 8.3.7. W przypadku rozrzutu impulsu przejdź do kroku 8.3.4.
    4. Narysuj kwadratowy zwrot z inwestycji o dowolnych wymiarach, a następnie kliknij przycisk Edytuj | Selekcja | Określ. Upewnij się, że opcja Jednostki skalowane jest zaznaczona, a następnie ustaw ROI na szerokość 15 μm i wysokość równą lub większą niż wysokość obrazu.
    5. Obróć ROI o kąt zmierzony w kroku 8.3.1, klikając Edytuj | Selekcja | Obróć, aby był prostopadły do aksonów, i umieść ROI jedną stroną wzdłuż bliższej krawędzi aktywowanego obszaru. Dodaj ten ROI, który będziemy nazywać proksymalnym przewodnikiem ROI, do menedżera, naciskając "t".
    6. Przeciągnij ROI, aby wyrównać się z dystalną krawędzią aktywowanego regionu i ponownie dodaj do menedżera ROI, naciskając "t". Będziemy to nazywać ROI dystalnego przewodnika. Zwroty ROI proksymalnej i dystalnej prowadnicy zostaną później wykorzystane do narysowania ROI pomiaru bocznego.
    7. Wybierz aksony do kwantyfikacji, korzystając z sekwencji zdjęć poklatkowych uzyskanych w kroku 5.11 powyżej. Ta sekwencja obrazów jest pomocna w tym celu, ponieważ wychwytuje słabą autofluorescencję aksonów, ujawniając ich morfologię poza aktywowanym regionem.
      UWAGA: Aksony, które nie spełniają następujących kryteriów, są wyłączone z analizy:
      1. Aksony muszą być ostre na całej długości wszystkich okien pomiarowych.
      2. Aksony muszą znajdować się w odległości nie większej niż 5° od prostopadłego do bliższego i dalszego końca obszaru aktywacji.
      3. Aksony nie mogą mieć wgłębień w promieniu 5 μm od bliższych i dalszych końców obszaru aktywacji.
      4. Wyklucz aksony, które widocznie zmieniają kształt w trakcie obrazowania.
      5. Wyklucz aksony, które wydają się niezdrowe, o czym świadczy brak dyskretnie aktywowanego regionu na obrazie po aktywacji (Rysunek 2C, na dole), ponieważ wskazuje to na dyfuzyjną dyspersję aktywowanej fluorescencji, która ma miejsce, gdy akson umiera.
    8. Obserwuj obraz wybielania z długim czasem naświetlania z kroku 5.5 dla struktur autofluorescencyjnych w aksonach. Ta fluorescencja jest spowodowana flawinami w mitochondriach16. Wyklucz aksony z analizy, jeśli te mitochondria wydają się zaokrąglone lub pofragmentowane (Rysunek 2D, na dole), w przeciwieństwie do rozszerzonych, liniowych struktur (Rysunek 2D, na górze), ponieważ wskazuje to na spadek metabolizmu.
    9. Korzystając z utworzonych powyżej proksymalnych i dystalnych wskaźników ROI, narysuj trzy pomiarowe ROI na analizowany akson: centralne okno obejmujące akson w obszarze aktywowanym 40 μm oraz dwa okna boczne o szerokości ograniczonej przez okno boczne ROI 15 μm i wysokości ograniczonej średnicą aksonu na granicy obszaru aktywacji. Dodaj wszystkie trzy regiony do menedżera ROI. W przypadku aksonów hamowanych glikolitycznie narysuj pojedynczy obszar, który ma nie więcej niż 5 μm szerokości w środku aktywowanego obszaru i nie wykracza poza akson. W przypadku paradygmatu ucieczki impulsu aktywowany obszar ma tylko 5 μm szerokości, więc należy użyć całego okna.
    10. Powtórzyć krok 8.3.9 dla wszystkich aksonów, które spełniają kryteria kroków 8.3.7 i 8.3.8.
    11. Ustaw aktywne pomiary na średnią intensywność pikseli, klikając Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) i wybierz opcję Mean gray value (Średnia wartość szarości). Upewnij się, że nie są zaznaczone żadne inne opcje pomiaru.
    12. Zaznacz wszystkie ROI w oknie Menedżera ROI, wybierając okno i naciskając "Ctrl" + "a". W oknie Menedżer zwrotu z inwestycji kliknij Więcej | Multi Measure do pomiaru intensywności fluorescencji. Skopiuj dane z okna wyników do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
    13. Ustaw aktywne pomiary w obszarze regionu, klikając przycisk Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) i wybierz opcję Area (Obszar). Upewnij się, że nie są zaznaczone żadne inne opcje pomiaru.
    14. Powtórz krok 8.3.12. Konieczne jest skopiowanie tylko jednego wiersza wyników dla obszaru, ponieważ obszar nie zmienia się w czasie.

9. Korekta fotowybielacza

  1. W arkuszu kalkulacyjnym danych dla aksonów hamowanych glikolitycznie odejmij średnią fluorescencję klatki 1 (ramkę przed aktywacją) od średniej fluorescencji każdej klatki, zaczynając od klatki 3 (pierwsza klatka poklatkowa) dla danego ROI. Wyniki są średnimi odejmowanymi od tła.
  2. Wykreśl dane jako wykres rozrzutu z numerami ramek jako odciętymi. Dopasuj wykładniczą linię trendu do danych z każdego ROI (większość programów do obsługi arkuszy kalkulacyjnych ma tę funkcję) za pomocą równania w postaci Ae-bx. Równanie to jest równoważne funkcji fotowybielania Ft = F0 * e-tɣ, gdzie F0 to fluorescencja w pierwszej klatce timelapse, ɣ to wykładniczy współczynnik bielenia, t to czas, a e to naturalna podstawa logarytmu.
  3. Powtórz kroki 9.1.1-9.1.2 dla wszystkich ROI wszystkich aksonów z nerwów hamowanych glikolitycznie. Aby uzyskać najdokładniejsze oszacowanie szybkości fotowybielania, użyj w sumie co najmniej 15 aksonów z co najmniej 5 oddzielnych nerwów. Użyj średniej wykładniczych szybkości bielenia (ɣ) ze wszystkich hamowanych aksonów, aby skorygować dane eksperymentalne dotyczące fotowybielania. Dla każdego eksperymentu lub badania należy przeprowadzić nową kalibrację wybielania, ponieważ fotowybielanie zależy od ustawień akwizycji obrazu i mocy lasera, która może się zmieniać w czasie.
  4. Powtórzyć krok 9.1.1 dla wszystkich obszarów aksonów zobrazowanych za pomocą soli fizjologicznej (tj. nie inhibitowanych glikolitami).
  5. Podziel każdy punkt danych przez e-tɣ, używając czasu dla t i średniej ɣ znalezionej w kroku 9.1.3. Są to środki skorygowane fotowybielaczem.
  6. Pomnóż każdy punkt danych przez obszar dla tego obszaru zainteresowania, aby znaleźć całkowitą fluorescencję w tym regionie za każdym razem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazy z eksperymentów ucieczki impulsu (pulse-escape) oraz rozprzestrzeniania się impulsu (pulse-spread). Opublikowaliśmy kilka badań opisujących dane uzyskane metodą pulse-escape oraz nasze metody analizy tych danych5,6,7,8,17. Poniżej pokazujemy, w jaki sposób dane z eksperymentów pulse-spr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Należy zachować ostrożność przy analizie eksperymentów z ucieczką i rozproszeniem impulsu, ponieważ istnieje znaczne ryzyko wprowadzenia błędu podczas przetwarzania końcowego, głównie podczas korekcji płaskiego pola, wyrównywania obrazu i korekcji wybielania. Korekcja płaskiego pola jest konieczna, aby skorygować niejednorodność oświetlenia, która powoduje spadek intensywności w całym polu widzenia od środka do obrzeży. Zakres niejednorodności jest zależny od długości fali, a zatem powinien być zawsze wykonywany na długo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Pauli Monsmie za instrukcje i pomoc przy mikroskopii konfokalnej i sekcji nerwu piszczelowego oraz dr Atsuko Uchida, Chloe Duger i Sana Chahande za pomoc w hodowli myszy. Praca ta była częściowo wspierana przez wspólne granty National Science Foundation IOS1656784 dla A.B. i IOS1656765 dla P.J. oraz granty National Institutes of Health R01 NS038526, P30 NS104177 i S10 OD010383 dla A.B. N.P.B. było wspierane przez stypendium z programu podoktoranckiego rektora Uniwersytetu Stanowego Ohio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14 x 22 Uszczelka prostokątna 0,1 mmBioptechs1907-1422-100wewnętrzna
2-deoksy-D-glukozaSigmaD6134
Uszczelka okrągła 30 mm zotworami Bioptechs1907-08-750zewnętrzna
35 x 10mm talerzThermo Fisher153066naczynia preparacyjne
40mm okrągłe szkiełka nakrywkoweBioptechs40-1313-0319
Strzykawka 60 ml - końcówka Luer-lockBD309653
System konfokalny Andor Revolution WD z wirującym dyskiemAndorwyposażony w systemy Perfect Focus i FRAPPA
Chlorek wapniaFisherC79
Szkiełka nakrywkoweFisher12-541-Bdo szkiełka fluoresceinowego
D-(+)-roztwór glukozySigmaG8769
Szpilki preparacyjneFine Science Tools26001-70
Kleszcze preparacyjneFine Science Tools11251-30kleszcze z cienką końcówką
Mikroskop preparacyjnyZeiss47 50 03
Patelnia preparcyjna z woskiemGinsberg Scientific568859
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools14061-09inicjał nożyczki preparacyjne
Komora perfuzyjna FCS2Bioptechs060319-2-03
Fluoresceina sodowaFluka46960
Podgrzewacz roztworuliniowego Warner InstrumentsSH27-B
Kleszcze do laminektomiiFine Science Tools11223-20kleszcze do wstępnego rozwarstwienia
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506
Zjeżdżalnia mikroakweduktuBioptechs130119-5
Szkiełka mikroskopoweFisher12-544-3do szkiełka fluoresceinowego
Wkładka stolika mikroskopuStosowane Oprzyrządowanie NaukoweI-3017
System podgrzewania obiektywówOkolabOko Touch z kołnierzem obiektywu
Olej do obiektywów - typ ANikonwycofany z produkcji
Plan Apo VC 100x 1.40 NAobiektyw NikonMRD01901
Chlorek potasuFisherP217
Fosforan potasuSigma-AldrichP0662
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6297
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Sód JodooctanSigma-AldrichI2512
Pompa strzykawkowaSage InstrumentsModel 355
Adapter rurki - żeńskiSmall Parts Inc.
Adapter do węży - męskiSmall Parts Inc.
Rurki TygonBioptechs1/16" ID, grubość ścianki 1/32"
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools15018-10cienkie nożyczki
uszczelka uszczelka 10051091005012

Bibliografia

  1. Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
  2. Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  3. Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
  4. Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
  5. Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
  6. Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
  7. Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
  8. Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  10. Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
  11. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  12. Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
  13. Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
  14. Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).
  15. Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
  16. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
  17. Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
  18. Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
  19. Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
  20. Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).
  21. Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
  22. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  23. Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
  24. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  25. Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
  26. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

fotoaktywowalne GFPkonfokalny mikroskop z dyskiem obrotowymmetoda Pulse Escapemetoda Pulse Spreadmikroskopia fluorescencyjnatransport aksonalnymodelowanie matematycznesoli fizjologicznej napowietrzonej
Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.