Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61272

⸱

7 czerwca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Radiation Oncology, The Ohio State University, 3Department of Veterinary Biosciences, The Ohio State University, 4Davis Heart & Lung Research Institute, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Streszczenie

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest niefortunną konsekwencją postępu choroby, agresywnych podtypów raka i/lub późnej diagnozy. Przerzuty do mózgu są szczególnie wyniszczające, trudne do leczenia i dają złe rokowanie. Chociaż dokładna częstość występowania przerzutów do mózgu w Stanach Zjednoczonych pozostaje trudna do oszacowania, prawdopodobnie wzrośnie, ponieważ terapie pozaczaszkowe stają się coraz bardziej skuteczne w leczeniu raka. Dlatego konieczne jest zidentyfikowanie i opracowanie nowych podejść terapeutycznych do leczenia przerzutów w tym miejscu. W tym celu wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie komórek nowotworowych stało się dobrze znaną metodą modelowania przerzutów do mózgu. Wcześniej niemożność bezpośredniego pomiaru wzrostu guza była techniczną przeszkodą dla tego modelu; Jednak rosnąca dostępność i jakość metod obrazowania małych zwierząt, takich jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), znacznie poprawia zdolność do monitorowania wzrostu guza w czasie i wnioskowania o zmianach w mózgu w okresie eksperymentalnym. W tym miejscu wykazano wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie mysich komórek guza sutka do myszy immunokompetentnych, a następnie MRI. Przedstawione podejście do iniekcji wykorzystuje znieczulenie izofluranem i konfigurację stereotaktyczną z cyfrowo sterowanym, zautomatyzowanym wstrzykiwaniem wiertła i igły w celu zwiększenia precyzji i zmniejszenia błędów technicznych. Rezonans magnetyczny jest mierzony w czasie za pomocą instrumentu o napięciu 9,4 Tesli w The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Pomiary objętości guza są demonstrowane w każdym punkcie czasowym za pomocą ImageJ. Ogólnie rzecz biorąc, to podejście do iniekcji wewnątrzczaszkowej pozwala na precyzyjne wstrzykiwanie, codzienne monitorowanie i dokładne pomiary objętości guza, co w połączeniu znacznie zwiększa użyteczność tego systemu modelowego do testowania nowych hipotez dotyczących czynników powodujących przerzuty do mózgu.

Wprowadzenie

Przerzuty do mózgu występują 10 razy częściej niż pierwotne nowotwory ośrodkowego układu nerwowego u dorosłych1, i zostały zgłoszone w prawie każdym typie guza litego z rakiem płuc, rakiem piersi i czerniakiem wykazującymi najwyższą częstość występowania2. Niezależnie od pierwotnego miejsca guza, rozwój przerzutów do mózgu prowadzi do złego rokowania, często związanego ze spadkiem funkcji poznawczych, uporczywymi bólami głowy, drgawkami, zmianami w zachowaniu i/lub osobowości1,3,4,5. Jeśli chodzi o raka piersi, poczyniono wiele postępów w zapobieganiu i leczeniu tej choroby. Jednak u 30% kobiet, u których zdiagnozowano raka piersi, pojawią się przerzuty, a wśród kobiet z chorobą w IV stopniu około 7% (SEER 2010-2013) ma przerzuty do mózgu6,7. Obecne możliwości leczenia przerzutów do mózgu obejmują resekcję chirurgiczną, radiochirurgię stereotaktyczną i/lub radioterapię całego mózgu. Jednak nawet przy tej agresywnej terapii mediana przeżycia dla tych pacjentów wynosi 8-11 miesięcy7,8,9. Te ponure statystyki silnie wspierają potrzebę identyfikacji i wdrożenia nowych, skutecznych strategii terapeutycznych. Tak więc, podobnie jak w przypadku wszystkich nowotworów, które dają przerzuty do mózgu, konieczne jest prawidłowe modelowanie przerzutów do mózgu związanych z rakiem piersi (BCBM) w laboratorium, aby zapewnić znaczące postępy w tej dziedzinie.

Do tej pory badacze wykorzystali różne metodologie do badania mechanizmów przerzutów do mózgu, z których każda miała inne zalety i ograniczenia10,11. Eksperymentalne metody przerzutów, takie jak żylna ogonowa i wstrzyknięcie dosercowe, rozprzestrzeniają komórki nowotworowe po całym ciele i mogą powodować ogromne obciążenie guzem w innych miejscach przerzutów, w zależności od wstrzykniętych komórek. Wyniki te są następnie mylące, jeśli konkretnie bada się przerzuty do mózgu. Metoda iniekcji do tętnicy szyjnej jest korzystna, ponieważ jest ukierunkowana na zasiewanie komórek nowotworowych w mózgu, ale jest ograniczona, ponieważ może być technicznie trudna do wykonania. Ortotopowa resekcja guza pierwotnego jest często uważana za najbardziej istotny klinicznie model przerzutów, ponieważ rekapituluje całą kaskadę przerzutów. Jednak takie podejście wiąże się z wydłużonymi okresami oczekiwania na wystąpienie spontanicznych przerzutów przy znacznie niższych wskaźnikach przerzutów do mózgu w porównaniu z innymi miejscami przerzutów, takimi jak węzeł chłonny, płuca i wątroba. Często zwierzęta muszą zostać usunięte z badań z powodu obciążenia guzem w tych innych miejscach przerzutów przed rozwojem przerzutów do mózgu. Inne metody obejmujące tropikalne linie komórkowe mózgu są skuteczne w przerzutach do mózgu; Jednak modele te są ograniczone, ponieważ potrzebują czasu na rozwój i często tracą swój tropizm wraz z rozmnażaniem. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, naukowcy rutynowo stosowali metodę iniekcji wewnątrzczaszkowej do modelowania przerzutów raka do mózgu11,12,13,14 z różnymi metodologiami15,16,17,18,19. Uznaje się, że to podejście ma również ograniczenia, przede wszystkim to, że nie pozwala na badanie wczesnych etapów przerzutów, w tym wynaczynienia z guza pierwotnego, penetracji przez barierę krew-mózg i osiedlenia się w mózgu. Pozwala jednak naukowcom przetestować (1) jakie czynniki pochodzące z guza pośredniczą we wzroście w mózgu (np. manipulacja genetyczna czynnikiem onkogennym w komórkach nowotworowych), (2) w jaki sposób zmiany w mikrośrodowisku przerzutowym wpływają na wzrost raka w tym miejscu (np. Porównanie myszy transgenicznych ze zmienionymi składnikami zrębu) oraz (3) skuteczność nowych strategii terapeutycznych na wzrost ustalonych zmian.

Biorąc pod uwagę potencjalną użyteczność modelu iniekcji wewnątrzczaszkowej, jest absolutnie konieczne zmniejszenie błędów technicznych podczas iniekcji i precyzyjne monitorowanie wzrostu guza w czasie. Opisana metoda polega na ciągłym dawkowaniu znieczulenia gazem wziewnym oraz bezpośrednim wszczepianiu komórek nowotworowych do miąższu mózgu za pomocą wiertła stereotaktycznego i stanowiska iniekcyjnego. Podanie znieczulenia gazowego pozwala na precyzyjne dostrojenie głębokości i długości znieczulenia, a także zapewnia szybki i płynny powrót do zdrowia. Sterowany cyfrowo, zautomatyzowany system wtrysku wiertła i igły zwiększa precyzję miejsca iniekcji i zmniejsza błędy techniczne często popełniane przy metodach wiercenia i iniekcji z wolnej ręki. Zastosowanie obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) dodatkowo zwiększa precyzję w monitorowaniu wzrostu guza, objętości guza, odpowiedzi tkankowej, martwicy guza i odpowiedzi na leczenie. MRI to metoda obrazowania z wyboru dla tkanek miękkich20,21. Ta technika obrazowania nie wykorzystuje promieniowania jonizującego i jest preferowana w stosunku do tomografii komputerowej (CT), szczególnie w przypadku wielu sesji obrazowania w trakcie badania. Rezonans magnetyczny ma znacznie większy zakres dostępnego kontrastu tkanek miękkich niż tomografia komputerowa lub obrazowanie ultrasonograficzne (USG) i bardziej szczegółowo przedstawia anatomię. Jest bardziej czuły i specyficzny dla nieprawidłowości w samym mózgu. Rezonans magnetyczny można wykonać w dowolnej płaszczyźnie obrazowania bez konieczności fizycznego przesuwania obiektu, jak ma to miejsce w przypadku obrazowania USG 2D lub optycznego 2D. Należy wspomnieć, że czaszka nie tłumi sygnału MRI, jak w przypadku innych metod obrazowania. MRI pozwala na ocenę struktur, które mogą być zasłonięte przez artefakty z kości w tomografii komputerowej lub USG. Dodatkową zaletą jest to, że dostępnych jest wiele środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego, co zwiększa granicę wykrywalności zmian, przy stosunkowo niskiej toksyczności lub skutkach ubocznych. Co ważne, rezonans magnetyczny umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym, w przeciwieństwie do oceny histologicznej w czasie sekcji zwłok, która jest ograniczona w rozszyfrowywaniu objętości guza. Inne metody obrazowania, takie jak obrazowanie bioluminescencyjne, są rzeczywiście skuteczne we wczesnym wykrywaniu i monitorowaniu guza w czasie; jednak metoda ta wymaga manipulacji genetycznej (np. znakowania lucyferazy/GFP) linii komórkowych i nie pozwala na pomiary wolumetryczne. Rezonans magnetyczny jest dodatkowo korzystny, ponieważ odzwierciedla monitorowanie pacjenta, a dalsza analiza wolumetryczna obrazów MR jest silnie skorelowana z histologiczną wielkością guza podczas sekcji zwłok22. Monitorowanie seryjne z przesiewowym rezonansem magnetycznym zwiększa również kliniczne monitorowanie zaburzeń neurologicznych, jeśli one wystąpią.

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona metoda stereotaktycznego wstrzykiwania guza wewnątrzczaszkowego, a następnie seryjnego rezonansu magnetycznego pozwala nam uzyskać wiarygodne, przewidywalne i mierzalne wyniki do badania mechanizmów przerzutów do mózgu w raku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metody opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Ohio (P.I. Gina Sizemore; Protokół #2007A0120). Wszystkie zasady IACUC dotyczące chirurgii przetrwania gryzoni są przestrzegane, w tym stosowanie sterylnych technik, materiałów, instrumentów, a także usuwanie sierści i sterylne przygotowanie miejsca nacięcia.

1. Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek raka piersi

UWAGA: Opisana tutaj metoda wykorzystywała linię komórkową mysiego guza sutka DB7 pochodzącą z pierwotnego guza MMTV-PyMT23. Wcześniejsze badania wykazały, że wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek DB7 jest modelem BCBM z histologią naśladującą chorobę człowieka12. Co ważne, w tym modelu wykorzystano myszy FVB/N kompetentne immunologicznie, ponieważ komórki DB7 pochodziły z tego szczepu myszy. Ponieważ jest to model raka piersi, do tych badań wykorzystuje się dorosłe samice myszy.

  1. Przygotuj komórki.
    1. W sterylnym kapturze odessać pożywkę z płytek do hodowli komórkowych przy użyciu standardowych technik.
    2. Umyj komórki 1x DPBS i trypsynizuj zgodnie z protokołem producenta.
    3. Dodaj odpowiednią objętość pożywki zawierającej FBS, aby zatrzymać reakcję trypsyny i określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub preferowanej metody.
    4. Komórki osadu w temperaturze 300 x g przez 4 min w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać pożywkę, przemyć 1x DPBS, ponownie wirować przy 300 x g przez 4 min w temperaturze 4 °C.
    6. Zawiesić komórki w 1x DPBS do odpowiedniego stężenia, około 50 000 komórek na objętość do wstrzyknięcia 2 μL.
      UWAGA: Numer komórki zależy od agresywności linii i musi zostać określony przez badacza. Rutynowo używamy 2 μl, ale zgłaszane jest użycie objętości <6 μL15,16,17,18,19. Małe ilości mają kluczowe znaczenie dla zachowania precyzji.
    7. Umieść zawieszone komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia, aby utrzymać żywotność.
  2. Przygotuj myszy do operacji.
    1. W przypadku myszy z sierścią: usuń sierść z czaszki za pomocą kremu/balsamu do depilacji lub golenia. Zrób to w ciągu 24-48 godzin przed zabiegiem, ponieważ wykonanie tego kroku zbyt blisko zabiegu może zakłócić jakość skóry i wytrzymałość szwów.
      UWAGA: Samice myszy FVB/N o wadze około 25 g zostały wykorzystane ze względu na badanie przerzutowego raka piersi, choroby głównie żeńskiej.
    2. Leki przeciwbólowe należy podawać zgodnie z ustaleniami IACUC i lekarza weterynarii prowadzącego: podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny SR-LAB (dawka 0,5-1 mg/kg, zapas buprenorfiny: 0,5 mg/ml dla dawki 0,0025-0,088 ml) co najmniej 1 godzinę przed zabiegiem w celu zapewnienia do 72 godzin znieczulenia, które w razie potrzeby można powtórzyć 48-72 godziny po pierwszej dawce. Należy również podawać NLPZ (20% ibuprofenu w wodzie pitnej, np. 1 mg/5 ml) co najmniej 24-48 godzin przed zabiegiem i kontynuować przez 2-7 dni po zabiegu, aby zapewnić co najmniej 72 godziny znieczulenia pooperacyjnego.
      UWAGA: Na Uniwersytecie Stanowym Ohio buprenorfina SR-LAB jest podawana przez personel weterynaryjny University Lab Animal Resources, ponieważ jest to substancja kontrolowana.
  3. Przygotowanie jednostek stereotaktycznych do operacji.
    1. Włącz wszystkie aparaty anestezjologiczne, cyfrowe wagi noniuszowe i cyfrowe wtryskiwacze.
      UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być odpowiednio oczyszczone i wysterylizowane przed zabiegiem.
    2. Używaj aparatów anestezjologicznych z przystawką do komory indukcyjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek 1A).
    3. Upewnij się, że wszystkie rurki z aparatów anestezjologicznych są podłączone do ramek stereotaktycznych (Rysunek 1B, wstawka 1C) i zaciski na rurkach są otwarte dla wszystkich używanych jednostek. Zamknij wszystkie zaciski na rurkach prowadzących do ram stereotaktycznych, które nie będą używane do operacji.
    4. Ustaw aparaty anestezjologiczne zgodnie z zalecanym przez producenta natężeniem przepływu stożka nosowego w oparciu o wagę myszy (np. 25 g masy zwierzęcia: natężenie przepływu stożka nosowego 34 ml/min).
      UWAGA: Uchwyt na głowę dołączony do tego zestawu stereotaktycznego jest zalecany tylko dla dorosłych myszy. Upewnij się, że przestrzegane są zalecenia producenta dołączone do konfiguracji stereotaktycznej.
    5. Upewnij się, że odpowiedni środek znieczulający (np. izofluran) wstępnie napełniony strzykawką jest podłączony do aparatu do znieczulania (Rysunek 1B).
      UWAGA: Nadmierne zalanie strzykawki może spowodować dostarczenie myszom zbyt dużej ilości znieczulenia podczas operacji i spowodować przedawkowanie środka znieczulającego.
    6. Przygotuj wiertła, przekręcając blokadę sceny, wkładając adapter wiertła i wiertło 1 mm do każdego wiertła i zablokuj wiertło, ręcznie dokręcając blokadę bitu.
    7. Przymocuj wiertła do ram stereotaktycznych (Rysunek 1C).
    8. Wyczyść strzykawki Hamilton 5 naprzemiennymi płukaniami 1x DPBS, następnie 70% etanolu, a następnie ponownie w 1x DPBS. Odłożyć na bok do czasu, aż zwierzę zostanie przygotowane do wstrzyknięcia.
    9. Ustaw wtryskiwacz cyfrowy tak, aby dostarczał z szybkością 0,4 μl/min i docelowym 2 μl. Ta szybkość i objętość pozwalają na powolne wprowadzanie komórek nowotworowych do mózgu, co zmniejsza ciśnienie i związane z tym uszkodzenia.
  4. Umieść myszy na ramkach stereotaktycznych.
    1. Znieczulenie myszy (np. izofluranem) za pomocą wspomnianej komory indukcyjnej.
    2. Utrzymuj myszy przez cały zabieg w głębokiej płaszczyźnie znieczulenia. % znieczulenia podawanego przez maszynę zależy od wielu czynników, w tym: natężenia przepływu, stopnia stymulacji i temperatury ciała. Często monitoruj myszy przez cały czas trwania procedury pod kątem głębokości znieczulenia, oceniając rytmiczne oddychanie (zwierzę nie sapie); brak odruchu powiekowego (trzepotanie powiek po stymulacji aplikatorem z bawełnianą końcówką); i brak szczypania palców u nóg (wycofanie kończyny pod wpływem szkodliwego bodźca w postaci szczypania palców).
      UWAGA: Różne szczepy myszy będą miały różną reakcję na znieczulenie.
    3. Po tym, jak myszy znajdą się w odpowiedniej, głębokiej płaszczyźnie znieczulenia, przenieś myszy do jednostki stereotaktycznej. Użyj poduszki grzewczej, gdy mysz jest włączona do urządzenia stereotaktycznego, aby utrzymać temperaturę ciała i odpowiednią płaszczyznę znieczulania.
      UWAGA: Aby uzyskać niski profil, używamy aktywowanych powietrzem ogrzewaczy do rąk umieszczonych w pudełku z odwróconą końcówką do pipet (pudełko podnoszące mysz w Rysunek 1D).
    4. Otwórz pysk myszy i umieść zęby w korycie paska ustnego znajdującego się na nosku na ramie stereotaktycznej (Rysunek 2A). Przesuń stożek nosa nad nosem/ustami myszy (Rysunek 2B).
      1. Umieść myszy z głowami na poziomie paska gębowego. Delikatnie otwórz usta końcem aplikatora z bawełnianą końcówką i wsuń na miejsce. Upewnij się, że stożek nosowy znajduje się całkowicie nad nosem myszy, w przeciwnym razie znieczulenie nie zostanie dostarczone prawidłowo. Stożek nosowy nie będzie się zazębiał z nosem, jeśli zęby nie są osadzone w tym rowku (Wstawka Rysunek 2A).
    5. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż lubrykant do oczu na każde oko myszy. Stosowanie lubrykantu do oczu łagodzi wysuszenie rogówki i zmniejsza ryzyko uszkodzenia rogówki oraz powikłań pooperacyjnych związanych z urazem rogówki.
    6. Ustabilizuj czaszkę myszy, dociskając lewą listwę uszną do przyśrodkowej kantu lewego ucha, blokując ją na miejscu za pomocą na ramce stereotaktycznej. Następnie wsuń prawą listwę douszną do przyśrodkowej kanty prawego ucha i mocno przykręć ramkę stereotaktyczną (Rysunek 2B).
      UWAGA: Upewnij się, że głowa myszy jest wypoziomowana i prosta podczas umieszczania nauszników. Jeśli głowa jest krzywa lub pochylona, wstrzyknięcie zostanie wykonane w niewłaściwym miejscu w mózgu. Pręty uszne powinny być zaciskane TYLKO do momentu unieruchomienia czaszki po stymulacji umiarkowanym sondowaniem ręcznym.
  5. Zrób okno kalwaryjne.
    1. Przygotuj i oczyść skórę głowy za pomocą 3 naprzemiennych przejść z roztworem betadyny i 70% etanolu. Ze względu na bliskie sąsiedztwo pola operacyjnego względem oczu, roztwór betadyny należy zastosować na peeling chirurgiczny.
    2. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 3-milimetrowe nacięcie przez skórę wzdłuż środkowej środkowej części czaszki (wzdłuż linii szwu strzałkowego). Krwawienie w miejscu nacięcia powinno być minimalne. W takim przypadku należy równomiernie, mocno uciskać miejsce krwawienia sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką przez >30 sekund.
    3. Zidentyfikuj i ustaw wiertło prostopadle do bregmy (Rysunek 2C), upewniając się, że cyfrowa skala noniusza została zresetowana do zera.
    4. Przesuń wiertło 2 mm w bok do szwu strzałkowego i 1 mm do przodu do szwu koronalnego (Rysunek 2C). Aby zapewnić powtarzalność, upewnij się, że lokalizacja po lewej lub prawej stronie linii szwu strzałkowego pozostaje spójna dla wszystkich zwierząt.
    5. Obróć wiertło na najwyższą prędkość. Upewnij się, że skóra jest odsunięta od wiertła, aby uniknąć uszkodzenia tkanek spowodowanego przez obracające się wiertło i ostrożnie zainicjuj wiertło na czaszce. Wywierć otwór o głębokości około 0,5 mm w kalwarii, co spowoduje powstanie okna kalwaryjnego. Uważaj, aby nie opuścić wiertła zbyt daleko, ponieważ wwierci się ono w mózg. Upuszczenie sterylnego roztworu soli fizjologicznej w miejscu wiercenia, gdy wiertło jest w ruchu, może zrównoważyć ciepło wytwarzane przez maszynę, które może spowodować uszkodzenie termiczne otaczającej tkanki.
    6. Po wykonaniu okna kalwarycznego ostrożnie podnieś wiertło i wyjmij je z ramy stereotaktycznej.
    7. Oczyść wiertła przy użyciu 70% etanolu i odłóż na bok, jeśli są ponownie używane. Jeśli nie, wyjmij wiertła i zanurz w 70% etanolu.
  6. Wstrzykiwanie komórek rakowych do mózgu
    1. Podłącz automatyczny zespół wtryskiwacza do aparatu stereotaktycznego (Rysunek 1D).
    2. Pobrać >2 μl komórek dokładnie zawieszonych w 1x DPBS w czystej strzykawce Hamiltona. Należy pamiętać o ponownym zawieszeniu komórek bezpośrednio przed napełnieniem strzykawki, aby zmniejszyć tworzenie się grudek i zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Idealnie nadaje się do wydobycia 6-8 μl objętości komórek, aby upewnić się, że nie ma kieszeni powietrznych/pęcherzyków.
    3. Umieścić strzykawkę Hamiltona na aparacie do wstrzykiwania i przygotować igłę do wstrzyknięcia, dozując niewielką ilość objętości na jednorazową sterylną serwetkę, aby upewnić się, że wstrzykiwacz działa prawidłowo. Przetrzyj strzykawkę 70% etanolem za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką (Rysunek 1D, wkładka). Powoduje to usunięcie komórek nowotworowych z zewnętrznej lufy trzonu igły, zmniejszając ryzyko wysiewu komórek nowotworowych wzdłuż drogi iniekcyjnej.
    4. Dopasuj końcówkę igły do środka okienka kalwarycznego, prawie dotykając odsłoniętego mózgu.
    5. Zresetuj cyfrową skalę noniusza do zera.
    6. Powoli wbij igłę na głębokość 3 mm do mózgu i pozwól, aby igła pozostała w mózgu przez co najmniej 60 sekund przed kontynuowaniem. Te ramy czasowe pozwalają miąższowi mózgu dostosować się wokół igły, co zmniejsza ciśnienie wsteczne i potencjalne wydalenie komórek nowotworowych wzdłuż drogi igły.
    7. Wybierz opcję Uruchom na ekranie wstrzykiwacza, aby rozpocząć dostarczanie komórek do miejsca wstrzyknięcia. Wstrzyknięcie tej objętości zajmie około 5 minut. Wydłużony czas na ten etap ma na celu zmniejszenie wtórnych uszkodzeń spowodowanych siłą wstrzyknięcia na miąższ mózgu.
    8. Po zakończeniu protokołu wstrzyknięcia pozwól igle spocząć w mózgu przez co najmniej 3 minuty, ponownie pozwalając miąższowi mózgu zaaklimatyzować się do wstrzyknięcia.
    9. Po upływie co najmniej 3 minut należy odsunąć igłę od mózgu z prędkością 0,75 mm/min. Rób to w bardzo powolny i konsekwentny sposób, aby zmniejszyć ciśnienie wsteczne i śledzenie guza w górę drogi igły.
    10. Gdy igła wyjdzie z mózgu, ostrożnie wyjąć strzykawkę Hamiltona z wstrzykiwacza i wyczyścić zgodnie z opisem w kroku 1.2.8.
    11. Nałóż ciepły wosk kostny na okienko kalwaryczne za pomocą sterylnego bawełnianego wacika. Wosk kostny działa jak fizyczna bariera, która utrzymuje guz w czaszce.
    12. Zamknij nacięcie (np. rozpuszczalne szwy 5-0 PDS w prostym przerywanym wzorze LUB klipsy do szwów, w zależności od tego, co jest najwygodniejsze dla chirurga).
    13. Przerwij podawanie znieczulenia i wyjmij mysz z aparatu, odblokowując i wysuwając nauszniki, zsuwając stożek nosowy z myszy i odłączając zęby od paska ustnego.
    14. Umieść mysz w czystej klatce, która jest na cieplejszym ustawieniu na 37 °C w celu odzyskania sprawności. Monitoruj myszy podczas rekonwalescencji, która zwykle następuje 10-15 minut po odstawieniu znieczulenia.
    15. Po odzyskaniu myszy należy monitorować kryteria wczesnego usuwania określone przez IACUC instytucji przyjmującej.

2. Rezonans magnetyczny

  1. Podaj środek kontrastowy na bazie gadolinu (100 μl/20 g masy ciała myszy 0,1 M MultiHance) myszom przez standardowe wstrzyknięcie dootrzewnowe24 10-20 minut przed obrazowaniem. Następnie znieczulić za pomocą komory indukcyjnej z wziewnym środkiem znieczulającym (np. izofluranem) zmieszanym z 95%O2 i 5% CO2 (tj. gazem dostarczanym powietrzem w pomieszczeniu).
  2. Umieść mysz na podgrzewanym uchwycie, aby utrzymać temperaturę ciała. Zabezpiecz głowę zębami do uszu i prętem do gryzienia oraz umieść uchwyt w magnesie 9,4 T wyposażonym w cewkę powierzchniową mózgu myszy. Utrzymuj znieczulenie w czasie obrazowania, badanie zwykle trwa około 20 minut na mysz. Monitoruj częstość oddechów i tętno (~70 uderzeń na minutę) przez cały czas trwania zabiegu za pomocą poduszki pneumatycznej i systemu monitorowania małych zwierząt.
  3. Uzyskaj obraz lokalizatora, a następnie zobrazuj mózg myszy za pomocą sekwencji rzadkiej ważonej T2 (TR = 3500-4228 ms, TE = 12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, rozmiar matrycy = 256 x 256, 1 mm lub 0,5 mm grubości warstwy, NA=2-4, 15-30 sąsiadujących warstw) i sekwencji rzadkiej po kontraście T1 na bazie gadolinu (TR = 1200 ms, TE=7,5 ms, RARE Factor = 4, FOV=2,0 x 2,0 cm, rozmiar matrycy = 256 x 256, 1 mm lub 0,5 mm grubości warstwy, NA=2-4, 15-30 sąsiadujących warstw).
  4. Po obrazowaniu umieść mysz w klatce na cieplejszym ustawieniu na 37 °C w celu regeneracji.

3. Wolumetryczne pomiary guza

  1. Uzyskanie całkowitej objętości guza
    1. Otwórz plik danych MRI DICOM w ImageJ, oprogramowaniu do przetwarzania obrazów dostępnym do bezpłatnego pobrania za pośrednictwem National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
      UWAGA: ImageJ umożliwia przeglądanie plików DICOM, które są wymagane do wykorzystania wymiarów osadzonych pikseli do obliczeń objętości guza (patrz Obraz, Właściwości, gdzie "jednostkę długości" można ustawić zgodnie z potrzebami (np. mm)).
    2. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby narysować kontur wokół guza. Wykonaj te zaznaczenia w ciemnym pomieszczeniu, aby poprawić widoczność. Nie reguluj jasności/kontrastu, aby zachować spójność między sesjami.
    3. Na karcie Analiza wybierz opcję Zmierz, aby uzyskać obszar wybranego regionu. Jeśli w kroku 3.1.1 wybrano jednostkę milimetrów, powierzchnia będzie podawana w milimetrach sześciennych. W razie potrzeby osadź zaznaczenie odręczne, naciskając ctrl+D. Zmień kolor wyjściowy, przechodząc do Edycja | Opcje | Kolor. Konwertowanie obrazu na obraz RGB (punkt menu Obraz | Rodzaj | Kolor RGB) przed zapisaniem jako plik .tif.
    4. Kontynuuj pomiar wszystkich wycinków zawierających guz dla pojedynczej myszy i skopiuj wartości do odpowiedniego programu do analizy danych (np. Microsoft Excel lub GraphPad Prism).
    5. Zsumuj obszary z każdego plasterka, aby uzyskać całkowitą objętość guza. Pamiętaj, aby skorygować obszar na podstawie grubości plastra (powierzchnia/grubość).
    6. Wykonuj kroki 3.1.1.-3.1.5., aż wszystkie myszy osiągną całkowitą objętość guza. Biorąc pod uwagę nieco subiektywny charakter nakreślania guzów, idealnie jest, jeśli ta sama metodologia jest powtarzana wiele razy i uśredniana w celu zmniejszenia błędu technicznego.
    7. Aby ustawić podziałkę liniową, otwórz plik danych DICOM i przejdź do Analizuj | Narzędzia | Pasek skali. Ponieważ wymiary są już osadzone w pliku DICOM, wystarczy wybrać żądaną długość/szerokość. Ukryty do obrazu RGB (Obraz | Rodzaj | Kolor RGB) przed zapisaniem jako plik .tif.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia zestawienie ilościowe objętości guza dla pojedynczej myszy w dwóch punktach czasowych (dzień 7 i dzień 10) po wstrzyknięciu mysich komórek guza gruczołu mlekowego. W tym doświadczeniu wstrzyknięto 50 000 komórek DB7, a mózg zwierzęcia oceniono za pomocą MRI. Podczas każdego skanowania zarejestrowano 30 warstw (grubość 0,5 mm). Analiza 30 warstw na skan wykazała, że w 7. dniu po wstrzyknięciu obciążenie nowotworowe występowało w 5 warstwach (Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystanie wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego, a następnie seryjnego monitorowania za pomocą MRI zapewnia wyjątkową możliwość wizualizacji wzrostu guza z dokładnością do objętości guza w czasie. Zastosowanie cyfrowej analizy obrazowej pozwala na interpretację zmian w mózgu pod kątem objętości guza, krwotoku, martwicy i odpowiedzi na leczenie.

Jak w przypadku każdej procedury, istnieją kluczowe kroki, które należy wykonać, aby odnieść sukces. Po pierwsze, staranne ustawienie urządzeń stereota...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie posiadają żadnych ujawnień.

Podziękowania

Reprezentatywne dane zostały sfinansowane przez National Cancer Institute (K22CA218472 do G.M.S.). Iniekcje wewnątrzczaszkowe są wykonywane w The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Validation Shared Resource (dyrektor – dr Reena Shakya), a MRI jest wykonywane w The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (dyrektor – dr Kimerly Powell). Oba wspólne zasoby są finansowane przez OSUCCC, grant OSUCCC Cancer Center Support Grant z National Cancer Institute (P30 CA016058), partnerstwa z uczelniami i wydziałami Uniwersytetu Stanowego Ohio oraz ustanowione systemy obciążeń zwrotnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały chirurgiczne
BetadinePurdue Products19-027132Jod powidonu, 7,5%
woskkostny Specjalizacje chirurgiczne903Sterylny i plastyczny wosk pszczeli oraz palmitynian izopropylu
Buponorfina SR-LabZooPharmN/ADługodziałający iniekcyjne środek przeciwbólowy 5 ml (0,5 mg/ml) preparat polimetryczny
Aplikatory z bawełnianą końcówkąPuritan25-806 10WCSterylne aplikatory z bawełnianą końcówką na długich nóżkach
Maść do oczuPuralube17033-211-38Maść okulistyczna na bazie wazeliny i oleju mineralnego
Ogrzewacze do rąkHothandsHH2Okłady rozgrzewające aktywowane powietrzem
IbuprofenUp & Up094-01-0245100mg na 5mL w płynnej zawiesinie
IsofluraneHenry Schein INC1182097Płynny środek znieczulający do stosowania w parownikach anestezjologicznych
SkalpeleIntegra Miltex4-410#10 jednorazowe ostrze skalpela
skóryVetbond1469SBBezpieczny dla skóry klej do ran
Sterylny opatrunekTIDI Products25-517Indywidualnie pakowane sterylne serwety
SzewCovidienSP5686G45 cm zaklinowany 5-0 monofilamentowy szew
Jednostka stereotaktyczna
Wiertarka szybkoobrotowa (Foredom)KopfModel 1474Max 38 000 obr./min
Uchwyt głowicy anestezjologicznej gazem dla myszyKopfModel 923-BPasek do ust z otworem na zęby i stożkiem nosowym
Niepękające nausznikiKopfModel 922Listwy nauszne odpowiednie do zastosowań myszowych
Przyrząd stereotaktycznyKopfModel 940Płyta podstawowa, rama i zespół skali liniowej z cyfrowym odczytem monitora
Injector
Igła wtryskiwacza i strzykawkaHamilton80366igła o rozmiarze 26, długość igły 51 mm i 10 μ Strzykawka L o objętości
Legato 130A Automatyczna pompa strzykawkowaKD ScientificP/N: 788130Programowalna podstawa ekranu dotykowego z automatycznym wtryskiwaczem
Maszyna anestezjologiczna
SomnoSuite Cyfrowy waporyzator o niskim przepływieKent ScientificSS-01Cyfrowy aparat do znieczulenia
SomnoSuite Zestaw startowy dla myszyKent ScientificSOMNO-MSEKITZawiera komorę indukcyjną, 2x strzykawki anestezjologiczne, rurkę 18", plastikowy nosecone, 2x kanistry z gazem do usuwania zużytych środków do znieczulania
Klej do polipropylenowy

Bibliografia

  1. Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
  2. Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
  3. Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
  4. Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
  5. Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
  6. Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
  7. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
  8. Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411(2017).
  9. Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
  10. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  11. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  12. Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
  13. Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006(2018).
  14. Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
  15. Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397(2012).
  16. Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017(2014).
  17. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403(2011).
  18. Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  20. Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
  21. Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
  22. Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
  23. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  24. Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
  25. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  26. Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
  27. Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar obj to ci guzaustawienie stereotaktyczneautomatyczny wiertarkaanaliza w programie ImageJkontrast gadolinowyMRI 94 Teslimysi guz piersi
Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.